专利名称：直接表达活化人c蛋白的载体和化合物的制作方法
技术领域：
本发明提供编码人C蛋白活性的新的DNA化合物和重组DNA克隆载体。这些载体提供了一种简单而有效的表达活性形式人C蛋白的工具。生产C蛋白的先有技术方法包括非活性形式的C蛋白(一种酶原)的生产，该方法需要用高水平的凝血酶或凝血酶和凝血调节蛋白(thrombomodulin)或其它昂贵的酶来进行活化处理。本发明提供了一种生产活化C蛋白的方法，它避免了这个繁琐的活化步骤，即提供一些载体，这些载体由于将蛋白水解切割位点编码DNA引入了C蛋白编码顺序，所以能在重组宿主细胞中直接表达活化C蛋白。
C蛋白是一种维生素K依赖性血浆蛋白，其生理上的重要性主要在于控制止血。C蛋白是以一种无活性的分子而合成的，本文将这种无活性分子称为初生C蛋白。初生C蛋白经过复杂的加工，产生数种不同的无活性分子，这将在下面作更详细的描述。本文将无活性的、分泌形式的C蛋白称为C蛋白酶原。血液中C蛋白的活化是通过一个与凝血调节蛋白-凝血酶复合物有关的反应而进行的。活化C蛋白及其辅因子S蛋白是具有重要生理意义的抗凝血剂。活化C蛋白能够防止血管内形成血栓并控制已有血块的扩展。近年来已搞清了活化型C蛋白的作用机制和将无活性酶原激活为活性蛋白酶的活化机制(综述见J.E.GardinerandJ.H.Griffin，ProgressinHematology，Vol，XⅢ，pp.265-278，ed.ElmerB.Brown，GruneandStratton，Inc.，1983)。
C蛋白的活化涉及凝血级联中最后一个丝氨酸蛋白酶即凝血酶，以及一种称为凝血调节蛋白的内皮细胞膜连结的糖蛋白。凝血调节蛋白与凝血酶形成紧密的化学计量复合物。凝血调节蛋白与凝血酶形成复合物后，完全改变了凝血酶的功能特性。凝血酶通常使血纤维蛋白原凝结，使血小板活化，并使凝血辅因子Ⅴ和Ⅷ转化为其活性形式Ⅴa和Ⅷa。最后，凝血酶激活C蛋白，但很慢而且效率很低。相反，凝血酶与凝血调节蛋白形成复合物后，则不能使血纤维蛋白原凝结，不能激活血小板，也不能将凝血因子Ⅴ和Ⅷ转化为其活化形式Ⅴa和Ⅷa，但却能非常有效地激活C蛋白。凝血调节蛋白-凝血酶激活C蛋白的速度常数比单独的凝血酶的速度常数高1，000多倍。
为了了解活化C蛋白下降调节血液凝固的机制，下面简单描述凝血酶系统。最好将凝血系统视为一个链反应，这一反应依次将若干酶原激活为活性丝氨酸蛋白酶。这个链反应最终产生凝血酶，凝血酶通过有限的蛋白水解而将血浆纤维蛋白原转化为不溶性的纤维蛋白凝胶。凝血级联中的两个关键步骤是通过凝血因子Ⅸa将凝血因子Ⅹ转变为Ⅹa;通过凝血因子Ⅹa将凝血酶原转变为凝血酶。这两个反应都是在细胞表面发生的，最明显的是在血小板表面。这两个反应都需要辅因子。主要的辅因子为因子Ⅴ和Ⅷ，它们以活性较小的前体在该系统中循环，但如果形成了先头的几个凝血酶分子，凝血酶反过来进入循环而通过有限的蛋白水解激活这两个辅因子。激活后的辅因子Ⅴa和Ⅷa使凝血酶原转化为凝血酶及因子Ⅹ转化为因子Ⅹa的速度都增加大约5个数量级。活化的C蛋白优先作用于低活性凝血因子Ⅴ和Ⅷ的活化形式，使凝血辅因子Ⅴa和Ⅷa发生蛋白水解降解、水解和不可逆破坏。相反，凝血因子Ⅴ和Ⅷ几乎不是活化C蛋白的底物。
一个重要的活化C蛋白的辅因子是S蛋白，它也是一个维生素K依赖性血浆蛋白。S蛋白使活化C蛋白介导的因子Ⅴa和Ⅷa的水解速度增加几乎25倍。
C蛋白被认为是一种有价值的治疗剂(参见例如列入本文参考文献的欧洲专利公告第0，215，548和0，191，606号)。活化C蛋白是一种新的抗凝血剂，其治疗指数比现有的抗凝血剂如肝素和口服羟基香豆素型抗凝血剂要宽。在未产生凝血酶时，C蛋白酶原和活化C蛋白都不起作用，因为需要凝血酶将凝血因子Ⅴ转化为Ⅴa，将Ⅷ转化为Ⅷa;这两种活化型辅因子是活化C蛋白的最佳底物。C蛋白酶原的激活也需要凝血酶，因为如果没有凝血调节蛋白-凝血酶复合物，C蛋白酶原就不能转化为其活性形式。
活化C蛋白是一种急需的抗凝血剂，因为活化C蛋白有使辅因子Ⅴa和Ⅷa失活的作用。由于需要凝血酶将因子Ⅴ和Ⅷ转化为其活化形式Ⅴa和Ⅷa，所以C蛋白只是在产生凝血酶之后才起到抗凝血剂的作用。与活化C蛋白相反，常规抗凝血剂只要给予患者就在整个循环过程中保持恒定的抗凝血剂状态，因而，比起C蛋白或活化C蛋白，大大增加了发生出血并发症的危险性。因此活化C蛋白是一种有广泛临床应用的急需的抗凝血剂，它可用作肝素和羟基香豆素类化合物的替代物。
在某些疾病如遗传性C蛋白缺陷症中，C蛋白酶原具有很重要的治疗作用。如果是先天性纯合型C蛋白缺陷症，则患者在童年早期就由于紫癜暴发而死亡，紫癜暴发是播散血管内凝血的常见致死形式。如果是杂合型C蛋白缺陷症，患者患有严重的阵发性血栓栓塞。据临床上确认，用来治疗血友病B或因子Ⅸ缺陷症的血浆蛋白浓缩物中含有C蛋白杂质，这种浓缩物可有效地预防和治疗杂合型C蛋白缺陷症中的血管内凝血。在血栓症如播散血管内凝血及某些易形成血栓的疾病如大创伤、大外科和肿瘤中，还观察到C蛋白的异常低水平。
虽然酶原形式的C蛋白作治疗用非常有效，但对某些疾病来说，给予患者活化形式的C蛋白能大大提高治疗效果。例如，在诸如心肌梗塞或深度静脉血栓形成(尤其是作下肢手术后出现的静脉血栓形成)等疾病中，患者的C蛋白酶原水平正常但活化C蛋白的水平仍不足以防止产生血栓，也不足以供除去已有血栓之需。不能产生足量的活化C蛋白可能是由于凝血调节蛋白水平不足，但无论原因如何，要有效地治疗这些疾病都需要服用活化C蛋白而非酶原。本发明提供利用重组DNA技术生产活化人C蛋白的新化合物和方法。
为便于理解本发明和C蛋白的活化，下面画出初生人C蛋白的编码顺序及相应的氨基酸残基顺序。
