Ehnv抗血清的制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及水生动物疾病防治领域，具体而言，涉及EHNV抗血清的制备方法及其应用。该EHNV抗血清的制备方法，其包括高纯度抗原的制备、纯化以及免疫并获得EHNV抗血清等步骤。本发明提供的该EHNV抗血清的制备方法，其实现了EHNV抗血清的制备，在该方法中，采用了低速长时离心方法，获得了高浓度EHNV(纯化后病毒)，将其作为抗原，对实验动物进行免疫操作，为制备特异性强和效价高的抗血清奠定了基础；解决了我国EHNV检测技术中免疫学诊断试剂高度依赖进口、检测成本高等问题，进而有利于EHNV免疫学诊断方法的推广使用。
【专利说明】EHNV抗血清的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及水生动物疾病防治领域，具体而言，涉及EHNV抗血清的制备方法及其 应用。
【背景技术】
[0002] 流行性造血器官坏死病（EHN)为世界动物卫生组织（0ΙΕ)公布的鱼类必报疫病， 该病在我国《进境动物检疫疫病名录》中被列为二类传染病。
[0003] 目前，在国内外，EHN的诊断方法主要有以下几种：病毒分离、免疫过氧化物酶试 验、抗原捕捉ELISA、免疫电镜和PCR等。其中，病毒分离为最常用方法，分离病毒主要采用 PCR技术进行鉴定。
[0004] 另外，ELISA等免疫学鉴定方法也是较为常用且被《水生动物疫病诊断手册》所 推荐使用的一种测定方法，该方法在测定的过程中需要各种EHN免疫学诊断试剂（主要为 EHNV抗血清），而国内市场上没有这些试剂（尤其是EHNV抗血清），主要依靠进口，价格昂 贵、成本高，不利于EHN免疫学诊断方法的推广使用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种EHNV抗血清的制备方法，以解决上述的技术问题。
[0006] 在本发明的实施例中提供了 EHNV抗血清的制备方法，包括以下步骤：
[0007] 在新培养敏感细胞中加入EHNV病毒液，吸附预定时间后再加入M199培养基进行 培养，得到病变细胞液；
[0008] 将所述病变细胞液于10000 X g-14000 X g离心25-35min，得到第一上清液和第一 沉淀；
[0009] 将所述第一沉淀用部分所述第一上清液重悬，然后利用液氮和35_37°C水浴反复 冻融3-4次，再进行超声波粉碎3-4次后，于6000 X g-7000 X g离心10-20min，得到第二上 清液；
[0010] 将所述第一上清液和所述第二上清液合并后于8000Xg-1200()Xg离心7-9h，得 到第二沉淀；
[0011] 将所述第二沉淀用Tris-HCl重悬，得到重悬病毒液；
[0012] 利用蔗糖密度梯度离心法将所述重悬病毒液进行纯化，得到纯化后病毒；
[0013] 以所述纯化后病毒作为抗原，免疫实验动物3-4次后采血，获得血样，将所述 血样于35-37°C温箱放置l_2h后，4°C放置半天，待血清析出后于2800-3200r/min离心 8-12min，得到EHNV抗血清；
[0014] 本发明提供的这种EHNV抗血清的制备方法，其实现了 EHNV抗血清的制备，在该方 法中，采用了低速长时离心方法，获得了高浓度EHNV (纯化后病毒），将其作为抗原，对实验 动物进行免疫操作，为制备特异性强和效价高的抗血清奠定了基础。
[0015] 通过实验验证，本发明提供的这种EHNV抗血清的制备方法，其制备得到的纯化后 病毒浓度可以达到32mg/mL，通过免疫之后，获得的EHNV抗血清的效价可达到1:204800。通 过该方法实现了高效价EHNV抗血清的制备，获得的抗血清可以应用到EHNV免疫过氧化物 酶检测方法中，为EHN过氧化物酶、酶联免疫吸附试验等免疫学诊断方法提供诊断试剂，克 服了现有技术中EHN免疫学诊断试剂，主要依靠进口、成本高，进而不利于EHN免疫学诊断 方法的推广使用的技术缺陷。解决了我国EHNV检测技术中免疫学诊断试剂高度依赖进口、 检测成本高等问题，进而有利于EHNV免疫学诊断方法的推广使用
[0016] 可选的：在所述在新培养敏感细胞中加入EHNV病毒液，吸附预定时间后再加入 M199培养基进行培养，得到病变细胞液的步骤中：
