一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法，该方法通过对烟叶进行两次超声循环提取，分别得到含茄尼醇、烟碱、绿原酸的粗膏和含蛋白质、糖的提取液，并结合液-液两相萃取、柱层析、重结晶、水蒸气蒸馏和沉淀等分离或纯化手段，将烟叶中五种有效成分茄尼醇、烟碱、绿原酸、蛋白质和糖逐一分离出来。本方法实现了烟叶中多种有效成分的连续提取与分离，大大提高了烟叶原料的利用率，具有提取效率高，分离产物多，废弃物排放少的优点，是一种高效且环境友好型的烟叶多成分综合提取技术。
【专利说明】一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于烟叶深加工【技术领域】，具体涉及一种从烟叶中逐步提取并分离有效成 分茄尼醇、烟碱、绿原酸、蛋白质和糖的方法。
【背景技术】
[0002] 烟叶中含有多种具有药用或食用价值的有效成分，如茄尼醇、烟碱、绿原酸、蛋白 质和糖类等。茄尼醇是一种高附加值的药用成分，具有抗菌、消炎和止血等药理作用，同时 也是合成维生素 K2和辅酶Q10的必要原料。烟碱是烟叶中一种生物碱，应用非常广泛，其 用途主要包括农药和医药两大方面。烟碱系列农药属植物杀虫剂，具有蒸薰、胃毒、触杀功 能和迅速降解无残留的特点，是理想的高效绿色杀虫剂和生物性农药。同时，高纯度烟碱是 医药工业上研制治疗心血管、皮肤、蛇虫咬伤等疾患药物的特种原料。绿原酸是一种重要的 生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自 由基和兴奋中枢神经系统等作用。烟叶蛋白含18种氨基酸，包括8种人体必需氨基酸，与 联合国粮农组织推荐的成人氨基酸模式基本相符，特别是赖氨酸含量较高。烟叶中所含水 溶性糖90%以上为还原性糖，还原性糖的作用和用途十分广泛，可以用于食品加工和医药 化工。
[0003] 为开发烟叶，特别是低次烟叶在非卷烟方面的用途，国内外研究人员已对烟叶中 有效成分的提取进行了大量研究，目前有多项专利公开了烟叶中茄尼醇、烟碱等成分的提 取工艺，但这些工艺均存在提取成分少，原料利用率不高的缺陷。近年来，人们对烟叶的综 合提取利用较为关注。专利CN200610069846. 6公开了 一种清洁化同步高效提取高纯度茄 尼醇和烟碱的方法，其特征在于采用渗漉回流法制备粗浸膏，粗浸膏经分离后得茄尼醇浸 膏和烟碱水溶液，茄尼醇浸膏经纯化分离得到高纯茄尼醇，烟碱水溶液经纯化萃取得高纯 度烟碱。专利CN200710034942. 1公开了一种从废次烟草中同时提取高纯天然烟碱和茄尼 醇的方法，具体是采用乙醇和水的混合液加热回流提取、过滤，分别得烟碱提取液和滤渣， 将烟碱提取液浓缩得烟碱浸膏，水溶后加入分相剂分相得烟碱产品，滤渣经处理后得茄尼 醇产品；专利CN201110113343. 5公开了一种从烟叶中提取茄尼醇和烟碱的方法，其工艺流 程是将烟叶粉碎后用碱液与用正己烷的混合溶剂萃取，萃取完毕过滤，分液，取上层正己烷 再用盐酸水溶液萃取，上层正己烷层浓缩至膏状即为茄尼醇粗提物，下层水相为粗盐酸烟 碱溶液。专利CN201110248504. 1公开了一种烟草连续提取的方法，具体涉及到利用超声波 碱化预处理从烟草中依次提取烟碱、半纤维素、木质素、纤维素的方法。