10203040ATGTGGCAGCTCACAAGCCTCCTGCTGTTCGTGGCCACCTGGGGAATTMETTRPGLNLEUTHRSERLEULEULEUPHEVALALATHRTRPGLYILE510155060708090TCCGGCACACCAGCTCCTCTTGACTCAGTGTTCTCCAGCAGCGAGCGTSERGLYTHRPROALAPROLEUASPSERVALPHESERSERSERGLUARG202530100110120130140GCCCACCAGGTGCTGCGGATCCGCAAACGTGCCAACTCCTTCCTGGAGALAHISGLNVALLEUARGILEARGLYSARGALAASNSERPHELEUGLU354045150160170180190GAGCTCCGTCACAGCAGCCTGGAGCGGGAGTGCATAGAGGAGATCTGTGLULEUARGHISSERSERLEUGLUARGGLUCYSILEGLUGLUILECYS505560200210220230240GACTTCGAGGAGGCCAAGGAAATTTTCCAAAATGTGGATGACACACTGASPPHEGLUGLUALALYSGLUILEPHEGLNASNVALASPASPTHRLEU65707580250260270280GCCTTCTGGTCCAAGCACGTCGACGGTGACCAGTGCTTGGTCTTGCCCALAPHETRPSERLYSHISVALASPGLYASPGLNCYSLEUVALLEUPRO859095290300310320330TTGGAGCACCCGTGCGCCAGCCTGTGCTGCGGGCACGGCACGTGCATCLEUGLUHISPROCYSALASERLEUCYSCYSGLYHISGLYTHRCYSILE100105110340350360370380GACGGCATCGGCAGCTTCAGCTGCGACTGCCGCAGCGGCTGGGAGGGCASPGLYILEGLYSERPHESERCYSASPCYSARGSERGLYTRPGLUGLY115120125
390400410420430CGCTTCTGCCAGCGCGAGGTGAGCTTCCTCAATTGCTCGCTGGACAACARGPHECYSGLNARGGLUVALSERPHELEUASNCYSSERLEUASPASN130135140440450460470480GGCGGCTGCACGCATTACTGCCTAGAGGAGGTGGGCTGGCGGCGCTGTGLYGLYCYSTHRHISTYRCYSLEUGLUGLUVALGLYTRPARGARGCYS145150155160490500510520AGCTGTGCGCCTGGCTACAAGCTGGGGGACGACCTCCTGCAGTGTCACSERCYSALAPROGLYTYRLYSLEUGLYASPASPLEULEUGLNCYSHIS165170175530540550560570CCCGCAGTGAAGTTCCCTTGTGGGAGGCCCTGGAAGCGGATGGAGAAGPROALAVALLYSPHEPROCYSGLYARGPROTRPLYSARGMETGLULYS180185190580590600610620AAGCGCAGTCACCTGAAACGAGACACAGAAGACCAAGAAGACCAAGTALYSARGSERHISLEULYSARGASPTHRGLUASPGLNGLUASPGLNVAL195200205630640650660670GATCCGCGGCTCATTGATGGGAAGATGACCAGGCGGGGAGACAGCCCCASPPROARGLEUILEASPGLYLYSMETTHRARGARGGLYASPSERPRO210215220680690700710720TGGCAGGTGGTCCTGCTGGACTCAAAGAAGAAGCTGGCCTGCGGGGCATRPGLNVALVALLEULEUASPSERLYSLYSLYSLEUALACYSGLYALA225230235240730740750760GTGCTCATCCACGCCTCCTGGGTGCTGACAGCGGCCCACTGCATGGATVALLEUILEHISPROSERTRPVALLEUTHRALAALAHISCYSMETASP245250255770780790800810GAGTCCAAGAAGCTCCTTGTCAGGCTTGGAGAGTATGACCTGCGGCGCGLUSERLYSLYSLEULEUVALARGLEUGLYGLUTYRASPLEUARGARG260265270
820830840850860TGGGAGAAGTGGGAGCTGGACCTGGACATCAAGGAGGTCTTCGTCCACTRPGLULYSTRPGLULEUASPLEUASPILELYSGLUVALPHEVALHIS275280285870880890900910CCCAACTACAGCAAGAGCACCACCGACAATGACATCGCACTGCTGCACPROASNTYRSERLYSSERTHRTHRASPASNASPILEALALEULEUHIS290295300920930940950960CTGGCCCAGCCCGCCACCCTCTCGCAGACCATAGTGCCCATCTGCCTCLEUALAGLNPROALATHRLEUSERGLNTHRILEVALPROILECYSLEU3053103153209709809901000CCGGACAGCGGCCTTGCAGAGCGCGAGCTCAATCAGGCCGGCCAGGAGPROASPSERGLYLEUALAGLUARGGLULEUASNGLNALAGLYGLNGLU32533033510101020103010401050ACCCTCGTGACGGGCTGGGGCTACCACAGCAGCCGAGAGAAGGAGGCCTHRLEUVALTHRGLYTRPGLYTYRHISSERSERARGGLULYSGLUALA34034535010601070108010901100AAGAGAAACCGCACCTTCGTCCTCAACTTCATCAAGATTCCCGTGGTCLYSARGASNARGTHRPHEVALLEUASNPHEILELYSILEPROVALVAL35536036511101120113011401150CCGCACAATGAGTGCAGCGAGGTCATGAGCAACATGGTGTCTGAGAACPROHISASNGLUCYSSERGLUVALMETSERASNMETVALSERGLUASN37037538011601170118011901200ATGCTGTGTGCGGGCATCCTCGGGGACCGGCAGGATGCCTGCGAGGGCMETLEUCYSALAGLYILELEUGLYASPARGGLNASPALACYSGLUGLY3853903954001210122012301240GACAGTGGGGGGCCCATGGTCGCCTCCTTCCACGGCACCTGGTTCCTGASPSERGLYGLYPROMETVALALASERPHEHISGLYTHRTRPPHELEU405410415
