一种基因治疗用载体蛋白及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明提供一种基因治疗用载体蛋白及其制备方法和用途，提供了人源H467-103作为DNA结合结构域，用于构建基因载体的用途，同时本载体利用人源组蛋白H4的部分DNA结合域（H467-103）作为携带治疗基因的核心区域，同时融合与特定细胞结合的识别区域、多种促进细胞转染的功能区域、核定位信号区等功能片段，产生一种新型的用于基因治疗的载体蛋白。这种载体蛋白能有效的携带治疗基因入肿瘤细胞，对正常细胞无毒性作用。与常规病毒与化学合成类载体相比，具有制备工艺简单、安全、无毒、易清除、靶向性好等优势。
【专利说明】一种基因治疗用载体蛋白及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明提供一种基因治疗用载体蛋白及其制备方法，是可以与治疗性基因表达质粒结合的蛋白，作为基因治疗用载体蛋白。同时还公开了该蛋白的制备方法，并应用此蛋白对多种肿瘤细胞进行效应研究，属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]目前用于基因治疗载体主要有两大类，即病毒衍生载体和非病毒载体。
[0003]病毒载体转染效率高，但是存在整合入人体基因组的危险及机体免疫反应，广泛应用于临床还需解决这些危险问题。
[0004]非病毒载体主要包括化学聚合物衍生载体和蛋白/多肽类衍生载体。目前化学聚合物衍生载体转染效率与病毒载体相当，但是免疫原性强，机体不易降解与清除，靶向性差，限制其应用。
[0005]蛋白/多肽类载体可分成天然蛋白类与合成蛋白类。合成蛋白类载体包括多聚精氨酸、多聚组氨酸等，依靠其所带正电荷与DNA结合，携带其进入细胞。这类蛋白/多肽类载体因其具有较强的免疫原性，不适于应用于临床。另外一类源于生物体表达的天然蛋白，他们通过特定空间结构与DNA结合，携带这些DNA进入细胞后，载体蛋白随着蛋白质体内降解途径被机体降解为氨基酸后，为机体所再利用，既无细胞毒性。如果这些蛋白为生物体内高度保守的蛋白，则免疫原性低，不引起免疫反应，也不易在血浆中降解，有利于维持血浆中的浓度。再者，蛋白/多肽类载体易与功能性多肽融合而获得诸如靶向性等优点。蛋白/多肽类载体的低毒性、低免疫原性、易获得靶向性、开发及制备成本低等优点成为基因载体的研究热点。
[0006]目前天然的蛋白/多肽类载体多采用组蛋白H1、组蛋白H2A、鱼精蛋白等高度保守的DNA结合蛋白为核心构件，融合促进转染的功能结构域，制备成融合蛋白。但是这些蛋白与合成蛋白类载体相比体积较大，又具有多个非DNA结合结构域，诸如与蛋白分子结合的结构域，使得载体蛋白之间易于相互结合，形成聚合物，是导致转染效率不高的原因之一。再者，蛋白/多肽类载体的跨膜及运输作用机制，尚不十分明确，需要制备多种不同种类的蛋白/多肽类载体，并加以研究，获得大量实验数据，进而阐明载体蛋白转运的作用机制。况且蛋白分子中的非DNA结合结构域的存在，在细胞内表现出与多种蛋白/因子结合，使得机制研究变得更加复杂，将单一 DNA结合结构域与多种转染相关功能结构域融合，是研究蛋白/多肽类载体特定结构域功能的有效途径，为蛋白转染机制的研究提供丰富的材料与数据。
[0007]本 发明采用人源组蛋白H4中一个DNA结合结构域(Μ67,)作为蛋白/多肽载体的核心结构，该结构在生物体中保守性极高，从植物中获取基因，略加改造就获得与人完全一致的蛋白序列。该结构维持其天然的构象，既可以有效结合DNA，免疫原性又低，是个理想的用于基因载体构建的元件。将Η467_1(ι3与多种已知的促进转染的功能结构域相融合，即可构建出低毒的基因转运蛋白。[0008]
【发明内容】
:
本发明提供一种人源H467_1(i3多肽，作为DNA结合结构域用于构建基因转运载体。
[0009]本发明进一步提供H467_1(i3多肽基因的获取方法。
[0010]本发明进一步提供载体蛋白，具有与质粒DNA结合，具有将质粒运输到肿瘤细胞的特征。
