一种从单粒棉籽棉絮中快速提取蛋白质的方法
【专利摘要】本发明公开一种从单粒棉籽棉絮中快速提取蛋白质的方法，包括以下步骤：取轧花后的单粒棉籽外壳上残余棉絮3-8mg剪碎置于1.5或2ml离心管中；加入200-500μl蛋白提取液，置于90-100℃保持30-90分钟，期间振荡2-3次；离心取上清，加入和蛋白提取液等体积的反应终止液，混匀后用于后续蛋白检测。本发明所述的蛋白提取方法样品需求量小，仅需单粒棉籽轧花后残留的棉絮，约5mg即可；本发明蛋白提取方法提取过程中不会对棉籽造成损害，不影响棉籽的后期种植；本发明蛋白提取方法简单快捷，不需将棉籽种植后进行鉴定，全过程仅需1小时；本发明的蛋白提取方法试剂配制简单易得，成本低，适合大规模棉籽蛋白提取鉴定。
【专利说明】一种从单粒棉籽棉絮中快速提取蛋白质的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体地说是一种从单粒棉籽棉絮中快速提取蛋白质的 方法。
【背景技术】
[0002] 近些年来，随着转基因棉花的大规模种植，如何快速精确的区分转基因棉花与非 转基因棉花就变的非常重要，尤其对于科研人员，在以转基因棉花为对象开展研究之前，必 须要对其进行鉴定，确定是否表达外源蛋白。但是通常情况下，科研人员拿到的棉花材料 都是轧花后的棉籽，要想进行身份鉴定，只能用破坏性方法从棉籽胚中提取蛋白进行外源 蛋白检测，或者将棉籽进行种植后使用植株叶片进行检测。两种方案都有明显的弊端：（1) 使用棉籽胚进行破坏性鉴定，只能是抽样检测，不能百分之百验证其它棉籽的身份，且经检 测过的棉籽已遭到破坏无法继续使用进行后续研究；（2)将棉籽进行种植后再进行检测， 耗时长，且如果鉴定出非要求结果还得补种，费时费力，补种后的棉花不能做到生长周期一 致，影响实验结果。
[0003] 因此，为了保证棉籽蛋白鉴定的准确性，亟需建立一种简单、高效、无损的棉籽蛋 白提取方法。
【发明内容】
[0004] 发明目的：针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种简单、高效、无损 的从单粒棉籽棉絮中快速提取蛋白质的方法，以解决传统棉籽蛋白提取鉴定方法耗时长， 对棉籽造成不可逆损伤的缺点，满足棉花外源蛋白快速鉴定的需要。
[0005] 技术方案：为实现上述发明的目的，本发明采用的技术方案是：一种从单粒棉籽 棉絮中快速提取蛋白质的方法，包括以下步骤：
[0006] 1)取轧花后的单粒棉籽外壳上残余棉絮3_8mg剪碎置于1. 5或2ml离心管中；
[0007] 2)加入200-500μ 1蛋白提取液，置于90-KKTC保持30-90分钟，期间振荡2-3 次；
[0008] 3)尚心取上清，加入和蛋白提取液等体积的反应终止液，混勻后用于后续蛋白检 测。
[0009] 其中，上述步骤（2)的蛋白提取液的有效成分为H2SO4和SDS的混合溶液。
[0010] 其中，上述H2SO4的质量百分比浓度为10?98%，SDS的质量百分比浓度为0. 5? 2 %。优选地，所述H2SO4质量百分比浓度为50 %，所述SDS的质量百分比浓度为1 %。
[0011] 其中，上述步骤3)的离心条件为3000-5000r/min离心5-10min。
[0012] 其中，上述步骤3)的反应终止液为NaOH溶液、KOH溶液或NH3溶液中的一种。
[0013] 其中，上述反应终止液中NaOH、KOH或NH3的浓度为15mol/L。
[0014] 有益效果：与现有棉籽蛋白提取技术相比具有以下优点：
[0015] (1)本发明所述的蛋白提取方法样品需求量小，仅需单粒棉籽轧花后残留的棉絮， 约5mg即可；
[0016] (2)本发明所述的蛋白提取方法提取过程中不会对棉籽造成损害，不影响棉籽的 后期种植；
[0017] (3)本发明所述的蛋白提取方法简单快捷，不需将棉籽种植后进行鉴定，全过程仅 需1小时左右；
[0018] (4)本发明所述的蛋白提取方法试剂配制简单易得，成本低，适合大规模棉籽蛋白 提取鉴定。
【具体实施方式】
[0019] 以下结合表格与具体实施进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限 制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明的范围。