12501260127012801290GTGGGCCTGGTGAGCTGGGGTGAGGGCTGTGGGCTCCTTCACAACTACVALGLYLEUVALSERTRPGLYGLUGLYCYSGLYLEULEUHISASNTYR42042543013001310132013301340GGCGTTTACACCAAAGTCAGCCGCTACCTCGACTGGATCCATGGGCACGLYVALTYRTHRLYSVALSERARGTYRLEUASPTRPILEHISGLYHIS4354404451350136013701380ATCAGAGACAAGGAAGCCCCCCAGAAGAGCTGGGCACCTTAGILEARGASPLYSGLUALAPROGLNLYSSERTRPALAPRO 2 450455460其中A为脱氧腺苷酸、G为脱氧乌苷酸、C为脱氧胞苷酸、T为胸苷酸、ALA为丙氨酸、ARG为精氨酸、ASP为天冬酰胺、ASP为天冬氨酸、CYS为半胱氨酸、GLN为谷氨酰胺、GLU为谷氨酸、GLY为甘氨酸、HIS为组氨酸、ILE为异亮氨酸、LEU为亮氨酸、LYS为赖氨酸、MET为甲硫氨酸、PHE为苯丙氨酸、PRO为脯氨酸、SER为丝氨酸、THR为苏氨酸、TRP为色氨酸、TYR为酪氨酸、VAL为缬氨酸。
上面画出的DNA顺序得自由编码人C蛋白的人肝mRNA制备的cDNA克隆。本领域专业人员知道，遗传密码具有简并性质，因此能构建出许多编码相同氨基酸残基顺序的不同DNA顺序。因此上面画出的初生人C蛋白的cDNA顺序只是许多可能的初生人C蛋白编码顺序中的一种。在构建cDNA克隆时，在C蛋白编码cDNA的末端构建了一个5′多聚G顺序、一个3′多聚C顺序、以及5′和3′PstⅠ限制酶识别顺序。对其中的两个cDNA克隆进行操作，构建出一个DNA分子，该分子既包含初生人C蛋白的编码顺序，也包含位于编码区5′和3′端而编码非翻译mRNA的若干DNA区段。将该DNA分子插入质粒pBR322的PstⅠ位点，构建出质粒pHC7。这样，质粒pHC7就包含了上述编码顺序(仍只画出该分子的一条链)，还分别在初生人C蛋白编码顺序编码链的5′端和3′端含有下面两个附加顺序5′-CTGCAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCTGTCATGGCGGCAGGACGGCGAACTTGCAGTATCTCCACGACCCGCCCCTACAGGTGCCAGTGCCTCCAGA-3′或5′-CGACCCTCCCTGCAGGGCTGGGCTTTTGCATGGCAATGGATGGGACATTAAAGGGACATGTAACAAGCACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCTGCAG-3′由于DNA碱基配对具有互补性质，因此双链DNA分子的一条链的顺序足以确定相反链的顺序。质粒pHC7可用常规方法从大肠杆菌(E.coli)K12RR1/pHC7中分离，后者是寄存在北方地区研究实验室(NRRL，Peoria，Illinois)永久贮存培养物保藏中心的一个菌株，并成为该保藏中心的一部分。可从NRRL得到登记号为NRRLB-15926的大肠杆菌K12RR1/pHC7培养物。附图2表示了质粒pHC7的限制位点和功能图谱。
初生C蛋白也可以用简图表示如下。
前肽原-初生人C蛋白的氨基酸残基1-42，编码人C蛋白的信号肽和肽原，它对指导C蛋白的分泌和γ-羧基化具有重要意义。
LC-初生C蛋白的氨基酸残基43-197，这些残基一经翻译后修饰，即构成双链酶原(由单链酶原除去KR二肽而形成，如下所述)和活化型C蛋白的轻链(LC)。
KR-初生人C蛋白的氨基酸残基198-199，据信这两个残基可能由一个两步反应而除去(根据与牛C蛋白的同源性)，第一步为切割(或者在残基197-198之间，或者在199-200之间)，接着是羧肽酶或氨肽酶作用，形成双链C蛋白。
AP-初生C蛋白的氨基酸残基200-211，构成活化肽，将其从C蛋白的酶原形式中除去即得到活化C蛋白。
AHC-初生C蛋白的氨基酸残基212-461，这些残基一经翻译后修饰，即构成活性C蛋白的活化重链(AHC)。
HC-双链形式C蛋白酶原的重链，它一经翻译后修饰，即构成氨基酸残基200-461，即AP和AHC。
人C蛋白酶原是一种在肝脏内合成的丝氨酸蛋白酶前体，并存在于血液中。C蛋白要经过翻译后修饰才能表达完全的生物活性，修饰过程需要维生素K。由二硫链连接的成熟双链C蛋白酶原是由单链前体经有限蛋白水解而产生的。据信这种有限蛋白水解包括，在初生多肽的细胞内加工和从细胞中分泌的过程中，切割并除去由氨基酸残基1-42组成的前肽原，并除去氨基酸残基198和199而形成见于酶原的两条链。该酶原活化为活性丝氨酸蛋白酶的过程包括ARG-LEU肽链(残其211和212)的蛋白水解切割。这后一个切割反应释放出一个构成双链酶原分子较大链(重链)氨基末端的十二肽(残基200-211)。C蛋白被显著糖基化，成熟酶含有～23%的糖。C蛋白还含有许多不常见的氨基酸，包括γ-羧基谷氨酸和β-羟基天冬氨酸(赤-L-β-羟基天冬氨酸)。γ-羧基谷氨酸(gla)是由谷氨酸残基借助肝微粒体羧化酶进行γ-谷氨酸基羧基化而产生的，该羧化酶需维生素K作辅因子。
人C蛋白的活化也可以用简图表示如下。本领域专业人员知道，简图中所示各步骤的顺序并不一定反映体内途径。
本发明提供直接表达重组活化C蛋白所用的新的化合物、载体、转化体和方法。
就本文所公开并请求保护的本发明的目的而言，下列术语限定如下。
Ad2LP-2型腺病毒主要后期启动子。
本文所述的蛋白质或肽中的氨基酸残基简写如下三字母缩写氨基酸残基单字母缩写PHE苯丙氨酸FLEU亮氨酸LILE异亮氨酸IMET甲硫氨酸MVAL缬氨酸VSER丝氨酸SPRO脯氨酸PTHR苏氨酸TALA丙氨酸ATYR酪氨酸YHIS组氨酸HGLN谷氨酰胺QASN天冬酰胺NLYS赖氨酸KASP天冬氨酸DGLU谷氨酸ECYS半胱氨酸C
TRP色氨酸WARG精氨酸RGLY甘氨酸GApR-氨苄青霉素抗性表型或赋予该表型的基因。
BK-BK病毒的DNA。
CAT-氯霉素乙酰转移酶基因。
Enh或增强子-BK病毒的增强子。
ep或SV40ep-一个DNA片段，包含T抗原基因的SV40早期启动子、T抗原结合位点、SV40增强子、SV40复制起点。
γ-羧基化-一种反应，它将羧基加至谷氨酸的γ-碳上。
γ-羧基化蛋白-一种蛋白，其中有某些谷氨酸残基已经过γ-羧基化。
IVS-编码一个内含子的DNA，也称为插入顺序。
MMTpro-小鼠金属硫因-I基因的启动子。
初生蛋白-mRNA转录本翻译后产生的、未进行任何翻译后修饰的多肽。但诸如谷氨酸残基的γ-羧基化和天冬氨酸残基的羟基化等翻译后修饰，可以在mRNA转录本完全翻译为蛋白质之前进行。
NeoR-新霉素抗性基因，它也可用来赋予抗生素G418抗性。