[0011]本发明进一步提供了上述载体蛋全长基因的获取方法。
[0012]本发明进一步提供了载体蛋白的原核表达质粒构建、载体蛋白原核表达、纯化及功能验证等详细方法。
[0013]本发明提供的人源H467_1(i3多肽作为DNA结合结构域用于构建基因转运载体的用途，
其中，所述的人源Η467_1(ι3多肽的氨基酸序列如下:SEQ n0.1。
[0014]本发明所述的人源Hf3多肽的基因的获取方法，包括以下步骤: 1)提取全小麦基因组；
2)以小麦全基因组为模板设计引物，在引物中替换个别核苷酸，使得所扩增的产物所编码的氨基酸序列与人源氨基酸序列一致；并在上游引物上添加酶切位点，用于原核表达载体构建；
所用引物为:
上游引物:
ATGGCTAGCA TCCGCGACGC CGTCACCTAC ACCGAGCACG CCAAGCGCAA GACCGTC ；
下游引物:
ACGTGAATTCTTAGCCGCCGAAGCCGTAG ；
以小麦全基因组为模板，上述两条引物，PCR法扩增得到人源Η467_1(ι3多肽基因序列，图1所示，P为Η467_1(ι3多肽基因的PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳结果，经测序完全正确。
[0015]本发明提供的一种载体蛋白，其特征在于:
是以Μ67,3多肽为DNA结合结构域、融合多种功能多肽的基因载体蛋白，具有与质粒DNA结合并且将质粒运输到肿瘤细胞的特征；
载体蛋白序列由以下几部分构成:Ν端起始为HiS6-H467_1(l3-NLS-Tat-AHNP ；
其氨基酸序列如下:
SEQ n0.2o
[0016]本发明所述载体蛋白的基因获取方法，具体步骤如下:
I)引物设计
上游引物:
ATGGCTAGCA TCCGCGACGC CGTCACCTAC ACCGAGCACG CCAAGCGCAA GACCGTC ；
下游引物为两条长引物 下游引物1:
TTCCTGCCAT ATGAACCGCC TCCACCTGGT TTCTTCTTTG GCTGGGGGCC GCCGAAGCCG ；
下游引物2:
CCGCAAGCTT TTAGTACCAC GGCGAGACGG TGAGTCTTCG TCGCTGTCTC CGCTTCTTCCTGCCATATGA ACC ；2)以人源H467_1(i3多肽PCR扩增产物为模板(图2第四泳道所示)，用上游引物和第一条下游引物组合，PCR扩增出部分载体蛋白基因序列(图2第一泳道所示)；
再以该PCR产物为模板，通过上游引物和第二条下游引物扩增出载体蛋白基因全长(图2第二泳道所示)，图2为2%琼脂糖凝胶电泳结果所示本发明载体蛋白基因全长的获取过程。
[0017]本发明所述载体蛋白的制备方法，包括以下步骤:
O原核表达质粒构建；
载体蛋白全长基因PCR扩增产物双酶切(Me I和Λ?/^ΙΙΙ)后，凝胶回收双酶切产物； pET28a表达质粒双酶切(Me I和Hind III)后，凝胶回收大片段；
将上述两个回收片段连接，获得将载体蛋白全长基因构建入pET28a表达载体中的重组质粒，既载体蛋白原核表达质粒；
2)载体蛋白原核表达
将步骤I)的载体蛋白原核表达质粒导入到BL21 (DE3)原核表达菌体系，37°C终浓度
0.1 mM IPTG诱导表达载体蛋白；
3)载体蛋白原核表达产物纯化
变性条件下，Ni亲 和层析一步法纯化步骤2)获得的载体蛋白，透析后分装冻存即得。
[0018]4)载体蛋白功能验证
4.1)应用凝胶阻滞实验证实载体蛋白可有效结合质粒DNA。
[0019]图4所示,该基因载体蛋白所带正电荷(pH 7.4条件下)与DNA所带负电荷(核苷酸个数)数量之比(P/N)为2:1时，DNA被完全阻滞。并应用动态光散射技术，对本发明的载体蛋白与DNA结合复合物的极性进行检测，图4所示，在P/N为2:1时，复合物所带净电荷由负电荷转至正电荷。
[0020]4.2)本发明所述载体蛋白转染功能检测。
