一种基于ndv血凝素蛋白单克隆抗体的胶体金免疫层析检测试纸条的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物工程领域，具体涉及了一种新制备的抗新城疫血凝素蛋白的杂交瘤细胞株，并利用该细胞株获得了对NDV具有广谱中和作用的单克隆抗体，并利用该抗体研制了快速检测新城疫病毒的免疫胶体金检测试纸条；采用本发明的试纸只需一步加样，5min就能判定结果，具有简单快速、特异敏感的特点，本试纸条的研制为新城疫的快速诊断提供了一种更加实用的工具和方法，适合基层兽医站和中小养殖场使用。
【专利说明】—种基于NDV血凝素蛋白单克隆抗体的胶体金免疫层析检测试纸条
【技术领域】
[0001]本发明涉及兽医生物制品领域的诊断试剂，具体提供了一种具有广谱中和活性的单抗隆抗体和以此为抗体建立的NDV胶体金免疫层析技术及试纸条。
【背景技术】
[0002]新城疫是由新城疫病毒引起的高度接触性、传染性疫病，可导致禽类的大量死亡或生产性能的急剧下降，给世界养禽业造成巨大的经济损失。国内外学者对新城疫的诊断方法进行了大量研究，传统的诊断方法包括病毒分离，ELISA、琼脂扩散实验、中和试验、血凝和血凝抑制试验等。近年来RT-PCR、荧光定量PCR、核酸诊断技术、限制性内切酶分析等分子生物学技术也广泛应用到ND的诊断上，但上述方法繁琐费时，需要一定的实验条件和实验人员及特殊的仪器设备，不方便在基层养殖场推广使用。
[0003]对于本领域而言，能够快速、准确诊断该病，对疫情监测，控制流行，减少养殖成本具有重要意义。而利用具有广谱中和作用的单克隆抗体来满足上述要求，在现有技术的基础上已经成为了可能，如何利用这一技术则成为现有技术亟待解决的问题。
【发明内容】
[0004]本发明针对现有新城疫病毒非诊断检测方法中存在的问题，利用新制备的抗新城疫血凝素蛋白的杂交瘤细胞株，获得了对NDV具有广谱中和作用的单克隆抗体，并利用该抗体研制了快速检测新城疫病毒的免疫胶体金检测试纸条。采用本发明的试纸只需一步加样，5m in就能判定结果，具有简单快速、特异敏感的特点，本试纸条的研制为新城疫的快速诊断提供了一种更加实用的工具和方法，适合基层兽医站和中小养殖场使用。
[0005]本发明的具体技术方案是:
[0006]发明人首先提供了一株全新的单克隆抗体杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株C3B3，同时进行了生物保藏，其保藏编号为:CCTCC NO:C2013174o
[0007]利用该杂交瘤细胞株，发明人进一步获得了对NDV具有广谱中和作用的单克隆抗体，具体步骤如下:
[0008]1.单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备
[0009]病毒的纯化:将NDV LaSota标准病毒接种9_10日龄鸡胚，收获死亡鸡胚的尿囊液，将尿囊液冻融I次，15000rpm/min离心Ih,收取上清再经30000rpm/min高速离心机离心2.5h,去上清,沉淀以PBS (pH7.4)悬浮，以鹿糖密度梯度离心35000rpm/min离心2min,收获纯化的NDV LaSota病毒；
[0010]以纯化的NDV LaSota病毒为免疫原，免疫6周龄~8周龄Balb/c小鼠6只，每次每只的免疫剂量为50ug，免疫方法为腹腔注射，一共免疫四次；每次免疫的间隔期为2周，首免用弗氏完全佐剂按体积比1:1的比例乳化蛋白，二免至四免用弗氏不完全佐剂按体积比1:1乳化蛋白；三次免疫一周后，小鼠眼眶采血测其效价，监测血清抗体效价；四免两周后，选择效价最高的小鼠，用不加佐剂的蛋白腹腔注射加强免疫一次，3d后取小鼠脾脏淋巴细胞与SP2/0细胞融合，置于37°C 5%C02培养箱培养；
[0011]5d~7d后用HT换出1/2HAT培养基，7d~IOd后用HT换出全部HAT ;采用间接ELISA和血凝抑制试验(HI实验)筛选均为阳性的克隆作为备选杂交瘤细胞株；