pA-编码多聚腺苷酸化信号的DNA顺序。
启动子-指导DNA转录为RNA的DNA顺序。
C蛋白活性-人C蛋白的与蛋白水解、酰胺水解、酯水解和生物活性(抗凝血或血纤维蛋白原溶解活性)有关的任何性质。测试蛋白抗凝血活性的方法是本领域内熟知的(参见Grinnelletal.，Biotechnology5∶1189，1987)。
重组DNA克隆载体-包括染色体整合剂、自主复制质粒和噬菌体在内的所有试剂，但不限于此。这些试剂中包含一个DNA分子，其上可以加入或已经加入一个或多个另外的DNA片段。
重组DNA表达载体-已掺入启动子的任何重组DNA克隆载体。
重组DNA载体-任何重组DNA克隆载体或表达载体。
复制子-控制并允许质粒或其它载体自主复制的DNA顺序。
限制片段-由一种或多种限制性核酸内切酶的作用而产生的任何线性DNA顺序。
敏感宿主细胞-在给定抗生素或其它毒性化合物存在下，如果没有赋予该毒性化合物抗性的DNA片段就不能生长的宿主细胞。
结构基因-编码功能性多肽的任何DNA顺序，包括翻译起始信号和终止信号。
TcR-四环素抗性表型或赋予该表型的基因。
转化-将DNA引入受体宿主细胞而改变受体细胞基因型的过程。
转化体-已经过转化的受体宿主细胞。
翻译激活顺序-使mRNA转录本翻译成肽或多肽的任何DNA顺序，包括编码核糖体结合位点的DNA顺序和翻译起始密码子，如5′-ATG-3′。
酶原-蛋白水解酶的无酶活性的前体。这里所用的C蛋白酶原一词，指分泌的、无活性形式的C蛋白，而不管是单链的还是双链的。
图1由4部分组成，图示质粒pLPC的构建方案，pLPC是用于构建本发明的质粒pLAPC的原料。
图1A图示的是由BK病毒和质粒pdBPV-MMTneo构建质粒pBKneo1。
图1B图示的是由腺病毒2和质粒pSV2cat构建质粒pLPcat。
图1C图示的是由质粒pBKneo1和质粒pLPcat构建质粒pBLcat。
图1D图示的是由质粒pBLcat和质粒pL133构建质粒pLPC。
图2图示的是质粒pL133的构建，质粒pL133是用于构建质粒pLPC的原料。
本发明涉及对表达活化人C蛋白编码的DNA化合物。几种生产人C蛋白酶原和初生人C蛋白的方法已有描述(见欧洲专利公告215548和191606)，但这些并不是直接表达活化人C蛋白的方法。相反，这些方法所产生的C蛋白酶原必须用某些物质处理才能得到活化C蛋白，这些物质有α-凝血酶、胰蛋白酶、Russell氏蝰蛇毒液因子X激活剂、或凝血酶与凝血调节蛋白的混合物。所有这些激活方法都效率低，有可能造成污染，成本也较重组生产活化人C蛋白为高。此外，某些激活反应必须进行严密监测，以使蛋白水解反应在活化肽蛋白水解切割后即停止，否则，所生成的活化C蛋白就会被切割而造成失活。本发明提供用于直接表达重组活化人C蛋白的DNA化合物、重组DNA表达载体、转化细胞系和方法。
本发明提供一种靠真核宿主细胞分泌直接生产重组活化C蛋白的方法，该方法包括(A)用重组DNA载体转化所述宿主细胞，所述载体包括(ⅰ)编码一个氨基酸残基顺序的DNA顺序，所述氨基酸残基顺序从氨基末端到羧基末端含有a)一个γ-羧基化的、分泌的蛋白的信号肽和肽原;
b)人C蛋白的轻链;
c)一个选自赖氨酸-精氨酸、赖氨酸-赖氨酸、或精氨酸-精氨酸的二肽;
d)一个细胞连接蛋白酶切割顺序;
e)人C蛋白的活化重链;
(ⅱ)一个启动子，其定位能驱动所述DNA顺序表达;
(B)在允许所述DNA顺序表达的条件下培养步骤(A)中转化的所述宿主细胞;
限制条件是，所述切割顺序不是人C蛋白酶原的活化肽。
本发明提供适用于活化C蛋白生产方法的新的DNA化合物。这些新化合物都编码一个前肽原，该前肽原含有一个指导分泌的信号肽和一个来自γ-羧基化(通过维生素K依赖性羧化酶的作用)蛋白的肽原。这些肽原顺序是本领域内熟知的(参见例如Suttieetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.84∶634-637，1987)。信号肽编码顺序和肽原编码顺序最好都得自一种γ-羧基化蛋白的前肽原的氨基酸残基顺序，这样也便于构建。这类γ-羧基化蛋白的例子有因子Ⅶ、因子Ⅸ、因子Ⅹ凝血酶原、S蛋白、Z蛋白，最好是C蛋白，但不限于此。
本发明的DNA化合物还包含人C蛋白轻链编码顺序，其定位紧接前肽原编码顺序下游并与该顺序同处翻译读码内。人C蛋白轻链含有初生C蛋白的氨基酸残基43至197(包括两头)，如前面背景技术部分所示。维生素K依赖性血浆蛋白质的氨基末端部分，如C蛋白轻链的氨基末端部分，负责这些蛋白质的钙结合活性。这些血浆蛋白如因子Ⅶ、因子Ⅸ、因子Ⅹ、凝血酶原和S蛋白的钙结合区可以互换(见欧洲专利公告第0，215，548A1号，第12和13页)，都相当于人C蛋白轻链的钙结合区。
本发明的DNA化合物还包含二肽LYS-ARG(KR)的编码顺序，其定位紧接轻链编码顺序下游并与该顺序同处翻译读码内。在初生蛋白中有一个象LYS-ARG这样的由二个碱性氨基酸组成的二肽，其位置在轻链羧基末端和细胞连结蛋白酶切割顺序的氨基末端之间。LYS-ARG二肽在所表达的蛋白质中的取向与本发明的目的无关。诸如LYS-LYS或ARG-ARG等由二个碱性氨基酸组成的二肽对本发明的目的而言与LYS-ARG二肽等价。
紧接LYS-ARG二肽密码子下游的是蛋白水解切割顺序的编码顺序。实际上，在位于人C蛋白的LYS-ARG二肽羧基末端处，有一个12个氨基酸残基的肽，即活化肽，它由蛋白水解切割反应而被除去，然而，本发明DNA化合物的关键性特征就是无需有活化肽编码顺序存在。本发明的优选DNA化合物不含活化肽编码顺序。相反，在这些优选化合物中，AP编码顺序被细胞连结蛋白酶蛋白水解切割顺序的编码顺序所代替。
因为本发明的目的是由重组细胞直接生产活化C蛋白，所以必须在细胞内，或者分泌后在细胞表面，从C蛋白的活化重链上切下C蛋白的轻链。就本发明的目的而言，细胞连接蛋白酶不仅包括位于细胞质或细胞器内的蛋白酶，而且包括位于细胞膜内的蛋白酶，这些蛋白酶能够在分泌过程中或在分泌后立即对蛋白质进行切割。因此，本发明提供编码细胞连结蛋白酶蛋白水解切割顺序的DNA化合物，用于分离人C蛋白轻链和活化重链之目的。
细胞连结蛋白酶的许多不同的蛋白水解切割顺序在本领域内都是已知的。切割顺序是邻接细胞连结蛋白酶切割位点的氨基酸顺序。下面的表Ⅰ列出了适于在本发明的方法和化合物中用作细胞连结蛋白酶切割顺序的一些切割顺序，但只是说明性的而非穷举。
