从植物中提取泛素及类泛素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从植物中提取泛素及类泛素的方法，包含如下步骤：1）将植物根茎、叶、种子或果实经清洗、消毒、洗涤去除消毒剂，得到原料；2）将原料粉碎，使其满足胶体磨的使用条件；3）若原料是植物种子，那么先经浸泡再用胶体磨进行湿磨；若是植物根茎、叶或果实则直接进行湿磨，得到植物粗浆液；4）利用纤维素酶处理植物粗浆液，得到粗浆处理液；5）将粗浆处理液细磨为细浆；6）将细浆离心分离，收集上清液得到粗蛋白液；7）将粗蛋白液多次用不同孔径膜过滤，得到泛素及类泛素。该方法工艺简单，操作过程中不引入不安全物质，减少能源消耗；同时综合利用植物；其制得的蛋白质即泛素及类泛素，具有较高的利用价值。
【专利说明】从植物中提取泛素及类泛素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，特别是涉及一种从植物中提取泛素及类泛素的方法。【背景技术】
[0002]泛素功能非常多样，广泛存在于各种生物体内，这种小蛋白参与了各种细胞过程，包括细胞分裂，DNA修复以及细胞程序化死亡，它还可以作为一种负责开放或关闭基因的蛋白质的秒表。泛素的一个最著名的功能就是帮助清理细胞。泛素连接酶能将一串泛素分子连接到无用的蛋白质上，其可激活蛋白酶体复合物，蛋白酶体复合物吞噬蛋白。转录因子在完成基因功能之后，也会被连接上泛素分子而被清除掉，因此泛素可以有效地关闭基因。同时类泛素蛋白(Ubls)作为信号使者控制着多种细胞功能，诸如细胞增殖、凋亡、细胞周期及DNA修复，且泛素在人体自我修复功能系统中扮演着重要的角色。
[0003]自1975年泛素在小牛胰脏中分离出来，目前国内外已对泛素及类泛素作用的机理、纯化、应用作出了大量研究。但对其制造方法的研究很少，目前利用植物提取蛋白的方法中，多数仅仅局限于一般植物的总蛋白的提取，所提取的蛋白质的功能针对性较小，仅局限于补充人体蛋白，所以导致在市场上的竞争力不强。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于:提供一种从植物中提取泛素及类泛素的方法，该方法能直接提取营养价值高的泛素及类泛素，且工艺简单，操作过程中不引入不安全物质，减少能源消耗；同时综合利用植物。
[0005]为此，本发明的技术方案在于:
[0006]一种从植物中提取泛素及类泛素的方法，包含如下步骤:
[0007]1)将植物根茎、叶、种子或果实经清洗、消毒、洗涤去除消毒剂，得到原料；
[0008]2 )对原料进行粉碎，使其满足胶体磨的使用条件；
[0009]3)如果经步骤2)处理后的原料是植物种子，那么先将植物种子置于24~30°C温水中浸泡24~48h，然后将浸泡后的植物种子或未浸泡的植物根茎、叶或果实置于胶体磨中进行研磨，研磨过程中加入pH=7.6~8.0,50~65毫摩尔(mMol)的磷酸盐缓冲液，优选磷酸氢二钠缓冲液或磷酸二氢钠缓冲液，所述缓冲液为所述原料质量的I~5倍，得到植物粗浆液；
[0010]4)将所述植物粗浆液装入储罐，加入酶活大于2000u/g的纤维素酶，所述纤维素酶质量为所述原料质量的0.2~0.5%，搅拌均匀，在28~42°C条件下放置0.5~1.5h，得到粗浆处理液；
[0011]5)将所述粗浆处理液利用胶体磨磨成细度为50~150目的细浆；
[0012]6)将所述细浆利用离心分离，收集上清液得到粗蛋白液；