[0004] 目前关于同时提取烟草中多种成分的报道，大多是针对茄尼醇和烟碱这两种物 质，而烟草中其他有效成分，如蛋白质、多酚和糖类没有得到充分利用，造成了资源的浪费。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种从烟叶中综合提取并分离多种有效成分的方法，该方 法提取效率高，且废弃物排放少，是一种高效且环境友好型的烟叶综合提取技术。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种从烟叶中综合提取多种有效成 分的方法，包括如下步骤：
[0007] (1)乙醇溶液超声循环提取茄尼醇、烟碱和绿原酸：将烟叶进行烘干粉碎后，得烟 叶碎片，并置于循环式超声提取器中，加入乙醇溶液，进行超声循环提取，过滤得乙醇提取 液和烟叶滤渣，将乙醇提取液进行浓缩，得含茄尼醇、烟碱和绿原酸的粗膏；
[0008] (2)碱性水溶液超声循环提取蛋白质和糖：将步骤（1)得到的烟叶滤渣置于循环 式超声提取器中，加入碱性水溶液，进行超声循环提取，过滤得含蛋白质和糖的提取液；
[0009] (3)茄尼醇、烟碱和绿原酸的分离：向含茄尼醇、烟碱和绿原酸的粗膏中加入石油 醚和酸性水溶液，进行液-液两相萃取，取上层石油醚层进行浓缩得茄尼醇粗膏，再进行柱 层析分离、重结晶得茄尼醇；下层水相用乙酸乙酯萃取后，取上层乙酸乙酯层进行浓缩得绿 原酸粗膏，再配成绿原酸水溶液通过柱层析分离得绿原酸；将经乙酸乙酯萃取所得的下层 水相进行浓缩，加入碱调节pH值，然后进行水蒸气蒸馏，用装有酸性水溶液的收集瓶收集 馏分，得烟碱盐水溶液，将烟碱盐水溶液进行浓缩，加入碱调节pH值，然后用二氯甲烷进行 萃取，取二氯甲烷层进行浓缩得烟碱；
[0010] (4)蛋白质和糖的分离：将步骤（2)中所得的含蛋白质和糖的提取液进行浓缩， 加入蛋白质沉淀剂，静置后，离心分离上层清液和蛋白质沉淀，蛋白质沉淀用无水乙醇洗涤 后，进行低温真空干燥，得所述蛋白质；上层清液加入乙醇进行醇沉，静置后进行过滤，得糖 滤饼，将糖滤饼用无水乙醇洗涤后，进行低温真空干燥，得所述糖。
[0011] 根据上述方案，所述步骤（1)中烟叶经烘干粉碎后所得烟叶碎片的尺寸为20目； 所述乙醇溶液为乙醇体积分数为80?95%的酸性乙醇水溶液，pH值为3?4, pH值通过磷 酸或柠檬酸进行调节。
[0012] 根据上述方案，所述步骤（1)的乙醇溶液超声循环提取过程中，超声波功率为 100?300W，超声提取温度为50?60°C，提取时间为30?60min ;烟叶碎片与乙醇溶液的 料液比为1: (5?20)，料液比单位为g/mL。
[0013] 根据上述方案，所述步骤（2)的碱性水溶液超声循环提取过程中，超声波功率为 100?300W，超声提取温度为50?60°C，提取时间为30?60min ;所述碱性水溶液为NaOH 或Κ0Η的碱性水溶液，pH值为7?8 ;烟叶滤渣与碱性水溶液的料液比为1: (10?20)，料 液比单位为g/mL。
[0014] 根据上述方案，所述茄尼醇的分离步骤中，步骤（3)中液-液两相萃取所用酸性水 溶液为磷酸水溶液，pH值为2?3,石油醚与酸性水溶液的体积比为2:3,萃取次数为2? 3次；所述茄尼醇的柱层析分离所用吸附材料为100?200目的硅胶，洗脱剂为石油醚/乙 酸乙酯混合溶剂，石油醚与乙酸乙酯的体积比为9:1 ;所述茄尼醇的重结晶溶剂为乙醇，重 结晶温度为-15°C。
[0015] 根据上述方案，所述绿原酸的分离步骤中，柱层析分离采用聚酰胺柱作为层析分 离柱，聚酰胺柱尺寸为80?100目，绿原酸水溶液的上样浓度为9mg/mL，上样量为5倍柱体 积，上样流速为每小时4倍柱体积，洗脱剂为体积分数为30%的乙醇水溶液，洗脱流速为每 小时4倍柱体积。