表Ⅰ细胞连结蛋白酶的蛋白水解切割顺序来源顺序(采用单字母缩写)被细胞连结蛋白酶识别而导致由单链分子产生双链分子的切割顺序包括胰岛素受体PRPSRKRRC蛋白KKRSHLKR因子ⅩQTLERRKR胰岛素LEGSLQKR和FYTPKTRR被细胞连结蛋白酶识别而导致从分泌蛋白中除去肽原的切割顺序包括胰高血糖素MLVQGSWQC蛋白QVLRIRKR因子ⅨKILNRPKR因子ⅩNILARVTR组织血纤维蛋白溶ARFRRGAR酶原激活剂被细胞连结蛋白酶识别而导致由多肽(如前胰高血糖素原)产生寡肽的切割顺序包括氨基末端肽DQMNEDKR胰高血糖素QWLMNTKR
间隔肽1NRDDIAKRGLP1LVKGRGRR间隔肽2IVEELGRRSchwartz列举了适用于本发明的另一些细胞连结蛋白酶切割顺序(Schwartz，FEBS200(1)∶1，1986)。此外，在C末端含有二碱性氨基酸二肽的任何肽编码顺序，不论是天然存在的还是人工合成的，都能构成细胞连结蛋白酶切割顺序。在表1列出的切割顺序中，切割后形成双链胰岛素受体分子的切割顺序对本发明目的来说是最为优选的。
本领域专业人员应该了解，切割顺序中氨基酸残基的数目可以略有变化。在本发明生产活化C蛋白的方法中，在轻链的羧基末端切割初生蛋白(在KR二肽处)，也在活化重链的氨基末端切割初生蛋白。所以，KR二肽和蛋白水解切割位点(位于活化重链的氨基末端)之间的残基，将在多肽加工过程中被除去。由于这两个蛋白水解切割反应将除去轻链羧基末端和重链氨基末端之间的所有残基，所以蛋白水解切割顺序可含有一些额外的残基而不影响终产物活化C蛋白的本质。因此，长于表1所示顺序的切割顺序可用于本发明的方法和化合物。此外，虽然前面所示的切割顺序都含有8个残基，但这8个残基可能不都是必需的，短一些的顺序也可用于本发明的方法和化合物。
在本发明的DNA顺序中，紧接蛋白水解切割顺序编码顺序下游并与该顺序同在翻译读码中的是人C蛋白活化重链编码顺序。如本发明的背景技术部分所述，人C蛋白活化重链由初生人C蛋白的残基212至461组成。
下面画出的是自mRNA转录本翻译的未加工初生多肽的氨基酸残基顺序，所述mRNA转录本是由本发明的优选DNA编码顺序产生的。该多肽以人C蛋白的前肽原起始，接着是人C蛋白轻链、LYS-ARG二肽、胰岛素受体切割顺序(IRS)、人C蛋白活化重链。
该多肽用简图表示为
该多肽的氨基酸残基顺序为H2N-MET TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILESERGLYTHRPROALAPROLEUASPSERVALPHESERSERSERGLUARGALAHISGLNVALLEUARGILEARGLYSARGALAASNSERPHELEUGLUGLULEUARGHISSERSERLEUGLUARGGLUCYSILEGLUGLUILECYSASPPHEGLUGLUALALYSGLUILEPHEGLNASNVALASPASPTHRLEUALAPHETRPSERLYSHISVALASPGLYASPGLNCYSLEUVALLEUPROLEUGLUHISPROCYSALASERLEUCYSCYSGLYHISGLYTHRCYSILEASPGLYILEGLYSERPHESERCYSASPCYSARGSERGLYTRPGLUGLYARGPHECYSGLNARGGLUVALSERPHELEUASNCYSSERLEUASPASNGLYGLYCYSTHRHISTYRCYSLEUGLUGLUVALGLYTRPARGARGCYSSERCYSALAPROGLYTYRLYSLEUGLYASPASPLEULEUGLNCYSHISPROALAVALLYSPHEPROCYSGLYARGPROTRPLYSARGMETGLULYSLYSARGSERHISLEULYSARGPROARGPROSERARGLYSARGARGLEUILEASPGLYLYSMETTHRARGARGGLYASPSERPROTRPGLNVALVALLEULEUASPSERLYSLYSLYSLEUALACYSGLYALAVALLEUILEHISPROSERTRPVALLEUTHRALAALAHISCYSMETASPGLUSERLYSLYSLEULEUVALARGLEUGLYGLUTYRASPLEUARGARGTRPGLULYSTRPGLULEUASPLEUASPILELYSGLUVALPHEVALHISPROASNTYRSERLYSSERTHRTHRASPASNASPILEALALEULEUHISLEUALAGLNPRO
ALATHRLEUSERGLNTHRILEVALPROILECYSLEUPROASPSERGLYLEUALAGLUARGGLULEUASNGLNALAGLYGLNGLUTHRLEUVALTHRGLYTRPGLYTYRHISSERSERARGGLULYSGLUALALYSARGASNARGTHRPHEVALLEUASNPHEILELYSILEPROVALVALPROHISASNGLUCYSSERGLUVALMETSERASNMETVALSERGLUASNMETLEUCYSALAGLYILELEUGLYASPARGGLNASPALACYSGLUGLYASPSERGLYGLYPROMETVALALASERPHEHISGLYTHRTRPPHELEUVALGLYLEUVALSERTRPGLYGLUGLYCYSGLYLEULEUHISASNTYRGLYVALTYRTHRLYSVALSERARGTYRLEUASPTRPILEHISGLYHISILEARGASPLYSGLUALAPROGLNLYSSERTRPALAPRO-COOH本领域专业人员应该知道，由于遗传密码的简并性，许多种DNA化合物都能编码上面画出的多肽。因此，下面所述及所附实施例中所述的本发明优选DNA化合物、载体、转化体的构建，仅仅是说明性的，并不限制本发明的范围。
在最初试图直接表达活化人C蛋白时，使用了已通过位点特异性诱变缺失了AP区的初生人C蛋白编码顺序。该编码顺序的结构用简图表示为
如所附的实施例所述，将该编码顺序插入重组DNA表达载体，将所得的称为pLAPC的载体转化入真核宿主细胞。所得转化体经用抗C蛋白抗体进行反应活性测定，确定该转化体产生常量的双链C蛋白。但该物质的C蛋白活性很低。构建质粒pLAPC的基本原理是，不论是什么蛋白水解活性负责切割KR区而形成双链酶原，都有可能同时起到切割缺少AP区的C蛋白分子的作用。观察到双链物质来自表达无APC蛋白编码顺序的细胞，但该物质仅具有低水平的活化人C蛋白酰胺水解活性。质粒pLAPC除了用来驱动活化C蛋白活性的表达外，还用作构建本发明的另一些载体的有用原料，这些载体可驱动活化人C蛋白的高水平直接重组表达。实例1描述了从起始质粒pHC7构建质粒pLAPC的方案。质粒pHC7可从北方地区研究中心(NRRL，Peoria，IL61604)以大肠杆菌K12RR1/pHC7的形式得到，其登记号为NRRLB-15926。