[0021]在P/N比为2:1条件下，将载体蛋白与质粒DNA室温条件下结合成稳定复合物，转染肿瘤细胞。成功的将绿色荧光(EGFP )质粒和荧光素酶(Luc )质粒转染入MCF-7和SK-0V-3肿瘤细胞系中。
[0022]图6为本发明所述载体蛋白转染表达绿色荧光蛋白基因质粒；
图7为本发明所述载体蛋白转染表达萤光素酶基因质粒。
[0023]以上实验证实本发明载体可有效将外源质粒DNA转染至肿瘤细胞，并表达质粒所携带的特定蛋白。
[0024]本发明的积极效果在于:提供了人源Η467_1(ι3作为DNA结合结构域，用于构建基因载体的用途，同时本载体利用人源组蛋白H4的部分DNA结合域(H467_1ci3)作为携带治疗基因的核心区域，同时融合与特定细胞结合的识别区域、多种促进细胞转染的功能区域、核定位信号区等功能片段，产生一种新型的用于基因治疗的载体蛋白。这种载体蛋白能有效的携带治疗基因入肿瘤细胞，对正常细胞无毒性作用。与常规病毒与化学合成类载体相比，具有制备工艺简单、安全、无毒、易清除、靶向性好等优势。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为本发明所述组蛋白H4 DNA结合结构域Μ67,3多肽基因片段的调取图(2%琼脂糖凝胶电泳);
图2为本发明所述载体蛋白全长基因的获取图(2%琼脂糖凝胶电泳)；
图3为本发明所述载体蛋白的Ni亲和层析纯化结果图(15% SDS-PAGE电泳图)；
图4为本发明所述载体蛋白与DNA的结合能力实验结果图(凝胶阻滞实验)；
图5为本发明所述载体蛋白与DNA在P/N=2时所形成复合物的表面电荷性质图(动态光散射)；
图6为本发明所述载体蛋白转染表达绿色荧光蛋白基因质粒结果图(荧光显微镜)；
图7为本发明所述载体蛋白转染表达萤光素酶基因质粒结果统计图(分光光度法)。
【具体实施方式】
[0026]通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明。下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容,但本发明的内容并不局限于此。
[0027]实施例1
人源Η467_1(ι3多肽基因的获取。
[0028]具体过程如下: I)检索人组蛋白H467_1CI3。(来源于NCBI核酸数据库)，并加以对比
1.1)人源 H4 (6H°3)多肽基因序列(来源 GenBank: BC075806.1)
I ATCCGTGACG CGGTGACTTA CACGGAGCAC GCCAAGCGCA AGACCGTCAC GGCCATGGAT
61 GTGGTGTACG CGCTGAAACG CCAGGGTCGC ACCCTTTATG GTTTCGGCGG TTGA ；
小麦H4 (67,3)多肽基因序列(来源GenBank: X00043.1)
I ATCCGCGATG CCGTCACCTA CACCGAGCAC GCCCGCCGCA AGACCGTCAC CGCCATGGAC
61 GTCGTCTACG CGCTCAAGCG CCAGGGCCGC ACCCTCTACG GCTTCGGCGG CTAA ；
1.2)组蛋白Hf3蛋白序列 人:IRDAVTYTEH AKRKTVTAMD VVYALKRQGR TLYGFGG*
小麦:IRDAVTYTEH ARRKTVTAMD VVYALKRQGR TLYGFGG*
组蛋白H467_1(i3为螺旋-转角-螺旋结构，是H4组蛋白中与DNA结合的结构域，各种生物的保守性较高，该结构可以结合在DNA大沟，并压缩DNA，因其分子小、并保留结合DNA的天然构象、物种间保守性强等特点，可以作为基因载体中理想的DNA结合工具。
[0029]2)引物设计；
以小麦全基因组为模板，设计引物，在引物中替换个别核苷酸，使得所扩增的产物所编码的氨基酸序列与人源一致。并在上游引物上添加酶切位点GVAe I)，用于原核表达载体构建。
[0030]所用引物为:
上游引物:
ATGGCTAGCA TCCGCGACGC CGTCACCTAC ACCGAGCACG CCAAGCGCAA GACCGTC ；
