一种大黄鱼鱼肉抗氧化肽及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明涉及一种大黄鱼鱼肉抗氧化肽及用途，其特征在于：该抗氧化肽为五肽化合物，氨基酸序列为Tyr-Leu-Met-Ser-Arg，ESI-MS检测给出分子量651.77Da（[M+H]+652.45Da）。该抗氧化肽制备方法包括匀浆、酶解、超滤和层析等步骤。制备得到的高活性抗氧化肽Tyr-Leu-Met-Ser-Arg对DPPH自由基、羟基自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，Tyr-Leu-Met-Ser-Arg亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用。Tyr-Leu-Met-Ser-Arg具有显著地抗氧化活性，可用作药品、保健食品或食品添加剂。
【专利说明】一种大黄鱼鱼肉抗氧化肽及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物活性肽及其制备方法和用途，尤其涉及一种大黄鱼鱼肉抗氧化肽及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002]HjtXPseudosciBeim crocea),又名黄鱼、大黄花鱼，为我国传统“四大海产”(大黄鱼、小黄鱼、带鱼、乌贼)之一，是我国近海名贵经济鱼类。但因过度捕捞，野生资源破坏严重。近年来，随着人工养殖技术的逐渐成熟，网箱、围网与土池等多种养殖模式均在大黄鱼养殖中得以应用，大黄鱼的产量逐年增加，大黄鱼的精深加工技术受到日益重视。
[0003]但是， 申请人:发现，以大黄鱼鱼肉为原料，利用酶解技术制备大黄鱼鱼肉抗氧化肽的工艺研究处于空白阶段，而以酶解产物为材料制备高活性鱼肉抗氧化肽及其应用更是未见报道。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种大黄鱼鱼肉抗氧化肽，该抗氧化肽活性强，安全无毒副作用，易于消化吸收，可有效清除自由基和抑制脂质过氧化作用。
[0005]本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种大黄鱼鱼肉抗氧化肽的制备方法。
[0006]本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种大黄鱼鱼肉抗氧化肽的应用。
[0007]本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为:一种大黄鱼鱼肉抗氧化肽，其特征在于该抗氧化肽的氨基酸序列为Tyr-Leu-Met-Ser_Arg(SEQ N0.1D:1),ESI_MS检测给出分子量为 651.77 Da ([M+H]+ 652.45 Da)。
[0008]本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为:一种大黄鱼鱼肉抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤:
1)将大黄鱼鱼肉绞碎，按照料液比1g:8?12 mL加入蒸馏水，调pH值至6.5?7.5，于45?55°C保温 10?15 min;
2)按照大黄鱼鱼肉质量的0.8?1.2%加入木瓜蛋白酶，于45飞5°C温度下酶解3?5 h ；将上述酶解液调pH值至9.(Γ10.0，按照大黄鱼鱼肉质量的1.5^2.0%加入碱性蛋白酶，于45?55 °C温度下酶解3?5 h ；
3)将酶解液加热到90?95°C灭活10?15min, 5000^6000 r/min离心15?25 min，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到抗氧化肽。
[0009]作为改进，所述步骤3)的超滤和层析的具体过程为:
超滤:将上清液调至pH 6.5?7.5，用截留分子量3 kDa的超滤膜进行超滤处理，根据羟基自由基清除活性，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解物；
层析:将上述超滤酶解物用双蒸水配成2(T30 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用双蒸水、0.45?0.55 mol/L和0.90?1.10 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，羟基自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解物；将上述离子交换层析酶解物用双蒸水配成1(T20 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，羟基自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45飞5 μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行纯化，根据羟基自由基清除活性得1个高活性抗氧化肽Tyr-Leu-Met-Ser-Argo
[0010]优选，所述阴离子交换树脂为DEAE-52纤维素，所述凝胶为葡聚糖凝胶G_15。
[0011]再优选，所述RP-HPLC条件为:进样量15?20 μ L ;色谱柱为Zorbax SB C-18column (4.6 X 250 mm);柱温为30 °C Γ流动相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈；梯度洗脱:(Tl00 min乙腈浓度从0勻速升至100% ;洗脱速度1.0 mL/min ;紫外检测波长280 nm。
[0012]本发明为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为:一种大黄鱼鱼肉抗氧化肽的应用，其特征在于Tyr-Leu-Met-Ser-Arg对DPPH自由基、羟基自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，Tyr-Leu-Met-Ser-Arg亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用；Tyr-Leu-Met-Ser-Arg具有显著的抗氧化活性,可以作为药品、保健食品和食品添加剂进行应用。
[0013]与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明选用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶作为酶解用酶，通过生物酶解法同时融合超滤分级和色谱精制，制得的多肽具有较强的抗氧化活性；与化学合成的抗氧化剂相比较，本发明制得的抗氧化肽具有抗氧化活性强、易于消化吸收和安全无毒副作用等优点，可用作药品、保健食品或食品添加剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1是本发明的大黄鱼鱼肉超滤酶解物的阴离子交换树脂(DEAE-52纤维素)层析图；
图2是本发明的大黄鱼鱼肉酶解物阴离子交换层析分离组分(Fr.A、Fr.C和Fr.D)的羟基自由基清除率图；
图3是本发明的阴离子交换层析分离组分(Fr.C)的葡聚糖凝胶G-15层析图；
图4是本发明的凝胶层析所分离各组分的羟基自由基清除率图；
图5是本发明的葡聚糖凝胶G-15制备酶解物(Fr.C_l)的RP-HPLC图；
图6是本发明的Tyr-Leu-Met-Ser-Arg的质谱(ES1-MS)图和结构式；
图7是本发明的Tyr-Leu-Met-Ser-Arg的脂质过氧化抑制作用图。
【具体实施方式】