[0016] 根据上述方案，所述烟碱的分离步骤包括：将步骤（3)中经乙酸乙酯萃取后的下 层水相进行浓缩至初始体积的1/3,然后加入NaOH或Κ0Η调节pH值至11?13 ;进行水 蒸气蒸馏烟碱时用柠檬酸溶液吸收烟碱馏出液，并控制接收液pH小于3,当溜出液用质量 分数为1 %的硅钨酸检测无沉淀物产生时停止蒸馏，然后将烟碱盐水溶液浓缩到原体积的 1/3?1/2,加 NaOH或KOH调节pH值至11?13,用二氯甲烷萃取1?2次，蒸发除去二氯 甲烷即得烟碱。
[0017] 根据上述方案，所述步骤（4)中所得的含蛋白质和糖的提取液浓缩至初始体积的 1/8?1/3 ;所述蛋白质沉淀剂为羧甲基壳聚糖，分子量为50000?100000,用量为0. 01? 0. 05% wt ;沉淀温度为4°C，时间为2?5h ;所得蛋白质沉淀用无水乙醇洗涤2?3次；所得 上层清液中加入的乙醇量为其体积的3?4倍；醇沉静置时间为1?2h，温度为4?20°C; 所得糖滤饼用无水乙醇洗涤2?3次。
[0018] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0019] (1)通过两次超声循环提取实现对烟叶多种有效成分的同步提取，并结合液-液 两相萃取、柱层析、重结晶、水蒸气蒸馏、沉淀等分离或纯化手段，将烟叶中五种有效成分茄 尼醇、烟碱、绿原酸、蛋白质和糖逐一分离出来，大大提高了烟草原料的利用率。
[0020] (2)本方法具有提取效率高，分离产物多，废弃物排放少的优点，属于一种高效且 环境友好型的烟叶多成分综合连续提取技术。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 下面结合附图对本发明作进一步说明，附图中：
[0022] 图1为本发明的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0023] 为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本 发明进行进一步详细说明，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本 发明。
[0024] 以下实施例中所使用的材料、试剂等如无特别说明，均可从商业途径中得到。
[0025] 以下实施例中茄尼醇、烟碱和绿原酸均采用高效液相色谱法测定最终产品纯度， 蛋白质纯度用微量凯式定氮法测定，糖用苯酚-硫酸法测定其纯度。
[0026] 茄尼醇的高效液相色谱测试参数包括：
[0027] 色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 反相柱（250mmX 4. 6mm，5 μ m);
[0028] 流动相：异丙醇：乙腈=50% :50% (体积比）；
[0029] 流速：lmL/min;
[0030] 紫外检测波长：210nm ;
[0031] 柱温：25°C;
[0032] 进样量：10 μ L。
[0033] 烟碱的高效液相色谱测试参数包括：
[0034] 色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 反相柱（250mmX 4. 6mm，5 μ m);
[0035] 流动相：甲醇：磷酸缓冲溶液=60 % : 40 % (体积比）；
[0036] 磷酸缓冲溶液配制：2. 420g磷酸氢二钠，3. 5mL磷酸和6. 5mL三乙胺，加水定容至 lOOOmL ；
[0037] 流速：lmL/mim;
[0038] 紫外检测波长：259nm ;
[0039] 柱温：30°C ;
[0040] 进样量：1〇 μ L。