[0013]7)将所述粗蛋白液通过孔径0.65~1.2 μ m的微滤膜收集一次滤过液；将所述一次滤过液通过0.22~0.45 μ m的微滤膜收集二次滤过液；一次、二次过滤是为了除去粗蛋白液中的微粒、细菌；将所述二次滤过液通过截留分子量为14000的超滤膜并收集三次滤过液，将所述三次滤过液通过截留分子量为6000的超滤膜收集截留液，所述截留液即为所述泛素及类泛素。
[0014]还包括步骤8):将所述泛素及类泛素用截留分子量为6000的超滤膜进行浓缩，得到浓缩液，将所述浓缩液在-18~_22°C进行保存。
[0015]所述植物根茎为木薯、马铃薯、甘薯、山药、芋头、菊芋、半夏、甘露子、萝卜、竹笋、油菜、莲藕、土豆、红薯或荸荠的根茎；
[0016]所述植物叶为桑科、藜科、寥科、苋科、十字花科、豆科、旋花科、茄科、菊科、葫芦科或雨久花科植物的叶子；
[0017]所述植物种子为杏仁、腰果、榛子、核桃、松子、板栗、白果、开心果、夏威夷果、花生、葵花子、南瓜子、西瓜子，稻米、小麦、玉米或大豆；
[0018]所述植物果实为葡萄、草莓、香蕉、番石榴、木瓜、苹果、梨、柑桔、柿子、山楂、桃、梅、李、杏、龙眼、蒸枝、楼桃、率或芒果。
[0019]本发明以植物的果实、根、茎、叶为主要原料提取泛素及类泛素蛋白，经过粉碎、研磨、离心、超滤等步骤，从植物中提取泛素及类泛素，不仅加工工艺简单，而且操作过程中不引入不安全物质，减少能源消耗。同时提高植物的综合利用加工效益，所提取的泛素及类泛素蛋白更具有经济效益和社会效益及实用价值。
[0020]本发明 [0021]I)工艺简单，不运用有毒不安全和造成污染的方式提取泛素及类泛素，安全无污染，工艺简单，耗能少，生产的泛素及类泛素蛋白的功能性更强，获得的效益高；
[0022]2)植物的种子、根、茎、叶等均可用此工艺生产。副产物主要是淀粉和纤维素，可生产各种淀粉制品和食用纤维素，其产值不亚于主产品，是一项可持续发展的农业产业化技术。
【具体实施方式】
[0023]以下结合实施例对本发明的技术方案进行详细描述。
[0024]实施例1
[0025]从玉米中提取泛素及类泛素的方法，包括以下步骤:
[0026]I)将玉米清洗干净、消毒后，去除消毒剂，得到原料；
[0027]2)对原料进行粉碎，使其满足胶体磨的使用条件；
[0028]3)将经步骤2)处理后的玉米置于24°C温水中浸泡48h，然后将浸泡后的玉米置于胶体磨中进行研磨，研磨过程中加入pH=8.0,60mMol的磷酸氢二钠缓冲液，所述缓冲液为所述原料质量的5倍，得到植物粗浆液；
[0029]4)将所述植物粗浆液装入储罐，加入酶活大于2000u/g的纤维素酶，所述纤维素酶质量为所述原料质量的0.5%，搅拌均匀，在28°C下放置1.5h，得到粗浆处理液；
[0030]5)将所述粗浆处理液利用胶体磨磨成细度为150目的细浆；
[0031]6)将所述细浆利用离心分离，收集上清液得到粗蛋白液；
[0032]7)将所述粗蛋白液通过孔径0.65~1.2 μ m的微滤膜收集一次滤过液；将所述一次滤过液通过0.22~0.45 μ m的微滤膜收集二次滤过液；一次、二次过滤是为了除去粗蛋白液中的微粒、细菌；将所述二次滤过液通过截留分子量为14000的超滤膜并收集三次滤过液，将所述三次滤过液通过截留分子量为6000的超滤膜收集截留液，所述截留液即为所述泛素及类泛素。
[0033]制得的泛素及类泛素可经以下步骤制得蛋白粉:
[0034]还可将所述泛素及类泛素用截留分子量为6000的超滤膜进行浓缩，得到满足喷雾干燥所需浓度的浓缩液，将所述浓缩液进行干燥制得泛素及类泛素蛋白粉。