下游引物:
ACGTGAATTCTTAGCCGCCGAAGCCGTAG ；
3)PCR法获得人源H467_1(i3多肽基因序列。
[0031]以小麦全基因组为模板，应用上述两条引物，扩增得到人源H467_1(i3多肽基因序列。[0032]PCR反应条件:
U96°C 3 min
2,95°C I min ； 58°C 30 s ； 72°C I min ； 30 cycles
3、72°C 10 min
4>4°C store
图1为本发明所述组蛋白H4 DNA结合结构域Μ67—103多肽基因片段的调取图。P为Μ67,3多肽基因的PCR产物凝胶电泳结果，经测序完全正确。
[0033]实施例2
载体蛋白基因获取方法:
是以人源Μ67,3多肽为DNA结合结构域、融合多种功能多肽的基因载体蛋白，具有与质粒DNA结合并且将质粒运输到肿瘤细胞的特征。本发明载体蛋白序列由以下几部分构成=N端起始为His6 (纯化用标签)-H467^103 (DNA结合核心区)-NLS (PQPKKKP，核定位信号)-Tat (YGRKKRRQRRR，跨膜结构域)-AHNP (LTVSPWY，拟 Her2 受体结合肽)。
[0034]具体步骤如下:
1)引物设计。
[0035]设计两条下游引物，第一条下游引物包括H467_1(i3多肽C端部分基因序列、NLS基因序列及部分Tat基因序 列。第二条引物包括Tat基因序列、AHNP基因序列及酶切位点(MindIII)。
[0036]上游引物:
ATGGCTAGCA TCCGCGACGC CGTCACCTAC ACCGAGCACG CCAAGCGCAA GACCGTC ；
下游引物为两条长引物 下游引物 I (Primer down I):
TTCCTGCCAT ATGAACCGCC TCCACCTGGT TTCTTCTTTG GCTGGGGGCC GCCGAAGCCG ；
下游引物 2 (Primer down 2):
CCGCAAGCTT TTAGTACCAC GGCGAGACGG TGAGTCTTCG TCGCTGTCTC CGCTTCTTCCTGCCATATGA ACC ；
2)以人源H467_1(i3多肽PCR扩增产物为模板，引物延长PCR法扩增出载体蛋白全长基因序列。
[0037]图2 2%琼脂糖凝胶电泳结果所示本发明载体蛋白基因全长的获取过程。
[0038]2.1)以H467_1(i3多肽的PCR产物(图2第四泳道所示)为模板为，用上游引物和第一条下游引物组合，PCR扩增出部分载体蛋白基因序列(图2第一泳道所示)。
[0039]2.2)再以该PCR产物为模板，通过上游引物和第二条下游引物扩增出载体蛋白基因全长(图2第二泳道所示)。经测序完全正确。
[0040]PCR反应条件:
1、96。。3min
2、95°CI min ； 58°C 30 s ； 72°C I min ； 30 cycles
3、72°C10 min
4>4°C store。
[0041]实施例3载体蛋白原核表达质粒构建、载体蛋白原核表达、纯化及功能鉴定等详细方法。
[0042]I)原核表达质粒构建。
[0043]1.1)载体蛋白全长基因PCR扩增产物双酶切(Me I取Hind III)后，凝胶回收双酶切产物。
[0044]1.2) pET28a表达质粒双酶切iNhe I和Hind III)后，凝胶回收大片段。
[0045]1.3)将上述两个回收片段连接，转入T0P10感受态细菌中，挑单菌落，提取质粒(ET28a-H467^103-NLS-Tat-AHNP)，获得将载体蛋白全长基因构建入pET28a表达载体中(插入到船6> I和III之间)的重组质粒，既载体蛋白原核表达质粒。经测序完全正确。
[0046]2)载体蛋白原核表达
2.l)pET28a-H46H°3-NLS-Tat-AHNP 质粒转入 B121(DE3)感受态细菌中。
[0047]2.2)挑单菌落至5 ml LB培养基中，37°C震荡培养过夜，1/1000接菌至400 ml LB培养基中，37°C震荡培养至OD6tltl至0.8-1.0，加入终浓度为0.1 mM IPTG,继续37°C震荡培养4_5小时。