[0015]以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0016]实施例1:一种大黄鱼鱼肉抗氧化肽的制备方法，制备工艺流程如下:大黄鱼鱼肉〃酶解〃酶解物〃超滤〃离子交换层析〃凝胶过滤层析〃高效液相色谱制备〃抗氧化肽。
[0017]1)将大黄鱼鱼肉绞碎，按照料液比1 g:12 mL加入蒸馏水，调pH值至7.0，于50°C保温10 min。
[0018]2)按照大黄鱼鱼肉质量的1.0%加入木瓜蛋白酶，于50°C酶解4 h ;将上述酶解液调pH值至9.5，按照大黄鱼鱼肉质量的2.0%加入碱性蛋白酶，于50°C酶解4 h。经过试验重复验证，其酶解产物成分稳定，具有很高的重复性。
[0019]3)将酶解液加热到90°C灭活10 min,6000 r/min离心15 min,取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到抗氧化肽。
[0020]①超滤:将上清液调至pH 7.0，采用截留分子量3 kDa的超滤膜进行超滤处理，根据羟基自由基清除活性，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解物；
②DEAE-52纤维素阴离子交换层析:将上述超滤酶解物用双蒸水配成25mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用双蒸水、0.50 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，羟基自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解物(Fr.C)(图1和图2)；
③凝胶层析:将上述离子交换层析酶解物(Fr.C)用双蒸水配成15 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，羟基自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物(Fr.C-1)(图3和图4);
④高效液相色谱精制:将上述凝胶制备酶解物(Fr.C-1)用双蒸水配成50 μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行纯化(条件:进样量20 μ L ;色谱柱为Zorbax SBC-18 (250 mm X 4.6 mm，5 μ m);柱温为30°C ;流动相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈；梯度洗脱:0-100 min乙腈浓度从0勻速升至100% ;洗脱速度1.0 mL/min ;紫外检测波长280 nm，根据羟基自由基清除活性得1个高活性抗氧化肽(图5)；
⑤结构检测:收集羟基自由基清除活性最高的1个抗氧化肽，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Tyr-Leu-Met-Ser-Arg，ES1-MS检测给出分子量为651.77 Da ([M+H] +652.45 Da)(见图 6)。
[0021]将上述制得的大黄鱼鱼肉抗氧化肽Tyr-Leu-Met-Ser-Arg进行DPPH自由基清除实验、轻基自由基清除实验、ABTS自由基清除实验、超氧阴尚子自由基清除实验和脂质过氧化抑制实验。实验结果表明:Tyr-Leu-Met-Ser_Arg对DPPH自由基(EC5Q 1.35 mg/mL)、轻基自由基(EC5Q 1.92 mg/mL) > ABTS自由基(EC5。0.31 mg/mL)和超氧阴离子自由基(EC5Q0.45 mg/mL)具有良好的清除作用；同时，Tyr-Leu-Met-Ser-Arg亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用(图7)。
[0022]最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种大黄鱼肉肉抗氧化肽，其特征在于该抗氧化肽的氨基酸序列为Tyr-Leu-Met-Ser-Arg, ES1-MS 检测分子量为 651.77 Da。
2.一种大黄鱼鱼肉抗氧化肽制备方法，其特征在于包括以下步骤: 1)将大黄鱼鱼肉绞碎，按照料液比Ig:8?12 mL加入蒸馏水，调pH值至6.5?7.5，于45?55°C保温 10?15 min ； 2)按照大黄鱼鱼肉质量的0.8?1.2%加入木瓜蛋白酶，于45飞5°C酶解3?5 h ;将上述酶解液调pH值至9.(Γ10.0，按照大黄鱼鱼肉质量的1.5?2.0%加入碱性蛋白酶，于45飞5°C酶解3?5 h ； 3)将酶解液加热到90?95°C灭活10?15min, 5000^6000 r/min离心15?25 min，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到抗氧化肽。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)的超滤和层析的具体过程为: 超滤:将上清液调至PH 6.5?7.5，采用分子量3 kDa的超滤膜进行超滤处理，根据羟基自由基清除活性，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解物； 层析:将上述超滤酶解物用双蒸水配成2(T30 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用双蒸水、0.45?0.55 mol/L和0.90?1.10 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，羟基自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解物；将上述离子交换层析酶解物用双蒸水配成1(T20 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，羟基自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用羟基配成45飞5 μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行纯化，根据抗氧化活性得I个高活性抗氧化肽Tyr-Leu-Met-Ser-Arg0
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述阴离子交换树脂为DEAE-52纤维素，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-15 ;所述RP-HPLC条件为:进样量15?20 μ L ;色谱柱为Zorbax SB C-18 column ;柱温为30°C ;流动相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈；梯度洗脱:(Tl00 min乙腈浓度从O勻速升至100% ;洗脱速度1.0 mL/min ;紫外检测波长280 nm。
5.一种大黄鱼鱼肉抗氧化肽的用途,其特征在于:Tyr-Leu-Met-Ser-Arg用于药品、保健食品或食品添加剂对DPPH自由基、羟基自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基的清除；或者，Tyr-Leu-Met-Ser-Arg用于药品、保健食品或食品添加剂起到脂质过氧化抑制作用的用途。
【文档编号】C07K1/34GK104250285SQ201410368760
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2014年7月30日 优先权日:2014年7月30日
【发明者】王斌, 马路凯, 迟长凤, 李涛 申请人:浙江海洋学院