[0012]其中所述的ELISA法筛选具体是:将纯化后的病毒按10ug/mL包被ELISA板，将杂交瘤细胞分泌的单抗(即细胞培养物上清)与之结合，检测孔的OD值与阴性对照的OD值的比值大于等于2为阳性；
[0013]所述的血凝抑制实验的具体步骤为:吸取25 μ L ELISA检测阳性孔的营养液加入96孔V型板第一个孔中，然后以25 μ LPBS (ρΗ7.4)进行倍比稀释至第11孔，第12孔为PBS对照孔，加入4ΗΑ单位的LaSota原始标准病毒25 μ L，室温作用20min后加入1%鸡红细胞25 μ L，15-20min后判定结果，以不凝集鸡红细胞的最高稀释倍数为血凝抑制价； [0014]通过上述方法挑取ELISA阳性和有血凝抑制性的阳性克隆以有限稀释法亚克隆3次，最后挑选ELISA检测中OD值反应值较高的单克隆扩大培养并作为建株细胞，并对其进行生物保藏，保藏编号为=CCTCC NO:C2013174 ；
[0015]2、单抗腹水的制备
[0016]8周龄~10周龄Balb/c小鼠腹腔注射无菌液体石蜡油0.5mL/只，7d后腹腔注射处于对数生长期的阳性杂交瘤细胞50万/只；每天观察至小鼠腹部明显膨大，抽取腹水并离心后取上清，从而获得阳性杂交瘤细胞C3B3制备的单抗；
[0017]通过离心可以去除掉腹水中的脂肪和血细胞，进而可以从腹水中获得足量的单克隆抗体用于后续的鉴定和制备。
[0018]3、单抗特性鉴定
[0019]3.1单抗特异性鉴定用SPF鸡胚尿囊液，新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、黄病毒等包被96孔酶标板，采用常规间接ELISA鉴定，最终发现上步中获得的阳性杂交瘤细胞C3B3制备的单抗仅与NDV有特异性反应，与其他病毒无交叉反应；
[0020]3.2单抗间接ELISA效价测定
[0021]包被的NDV病毒的酶标板每孔分别加入上步中获得的单抗腹水，倍比稀释，最终获得阳性杂交瘤细胞C3B3制备的单抗C3B3的ELISA效价为2.56 X IO5 ；
[0022]3.3单抗的血凝抑制(HI)特性
[0023]首先以NDV LaSota, F48E8及其他不同NDV毒株为HI抗原，研究单抗的HI特性，结果表明C3B3与NDV标准毒株LaSota，F48E8和17个NDV分离毒在HI试验中反应均为阳性；
[0024]3.4单抗中和特性鉴定(采用细胞中和试验进行)单抗C3B3与NDV标准强毒性(F48E8)以及NDV参考株中和反应均为阳性，与HI试验结果一致；
[0025]上述涉及的毒株均为常见毒株，本发明中所采用的参考株菌来源于国家参考实验室;
[0026]4、单抗的纯化及效价测定
[0027]用辛酸-硫酸铵法粗提腹水上步中获得的单克隆抗体C3B3，纯化的单抗用Protein G柱子亲和层析法纯化，以SDS-PAGE检测提纯的单抗为两条带(见图1)，分别为轻链和重链，以血凝抑制实验检测提纯的单抗的效价为210。
[0028]通过上述鉴定可知纯化获得的单抗纯度高并具有较高的抗体效价及良好的生物学活性。
[0029]在获得了上述的单克隆抗体之后，发明人进一步的利用该抗体获得对应的胶体金试纸条，该试纸条的具体制备方法如下:
[0030]1.胶体金的制备 [0031]采用改良后的柠檬酸三钠还原方法制备不同直径的胶体金，具体步骤如下:(所涉及的均为重量百分比)
[0032]取0.01%氯金酸IOOmL置于锥形瓶内在恒温加热磁力搅拌器上加热，直至煮沸；
[0033]准确吸取2.0mL的1%柠檬酸三钠，迅速加入锥形瓶中，摇晃均匀后，立即放到恒温加热磁力搅拌器继续煮沸，转速控制在lOOr/min，直至金黄色的氯金酸变成红色后再煮15min后取出，冷却过滤，低温保存以保持胶体的状态。以该法制备的胶体金外观呈清亮透明的橙红色，无凝集的颗粒，在电镜下观察，直径约为30nm的胶体金颗粒，颗粒大小均匀、呈单一分散状态悬浮；
[0034]2胶体金颗粒与单抗C3B3最佳的标记量的确定
[0035]先将上述获得的胶体金溶液以0.2mol/L K2CO3调至pH=8.3，取若干小试管，加入ImL胶体金溶液；之后每个试管中加入不同体积的1.0mg/mL单抗C3B3的水溶液，5min后在上述各管内分别加入100 μ L10%氯化钠，混匀后静置2h ；