[0048]3)载体蛋白原核表达产物纯化
3.1)4°C 4000g离心收集菌体，PBS(pH 7.4)洗涤一次，按照每克湿菌加入50 ml BufferA (500 mM NaCl, 50 mM Tris, 10 mM imidazol, 10% glycerol; (pH 7.4))重悬菌体。
[0049]3.2)超声裂解细菌(工作时间3秒，间歇时间5秒，强度450W，总工作时长10分钟)。12，000Xg，4°C离心30分钟，留取沉淀。
[0050]3.3)用与 Buffer A 相同体积的 Buffer B (500 mM NaCl, 6 M urea, 50 mM Tris, 10mM imidazol, 10% glycerol; (pH 7.4))重悬沉淀，室温不停摇动 2-4 小时。12, 000 Xg, 4。。离心2小时，收集上清，0.45 μ m滤膜过滤，备用(图3泳道3)。
[0051]3.4)Ni层析介质空跑。Buffer A平衡后Ni层析柱,用5倍体积的Buffer B平衡，2 倍体积的 Buffer C (500 mM NaCl, 6 M urea, 50 mM Tris, 500 mM imidazol, 10% glycerol;(pH 7.4))过柱，10倍体积的ddH20洗涤后，5倍体积的Buffer B再平衡。
[0052]3.5)将步骤3所制备的样品，与步骤4的Ni介质(0.5ml Ni介质/g湿菌)混合，4°C翻转摇床上，轻摇2小时。
[0053]3.6)将步骤5的样品连同Ni介质一同装柱。200 ml Buffer B充分洗涤。
[0054]3.7)洗脱。10 ml 洗脱液(500 mM NaCl, 6 M urea, 50 mM Tris, 100 mM imidazol, 10%glycerol; (pH 7.4))(用Buffer B与Buffer C适当比例混合而成)洗脱，流速控制在8-10滴/分钟。收集OD28tl峰值处流出液，约6-8 ml。
[0055]3.8)透析与储存。
[0056]3.8.1 )透析:一个小时之内，至少四次更换透析液(500 mM NaCl, 50 mM Tris, 10%glycerol; (pH 7.4)),用以除去残存的咪唑和尿素。
[0057]3.8.2 )透析后的样品，12，000Xg，4°C离心5分钟，分装上清，迅速置于液氮中过夜。_80°C冰箱保存，备用(图3泳道I)。
[0058]3.9)鉴定。SDS-PAGE及Westen Blot检测纯化的样品。变性条件下，Ni亲和层析一步法纯化融合蛋白，透析后分装冻存。图3 —泳道为纯化后的载体蛋白。
[0059]4 )载体蛋白功能验证 具体过程如下:4.1)载体蛋白与DNA结合能力检测与蛋白质/质粒复合物带电性质检测将载体蛋白与质粒DNA按照不同P/N (蛋白所携带正电荷数量(P)与DNA所带负电荷数量(N)数量之比)混合，室温结合8小时，凝胶阻滞实验鉴定载体蛋白结合DNA的能力，动态光散射测定蛋白质/质粒复合物带电性质。如图4所示，当N/P=2时，DNA在琼脂糖凝胶中不能泳动，而被完全阻滞在加样孔中。如图5所示，当N/P=2时，蛋白质/质粒复合物呈现正电荷性质。
[0060]4.2)本发明所述载体蛋白转染功能检测 转染方法:
4.2.1)根据凝胶阻滞实验结果，采用质粒刚被完全阻滞时所需的蛋白量(P/N=2)。质粒量按照2微克/孔(24孔板)与相对应的蛋白量结合，混匀，4°C放置大于8小时。
[0061]4.2.2)转染前3小时铺细胞，转染前更换为无血清培养基。
[0062]4.2.3)每孔用无血清培养基补充体积至200 μ I/孔，加入至质粒/蛋白复合体体系中，然后加入终浓度为10 mM CaCl2,充分混匀。
[0063]4.2.4)弃除培养板上原有培养基，将复合物滴加至培养板中。 [0064]4.2.5)转染后4小时，更换为含2 mM CaCl2的完全培养基。
