一种从金银花地上部分提取高纯度绿原酸的方法
【专利摘要】本发明公开了属于中药活性成分提取【技术领域】的一种从金银花地上部分提取高纯度绿原酸的方法。该方法以金银花地上部位为原料，通过以下步骤得到高纯度绿原酸：第一步，用pH2-5的60-80％乙醇溶液回流提取两次，或用pH2-5的酸水中加入纤维素酶和酸性蛋白酶在40-60℃下提取两次；第二步，将第一步所得提取液按一定比例浓缩，室温放置4-12h，抽滤除去析出的沉淀；第三步，将以上滤液浓缩至无醇味，加酸水稀释；通过大孔吸附树脂进一步纯化，可以得到纯度在90％以上的绿原酸。本发明得到的绿原酸纯度高，方法简单，绿色环保，且成本低廉，适合于工业化生产。
【专利说明】一种从金银花地上部分提取高纯度绿原酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于中药活性成分提取【技术领域】，具体涉及一种从金银花地上部分提取高纯度绿原酸的方法。
【背景技术】
[0002]金银花,学名忍冬(Lonicera japonica Thurb),为忍冬科忍冬属植物，具有清热解毒、凉风散热、抗病毒、保肝利胆等功能，是我国传统的中药材之一。金银花中主要化学成分为绿原酸、异绿原酸、黄酮化合物、芳樟醇、双花醇等。近代研究一般认为金银花的生物活性有效成分为绿原酸类化合物，并且常以绿原酸含量的高低来评价金银花质量的优劣。
[0003]绿原酸为含有羧基和邻二酚羟基的有机酸，易溶于水、醇、丙酮等溶剂中，分子量为354.3，它的半水化合物为白色或微黄色针状结晶。绿原酸(ChlOTogenic acid)是金银花中的主要活性成分之一，具有明显的降压、降脂、抗肿瘤、抗癌等药理作用。绿原酸既可作为食品中的添加剂、植物生长激素及一些高级化妆品的添加剂等，又是食品、药品、化妆品等工业的重要原料。高纯度的绿原酸价格昂贵，是目前国际公认的“植物黄金”，因此，绿原酸的提取市场前景广阔、发展潜力巨大。
[0004]目前，金银花中绿原酸提取主要靠溶剂提取法，采用乙醇提取，超声破壁等工艺，且提取部位主要来源于花，这些提取工艺能耗大，后处理污染较严重。也有文献或专利采用酶法提取，王瑞红等采用纤维素酶酶法提取提取(文献:纤维素酶在金银花提取工艺中的应用，王瑞红等，黑龙江医药，2003，16 (4) =286-287)，凌宁生等用纤维素酶和果胶酶二者的复合酶进行酶解提取的(专利名称:一种采用复合酶法提取金银花中绿原酸的方法，专利申请号:201010124495.0)。经过试验，上述酶法提取得到的绿原酸提取率及提取物纯度不高。发明人分别试验采用(I) 60-80%乙醇酸水溶液，(2)纤维素酶，(3)纤维素酶与果胶酶二者的复合酶及(4)纤维素酶与酸性蛋白酶复合酶四种工艺，进行提取金银花地上部分的绿原酸，结果显示纤维素酶与酸性蛋白酶组合成的复合酶提取得到的绿原酸提取率及提取物纯度与60-80%乙醇酸水提取结果接近。其原理可能是纤维素酶可以破坏植物细胞壁的结构，有利于包裹于细胞壁内的有效植物成分溶出，酸性蛋白酶可以在较低PH值条件下水解溶液中的蛋白质，有利于抑制水提取液中蛋白酶对绿原酸的破坏及后续蛋白质类杂质对大孔树脂纯化的影响。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种从金银花地上部分提取高纯度绿原酸的方法，该方法提高了所提取绿原酸的纯度，减少了提取过程中的环境污染，使金银花中绿原酸的提取不局限于花部位，提高了金银花全草的利用率。
[0006]一种从金银花地上部分提取高纯度绿原酸的方法，按照如下步骤进行:
[0007](I)将干燥的金银花地上部分粉碎，得到金银花地上部分粗粉；
[0008](2)将步骤(1)中得到的金银花地上部分粗粉加入60-80%乙醇水溶液，按照Ikg粗粉加10-20L乙醇水溶液的比例加入，回流提取l_3h，减压抽滤，重复该操作，合并滤液，取该合并滤液总体积的7/8~4/5浓缩，浓缩比例为5:1~9:1，该浓缩液与原未浓缩部分溶液合并，室温放置4~12h，有墨绿色沉淀析出，抽滤除去沉淀，将该滤液进一步浓缩至干粉；