[0017] 所述敏感细胞为CHSE-214、鲈鱼鳃细胞系、胖头臟肌肉细胞系或鲤上皮瘤细胞 系；
[0018] 在所述吸附的过程中，吸附的温度为12-18°C、所述预定时间为50-70min。
[0019] 可选的，在所述在新培养敏感细胞中加入EHNV病毒液吸附预定时间后再加入 M199培养基进行培养，得到病变细胞液的步骤中；
[0020] 所述M199培养基中含体积份数为2%的胎牛血清。
[0021] 可选的，在所述将所述病变细胞液于10000Xg-14000Xg离心25-35min，得到第 一上清液和第一沉淀的步骤中：
[0022] 所述离心的温度为4°C。
[0023] 可选的，在所述将所述第一沉淀用部分所述第一上清液重悬，然后利用液氮和 35-37 °C水浴反复冻融3-4次，再进行超声波粉碎3-4次后，于6000 X g-7000 X g离心 10-20min，得到第二上清液的步骤中：
[0024] 每次所述超声波粉碎所用的时间为50-70秒。
[0025] 可选的，在所述将所述第二沉淀用Tris-HCl重悬，得到重悬病毒液的步骤中；所 述 Tris-HCl 的浓度为 lOOmM、pH 为 8. 6。
[0026] 可选的，在所述以所述纯化后病毒作为抗原，免疫实验动物3-4次后采血，获得血 样，将所述血样于35-37°C温箱放置l_2h后，4°C放置半天，待血清析出后于2800-3200r/ min离心8_12min，得到EHNV抗血清的步骤中：
[0027] 所述实验动物包括新西兰大耳白兔、小鼠、山羊或绵羊中的一种。
[0028] 可选的，在所述以所述纯化后病毒作为抗原，免疫实验动物3-4次后采血，获得血 样，将所述血样于35-37°C温箱放置l_2h后，4°C放置半天，待血清析出后于2800-3200r/ min离心8-12min，得到EHNV抗血清的步骤中，相邻两次免疫的时间间隔为3周。
[0029] 根据上述的EHNV抗血清的制备方法获得的EHNV抗血清及其在EHNV免疫过氧化 物酶检测方法中的应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 为了更清楚地说明本发明【具体实施方式】或现有技术中的技术方案，下面将对具体 实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的 附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前 提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0031] 图1为本发明实施例一提供的EHNV抗血清的制备方法的流程图；
[0032] 图2示出了本发明实施例二中的纯化后病毒的SDS-PAGE图；
[0033] 图3示出了本发明实施例二中的疫过氧化物酶检测中的阳性反应图；
[0034] 图4示出了本发明实施例二中的疫过氧化物酶检测中的阴性反应图。
【具体实施方式】
[0035] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行 清楚、完整的描述，基于本发明中的【具体实施方式】，本领域普通技术人员在没有做出创造性 劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
[0036] 实施例一
[0037] 本发明实施例提供的这种EHNV抗血清的制备方法，请参考图1，包括以下步骤：
[0038] 步骤101 :在新培养敏感细胞中加入EHNV病毒液吸附预定时间后再加入M199培 养基进行培养，得到病变细胞液；
[0039] 在步骤101中，敏感细胞，是指在体外培养建立的细胞系。通过在敏感细胞中加入 EHNV病毒液，使得病毒液大量的吸附在敏感细胞上，并进行大量的病毒增殖，而M199培养 基则为敏感细胞的增殖提供营养，在培养的过程中，当细胞病变（CPE)达到80%时，即可进 行收毒操作，通过_8(TC冰箱速冻，以备后用。
[0040] 步骤102 :将所述病变细胞液于10000 X g-14000 X g离心25-35min，得到第一上清 液和第一沉淀；
