一种微囊藻毒素的提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种微囊藻毒素的提取方法，以天然水华的新鲜蓝藻为原料，经乙醇粗提萃取，再经二次过大孔吸附树脂柱分离纯化出MCs。本发明的方法提纯MCs具有成本低、操作安全、直观简便等优点。
【专利说明】一种微囊藻毒素的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生化分离的【技术领域】，具体地说，涉及一种微囊藻毒素的提取方法。
【背景技术】
[0002]近年来，由水体富营养化导致的蓝藻水华污染已引起全球关注。蓝藻水华污染所带来的主要危害是有毒蓝藻向水体中释放多种不同类型的微囊藻毒素(m1-crocystis，MCs)，其中微囊藻毒素MC-LR和MC-RR是我国富营养化水体中最主要的两种藻毒素，。MCs是一种公认的肝毒素和促癌剂，长期饮用含有MCs的水会对人的肝脏造成损伤，极端情况下会危及到人的生命。
[0003]随着水华污染问题的深入研究，MCs在环境中的分布、迁移、积累和归宿等环境行为，以及在环境污染治理方面受到环保工作者的特别关注。到目前为止，对MCs的分布、结构鉴定、含量检测、毒性评价以及毒性机理等方面已做了大量工作，但MCs纯品的缺少成为困扰研究人员对MCs进行深入研究的瓶颈问题之一，因此迫切需要研究一种有效提取、纯化MCs的方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种以水华新鲜蓝藻为原料，通过萃取和大孔树脂层析提取微囊藻毒素，方法简单，操作简便，成本低廉。
[0005]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
一种微囊藻毒素的提取方法，包括以下步骤:
步骤一:以天然水华的新鲜蓝藻为原料，体积比为65-75%的甲醇溶液为提取剂，磁力搅拌1.5-2小时，超声20-30分钟后，离心，取出上清液；
步骤二:将滤渣重复上面的步骤，合并两次的上清液，去除残渣；
步骤三:将粗提取液调节PH为7.5-8后过滤，在35-40°C的温度下蒸出甲醇；
步骤四:将浓缩的粗提液通过0.45 μ m的微滤膜，即得微囊藻毒素粗品；
步骤五:调节微囊藻毒素粗品的PH值为3-4，将粗品液过DlOl大孔吸附树脂柱，流速为3mL/ min,再用体积分数为45%的乙醇洗脱；
步骤六:收集洗脱液，蒸发出乙醇后，再调节PH值为3-4，过DlOl大孔吸附树脂柱，流速为3mL/ min,再用体积分数为55%的乙醇洗脱；
步骤七:在6.892min时收集MC-RR峰，15.282min收集MC-LR收集完后，分别收集得到的MC-RR和MC-LR洗脱液，用旋转蒸发仪蒸干，再加入乙醇溶解；
步骤八:将得到的MC-RR和MC-LR乙醇溶液，蒸干溶剂，即得产品。
[0006]更进一步地，步骤一中的蓝藻与甲醇溶液的体积比为1:10-1:20。
[0007]更进一步地,步骤一中的磁力搅拌的转速为:2 000 r/min-2500 r/min。
[0008]更进一步地,步骤一中的离心的条件为:转速10000r/min-20000r/min,时间5-10分钟。[0009]有益效果:
本发明方法的技术方案中，原料采用的自然环境水华发生时产生的蓝藻，藻粉处理过程简单，原料成本可以忽略不计，操作过程中采用的操作相对简单，藻粉的预处理对实验人员要求较低；
用传统的反相C18填料作为固相萃取相分离纯化M C s，虽然可以得到纯度较高的MCs，但因为上柱量和流速的限制无法得到大量提纯的MCs供使用，经过2次大孔吸附树脂纯化后的MCs，虽然纯度在70%~85%之间，但可以获得大量的MCs，从而满足MCs的各种环境化学行为实验的需要；