[0065]4.2.6)转染后24小时，更换完全培养基(无CaCl2)。
[0066]4.2.7)转染后48-60小时，荧光显微镜观察表达绿色荧光细胞/测量荧光素酶活性。
[0067]结果说明构建的载体蛋白可成功将外源性核酸转入目标细胞中，并且成功表达出目标蛋白(绿色荧光蛋白及萤光素酶)，含可见绿色荧光的细胞占总细胞数约15%,萤光素酶表达量约为脂质体转染效率的10%。
[0068]图6为本发明所述载体蛋白转染表达绿色荧光蛋白基因质粒图(荧光显微镜)；
图7为本发明所述载体蛋白转染表达萤光素酶基因质粒结果统计图(分光光度计)。
[0069]以上实验证实本发明载体可有效将外源质粒DNA转染至肿瘤细胞，并表达质粒所携带的特定蛋白。
【权利要求】
1.人源H46h°3多肽作为DNA结合结构域用于构建基因转运载体的用途，所述的人源H46HO3多肽的氨基酸序列如下:SEQ n0.1。
2.根据权利要求1所述的人源Μ67,3多肽的基因的获取方法，包括以下步骤: 1)提取全小麦基因组； 2)以小麦全基因组为模板设计引物，在引物中替换个别核苷酸，使得所扩增的产物所编码的氨基酸序列与人源氨基酸序列一致；并在上游引物上添加酶切位点，用于原核表达载体构建； 所用引物为: 上游引物:
ATGGCTAGCA TCCGCGACGC CGTCACCTAC ACCGAGCACG CCAAGCGCAA GACCGTC ； 下游引物:
ACGTGAATTCTTAGCCGCCGAAGCCGTAG ； 以小麦全基因组为模板，上述两条引物，PCR法扩增得到人源Η467_1(ι3多肽基因序列。
3.一种载体蛋白，其特征在于: 是以人源Μ67,3多肽 为DNA结合结构域、融合多种功能多肽的基因载体蛋白，具有与质粒DNA结合并且将质粒运输到肿瘤细胞的特征； 载体蛋白序列由以下几部分构成:Ν端起始为HiS6-H467_1(l3-NLS-Tat-AHNP ； 其氨基酸序列如下:
SEQ n0.2o
4.权利要求3所述载体蛋白的基因获取方法，具体步骤如下: 1)引物设计 上游引物:
ATGGCTAGCA TCCGCGACGC CGTCACCTAC ACCGAGCACG CCAAGCGCAA GACCGTC ； 下游引物为两条长引物 下游引物1:
TTCCTGCCAT ATGAACCGCC TCCACCTGGT TTCTTCTTTG GCTGGGGGCC GCCGAAGCCG ； 下游引物2: CCGCAAGCTT TTAGTACCAC GGCGAGACGG TGAGTCTTCG TCGCTGTCTC CGCTTCTTCCTGCCATATGA ACC ； 2)以人源H467_1(i3多肽PCR扩增产物为模板，用上游引物和第一条下游引物组合，PCR扩增出部分载体蛋白基因序列； 再以该PCR产物为模板，通过上游引物和第二条下游引物扩增出载体蛋白基因全长。
5.权利要求3所述载体蛋白的制备方法，包括以下步骤: O原核表达质粒构建； 载体蛋白全长基因PCR扩增产物双酶切(Me I和Λ?/^ΙΙΙ)后，凝胶回收双酶切产物； pET28a表达质粒双酶切(Me I和Hind III)后，凝胶回收大片段； 将上述两个回收片段连接，获得将载体蛋白全长基因构建入pET28a表达载体中的重组质粒，既载体蛋白原核表达质粒； 2)载体蛋白原核表达将步骤I)的载体蛋白原核表达质粒导入到BL21 (DE3)原核表达菌体系，37°C终浓度0.1 mM IPTG诱导表达载体蛋白； 3)载体蛋白原核表达产物纯化 变性条件下，Ni亲和层析一步法纯化步骤2)获得的载体蛋白，透析后分装冻存即得。
6.权利要求3所述的载体蛋白在作为肿瘤基因治疗用载体的用途。
【文档编号】C07K14/00GK104031134SQ201410272758
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月19日 优先权日:2014年6月19日
【发明者】艾永兴, 吴山力, 邓晨, 郑海南, 赵程程, 于佩峰, 王梦云, 郝林琳, 于浩, 张玉静 申请人:吉林大学