[0041] 绿原酸的高效液相色谱测试参数包括：
[0042] 色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 反相柱（250mmX 4. 6mm，5 μ m);
[0043] 流动相：乙腈：2 %乙酸=13 % : 87 % (体积比）；
[0044] 流速：lmL/min;
[0045] 紫外检测波长：328nm ;
[0046] 柱温：25°C ;
[0047] 进样量：10 μ L。
[0048] 实施例一：
[0049] 一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法，包括以下步骤：
[0050] (1)乙醇溶液超声循环提取烟叶中茄尼醇、烟碱和绿原酸：将云南烟叶烘干粉碎 至20目后，称取100g烟叶碎片，置于超声循环提取器中，然后加入500mL乙醇体积分数为 80%的酸性乙醇水溶液，溶液的pH值为3,通过磷酸进行调节。在温度为50°C，超声波功率 为100W的条件下超声循环提取30min，过滤得到酸性乙醇提取液和烟叶滤渣。将乙醇提取 液进行浓缩得含茄尼醇、烟碱和绿原酸的粗膏18. 2g，其中茄尼醇提取率48. 2%，烟碱提取 率59. 4 %，绿原酸提取率62. 7 %。
[0051] (2)碱性水溶液超声循环提取烟叶滤渣中的水溶性蛋白质和糖：将步骤（1)得到 的烟叶滤渣置于循环式超声提取器中，加入l〇〇〇mL pH值为7的NaOH水溶液，在温度为 50°C，超声波功率为100W的条件下超声循环提取30min，过滤得二次滤渣和含水溶性蛋白 质和糖的提取液，水溶性蛋白质提取率为52. 4%，水溶性糖提取率为78%。
[0052] (3)茄尼醇、烟碱和绿原酸的分离：向18. 2g含茄尼醇、烟碱和绿原酸的粗膏中分 别加入石油醚l〇〇mL和pH值为2磷酸水溶液150mL，进行液-液两相萃取，取上层石油醚 层，下层水相继续用l〇〇mL石油醚萃取第2次，合并两次石油醚层并进行浓缩得茄尼醇粗膏 1. 7g，再通过100?200目的硅胶进行柱层析分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=9:1 (体积 比）的混合溶剂，收集洗脱液中茄尼醇富集段，浓缩得0. 42g茄尼醇纯化物，然后加入5mL 乙醇，在-15°C下重结晶，过滤所得晶体在室温真空干燥（20°C )，即得精制茄尼醇0. 29g，纯 度测定为91%。
[0053] 两次石油醚萃取过的下层水相继续用乙酸乙酯萃取两次，每次乙酸乙酯的用量为 100mL，合并得到的乙酸乙酯层并进行浓缩得绿原酸粗膏1. 42g，然后加入蒸馏水配成9mg/ mL的绿原酸水溶液进行聚酰胺柱层析分离，聚酰胺柱尺寸为80?100目，上样量为5倍柱 体积，上样流速为每小时4倍柱体积，洗脱剂为体积分数为30 %的乙醇水溶液，洗脱流速 为每小时4倍柱体积，总共洗脱6倍柱体积，以1/2倍柱体积为接收单位，收集绿原酸含量 较高的洗脱液，减压浓缩并进行真空低温干燥（温度低于20°C )即得绿原酸0. 58g，纯度 47%。
[0054] 将乙酸乙酯萃取得到的150mL下层水相浓缩到50mL后加入NaOH调节pH值至11， 然后进行水蒸气蒸馏，用事先装有柠檬酸水溶液的接收瓶收集馏分，并控制接收瓶内pH小 于3,当馏出液用质量分数为1%的硅钨酸检测无沉淀物产生时停止蒸馏，此时接收瓶内溶 液体积约200mL，然后将接收瓶内的柠檬酸烟碱溶液真空浓缩到lOOmL，加入NaOH调节pH 值至11左右，用二氯甲烷萃取两次，每次二氯甲烷萃的用量为80mL，合并二氯甲烷层并用 无水硫酸钠进行干燥，最后减压蒸馏除去二氯甲烷即得烟碱1. 63g，纯度测定为98 %。
