一种抗人Delta like4单克隆抗体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种抗人Delta?like4(hD114)单克隆抗体。本发明提供的单克隆抗体或其片段的特征在于：可以与hD114特异性结合；可以阻断D114对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的抑制；同时，可以在鸡胚尿囊膜模型中促进毛细血管的增殖。本发明具体地公开了抗人Delta?like4单克隆抗体的筛选、其制备方法。本发明同时还公开抗人Delta?like4单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列，包括对应于互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸和氨基酸序列。
【专利说明】—种抗人De I ta Ii ke4单克隆抗体
【技术领域】
[0001]本发明具体涉及生物【技术领域】,具体地说,本发明涉及一种新的抗人Delta like4单克隆抗体。
【背景技术】
[0002]自Folkman[1]于1971年提出的“肿瘤血管生成依赖学说”以来，抗肿瘤新生血管形成成为肿瘤治疗的重要策略之一。目前，通过阻断血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)及其主要受体VEGFR2来达到抑制肿瘤新生血管形成的目的M。但临床研究发现:多种肿瘤对VEGF及VEGFR2抑制剂有拮抗作用，不能有效抑制肿瘤的生长[3]。
[0003]Delta like ligand4 (D114)广泛存在于无脊椎及脊椎动物体内，通过与其受体Notch相互作用，激活Notch信号向细胞内传导，并调节下游靶基因的表达，从而参与生物体的生长、发育等生命过程。研究发现，D114 / Notch在肿瘤血管生成中发挥着重要的调节作用，抑制肿瘤组织中D114 / Notch信号传导，会导致肿瘤组织内生成大量无功能的新生血管，不能有效地为肿瘤组织提供氧气和营养物质，最终会导致肿瘤的生长受到抑制。并且，阻断肿瘤组织中D114 / Notch的信号传导，同样会抑制对VEGF抑制剂治拮抗的肿瘤组织的生长[4’5]，因此，抑制D114 / Notch的信号传导是抑制肿瘤生长的重要途径。
[0004]本发明利用杂交瘤技术，以重组人Delta like4 (rhD114)为抗原，免疫BALB / c小鼠，获得高亲和力和 生物学活性的抗人Delta like4(hD114)单克隆抗体。
[0005]参考文献:
[0006]1.Folkman J.Tumor angiogenesis !therapeutic implication.J InvestDermatol.1972，59:40-43.[0007]2.Hicklin DJ.Ellis LM.Role ofthe vascular endothelial growth factorpathway in tumor growth and angiogenesis.J clin Oncol.2005.23:1011-1027.[0008]3.Jain RKiDuda DGiClark JW，et al.Lessons from phase III clinical trialson ant1-VEGF therapy for cancer.Nat Clin Pract Oncol.2006,3:24-40.[0009]4.Ridgway J，Zhang G，Wu Y，et al.1nhibition of D114signalling inhibitstumour growth by deregulating angiogenesis.Nature.2006,444:1083-1087.[0010]5.Noguera-Troise I，Daly C，Papadopoulos NJ, et al.BlockadeofDl14inhibits tumor growth by promoting non-productive angiogenesis.Nature.2006,444:1032-1037.
【发明内容】
[0011]本发明提供一种具有潜在医学和药学价值的抗hD114单克隆抗体，及其相关蛋白质和核苷酸序列。为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案。
[0012]本发明提供一种抗hD114单克隆抗体，它包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，重链可变区具有SEQ ID NO:2，18，34，50，66和82所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO: 10，26，42，58，74和90所示的氨基酸序列。
[0013]本发明同时提供一种DNA分子，该DNA分子含有SEQ IDNO: 1，17，33，49，65和81所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及SEQ IDNO:9，25，41，57，73和89所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列。
[0014]本发明提供了抗hD114单克隆抗体的重链互补决定区⑶R1、⑶R2和⑶R3及轻链可变区⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸和核苷酸序列。
[0015]本发明提供制备上述单克隆抗体的制备方法。
[0016]本发明所提供的抗hD114单克隆抗体在体内外均能有效地发挥其生物学功能。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1.抗hD114单克隆抗体基因核酸电泳图，A:重链基因；B:轻链基因；
[0018]图2.抗hD114单克隆抗体腹水效价，P / N为rhD114组吸光值/ Control组吸光值，当P / N > 2时，ELISA结果为阳性；
[0019]图3.抗hD114单克隆抗体经纯化后SDS-PAGE图；
[0020]图4.SPR测定抗hD114单克隆抗体亲和力拟合曲线图；
[0021]图5.Western Bloting鉴定抗hD114单克隆抗体与rhD114的特异性结合；
[0022]图6.抗hD114单克隆抗体阻断Delta like4人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的抑制；
[0023]图7.抗hD114单克隆抗体促进鸡胚尿囊膜血管过度增殖。
【具体实施方式】
[0024]下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。
[0025]实施例1、抗hD114单克隆抗体的制备:
[0026](I)免疫小鼠
[0027]以重组人Delta like4 (rhD114)为免疫原，与quick antibody佐剂等体积混合，震荡混匀，肌肉注射免疫小鼠，每只小鼠注射100μ I。第21天按同样方式加强免疫一针。第35天按常规方法进行抗原冲击免疫。3天后，处死小鼠，取出脾脏。
[0028](2)细胞融合