[0035]实施例2
[0036]从桑叶中提取泛素及类泛素的方法，包含如下步骤:
[0037]1)首先将桑叶清洗干净、消毒后，去除消毒剂，得到原料；
[0038]2)对原料进行粉碎，使其满足胶体磨的使用条件；
[0039]3)将经步骤2)处理后的桑叶置于胶体磨中进行研磨,研磨过程中加入pH=8.0,65mMol的磷酸盐缓冲液，所述缓冲液为所述原料质量的I倍，得到桑叶浆液；
[0040]4)将所述桑叶粗浆液装入储罐，加入酶活大于2000u/g的纤维素酶，所述纤维素酶质量为所述原料质量的0.5%，搅拌均匀，在36°C下放置1.0h，得到粗浆处理液；
[0041]5)将所述粗浆处理液利用胶体磨磨成细度为50目的细浆；
[0042]6)将所述细浆利用离心分离，收集上清液得到粗蛋白液；
[0043]7)将所述粗蛋白液通过孔径0.65~1.2 μ m的微滤膜收集一次滤过液；将所述一次滤过液通过0.22~0.45 μ m的微滤膜收集二次滤过液；一次、二次过滤是为了除去粗蛋白液中的微粒、细菌；将所述二次滤过液通过截留分子量为14000的超滤膜并收集三次滤过液，将所述三次滤过液通过截留分子量为6000的超滤膜收集截留液，所述截留液即为所述泛素及类泛素。
[0044]制得的泛素及类泛素可经以下步骤制得胶囊或片剂:
[0045]将上述泛素及类泛素，加入其重量10%的可溶性淀粉或药用淀粉，搅匀，在喷雾干燥机内调节适宜温度喷制成细粉，将粉进行胶囊包装或制片装瓶包装、杀菌。
[0046]实施例3
[0047]从山楂中提取泛素及类泛素的方法，包含如下步骤:
[0048]1)首先将山楂清洗干净、消毒后，去除消毒剂，得到原料；
[0049]2)对所述原料进行粉碎，使其满足胶体磨的使用条件；
[0050]3)将经步骤2)处理的山楂果实置于胶体磨中进行研磨，研磨过程中加入pH=7.6~8.0,50mMol的磷酸盐缓冲液，所述缓冲液为所述原料质量的3倍，得到山楂粗浆液；
[0051]4)将所述植物粗浆液装入储罐，加入酶活大于2000u/g的纤维素酶，所述纤维素酶质量为所述原料质量的0.2%，搅拌均匀，在37°C下放置0.5h，得到粗浆处理液；
[0052]5)将所述粗浆处理液利用胶体磨磨成细度为80目的细浆；
[0053]6)将所述细浆利用离心分离，收集上清液得到粗蛋白液；
[0054]7)将所述粗蛋白液通过孔径0.65~1.2 μ m的微滤膜收集一次滤过液；将所述一次滤过液通过0.22~0.45 μ m的微滤膜收集二次滤过液；一次、二次过滤是为了除去粗蛋白液中的微粒、细菌；将所述二次滤过液通过截留分子量为14000的超滤膜并收集三次滤过液，将所述三次滤过液通过截留分子量为6000的超滤膜收集截留液，所述截留液即为所述泛素及类泛素。
[0055]制得的泛素及类泛素可经以下步骤制得胶囊或片剂:
[0056]将上述泛素及类泛素，加入其重量10%的可溶性淀粉或药用淀粉，搅匀，在喷雾干燥机内调节适宜温度喷制成细粉，将粉进行胶囊包装或制片装瓶包装、杀菌。
[0057]性能测试:
[0058](I)泛素及类泛素对小鼠脾淋巴细胞活性影响试验
[0059]取实例1、2中提取的泛素及类泛素蛋白，选取小白鼠进行试验。
[0060]试验方法:将小鼠处死，无菌取脾脏，用镊子轻轻将脾磨碎，用Hank’s液洗涤两次，在1000r/min条件下离心IOmin收集细胞，用含血清的RPM1-1640培养液制成单个细胞悬液。然后调整细胞浓度为4X IO6个/mL。将细胞悬液加入96孔培养板中，150 μ L/孔，白对照加入不含血清的RPM1-1640培养液50 μ L，其他各组加入用不含血清的RPM1-1640培养液配置成的蛋白质溶液50 μ L，每个样品做三个平行，置37°C、含有5%C02的CO2孵箱中培养 72h。