在试图用另一种方法直接表达活化C蛋白时，制备了这样一个编码顺序，其中将蛋白水解切割顺序插入到C蛋白编码顺序的AP编码顺序和AHC编码顺序之间。借助一个得自胰岛素受体的蛋白水解切割顺序引入了蛋白水解切割位点。这样，该编码顺序的结构用简图表示为
将该编码顺序插入一个类似于质粒pLAPC的载体，产生质粒pLPC-IRS。曾试图将质粒pLPC-IRS引入真核宿主细胞，但从未得到一个产生可检测的C蛋白活性或抗原的转化体。
因此，只有用IRS编码顺序代替AP编码顺序，才能实现本发明的直接表达活化C蛋白的方法。所得编码顺序的结构图示如下
实例3描述了该编码顺序的构建，其中用IRS顺序代替AP编码顺序。这一构建方法基本上涉及C蛋白编码顺序的位点特异性诱变。从质粒pHC7中分离出C蛋白编码顺序中包含活化肽编码DNA的部分，将其插入噬菌体M13mp18，然后利用位点特异性诱变使其发生改变。然后将诱变后的编码顺序克隆到真核克隆载体中，得到一个称为pLAPC-IRS的质粒，该质粒除了在KR和AHC编码顺序之间插入了IRS编码顺序外，与质粒pLAPC相同。质粒pLAPC-IRS与质粒pLPC-IRS的不同仅在于缺失了AP编码顺序。实例3详细描述了质粒pLAPC-IRS的构建方案。
所附的实例描述的位点特异性诱变方法是说明性的，这些方法可用来产生本发明的另一些化合物，在这些化合物中，用不同的细胞连结蛋白酶蛋白水解切割位点的编码顺序代替IRS编码顺序。本发明的DNA化合物还可以化学合成，或者通过合并限制片段来合成，或者结合使用本领域内已知技术来合成。DNA合成仪也可以加以利用，可用来构建本发明的化合物。
本发明的说明性载体质粒pLAPC-IRS含有BK增强子，其定位能够刺激本发明的新的活化C蛋白编码顺序由腺病毒主要晚期启动子驱动的转录。本领域专业人员知道，本领域内已知有大量真核启动子、增强子和表达载体，它们都可用于本发明的方法。本领域专业人员还知道，真核表达载体能够在没有增强子成分的情况下起作用。本发明的关键方面并不在于特定的增强子(如果有的话)或用于驱动活化C蛋白表达的启动子，而在于在C蛋白编码顺序中应用蛋白水解切割顺序，从而直接由重组细胞生产活化C蛋白。
然而，载体中的各成分如启动子、增强子和可选择标记的选择，能够对真核宿主细胞所产生的活化C蛋白的最终水平产生很强的影响。1986年4月9日提交的美国专利申请第849，999号(列入本文参考文献)公开了许多C蛋白酶原表达载体，这些载体利用BK增强子来刺激其定位能够驱动人C蛋白表达的真核启动子。如果将这些载体转化入那些同时还表达大DNA病毒的直接早期基因产物(如腺病毒的E1A基因产物)的真核细胞中，这些载体尤其能够驱动高水平表达。从本文所公开的说明性载体pLAPC-IRS明显可见，第849，999号申请的BK增强子-E1A基因产物表达方法特别适用于本发明的载体。
本发明的应用不限于特定的真核宿主细胞。从诸如美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD20852)这样的保藏机构可得到多种真核宿主细胞，它们都适用于本发明的载体。特定的宿主细胞的选择在某种程度上取决于用来驱动本发明的活化C蛋白编码DNA化合物表达的特定表达载体。但是，由于C蛋白酶原要经过实质性的翻译后修饰，所以某些宿主细胞更适用于本发明的载体。美国专利申请第849，999号和Grinnell等人(Grinnelletal.，Bio/Technology5∶1189，1987)公开了用腺病毒转化的人胚肾细胞特别适用于重组生产γ-羧基化蛋白如人C蛋白。293细胞系就是这样一种用腺病毒转化的人胚肾细胞系，它可从ATCC得到，登记号为CRL1573。293细胞系还适用于本发明的载体。
但是，在腺病毒转化细胞系中生产γ-羧基化蛋白如人C蛋白的优点不只是腺病毒转化的人胚肾细胞才有。实际上，腺病毒转化的细胞对生产γ-羧基化的人C蛋白来说一般是不常用的宿主。这类细胞中特别优选的细胞系是AV12-664(以下简称“AV12”)细胞系，它可从ATCC得到，登记号为CRL9595。AV12细胞系的建立，是在金黄仓鼠的颈背注射人腺病毒12，然后从所产生的肿瘤中分离细胞。下面的实例4描述了用说明性载体pLAPC-IRS转化293细胞系和AV12细胞系的方法。
本发明的载体能够转化入多种真核宿主细胞，尤其是哺乳动物宿主细胞，并在其中进行表达。本发明的那些不具有可选择标记(用来分离鉴定稳定的真核转化体)的载体，不仅可用于瞬时测定(transientassay)之目的，而且可用于共转化之目的。共转化是1983年8月26日颁发的美国专利第4，399，216号(列入本文参考文献)所公开的一种方法。本发明的载体还含有促使载体在大肠杆菌中复制的顺序，因为在大肠杆菌中制备质粒DNA通常比在其它宿主生物中更有效。
在那些其中的特定启动子与结构基因的功能相关的宿主细胞中，本发明载体上所含的活化人C蛋白结构基因直接进行表达。适用于本发明的有代表性的宿主细胞列于表Ⅱ，其中加了适当的评注。
如表Ⅱ所表明，许多哺乳动物宿主细胞具有对本发明化合物上的信号肽和蛋白水解切割位点进行识别和正确加工所必需的细胞机构，因而可进行翻译后修饰，如糖基化、γ-羧基化和β-羟基化，正如对血浆中存在的人C蛋白所观察的那样。下面讨论的很不相同的各种载体都可用来转化这样一些真核宿主细胞，但下面列举的具体载体决不是要限制本发明的范围。
pSV2型载体含有SV40基因组的一些片段，这些片段构成一个明确的真核转录单位-启动子(ep)、插入顺序(ⅣS)和多聚腺苷酸化(pA)位点。在没有SV40T抗原的情况下，质粒pSV2型载体可通过整合入宿主细胞染色体DNA而转化哺乳动物宿主细胞和其它真核宿主细胞。已构建出多种质粒pSV2型载体(见EukaryoticViralVectors，ed.Gluzman，ColdSpringHarborLabora-tories，ColdSpringHarbor，NewYork，1982)，如质粒pSV2-gpt、pSV2-neo、pSV2-dhfr、pSV2-hyg、pSV2-β-球蛋白，其中用SV40启动子驱动插入基因的转录。这些载体适用于本发明的编码顺序，并可从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，Maryland)或北方地区研究实验室(NRRL，Peoria，Illinois)得到。