[0055] (4)蛋白质和糖的分离：将步骤⑵中水溶液超声循环提取所得的含蛋白质和糖 的水溶液l〇〇〇mL浓缩到250mL，然后缓慢搅拌加入5mL羧甲基壳聚糖（分子量为50000)浓 度为0. 5wt %的溶液，在4°C下静置2h后，离心取上层清液230mL，所得蛋白质沉淀用无水乙 醇洗涤两次后，进行低温真空干燥（温度低于20°C)即得水溶性蛋白质4. lg，纯度70%。
[0056] 所得上层清液继续加入800mL乙醇进行醇沉，在4°C下静置lh时间后过滤，得糖滤 饼用无水乙醇洗涤两次后，进行低温真空干燥（温度低于20°C)即得水溶性糖8. 2g，纯度 80%。
[0057] 实施例二：
[0058] -种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法，包括以下步骤：
[0059] (1)乙醇溶液超声循环提取烟叶中茄尼醇、烟碱和绿原酸：将云南烟叶烘干粉碎 至20目后，称取100g烟叶碎片，置于超声循环提取器中，然后加入1000mL乙醇体积分数为 90%的酸性乙醇水溶液，溶液的pH值为4,通过磷酸进行调节。在温度为55°C，超声波功率 为200W的条件下超声循环提取45min，过滤得到酸性乙醇提取液和烟叶滤渣。将乙醇提取 液进行浓缩得含茄尼醇、烟碱和绿原酸的粗膏20. 3g，其中茄尼醇提取率68. 2%，烟碱提取 率72. 3 %，绿原酸提取率74. 7 %。
[0060] (2)碱性水溶液超声循环提取烟叶滤渣中的水溶性蛋白质和糖：将步骤（1)得到 的烟叶滤渣置于循环式超声提取器中，然后加入1500mL的pH值为8的NaOH水溶液，在温 度为55°C，超声波功率为200W的条件下超声循环提取45min，过滤得二次滤渣和含水溶性 蛋白质和糖的提取液，水溶性蛋白质提取率为72. 4%，水溶性糖提取率为82%。
[0061] (3)茄尼醇、烟碱和绿原酸的分离：向20. 3g含茄尼醇、烟碱和绿原酸的粗膏中分 别加入石油醚l〇〇mL和pH值为2磷酸水溶液150mL，进行液-液两相萃取，取上层石油醚 层，下层水相继续用l〇〇mL石油醚萃取第2次，合并两次石油醚层并进行浓缩得茄尼醇粗膏 2. 2g，再通过100?200目的硅胶进行柱层析分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=9:1 (体积 比）的混合溶剂，收集洗脱液中茄尼醇富集段，浓缩得0. 54g茄尼醇纯化物，然后加入5mL 乙醇，在-15°C下重结晶，过滤所得晶体在室温真空干燥（20°C )，即得精制茄尼醇0. 35g，纯 度测定为90%。
[0062] 两次石油醚萃取过的下层水相继续用乙酸乙酯萃取两次，每次乙酸乙酯的用量为 100mL，合并得到的乙酸乙酯层进行浓缩得绿原酸粗膏1. 72g，然后加入蒸馏水配成9mg/mL 的绿原酸水溶液进行聚酰胺柱层析分离，聚酰胺柱尺寸为80?100目，上样量为5倍柱体 积，上样流速为每小时4倍柱体积，洗脱剂为体积分数为30%的乙醇水溶液，洗脱流速为每 小时4倍柱体积，总共洗脱6倍柱体积，以1/2倍柱体积为接收单位，收集绿原酸含量较高 的洗脱液，减压浓缩并进行真空低温干燥（温度低于20°C)即得绿原酸0.7g，纯度46 %。