[0061]培养结束前4h，加入XTT-PMS30 μ L/孔，培养结束后，在酶标仪上测450nm波长条件下各孔的光吸收值，以此值表示细胞增殖程度。
[0062]实验结果:下表为不同蛋白质对小鼠脾淋巴细胞增殖的直接影响。可见2-5组空白对照组相比有显著差异，实例中获取的蛋白质均能促进脾淋巴细胞的增殖，实例中获得泛素及类泛素蛋白与普通蛋白相比更加能促进脾淋巴细胞的增殖。
[0063]
【权利要求】
1.一种从植物中提取泛素及类泛素的方法，其特征在于包含如下步骤: 1)将植物根茎、叶、种子或果实经清洗、消毒、洗涤去除消毒剂，得到原料； 2)对原料进行粉碎，使其满足胶体磨的使用条件； 3)如果经步骤2)处理后的原料是植物种子，那么先将植物种子置于24~30°C温水中浸泡24~48h，然后将浸泡后的植物种子或未浸泡的植物根茎、叶或果实置于胶体磨中进行研磨，研磨过程中加入PH=7.6~8.0、50~65毫摩尔的磷酸盐缓冲液，所述缓冲液为所述原料质量的1~5倍，得到植物粗浆液； 4)将所述植物粗浆液装入储罐，加入酶活大于2000u/g的纤维素酶，所述纤维素酶质量为所述原料质量的0.2~0.5%，搅拌均匀，在28~42°C条件下放置0.5~1.5h，得到粗浆处理液； 5)将所述粗浆处理液利用胶体磨磨成细度为50~150目的细浆； 6)将所述细浆利用离心分离，收集上清液得到粗蛋白液； 7)将所述粗蛋白液通过孔径0.65~1.2 μ m的微滤膜收集一次滤过液；将所述一次滤过液通过0.22~0.45 μ m的微滤膜收集二次滤过液；将所述二次滤过液通过截留分子量为14000的超滤膜并收集三次滤过液，将所述三次滤过液通过截留分子量为6000的超滤膜收集截留液，所述截留液即为所述泛素及类泛素。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述植物根茎为木薯、马铃薯、甘薯、山药、芋头、菊芋、半夏、甘露子、萝卜、竹笋、油菜、莲藕、土豆、红薯或荸荠的根茎； 所述植物叶为桑科、藜科、寥科、苋科、十字花科、豆科、旋花科、茄科、菊科、葫芦科或雨久花科植物的叶子； 所述植物种子为杏仁、腰果、榛子、核桃、松子、板栗、白果、开心果、夏威夷果、花生、葵花子、南瓜子、西瓜子，稻米、小麦、玉米或大豆； 所述植物果实为葡萄、草莓、香蕉、番石榴、木瓜、苹果、梨、柑桔、柿子、山楂、桃、梅、李、杏、龙眼、荔枝、樱桃、枣或芒果。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于:磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠缓冲液或磷酸二氢钠缓冲液。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于:还包括步骤8)将步骤7制得的泛素及类泛素用截留分子量为6000的超滤膜进行浓缩，得到浓缩液，将所述浓缩液在-18~-22°C进行保存。
【文档编号】C07K1/34GK103788174SQ201410071662
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月28日 优先权日:2014年2月28日
【发明者】赵金梁, 赵发 申请人:天津替代医学科技有限公司