[0041] 得到的病变细胞液需要进行进一步的纯化操作，在步骤102中，将其通过离心之 后即可得到含有大量病毒的第一上清液和含有少量病毒的第一沉淀。
[0042] 步骤103 :将所述第一沉淀用部分所述第一上清液重悬，然后利用液氮和35-37°C 水浴反复冻融3-4次，再进行超声波粉碎3-4次后，于6000Xg-7000Xg离心10-20min，得 到第二上清液；
[0043] 由于第一沉淀中含有一定量的病毒，因此，需要将其进行进一步的处理。利用少量 的第一上清液将其重悬，使其呈悬液状态，然后再通过液氮和35-37°C水浴反复冻融数次之 后，再进行超声波粉碎，使得大量的细胞破碎，细胞内的病毒即可得到释放。病毒细胞碎片 悬液经过低速离心之后，即可得到病毒含量较高的第二清液。
[0044] 步骤104 :将所述第一上清液和所述第二上清液合并后于8000 X g-12000 X g离心 7_9h，得到第二沉淀；
[0045] 第一上清液和第二上清液合并后在8000 X g-12000 X g离心7-9h，通过低速长时 间的离心，大量汇集的清液中的病毒沉底，并存在于第二沉淀中。
[0046] 步骤105 :将所述第二沉淀用Tris-HCl重悬，得到重悬病毒液；
[0047] 在步骤105中，得到的第二沉淀经过Tris-HCl重悬后形成重悬病毒液，而重悬病 毒也其需要进行进一步的提纯操作才可以获得高纯度的病毒。
[0048] 步骤106 :利用蔗糖密度梯度离心法将所述重悬病毒液进行纯化，得到纯化后病 毒；
[0049] 密度梯度区带离心法（简称区带离心法），是将样品加在惰性梯度介质中进行离 心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区 带的分离方法。此法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能象 差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒 不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。
[0050] 在本实施例中，重悬病毒液通过蔗糖密度梯度离心法进行纯化，以去除细胞碎片 等杂物，获得纯化后病毒。得到纯化后病毒后，可利用核酸蛋白检测仪对其检测浓度，进而 判断所获病毒的浓度大小；另外，纯化后病毒也可进行SDS-PAGE分析；通过观测电泳条带 是否有其他明显的杂带进而判定其是否具备较高的纯度。
[0051] 步骤107 :以所述纯化后病毒作为抗原，免疫实验动物3-4次后采血，获得血样，将 所述血样于35-37°C温箱放置l_2h后，4°C放置半天，待血清析出后于2800-3200r/min离心 8-12min，得到EHNV抗血清。
[0052] 纯化后病毒经过乳化操作后，即可作为抗原并对实验动物进行免疫，进而促使实 验动物体内产生相应的抗体，在免疫的过程中，免疫次数具体为3-4次；在采血的过程中， 采用颈动脉采血，获得血样于35-37°C温箱放置l_2h后，4°C放置半天，待血清析出后于 2800-3200r/min离心8-12min，得到EHNV抗血清。获得的EHNV抗血清可进一步的进行效 价的测定。
[0053] 本发明提供的这种EHNV抗血清的制备方法，其实现了 EHNV抗血清的制备，在该方 法中，采用了低速长时离心方法，获得了高浓度EHNV (纯化后病毒），将其作为抗原，对实验 动物进行免疫操作，为制备特异性强和效价高的抗血清奠定了基础。
[0054] 通过该方法实现了高效价EHNV抗血清的制备，获得的抗血清可以应用到EHNV免 疫过氧化物酶检测方法中，为EHN过氧化物酶、酶联免疫吸附试验等免疫学诊断方法提供 诊断试剂，克服了现有技术中EHN免疫学诊断试剂高度依赖进口、检测成本高等问题，进而 有利于EHN免疫学诊断方法的推广使用。
[0055] 为了使得本发明上述实施例的EHNV抗血清的制备方法得到更好的应用，更加有 效应用到水生动物疾病防治中，本发明还在上述实施例的基础之上提供了实施例二，实施 例二是上述实施例的EHNV抗血清的制备方法进一步细化或者增加，现做详细的阐述和解 释，请参考图1至图4 :
[0056] 实施例二