[0063] 乙酸乙酯萃取得到的255mL下层水相浓缩到85mL后加入NaOH调节pH值至12， 然后进行水蒸气蒸馏，用事先装有柠檬酸水溶液的接收瓶收集馏分，并控制接收瓶内pH小 于3,当馏出液用质量分数为1%的硅钨酸检测无沉淀物产生时停止蒸馏，此时接收瓶内溶 液体积约为200mL，然后将接收瓶内的柠檬酸烟碱溶液真空浓缩到lOOmL，加入NaOH调节pH 值至11左右，用二氯甲烷萃取两次，每次二氯甲烷的用量为80mL，合并二氯甲烷并用无水 硫酸钠进行干燥，最后减压蒸馏除去二氯甲烷即得烟碱2. lg，纯度测定为97%。
[0064] (4)蛋白质和糖的分离：将步骤（2)中水溶液超声循环提取所得的含蛋白质和糖 的水溶液1500mL浓缩到300mL，然后缓慢搅拌加入10mL含量为0. 5wt%的羧甲基壳聚糖 (分子量为50000)溶液，在4°C下静置5h后，离心取上层清液280mL，所得蛋白质沉淀用 无水乙醇洗涤两次后，进行低温真空干燥（温度低于20°C)即得水溶性蛋白质5. 8g，纯度 71%。
[0065] 所得上层清液继续加入900mL乙醇进行醇沉，在20°C下静置lh时间后过滤，得糖 滤饼用无水乙醇洗涤三次后，进行低温真空干燥（温度低于20°C )即得水溶性糖8. 9g，纯 度 81%。
[0066] 实施例三：
[0067] 一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法，包括以下步骤：
[0068] (1)乙醇溶液超声循环提取烟叶中茄尼醇、烟碱和绿原酸：将云南烟叶烘干粉碎 至20目后，称取100g烟叶碎片，置于超声循环提取器中，然后加入2000mL乙醇体积分数为 95%的酸性乙醇水溶液，溶液的pH值为4,通过磷酸进行调节。在温度为60°C，超声波功率 为300W的条件下超声循环提取60min，过滤得到酸性乙醇提取液和烟叶滤渣。将乙醇提取 液进行浓缩得含茄尼醇、烟碱和绿原酸的粗膏21. 6g，其中茄尼醇提取率81. 2%，烟碱提取 率94. 3 %，绿原酸提取率93. 7 %。
[0069] (2)碱性水溶液超声循环提取烟叶滤渣中的水溶性蛋白质和糖：将步骤（1)中得 到的烟叶滤渣置于超声循环提取器中，然后加入2000mL的pH值为8的NaOH水溶液，在温 度为60°C，超声波功率为300W的条件下超声循环提取60min，过滤得二次滤渣和含水溶性 蛋白质和糖的提取液，水溶性蛋白质提取率为81. 2%，水溶性糖提取率为84%。
[0070] (3)茄尼醇、烟碱和绿原酸的分离：向21. 6g含茄尼醇、烟碱和绿原酸的粗膏中分 别加入石油醚l〇〇mL和pH值为3磷酸水溶液150mL，进行液-液两相萃取，取上层石油醚 层，下层水相继续用l〇〇mL石油醚萃取第2次，合并两次石油醚层浓缩得茄尼醇粗膏2. 4g， 再通过100?200目的硅胶进行柱层析分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=9:1(体积比） 的混合溶剂，收集洗脱液中茄尼醇富集段，进行浓缩得〇. 61g茄尼醇纯化物，然后加入5mL 乙醇，在-15°C下重结晶，过滤所得晶体在室温真空干燥（20°C )，即得精制茄尼醇0. 4g，纯 度测定为91%。
[0071] 经两次石油醚萃取过的下层水相继续用乙酸乙酯萃取两次，每次乙酸乙酯的用量 为100mL，合并得到的乙酸乙酯层进行浓缩得绿原酸粗膏1.78g，然后加入蒸馏水配成9mg/ mL的绿原酸水溶液进行聚酰胺柱层析分离，聚酰胺柱尺寸为80?100目，上样量为5倍柱 体积，上样流速为每小时4倍柱体积，洗脱剂为体积分数为30 %的乙醇水溶液，洗脱流速 为每小时4倍柱体积，总共洗脱6倍柱体积，以1/2倍柱体积为接收单位，收集绿原酸含量 较高的洗脱液，减压浓缩并进行真空低温干燥（温度低于20°C )即得绿原酸0. 73g，纯度 46%。