质粒pSV2-dhfr(ATCC37146)含有处在SV40早期启动子控制下的鼠类二氢叶酸还原酶(dhfr)基因。已知dhfr基因在适当的条件下可在宿主染色体中扩增或复制。这一扩增(综述见Schimke，Cell37∶705-713，1984)能够连带紧接dhfr基因的DNA顺序，如本发明的活化人C蛋白编码顺序，因此可利用扩增来提高活化C蛋白的产量。
为在哺乳动物宿主细胞或其它真核宿主细胞中表达活化C蛋白活性而构建的本发明的质粒，能够利用很多种不同的启动子。本发明决不仅限于应用本文所列举的特定真核启动子。诸如SV40晚期启动子或Bucher等人(Bucheretal.，Nuc.AcidsRes.14(24)∶1009，1986)所公开的真核启动子，或真核基因启动子，都易于分离和修饰而用在为在真核宿主细胞中生产C蛋白而设计的重组DNA表达载体上。上述真核基因的例子有，雌激素诱导性鸡卵清蛋白基因、干扰素基因、糖皮质激素诱导性酪氨酸氨基转移酶基因、胸苷激酶基因、主要早期和晚期腺病毒基因。还可以应用串联的真核启动子来驱动C蛋白的表达。此外，已知大量的还原病毒能感染范围广泛的真核宿主细胞。还原病毒DNA中长段的末端重复顺序常常编码启动子活性，因此可用来驱动活化人C蛋白的表达。
质粒pRSVcat(ATCC37152)含有劳氏肉瘤病毒(RSV)末端重复顺序的若干部分，已知RSV是一种感染鸡和其它宿主细胞的病毒。RSV长段末端重复顺序可在质粒pRSVcat的～0.76kbNdeⅠ-HindⅢ限制片段上分离得到。RSV长段末端重复顺序中的启动子(Gormanetal.，P.N.A.S.796777，1982)适用于本发明的载体。质粒pMSVi(NRRLB-15929)含有鼠类肉瘤病毒(MSV)的长段末端重复顺序，已知MSV是一种感染小鼠和其它宿主细胞的病毒。这些重复顺序适于用作本发明载体中的启动子。小鼠金属硫因(MMT)启动子也已被充分鉴定为可用于真核宿主细胞，因而适用于本发明的载体。MMT启动子存在于15kb质粒pdBPV-MMTneo(ATCC37224)中，该质粒可用作构建本发明其它质粒的原料。
有可能对本发明的说明性DNA顺序和质粒进行多种修饰和改变。例如，遗传密码的简并性允许替换整个多肽编码区及翻译终止信号中的核苷酸，而不改变所编码的多肽编码顺序。这样一些可替换的顺序可以从人C蛋白已知的氨基酸顺序或DNA顺序推出，并可利用下列常规合成法或位点特异性诱变法进行构建。合成法可基本按照Itakura等人和Crea等人的方法进行(Itakuraetal.，Science1981056，1977;Creaetal.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA755765，1978)。因此，本发明决不限于具体列举的DNA顺序和质粒。
将本发明载体转化入真核宿主细胞后，能够靠可选择表型来选择转化体。赋予这个可选择表型的可选择标记，既可以存在于表达载体上，也可以存在于与该表达载体共转化入宿主细胞的另一个载体上。一旦选择出转化体，就需要鉴定哪些转化体最高水平地表达载体上所编码的所需蛋白。这种鉴定在进行共转化操作后尤其重要，因为共转化产生许多仅含有含可选择标记质粒因而不含有表达载体的转化体。
因此，本发明提供了一种新方法，该方法不仅适用于鉴定表达并分泌所需蛋白的细胞，而且适用于定量测定这些细胞所分泌的蛋白相对于用该方法检测的其它细胞的量。借助该方法还能分离出分泌所需蛋白的存活形式的细胞。虽然该方法普遍适用于所有分泌蛋白，但本文是特别参考活化C蛋白来加以说明的。此外，虽然该方法适用于所有细胞，不论是真核的还是原核的，也不论是转化的还是天然存在的，但本文是利用该方法对真核转化体的应用来加以说明的。
这个适用于鉴定和分离表达并分泌一种蛋白的细胞，并且适用于定量测定该细胞所产生的蛋白质相对于用该方法检测的其它细胞的量的方法，包括如下步骤(a)在合适的固体基质上获得细胞群体;(b)在所述细胞上铺一层无菌琼脂膜;(c)在所述琼脂膜上放一张硝酸纤维素膜;(d)取下所述硝酸纤维素膜，用抗所述蛋白的抗体检测结合在该膜上的所述蛋白。任何蛋白结合膜包括尼龙、DBM或乙酸纤维素，都可用来代替硝酸纤维素。另外，可以用明胶来代替琼脂。下面的实例5更充分地描述了这个鉴定分泌高水平蛋白的细胞的方法。
以下各实例说明本发明的方法并描述本发明具有代表性的化合物、载体和转化体的构建方案，但并不限制本发明。
实例1质粒pLAPC的构建本实例提供了一个构建质粒pLAPC的详细方案。简单地说，实例1A描述了从质粒pHC7中分离编码包括活化肽在内的一部分C蛋白分子的DNA片段。实例1B描述了将该DNA片段克隆到噬菌体M13mp18中，并通过位点特异性诱变从所得重组噬菌体中除去编码活化肽的DNA。实例1C描述了质粒pLAPC构建的最后步骤，更具体地说是分离诱变片段并将其与得自质粒pLPC的两个片段连接，产生质粒pLAPC。质粒pLPC的构建方案在实例2中描述。
A.含有人C蛋白活化肽编码顺序的DNA片段的分离质粒pHC7含有初生人C蛋白的完整编码顺序。在1升含有15μg/ml四环素的L液体培养基(10g蛋白胨、10gNaCl、5g酵母抽提物)中接种大肠杆菌K12RR1/pHC7(NRRLB-15926)培养物，并在一空气培养摇床中37℃下培养，直到在590nm处的光密度(O.D.)为～1个光吸收单位，这时，向培养物中加入150mg氯霉素。继续培养约16小时。氯霉素的加入抑制了蛋白质的合成，进而抑制了细胞分裂，但允许继续进行质粒复制。
将培养物在SorvollGSA转子(DuPontCo.，Instrum-entProducts，BiomedicalDivision，Newtown，CN06470)中于4℃下以6000rpm离心5分钟。弃去所得上清液，用40mlTES缓冲液(10mMTris-HCI，pH＝7.5;10mMNaCl;1mMEDTA)洗涤细胞沉淀，然后再离心沉淀。再弃去上清液，细胞沉淀在干冰-乙醇浴中冰冻，然后融化。融化的细胞沉淀在10ml25%蔗糖/50mMEDTA溶液中再悬浮。向溶液中加入约1ml5mg/ml的溶菌酶溶液;3ml0.25MEDTA，pH＝8.0;100μl10mg/mlRNA酶A，然后在冰上保温15分钟。向溶菌酶处理过的细胞中加入3ml溶胞溶液(其制备是混合3ml10%曲拉通-X100;75ml0.25MEDTA，pH＝8.0;15ml1MTris-HCl，pH＝8.0;7ml水)，混合后，所得溶液再在冰上保温15分钟。溶解的细胞在干冰-乙醇浴中冰冻，然后融化。