由于提纯量大，相比较甲醇，采用不同浓度乙醇作为洗脱液在具体操作中更加安全、方便；本发明的方法提纯MCs具有成本低、操作安全、直观简便等优点。
【具体实施方式】
[0010]下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例
[0011]一种微囊藻毒素的提取方法，包括以下步骤:
步骤一:以天然水华的新鲜蓝藻为原料，体积比为65-75%的甲醇溶液为提取剂，磁力搅拌1.5-2小时，超声20-30分钟后，离心，取出上清液； 步骤二:将滤渣重复上面的步骤，合并两次的上清液，去除残渣；
步骤三:将粗提取液调节PH为7.5-8后过滤，在35-40°C的温度下蒸出甲醇；
步骤四:将浓缩的粗提液通过0.45 μ m的微滤膜，即得微囊藻毒素粗品；
步骤五:调节微囊藻毒素粗品的PH值为3-4，将粗品液过DlOl大孔吸附树脂柱，流速为3mL/ min,再用体积分数为45%的乙醇洗脱；
步骤六:收集洗脱液，蒸发出乙醇后，再调节PH值为3-4，过DlOl大孔吸附树脂柱，流速为3mL/ min,再用体积分数为55%的乙醇洗脱；
步骤七:在6.892min时收集MC-RR峰，15.282min收集MC-LR收集完后，分别收集得到的MC-RR和MC-LR洗脱液，用旋转蒸发仪蒸干，再加入乙醇溶解；
步骤八:将得到的MC-RR和MC-LR乙醇溶液，蒸干溶剂，即得产品。
[0012]更进一步地，步骤一中的蓝藻与甲醇溶液的体积比为1:10-1:20。
[0013]更进一步地,步骤一中的磁力搅拌的转速为:2 000 r/min-2500 r/min。
[0014]更进一步地,步骤一中的离心的条件为:转速10000r/min-20000r/min,时间5-10分钟。
【权利要求】
1.一种微囊藻毒素的提取方法，其特征在于:包括以下步骤: 步骤一:以天然水华的新鲜蓝藻为原料，体积比为65-75%的乙醇溶液为提取剂，磁力搅拌1.5-2小时，超声20-30分钟后，离心，取出上清液； 步骤二:将滤渣重复上面的步骤，合并两次的上清液，去除残渣； 步骤三:将粗提取液调节PH为7.5-8后过滤，在35-40°C的温度下蒸出甲醇； 步骤四:将浓缩的粗提液通过0.45 μ m的微滤膜，即得微囊藻毒素粗品； 步骤五:调节微囊藻毒素粗品的PH值为3-4，将粗品液过DlOl大孔吸附树脂柱，流速为3mL/ min,再用体积分数为45%的乙醇洗脱； 步骤六:收集洗脱液，蒸发出乙醇后，再调节PH值为3-4，过DlOl大孔吸附树脂柱，流速为3mL/ min,再用体积分数为55%的乙醇洗脱； 步骤七:在6.892min时收集MC-RR峰，15.282min收集MC-LR收集完后，分别收集得到的MC-RR和MC-LR洗脱液，用旋转蒸发仪蒸干，再加入乙醇溶解； 步骤八:将得到的MC-RR和MC-LR乙醇溶液，蒸干溶剂，即得产品。
2.如权利要求1所述的一种微囊藻毒素的提取方法，其特征在于:步骤一中的蓝藻与乙醇溶液的体积比为1:10-1:20。
3.如权利要求1所述的一种微囊藻毒素的提取方法，其特征在于:步骤一中的磁力搅拌的转速为:2 000 r/min -2500 r/min。
4.如权利要求1所述的一种微囊藻毒素的提取方法，其特征在于:步骤一中的离心的条件为:转速 10000r/min-20000r/min，时间 5-10 分钟。
【文档编号】C07K1/14GK104017059SQ201410274127
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月19日 优先权日:2014年6月19日
【发明者】闻献 申请人:南京麦思德餐饮管理有限公司