[0057] 在本实施例中，EHNV抗血清的制备方法的制备方法包括以下步骤：
[0058] S1 :在新培养敏感细胞中加入EHNV病毒液，吸附预定时间后再加入M199培养基进 行培养，得到病变细胞液；
[0059] 在本发明中，敏感细胞是指通过体外培养所建立的一种细胞系，具体的，敏感细胞 可以为鲈鱼鳃细胞系（BF-2)、胖头臟肌肉细胞系（FHM)或鲤上皮瘤细胞系系（EPC)。在本 实施例中，所用的敏感细胞具体为CHSE-214,另外，在吸附的过程中，为了实现病毒大量地 吸附的细胞中，吸附的温度为12_18°C (以15°C为最佳）、预定时间为50-70min(以60为 最佳）。此外，为了给CHSE-214细胞提供充足的营养，优选的，所述M199培养基中，含体积 份数为2%的胎牛血清、100IU/mL的青霉素、100μ g/mL的链霉素、2μ g/mL的两性霉素 B ; 并且，在接毒的过程中，所述EHNV病毒液与所述M199培养基的优选的体积比为1:10-1: 7。 通过上述的条件限定，可以使得病毒和细胞均进行快速大量的增殖，其培养24小时后即可 发生细胞病变。
[0060] S2 :将所述病变细胞液于12000 X g离心30min，得到第一上清液和第一沉淀；
[0061] 另外，具体的，在该步骤中，为了保证病毒的活性，优选的，离心温度为4°C。
[0062] S3 :将所述第一沉淀用部分所述第一上清液重悬，然后利用液氮和37°C水浴反复 冻融3次，再进行超声波粉碎3次，每次超声的时间为50-70秒，然后于6500 X g离心15min， 得到第二上清液；
[0063] 为了防止超声过度，在该步骤中，每次超声的时间为50-70秒，以60秒为最佳。
[0064] S4 :将所述第一上清液和所述第二上清液合并后于10000 Xg离心8h，得到第二沉 淀；
[0065] 在该步骤中，离心温度选择为4°C，另外，10000Xg离心8h，其以低速长时间离心 的方式，大大的提高了病毒的沉淀率，为后续获得高浓度的抗原奠定了基础。
[0066] S5 :将所述第二沉淀用浓度为lOOmM、pH为8. 6的Tris-HCl重悬，得到重悬病毒 液；
[0067] 重悬的操作中，浓度为lOOmM、pH为8. 6的Tris-HCl其可以很好的保证病毒的活 性，防止在操作过程中病毒由于外界因素而失活。
[0068] S6 :利用蔗糖密度梯度离心法将所述重悬病毒液进行纯化，得到纯化后病毒；
[0069] 重悬病毒液平分置于准备好的15?60%梯度蔗糖上，4°C 150000Xg超速离心 45min。分别抽吸收集超离后的条带，用100mM、pH = 8. 6的Tris-HCl缓冲液稀释直至鹿糖 浓度为10%，然后稀释液用20%蔗糖垫底，在41：80000\8离心111。沉淀用1001111、？!1 = 8. 6的Tris-HCl缓冲液200 μ L重悬，得到纯化后病毒。通过核酸蛋白检测仪检测纯化后病 毒，其浓度为32mg/mL。
[0070] 另外，在本实施例中，对其进行SDS-PAGE分析，取纯化后的病毒加等体积的上样 缓冲液（〇. 2mol/L DTT的2XSDS)，煮沸5min，置4°C备用。按照《分子克隆实验指南》的方 法制备分离胶和浓缩胶。电泳槽内室加满电泳缓冲液，夕卜围电泳液液面一定要低于内室液 面，然后取20 μ L处理好的样品上样并加蛋白质Marker。接通电原电压调至80V，当溴酚蓝 指示剂跑至浓缩胶和分离胶分界面以下时将电压调至120V直到指示剂跑到电泳槽底，取 出凝胶，用考马斯亮蓝染色4h，用脱色液脱色2h。结果显示，纯化后的EHNV病毒有两条主 要条带，分布在42. 7-66. 2kDa之间，无其他明显的杂带，纯度较高，请参考图2,其中1、2分 别为纯化后病毒的条带，Μ为Marker。
[0071] S7 :以所述纯化后病毒作为抗原，免疫实验动物3-4次后采血，获得血样，将所述 血样于35-37°C温箱放置l_2h后，4°C放置半天，待血清析出后于2800-3200r/min离心 8-12min，得到EHNV抗血清。
[0072] 具体的，所述实验动物包括新西兰大耳白兔（本实施例所使用）、小鼠、山羊或绵 羊中的一种；另外，免疫具体包括以下操作：第1次免疫后每隔三周再次进行免疫，共免疫4 次；且第1次免疫所用的所述抗原利用弗氏完全佐剂乳化后进行免疫；第2-4次免疫所用 的抗原利用弗氏不完全佐剂乳化后进行免疫。