[0036]之后于4°C 2000r/min离心10min，取上清用紫外可见光分光光度计在可见光范围内(400-600nm)测定最大吸收波长、吸光值，以出现最大吸收峰时对应的蛋白质用量为最小保护剂量，在此基础上再加20%为稳定胶体金的抗体蛋白实际用量；最终发现当ImL胶体金中单克隆抗体添加量为30 μ g时，对应的吸收峰最大，在此基础上再加20%，即最适标记量为36 μ g/mL时,是单抗的最佳标记量；
[0037]3.单抗C3B3的胶体金标记及纯化
[0038]于50mL小烧杯中加入20mL步骤I中制备的胶体金，以0.lmol/L K2CO3溶液调整至pH为8.3，在电磁搅拌下，将720 μ L1.0mg/mL C3B3单抗水溶液加入到上述的胶体金溶液中，继续搅拌30min，加入浓度为10%的牛血清白蛋白(BSA)至终浓度为1%，作为稳定剂，继续搅拌30min，最终获得36 μ g/mL的金标抗体；
[0039]先将上述获得的20mL金标抗体用1500r/min低速离心Ih,取上清，再将上清以15000r/min4°C离心Ih,弃上清;将沉淀以0.02mol/L TBS ρΗ8.3溶解，重复离心2-3次，沉淀溶于ImL0.02mol/L TBS ρΗ8.3的TBS中，4°C保存备用；
[0040]4.检测带兔抗NDV IgG浓度的确定
[0041]将金标抗体浓度固定，以包被液(0.01MpH7.4PBS+0.01%Tween_20，Tween-20为体积百分比)将兔抗NDV IgG进行2倍倍比稀释，按不同的喷涂量标记于NC膜上，将玻璃纤维分别与上述几种NC膜粘贴于PVC底板上，制备试纸条，并用它们分别检测阳性与阴性参考样本；根据检测带显色深度与显色时间确定检测带抗体使用最佳喷涂浓度是0.8mg/ml,喷涂量为lul/cm ；
[0042]5.质控带羊抗鼠IgG抗体浓度的确定
[0043]将金标抗体和检测带喷涂浓度固定，加于NC膜上的质控带羊抗豚鼠IgG抗体用包被液(同步骤4所用包被液)依次作2倍倍比稀释后，喷涂于NC膜上，将玻璃纤维分别与上述几种NC膜粘贴于PVC底板上，制备试纸条初品，检测阳性参考样本，根据检测带与质控带的显色情况确定质控带羊抗豚鼠IgG抗体的喷涂浓度为lmg/ml,喷涂量为lul/cm;
[0044]6.试纸条的组装与结果判定
[0045]首先将样品垫(玻璃纤维素膜GF33)和金标结合垫(玻璃纤维素膜GF33)用预处理液(20mMpH8.5Tris-HCl+l%Tween_20)处理，于 37°C温箱中干燥；
[0046]用点膜仪将步骤3制备好的金标抗体用喷金工作稀释液(IOmMpH7.4PB+l%BSA+20%sucrose)稀释10倍喷涂于玻璃纤维上，喷涂量为2ul/cm，立即放入冷冻真空干燥机中抽干；
[0047]在硝酸纤维素膜(NCM-HF240)上喷涂检测线和质控线，检测线喷涂兔抗NDV抗体，浓度为0.8mg/ml，喷涂量为lul/cm ;质控线喷涂羊抗鼠IgG，浓度为lmg/ml，喷涂量为lul/cm,检测线和质控线间隔5mm, 37°C温箱中干燥30min后取出；
[0048]最后将样品垫、胶体金垫、NC膜和吸收垫依次粘贴在PVC底板上，即成检测试纸条；(具体结构见图4);所述的试纸条包括PVC底衬，PVC底衬上自左向右分别设置有样品垫，胶体金垫，NC膜和吸收垫，其中NC膜中部自左向右分别设置有一条检测线和一条控制线，NC膜左侧上表面粘贴有涂覆金标抗体的胶体金垫，NC膜右侧表面粘贴有吸收垫；胶体金垫左侧上表面 粘贴有样品垫；
[0049]所述胶体金垫上涂覆的为基于NDV血凝素蛋白单克隆抗体C3B3。
[0050]结果判定标准:当试纸条的质控线和检测线同时出现肉眼可见的紫红色条带，结果判为阳性；若仅在质控线出现而检测线不出现紫红色条带，则结果判为阴性；两条线均不出现则判为检测试纸条失效。
[0051]上述获得的胶体金试纸条的性能测试结果如下:
[0052]I敏感性将标准的NDV和含有病毒的尿囊液做倍比稀释，一直稀释到1:2n，同时用其他国产NDV免疫胶体金检测试纸条作检测，敏感性结果如图2，可见本发明胶体金试纸条在血凝价1:21°以上均能检测到。其他国产试纸条作平行对比实验结果在1:27_8能检测到。
[0053]2特异性将AIV、IBV、IBDV、MDV、DPV、DHV等病毒，分别滴加在试纸条上，每种病毒检测5份，结果均显示阴性。
[0054]3重复性用不同批次试纸条检测ND阳性和阴性尿囊液，每个样品重复检测10次，结果显示:阳性符合率为98.3%,阴性符合率为100% (表2)。
[0055]表2重复性检测结果
[0056]
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[0057]5.5.4稳定性将试纸条密封干燥保存在室温下，每隔一周检测上述检测样品，试纸条在半年内，其检测结果与以前检测样品的符合率为100%。[0058]可见，通过本发明所获得的杂交瘤细胞获得的单抗C3B3，具有广谱中和作用的单克隆抗体，并利用该抗体研制了快速检测新城疫病毒的免疫胶体金检测试纸条，采用这种试纸只需一步加样，5m in就能判定结果,具有简单快速、特异敏感的特点，本试纸条的研制为新城疫的快速诊断提供了一种更加实用的工具和方法，适合基层兽医站和中小养殖场使用。
[0059]发明人对本发明所公开的重组的单克隆抗体杂交瘤细胞进行了生物保藏，具体保藏信息如下:
[0060]保藏信息
[0061]保藏时间:2013年12月25日 [0062]保减单位名称:中国典型培养物保减中心
[0063]保藏编号:CCTCCNO:C2013174
[0064]保藏单位地址:武汉大学中国典型培养物保藏中心
[0065]分类命名:杂交瘤细胞株C3B3
【专利附图】
【附图说明】
[0066]图1为SDS-PAGE检测纯化的C3B3单抗电泳示意图:
[0067]图中最左边泳道为蛋白分子量Marker，1、2、3泳道为不同上样量的纯化单抗蛋白；从图中可知单抗纯度较高，经PAGE电泳后呈现2条单一条带，分子量分别约为25KD、50KD，分别代表纯化单抗的轻链和重链；
[0068]图2为本发明所述试纸条敏感性试验结果灰度图；
[0069]图中的数字分别代表被检病毒以1:21，1:22，…1:211进行稀释，C线代表质控先，T线代表检测线，从图中可知病毒稀释到1:21°仍可检测到；
[0070]图3为实验例I中临床样品的部分检测结果灰度图；
[0071]图中所示实验例I中37个临床样品为采集的棉拭子样品经PBS简单处理后直接滴加到试纸条上呈现的检测结果；
[0072]图4为本发明所述试纸条的结构示意图，
[0073]图中I为样品垫，2为胶体金垫，3为检测线，4控制线，5为吸收垫，6为PVC底衬，7为NC膜。
【具体实施方式】
[0074]实施例1单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备
[0075]病毒的纯化:将NDV LaSota标准病毒接种9_10日龄鸡胚，收获死亡鸡胚的尿囊液，将尿囊液冻融I次，15000rpm/min离心Ih,收取上清再经30000rpm/min高速离心机离心2.5h,去上清,沉淀以PBS (pH7.4)悬浮，以鹿糖密度梯度离心35000rpm/min离心2min,收获纯化的NDV LaSota病毒；
[0076]以纯化的NDV LaSota病毒为免疫原，免疫6周龄~8周龄Balb/c小鼠6只，每次每只的免疫剂量为50ug，免疫方法为腹腔注射，一共免疫四次；每次免疫的间隔期为2周，首免用弗氏完全佐剂按体积比1:1的比例乳化蛋白，二免至四免用弗氏不完全佐剂按体积比1:1乳化蛋白；三次免疫一周后，小鼠眼眶采血测其效价，监测血清抗体效价；四免两周后，选择效价最高的小鼠，用不加佐剂的蛋白腹腔注射加强免疫一次，3d后取小鼠脾脏淋巴细胞与SP2/0细胞融合，置于37°C 5%C02培养箱培养；
[0077]5d~7d后用HT换出1/2HAT培养基，7d~IOd后用HT换出全部HAT ;采用间接ELISA和血凝抑制试验(HI实验)筛选均为阳性的克隆作为备选杂交瘤细胞株；