[0020] 实施例中所用的生化试剂均为市售。以下实施方案中，使用的棉花材料为中棉所 30及其母本中棉所16。由中国农科院棉花所提供。
[0021] 实施例1 :
[0022] 本发明蛋白提取液中酸的种类的比较选择：取轧花后的中棉所30及其母本中棉 所16棉籽外壳上残余棉絮311^、411^、511^、711^、811^剪碎分别置于5个21111离心管中 ；依次按 顺序分别加入 200μ 1 包含 0· 5% SDS 和 10% H2S04、250y 1 包含 0· 8% SDS 和 30% H2S04、 300 μ 1 包含 I. 0% SDS 和 50% H2S04、350 μ 1 包含 I. 5% SDS 和 70% H2S04、500 μ 1 包含 2% SDS和98% H2SO4的蛋白提取液；
[0023] 再取乳花后的中棉所30及其母本中棉所16棉籽外壳上残余棉絮3mg、4mg、5mg、 7mg、8mg剪碎分别置于5个2ml离心管中；依次按顺序分别加入200 μ 1包含0· 5% SDS和 5% HCl、250y 1 包含 0· 8% SDS 和 10% HCl、300y 1 包含 L 0% SDS 和 20% HCl、350y 1 包 含L 5% SDS和30% HC1、500 μ 1包含2% SDS和36. 5% HCl的蛋白提取液；
[0024] 再取乳花后的中棉所30及其母本中棉所16棉籽外壳上残余棉絮3mg、4mg、5mg、 7mg、8mg剪碎分别置于5个2ml离心管中；依次按顺序分别加入200 μ 1包含0· 5% SDS和 5% ΗΝ03、250μ 1 包含 0· 8% SDS 和 10% ΗΝ03、300μ 1 包含 L 0% SDS 和 30% ΗΝ03、350μ 1 包含I. 5% SDS和50% ΗΝ03、500 μ 1包含2% SDS和65% HNO3的蛋白提取液；
[0025] 将上述所有的蛋白提取液分别置于95°C保持60分钟，期间振荡2-3次；孵育结束 后离心取上清，加入各自对应的反应终止液，混匀后用于后续检测；
[0026] 使用Envirologix公司的Bt蛋白Elisa检测试剂盒对上述溶液进行检测，结果如 表1、2、3所示：只有含I. 0% SDS和50% H2SO4的蛋白提取液的中棉所30棉花组检测结果 为阳性，其余组均未检测出Bt蛋白，说明使用含I. 0% SDS和50% H2SO4蛋白提取液、反应 终止液为15mol/L的NaOH溶液的提取效果最佳。
[0027] 表1含不同浓度SDS和H2SO4的蛋白提取液在95°C孵育不同时间后的Bt蛋白 Elisa检测结果；
[0028]
【权利要求】
1. 一种从单粒棉籽棉絮中快速提取蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 取轧花后的单粒棉籽外壳上残余棉絮3-8mg剪碎置于1. 5或2ml离心管中； 2) 加入200-500 ill蛋白提取液，置于90-KKTC保持30-90分钟，期间振荡2-3次； 3) 离心取上清，加入和蛋白提取液等体积的反应终止液，混匀后用于后续蛋白检测。
2. 根据权利要求1所述的一种从单粒棉籽棉絮中快速提取蛋白质的方法，其特征在 于，所述步骤（2)的蛋白提取液的有效成分为H2S04和SDS的混合溶液。
3. 根据权利要求2所述的一种从单粒棉籽棉絮中快速提取蛋白质的方法，其特征在 于，所述H2S04的质量百分比浓度为1(T98%，SDS的质量百分比浓度为0. 5~2%。
4. 根据权利要求1所述的一种从单粒棉籽棉絮中快速提取蛋白质的方法，其特征在 于，所述步骤3)的离心条件为3000-5000r/min离心5-10min。
5. 根据权利要求1所述的一种从单粒棉籽棉絮中快速提取蛋白质的方法，其特征在 于，所述步骤3)的反应终止液为NaOH溶液、KOH溶液或NH3溶液中的一种。
6. 根据权利要求5所述的一种从单粒棉籽棉絮中快速提取蛋白质的方法，其特征在 于，所述反应终止液中NaOH、K0H或NH3的浓度为15mol/L。
【文档编号】C07K1/14GK104402967SQ201410724653
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月3日 优先权日:2014年12月3日
【发明者】方志翔, 刘标, 李衍亮 申请人:环境保护部南京环境科学研究所