[0073] 表1兔的免疫程序
[0074]
【权利要求】
1. 一种EHNV抗血清的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 在新培养敏感细胞中加入EHNV病毒液，吸附预定时间后再加入M199培养基进行培养， 得到病变细胞液； 将所述病变细胞液于10000Xg-14000Xg离心25-35min，得到第一上清液和第一沉 淀； 将所述第一沉淀用部分所述第一上清液重悬，然后利用液氮和35-37°C水浴反复冻融 3-4次，再进行超声波粉碎3-4次后，于6000 X g-7000 X g离心10-20min，得到第二上清液； 将所述第一上清液和所述第二上清液合并后于8000 X g-12000 X g离心7-9h，得到第 二沉淀； 将所述第二沉淀用Tris-HCl重悬，得到重悬病毒液； 利用蔗糖密度梯度离心法将所述重悬病毒液进行纯化，得到纯化后病毒； 以所述纯化后病毒作为抗原，免疫实验动物3-4次后采血，获得血样，将所述血样于 35-37°C温箱放置l_2h后，4°C放置半天，待血清析出后于2800-3200r/min离心8-12min，得 到H1NV抗血清。
2. 根据权利要求1所述的EHNV抗血清的制备方法，其特征在于，在所述在新培养敏感 细胞中加入EHNV病毒液吸附预定时间后再加入M199培养基进行培养，得到病变细胞液的 步骤中： 所述敏感细胞为CHSE-214、鲈鱼鳃细胞系、胖头臟肌肉细胞系或鲤上皮瘤细胞系； 在所述吸附的过程中，吸附的温度为12_18°C、所述预定时间为50-70min。
3. 根据权利要求1所述的EHNV抗血清的制备方法，其特征在于，在所述在新培养的敏 感细胞中加入EHNV病毒液吸附预定时间后再加入M199培养基进行培养，得到病变细胞液 的步骤中； 所述M199培养基中含体积份数为2%的胎牛血清。
4. 根据权利要求1所述的EHNV抗血清的制备方法，其特征在于，在所述将所述病变细 胞液于10000Xg-14000Xg离心25-35min，得到第一上清液和第一沉淀的步骤中： 所述离心的温度为4°C。
5. 根据权利要求1所述的EHNV抗血清的制备方法，其特征在于，在所述将所述第一沉 淀用部分所述第一上清液重悬，然后利用液氮和35-37°C水浴反复冻融3-4次，再进行超声 波粉碎3-4次后，于6000 X g-7000 Xg离心10-20min，得到第二上清液的步骤中： 每次所述超声波粉碎所用的时间为50-70秒。
6. 根据权利要求1-5任一项所述的EHNV抗血清的制备方法，其特征在于，在所述将所 述第二沉淀用Tris-HCl重悬，得到重悬病毒液的步骤中； 所述Tris-HCl的浓度为lOOmM、pH为8. 6。
7. 根据权利要求6所述的EHNV抗血清的制备方法，其特征在于，在所述以所述纯化 后病毒作为抗原，免疫实验动物3-4次后采血，获得血样，将所述血样于35-37°C温箱放置 l-2h后，4°C放置半天，待血清析出后于2800-3200r/min离心8-12min，得到EHNV抗血清的 步骤中： 所述实验动物包括新西兰大耳白兔、小鼠、山羊或绵羊中的一种。
8. 根据权利要求7所述的EHNV抗血清的制备方法，其特征在于，在所述以所述纯化 后病毒作为抗原，免疫实验动物3-4次后采血，获得血样，将所述血样于35-37°C温箱放置 l-2h后，4°C放置半天，待血清析出后于2800-3200r/min离心8-12min，得到EHNV抗血清的 步骤中，相邻两次免疫的时间间隔为3周。
9. 权利要求1-8任一项所述的EHNV抗血清的制备方法获得的EHNV抗血清。
10. 权利要求1-8任一项所述的EHNV抗血清的制备方法获得的EHNV抗血清在EHNV免 疫过氧化物酶检测方法中的应用。
【文档编号】C07K16/18GK104086653SQ201410343072
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月17日 优先权日:2014年7月17日
【发明者】周毅, 段宏安, 徐晔, 丁超, 姚燕林, 曹洁, 李金华 申请人:中华人民共和国连云港出入境检验检疫局