[0078]其中所述的ELISA法筛选具体是:将纯化后的病毒按10ug/mL包被ELISA板，将杂交瘤细胞分泌的单抗(即细胞培养物上清)与之结合，检测孔的OD值与阴性对照的OD值的比值大于等于2为阳性；
[0079]所述的血凝抑制实验的具体步骤为:吸取25 μ L ELISA检测阳性孔的营养液加入96孔V型板第一个孔中，然后以25 μ LPBS (ρΗ7.4)进行倍比稀释至第11孔，第12孔为PBS对照孔，加入4ΗΑ单位的LaSota原始标准病毒25 μ L，室温作用20min后加入1%鸡红细胞25 μ L，15-20min后判定结果，以不凝集鸡红细胞的最高稀释倍数为血凝抑制价；
[0080]通过上述方法挑取ELISA阳性和有血凝抑制性的阳性克隆以有限稀释法亚克隆3次，最后挑选ELISA检测中OD值反应值较高的单克隆扩大培养并作为建株细胞，并对其进行生物保藏，保藏编号为=CCTCC NO:C2013174 ；
[0081]实施例2单抗的获得和鉴定纯化
[0082]1、单抗腹水的制备
[0083]8周龄~10周龄Balb/c小鼠腹腔注射无菌液体石蜡油0.5mL/只，7d后腹腔注射处于对数生长期的阳性杂交瘤细胞50万/只；每天观察至小鼠腹部明显膨大，抽取腹水并离心后取上清，从而获得阳性杂交瘤细胞C3B3制备的单抗；
[0084]通过离心可以去除掉腹水中的脂肪和血细胞，进而可以从腹水中获得足量的单克隆抗体用于后续的鉴定和制备；
[0085]2、单抗特性鉴定
[0086]2.1单抗特异性鉴定用SPF鸡胚尿囊液，新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、黄病毒等包被96孔酶标板，采用常规间接ELISA鉴定，最终发现上步中获得的阳性杂交瘤细胞C3B3制备的单抗仅与NDV有特异性反应，与其他病毒无交叉反应；
[0087]2.2单抗间接ELISA效价测定
[0088]包被的NDV病毒的酶标板每孔分别加入上步中获得的单抗腹水，倍比稀释，最终获得阳性杂交瘤细胞C3B3制备的单抗C3B3的ELISA效价为2.56 X IO5 ；
[0089]2.3单抗的血凝抑制(HI)特性
[0090]首先以NDV LaSota, F48E8及其他不同NDV毒株为HI抗原，研究单抗的HI特性，结果表明C3B3与NDV标准毒株LaSota，F48E8和17个NDV分离毒在HI试验中反应均为阳性(如表1所示)。
[0091]2.4单抗中和特性鉴定(采用细胞中和试验进行)
[0092]单抗C3B3与NDV标准强毒性(F48E8)以及NDV参考株中和反应均为阳性，与HI试验结果一致(如表1所示)。
[0093]表1单抗C3B3与NDV不同毒株在HI和中和试验中的反应性
[0094]
【权利要求】
1.一株抗新城疫血凝素蛋白杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株C3B3，其保藏编号为:CCTCC NO:C2013174o
2.一种基于NDV血凝素蛋白单克隆抗体C3B3，其是由保藏编号为:CCTCC NO:C2013174的杂交瘤细胞株获得的。
3.一种基于NDV血凝素蛋白单克隆抗体的胶体金免疫层析检测试纸条，包括PVC底衬(6)，其特征在于:PVC底衬(6)上自左向右分别设置有样品垫(1)，胶体金垫(2)，NC膜(7)和吸收垫(5)，其中NC膜(7)中部自左向右分别设置有一条检测线(3)和一条控制线(4)，NC膜(7)左侧上表面粘贴有涂覆金标抗体的胶体金垫(2)，NC膜(7)右侧表面粘贴有吸收垫(5);胶体金垫(2)左侧上表面粘贴有样品垫(1)； 所述胶体金垫(2)上涂覆的为基于NDV血凝素蛋白单克隆抗体C3B3。
【文档编号】C07K16/10GK103937751SQ201410145689
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月11日 优先权日:2014年4月11日
【发明者】杨少华, 许传田, 胡北侠, 张琳, 黄庆华, 伊惠, 张秀美 申请人:山东省农业科学院畜牧兽医研究所