[0029]对取出的脾脏，用常规方法制备脾脏单细胞悬液，并用台盼蓝方法检测细胞活性，确定细胞活性>90%。将脾脏细胞与SP2 / O小鼠骨髓瘤细胞5:1混合离心共沉淀，在37°C C水浴条件下，PEG(1450)进行细胞融合。融合时间3分钟后加入新鲜无血清培养基终止融合。离心沉淀后将细胞加入到含有20% FCSl XHATDMEM培养基96孔板中。每3天更换新鲜培养基I次，至长出克隆。
[0030](3)克隆筛选
[0031]第14天取出上清液，用间接ELISA法测定抗体表达情况。挑选阳性孔亚克隆，在常规条件下传代，并对阳性孔进行亚克隆，直至所挑选克隆为全部为阳性。
[0032]实施例2、抗hD114单克隆抗体可变区基因的扩增[0033]根据鼠抗体基因的保守性，采用以下引物以克隆抗hD114单克隆抗体的可变区序列:
[0034]扩增重链可变区5'端引物:
[0035]1.ctt ccg gaattc SAR GTN MAG CTG SAG SAG TC
[0036]2.ctt ccg gaattc SAR GTN MAG CTG SAG SAG TCff GG
[0037]扩增重链可变区3'端引物:
[0038]gga agatct CTT GAC CAG GCA TCC TAGAGT CA
[0039]扩增Kappa轻链可变区5'端引物:
[0040]gg gag ctc GAYATT GTG MTS ACM CAR WCT MCA[0041 ] 扩增Kappa轻链可变区3'端引物:
[0042]ggtgcatgc GGATACAGTTGG TGCAGCATC
[0043]上述引物中:R=A、G;Y=C、T ;M=A、C ;K=G、T ;S=C、G ;W=A、T ;V=A、C、G ;N=A、C、G。
[0044]采用Trizol总RNA抽提试剂盒，从获得的杂交瘤细胞株中抽提纯化总R N A，整个操作步骤按厂家提供说明书进行。
[0045]在1%琼脂糖电泳上对上述纯化的RNA进行质量鉴定后，按照逆转录试剂盒说明书进行反转录获得cDNA。
[0046]用上述引物和c D N A分别进行PCR扩增得到V L和V H片段。PCR反应条件如下:
[0047]反应体系:
【权利要求】
1.一种单克隆抗体,其特征在于: a.该抗体特异结合人Deltalike4配体； b.可以阻断Deltalike4对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的抑制； c.在鸡胚尿囊膜模型中，可促进血管的过度增殖； d.包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区具有SEQIDNO:2，或18，或34，或50，或66，或82所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO: 10，或26，或42，或58，或74，或90所示的氨基酸序列。
2.—种DNA分子，其特征在于:它编码权利要求1所示的单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，该DNA分子含有SEQID N0:1，或17，或33，或49，或65，或81所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及SEQID NO:9，或25，或41，或57，或73，或89所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体其特征在于: 所述的抗人Delta like4单克隆抗体，具有重链CDRl域，该域包含SEQ ID N0:4，或20，或36，或52，或68，或84的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体其特征在于: 所述的抗人Delta like4单克隆抗体，具有重链CDR2域，该域包含SEQ ID N0:6，或22，或38，或54，或70，或86的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体其特征在于: 所述的抗人Delta like4单克隆抗体，具有重链CDR3域，该域包含SEQ ID N0:8，或24，或40，或56，或72，或88的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体其特征在于: 所述的抗人Delta like4单克隆抗体，具有轻链CDRl域，该域包含SEQ ID NO: 12，或28，或44，或60，或76，或92的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体其特征在于: 所述的抗人Delta like4单克隆抗体，具有轻链CDR2域，该域包含SEQ ID NO: 14，或30，或46，或62，或78，或94的氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体其特征在于: 所述的抗人Delta like4单克隆抗体，具有轻链CDR3域，该域包含SEQ ID NO: 16，或32，或48，或64，或80，或96的氨基酸序列。
10.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，该DNA分子含有SEQID N0:3，或19，或35，或51，或67，或83所示的编码所述单克隆抗体重链⑶Rl域的核苷酸序列。
11.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，该DNA分子含有SEQID N0:5，或21，或37，或53，或69，或85所示的编码所述单克隆抗体重链⑶R2域的核苷酸序列。
12.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，该DNA分子含有SEQID NO:7，或23，或39，或55，或71，或87所示的编码所述单克隆抗体重链⑶R3域的核苷酸序列。
13.根据权利要 求2所述的DNA分子，其特征在于，该DNA分子含有SEQID N0:11，或27，或43，或59，或75，或91所示的编码所述单克隆抗体轻链⑶Rl域的核苷酸序列。
14.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，该DNA分子含有SEQID NO:13，或，29，或45，或61，或77，或93所示的编码所述单克隆抗体轻链⑶R2域的核苷酸序列。
15.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，该DNA分子含有SEQID NO:15，或31，或47，或63，或79，或95所示的编码所述单克隆抗体轻链⑶R3域的核苷酸序列。
16.权利要求1所述抗体在治疗人Deltalike4相关疾病的制剂中的应用。
17.权利要求2所示DNA分子在人DeltaIike4相关疾病的制剂中的应用。
18.权利要求1的抗体片段，选自单链抗体、Fab、单链Fv、双抗体和三抗体及抗体或抗体片段的偶联 物。
【文档编号】C07K16/18GK103804497SQ201410079857
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年3月6日 优先权日:2014年3月6日
【发明者】王旻, 王泽根, 涂孝洁, 金海珍, 厉道娟, 许卓斌, 张娟, 吴旻 申请人:中国药科大学