[0009]或将步骤(1)中得到的金银花地上部分粗粉中加入PH3-5的酸水，升温至40-50 °C，加入纤维素酶4000-10000u/kg粗粉，酶解2_4h，然后加入酸性蛋白酶15000-25000u/kg粗粉，酶解2_4h，酶解完成后升温至70-100°C灭酶处理10_60min，抽滤，将过滤后的药渣用70-100°C的去离子水回流l_3h，重复操作I次，抽滤，合并三次滤液，将其浓缩至干粉；
[0010](3)将步骤(2)中的干粉用1.0-1.5BV (BV, bed volume,树脂柱床体积)的0.5-lmol/L稀盐酸水溶液溶解，溶液中绿原酸含量调节为5.0-6.0mg/mL,为上样液，进行大孔吸附树脂柱层析，用去离子水作为洗脱液，去离子水洗脱体积2-3BV，继续用7-10BV的20-30%乙醇水溶液洗脱，合并20-30%乙醇洗脱溶液，浓缩，浓缩比例为6: 1-10: 1，静置4-12h后，有白色颗粒或粉末状物析出，为绿原酸成品。
[0011]所述步骤(1)中，金银花地上部分为金银花的叶，藤茎，花，果实，中的一种或一种以上的组合。
[0012]所述步骤⑶中大孔吸附树脂为AB-8树脂，HZ-818树脂，X-5树脂或DiaionHP-20树脂。
[0013]所述60-80%乙醇水溶液用0.5-lmol/L盐酸调pH2_5。
[0014]本发明的有益效果:本发明对60-80%乙醇酸水溶液提取或纤维素酶与酸性蛋白酶复合酶提取得到的金银花地上部分提取物的酸水溶液，进一步试验采用AB-8、HZ-818、X-5、Diaion HP-20、D-10U XDA-U XDA-1b等大孔树脂进行纯化，经过优选得到AB-8、HZ-818、X-5、Diaion HP-20四种型号的大孔树脂，具有除杂好、绿原酸洗脱集中、使用有机溶剂少、树脂可重复使用等优点。本发明经过多种工艺的试验比较，确定了采用含有乙醇60-80%的酸水溶液或采用纤维素酶和酸性蛋白酶的酸水溶液进行金银花地上部分绿原酸提取，提取液进一步采用优选的大孔树脂进行纯化得到高纯度的绿原酸，经检测绿原酸纯度可达90%以上，工艺简便，易于在工厂运行，且成本低廉。
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
[0016]实施例1
[0017]取金银花的叶，粉碎，取粗粉50g，加入1.0L70%乙醇水溶液(0.5-lmol/L盐酸调PH2.5)，回流提取lh，趁热过滤，药渣重复提取I次，抽滤，两次滤液合并，得提取液1.85L，取该提取液1.5L浓缩至300mL，与未浓缩的提取液混合，静置8h，溶液下层有明显的墨绿色沉淀，减压抽滤，得到滤液进一步浓缩至干粉，干粉加去离子水300-400mL溶解并用IM的盐酸水溶液调pH3(以绿原酸含量5.4mg/mL计)，即为大孔吸附树脂柱层析的上样液。取500mL的AB-8大孔吸附树脂，首先按购买时说明书将AB-8大孔吸附树脂(柱直径为
5.5cm，柱长为25cm)进行酸碱预处理，然后用去离子水平衡该树脂柱，取上述配置好的上样液300mL动态上样，洗脱流速为10mL/min，上样液完全吸附于树脂柱上后，继用去离子水洗脱800mL，20%乙醇水溶液洗脱2.0L,将水洗脱液(约1L)弃去，20 %乙醇溶液洗脱部分(2.0L)合并，浓缩至200mL，室温(25°C )静置12h，析出沉淀，抽滤后干燥，得到绿原酸提取物(0.5g，收率1.0% )，经反相HPLC检测，采用面积归一化法检测该提取物中绿原酸纯度>90%。
[0018]实施例2
[0019]取金银花地上部分粗粉50g，加入1.0L的70%乙醇/稀盐酸水溶液(0.5-lmol/L盐酸调PH4)，回流提取2h，过滤，药渣重复提取I次，抽滤，合并两次滤液，得总提取液1.8L，取该提取液1.5L浓缩至200mL，与未浓缩的提取液混匀，静置8h，抽滤，除去墨绿色沉淀，收集滤液，进一步浓缩至干粉，干粉加300-400mL的蒸馏水溶解，并用0.5mol/L稀盐酸溶液调节该溶液至PH3.5，该溶液中绿原酸含量为4.0mg/mL,然后经X-5大孔吸附树脂树脂柱层析。取500mL的X-5大孔吸附树脂，首先按购买时说明书将X_5大孔吸附树脂(柱直径为