[0072] 乙酸乙酯萃取得到的255mL下层水相浓缩到85mL后加入NaOH调节pH值至12,然 后进行水蒸气蒸馏，用事先装有柠檬酸水溶液的接收瓶收集馏分，并控制接收瓶内pH小于 3,当馏出液用质量分数为1%硅钨酸检测无沉淀物产生时停止蒸馏，此时接收瓶内溶液体 积约为300mL，然后将接收瓶内的柠檬酸烟碱溶液真空浓缩到lOOmL，加入NaOH调节pH值 至12左右，用二氯甲烷萃取两次，每次二氯甲烷萃的用量为80mL，合并二氯甲烷并用无水 硫酸钠进行干燥，最后减压蒸馏除去二氯甲烷即得烟碱2. 8g，纯度测定为97 %。
[0073] (4)蛋白质和糖的分离：将步骤⑵中水溶液超声循环提取所得的含蛋白质和糖 的水溶液2000mL浓缩到300mL，然后缓慢搅拌加入15mL含量为0. 5wt%的羧甲基壳聚糖 (分子量为50000)溶液，在4°C下静置2h后，离心取上层清液270mL，所得蛋白质沉淀用无 水乙醇洗涤两次后，进行低温干燥（温度低于20°C)即得水溶性蛋白质6. 5g，纯度74%。
[0074] 所得上层清液继续加入950mL乙醇进行醇沉，在4°C下静置2h时间后过滤，得糖滤 饼用无水乙醇洗涤两次后，进行低温真空干燥（温度低于20°C)即得水溶性糖9. 3g，纯度 81%。
[0075] 在不违背本发明实质及精神的情况下，熟悉本领域的技术人员可能根据本发明做 出各种各样的改变或变形，但这些相应的改变或变形都应属于本发明所附的权利要求的保 护范围。
【权利要求】
1. 一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 乙醇溶液超声循环提取茄尼醇、烟碱和绿原酸：将烟叶进行烘干粉碎后，得烟叶碎 片，并置于循环式超声提取器中，加入乙醇溶液，进行超声循环提取，过滤得乙醇提取液和 烟叶滤渣，将乙醇提取液进行浓缩，得含茄尼醇、烟碱和绿原酸的粗膏； (2) 碱性水溶液超声循环提取蛋白质和糖：将步骤（1)得到的烟叶滤渣置于循环式超 声提取器中，加入碱性水溶液，进行超声循环提取，过滤得含蛋白质和糖的提取液； (3) 茄尼醇、烟碱和绿原酸的分离：向含茄尼醇、烟碱和绿原酸的粗膏中加入石油醚和 酸性水溶液，进行液-液两相萃取，取上层石油醚层进行浓缩得茄尼醇粗膏，再进行柱层析 分离、重结晶得茄尼醇；下层水相用乙酸乙酯萃取后，取上层乙酸乙酯层进行浓缩得绿原酸 粗膏，再配成绿原酸水溶液通过柱层析分离得绿原酸；将经乙酸乙酯萃取所得的下层水相 进行浓缩，加入碱调节pH值，然后进行水蒸气蒸馏，用装有酸性水溶液的收集瓶收集馏分， 得烟碱盐水溶液，将烟碱盐水溶液进行浓缩，加入碱调节pH值，然后用二氯甲烷进行萃取， 取二氯甲烷层进行浓缩得烟碱； ⑷蛋白质和糖的分离：将步骤⑵中所得的含蛋白质和糖的提取液进行浓缩，加入蛋 白质沉淀剂，静置后，离心分离上层清液和蛋白质沉淀，蛋白质沉淀用无水乙醇洗涤后，进 行低温真空干燥，得所述蛋白质；上层清液加入乙醇进行醇沉，静置后进行过滤，得糖滤饼， 将糖滤饼用无水乙醇洗涤后，进行低温真空干燥，得所述糖。
2. 根据权利要求1所述的一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法，其特征在于， 所述步骤（1)中烟叶经烘干粉碎后所得烟叶碎片的尺寸为20目；所述乙醇溶液为乙醇体积 分数为80?95%的酸性乙醇水溶液，pH值为3?4, pH值通过磷酸或柠檬酸进行调节。