5.5cm，柱长为25cm)进行酸碱预处理，然后用去离子水平衡该树脂柱，取上述配置好的上样液300mL动态上样，洗脱流速为10mL/min，上样液完全吸附于树脂柱上后，继用600mL去离子水洗脱，此部分洗脱液弃去，继用2L的30%乙醇水溶液洗脱，收集合并该部分洗脱液(2L)，将此洗脱液浓缩至200mL，室温(15°C )静置12h，析出沉淀，将该沉淀抽滤后干燥，得到绿原酸提取物，经反相HPLC检测，采用面积归一化法测得绿原酸纯度> 90%。
[0020]实施例3
[0021]取金银花地上部分粗粉50g，加入去离子水500mL，升温至45°C，用0.5mol/L调节pH3，加入纤维素酶IOmg (酶活力300)，酶解2h。酶解完成后加入酸性蛋白酶20mg(酶活力1000)，酶解2h，酶解完成后升温至80°C灭酶处理30min。将过滤后的滤渣用82V的800mL去离子水回流1.5h，重复水提取1次，抽滤，合并三次滤液，共得抽滤液2.0L,抽率液浓缩至干粉，此干粉用去离子水350mL溶解,再用1.0mol/L盐酸调节pH值至2.5,该溶液中绿原酸浓度为6.0mg/mL,该溶液经大孔吸附树脂进一步分离纯化。首先，将HZ-818大孔树脂500mL装柱(柱直径为5.5cm，柱长为25cm)，按照厂家提供的方法进行酸碱预处理，取上述配置好的上样液400mL动态上样,洗脱流速为10mL/min,上样液完全吸附于树脂柱上后,继用去离子水800mL洗脱，上述洗脱液弃去，继用30%乙醇水2.4L洗脱并收集，将该部分洗脱液浓缩至200mL，室温(20°C )静置5h，析出沉淀，抽滤，滤渣干燥，得到绿原酸提取物，使用HPLC分析，经反相HPLC检测，采用面积归一化法测得绿原酸纯度> 90%。
【权利要求】
1.一种从金银花地上部分提取高纯度绿原酸的方法，其特征在于，按照如下步骤进行: (1)将干燥的金银花地上部分粉碎，得到金银花地上部分粗粉； (2)将步骤(1)中得到的金银花地上部分粗粉加入60-80%乙醇水溶液，按照Ikg粗粉加10-20L乙醇水溶液的比例加入，回流提取l_3h，减压抽滤，重复该操作，合并滤液，取该合并滤液总体积的7/8~4/5浓缩，浓缩比例为5:1~9:1，该浓缩液与原未浓缩部分溶液合并，室温放置4~12h，有墨绿色沉淀析出，抽滤除去沉淀，将该滤液进一步浓缩至干粉； 或将步骤(1)中得到的金银花地上部分粗粉中加入PH3-5的酸水，升温至40-50°C，加入纤维素酶4000-10000u/kg粗粉，酶解2-4h，然后加入酸性蛋白酶15000_25000u/kg粗粉，酶解2-4h，酶解完成后升温至70-100°C灭酶处理10-60min，抽滤，将过滤后的药渣用70-100°C的去离子水回流l_3h，重复操作I次，抽滤，合并三次滤液，将其浓缩至干粉； (3)将步骤(2)中的干粉用1.0-1.58￥的0.5-111101/1稀盐酸水溶液溶解，溶液中绿原酸含量调节为5.0-6.0mg/mL，为上样液，进行大孔吸附树脂柱层析，用去离子水作为洗脱液，去离子水洗脱体积2-3BV，继续用7-10BV的20-30%乙醇水溶液洗脱，合并20-30%乙醇洗脱溶液，浓缩，浓缩比例为6: 1-10: 1，静置4-12h后，有白色颗粒或粉末状物析出，为绿原酸成品。
2.根据权利要求1所述从金银花地上部分提取高纯度绿原酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，金银花地上部分为金银花的叶，藤茎，花，果实，中的一种或一种以上的组
3.根据 权利要求1所述所述从金银花地上部分提取高纯度绿原酸的方法，其特征在于，所述步骤(3)中大孔吸附树脂为AB-8树脂，HZ-818树脂，X-5树脂或Diaion HP-20树脂。
4.根据权利要求1所述所述从金银花地上部分提取高纯度绿原酸的方法，其特征在于，所述60-80%乙醇水溶液用0.5-lmol/L盐酸调pH2_5。
【文档编号】C07C67/48GK103787885SQ201410079889
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年3月6日 优先权日:2014年3月6日
【发明者】王彩芳, 潘宣, 张呈瑞 申请人:山东禾本堂生物科技有限公司