3. 根据权利要求1所述的一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法，其特征在于， 所述步骤（1)的乙醇溶液超声循环提取过程中，超声波功率为100?300W，超声提取温度为 50?60°C，提取时间为30?60min ;烟叶碎片与乙醇溶液的料液比为1: (5?20)，料液比 单位为g/mL。
4. 根据权利要求1所述的一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法，其特征在于， 所述步骤（2)的碱性水溶液超声循环提取过程中，超声波功率为100?300W，超声提取温度 为50?60°C，提取时间为30?60min ;所述碱性水溶液为NaOH或KOH的碱性水溶液，pH 值为7?8 ;烟叶滤渣与碱性水溶液的料液比为1: (10?20)，料液比单位为g/mL。
5. 根据权利要求1所述的一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法，其特征在于， 所述茄尼醇的分离步骤中，步骤（3)中液-液两相萃取所用酸性水溶液为磷酸水溶液，pH值 为2?3,石油醚与酸性水溶液的体积比为2:3,萃取次数为2?3次；茄尼醇的柱层析分离 所用吸附材料为100?200目的硅胶，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合溶剂，石油醚与乙酸 乙酯的体积比为9:1 ;所述茄尼醇的重结晶溶剂为乙醇，重结晶温度为-15°C。
6. 根据权利要求1所述的一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法，其特征在于， 所述绿原酸的分离步骤中，柱层析分离采用聚酰胺柱作为层析分离柱，聚酰胺柱尺寸为 80?100目，绿原酸水溶液的上样浓度为9mg/mL，上样量为5倍柱体积，上样流速为每小时 4倍柱体积，洗脱剂为体积分数为30%的乙醇水溶液，洗脱流速为每小时4倍柱体积。
7. 根据权利要求1所述的一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法，其特征在于， 所述烟碱的分离步骤包括：将步骤（3)中经乙酸乙酯萃取后的下层水相进行浓缩至初始体 积的1/3,然后加入NaOH或KOH调节pH值至11?13 ;进行水蒸气蒸馏烟碱时用柠檬酸溶 液吸收烟碱馏出液，并控制接收液pH小于3,当溜出液用质量分数为1 %的硅钨酸检测无沉 淀物产生时停止蒸馏，然后将烟碱盐水溶液浓缩到原体积的1/3?1/2,加 NaOH或K0H调节 pH值至11?13,用二氯甲烷萃取1?2次，蒸发除去二氯甲烷即得烟碱。
8.根据权利要求1所述的一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法，其特征在于， 所述步骤（4)中所得的含蛋白质和糖的提取液浓缩至初始体积的1/8?1/3 ;所述蛋白质 沉淀剂为羧甲基壳聚糖，分子量为50000?100000,用量为0.01?0.05% wt ;沉淀温度为 4°C，时间为2?5h ;所得蛋白质沉淀用无水乙醇洗涤2?3次；所得上层清液加入乙醇量 为滤液体积的3?4倍；醇沉静置时间为1?2h，温度为4?20°C;所得糖滤饼用无水乙醇 洗涤2?3次。
【文档编号】C07D401/04GK104151140SQ201410330343
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月11日 优先权日:2014年7月11日
【发明者】刘治田, 张旗, 郑乐驰 申请人:武汉工程大学