在SW27转子(Beckman，7360N.LincolnAve.，Lin-colnwood，IL60646)中以25，000rpm离心40分钟，从溶液中除去细胞碎片。向溶液中加入约30.44gCsCl及～1ml5mg/ml溴化乙锭溶液，然后将溶液的体积调到40ml。将溶液轻轻倒入Vti50超离心管(Beckman)。将试管密封，然后在Vti50转子中以42，000rpm离心～16小时。分离用紫外光显现的所得质粒带，然后放入ti75离心管及转子(Beckman)中，以55，000rpm离心16小时。利用含有0.761g/mlCsCl的TES作任何必要的体积调节。再次分离质粒带，用盐饱和的异丙醇提取溴化乙锭，最后用TES缓冲液稀释3倍。然后向溶液中加入2倍体积的乙醇，所得混合物在-20℃下保温过夜。在SS34转子(DuPontCo.)中以10，000rpm将溶液离心15分钟，沉淀出质粒DNA。
将由该方法得到的～1mg质粒pHC7DNA悬浮于1mlTE缓冲液(10mMTris-HCl，pH7.6，0.1mMEDTA)中，于-20℃下贮存。质粒pHC7的限制位点和功能图谱示于附图2。
将约7μg(7μl)质粒pHC7 DNA加入25μl 10X Core缓冲液TM(Core缓冲液TM，BRL，为500mM Tris-HCl，pH＝8.0;500mM NaCl;100mM MgCl2)、198μl H2O、和12μl限制酶SstⅠ(～60单位，Bethesda Research Laboratories(BRL)，Gaithersburg，MD20877;除非特别说明，这些实例中提到的所有的酶均由BRL或New England Biolabs(NEB)，Beverly，MA 01915-9990提供，并基本根据制造商的建议使用)，及8μl(80单位)限制酶SalⅠ。反应混合物在37℃下保温4小时;然后，先用苯酚，再用氯仿提取用SstⅠ-SalⅠ消化过的质粒pHC7 DNA，通过乙醇沉淀及离心进行收集，最后悬浮于15μl TE/10缓冲液(10mM Tris碱，pH＝7.6，0.1mM EDTA)中。
然后，反应混合物在Tris-乙酸缓冲液中，在～0.6%低胶凝点琼脂糖(FMCCorporation，MarineColloidsDiv-ision，Rocklancl，Maine04841)凝胶上以～130V的电压和～65mA的电流电泳2-3小时。凝胶在稀溴化乙锭的溶液中染色，用长波紫外光进行观察，从凝胶上切下构成～0.7kbSstⅠ-SalⅠ限制片段的DNA条带的小条。由小条的重量和密度确定小条的体积，向含有小条的试管中加入4倍体积的含有0.25MNaCl的TE。然后在72℃下保温熔化小条。得到约0.5μg质粒pHC7的～0.7kbSstⅠ-SalⅠ限制片段，体积约为400μl。根据厂商的建议，使DNA溶液通过NACS-prepac 柱(BRL)而使DNA得到进一步的纯化，纯化的片段再悬浮于15μl去离子水中。
B.通过位点特异性诱变构建重组噬菌体并除去活化肽编码DNA基本根据实例1A所述的方法，用限制酶SstⅠ和SalⅠ消化约1μg噬菌体M13mp18(得自NewEnglandBiolabs)RF(复制形式)DNA。通过用苯酚再用氯仿提取反应混合物而终止反应;然后沉淀出DNA，离心收集，并再悬浮于约15μlTE缓冲液中。在～0.6%低胶凝点琼脂糖凝胶上分离两个消化得到的片段，从凝胶上切下较大的片段，如实例1A所述进行纯化。
将约0.1μg(7μl H2O中)质粒pHC7的～0.7kb SstⅠ-SalⅠ限制片段加入5μl SstⅠ-SalⅠ消化的M13mp18 RF DNA及2μl 100X连接酶缓冲液(0.5M Tris-HCl，pH＝7.8;60mM MgCl2;0.2M二硫苏糖醇(DTT))、2μl 1mg/ml BSA、1μl 25mM ATP、1μl(～400单位)T4DNA连接酶(NEB)、2μl H2O中。连接反应物在25℃下保温过夜，连接后的DNA构成所需的双链形式噬菌体M13mp18-HE1 DNA。
用约300μl大肠杆菌K12 JM101(New England Biolabs)的过夜培养物接种30ml 2X TY液体培养基(TY液体培养基为10g/L胰蛋白胨、10g/L NaCl、5g/L酵母提取液)，所得培养物在37℃下通气培养，直到O.D.600为～0.5。将培养物在冰水浴中冷却10分钟，离心收集，再悬浮于15ml冷的10mM NaCl中。再离心收集细胞，并再悬浮于15ml冷的30mM CaCl2中。将细胞在冰上放置20分钟，离心收集。将细胞再悬浮于1.5ml冷的30mM CaCl2中;取出200μl细胞样品，加到9μl上述制备的连接DNA中，在冰上保温约30分钟。然后，在42℃下培养细胞-DNA混合物2分钟，将其加入3ml表面琼脂(top agar)(TY液体培养基加上在45℃下保持熔融的0.5%琼脂)，该琼脂还含有50μl 2%X-Gal(“X-Gal”为5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)、50μl 100mM IPTG(“IPTG”为异丙基β-D-吡喃硫代半乳糖苷)、100μl对数生长期的大肠杆菌K12 JM101。然后，用细胞-表面琼脂混合物铺TY-琼脂板，琼脂板在37℃下培养过夜。
第二天早上，分别用4个清晰的噬菌斑接种2ml 2X TY液体培养基，所得培养物在37℃下通气培养6小时。然后，离心培养物，将500μl所得上清液(细胞沉淀用于制备噬菌体DNA而用于限制酶分析)加到500μl大肠杆菌K12 JM101培养物(O.D.550＝0.5)和50ml 2X TY液体培养基中。这些培养物在37℃下培养过夜。利用实例1A所述方法但缩小规模，从细胞沉淀中分离噬菌体RF DNA，与实例1A不同的是培养基中不含抗生素，超离心步骤由苯酚和氯仿提取代替。含有噬菌体M13mp18-HE1 DNA的转化体由其噬菌体DNA的限制酶分析来鉴定。
将过夜培养物离心，每5ml上清液中加入约1ml由20%聚乙二醇(PEG)6000和2.5mMNaCl组成的溶液，然后在室温下培养10分钟。将混合物以10，000rpm离心10分钟，所得沉淀含有单链噬菌体M13mp18-HE1DNA，将其再悬浮于500μlTES缓冲液(20mMTris-HCl，pH＝7.5;0.1MEDTA;10mMNaCl)中。该DNA溶液先用氯仿提取，然后用TE饱和的苯酚提取两次，再用氯仿提取。然后利用NaOAc和乙醇沉淀出单链DNA，离心，沉淀用70%乙醇洗涤并干燥，然后将所得沉淀溶于80μl H2O中。该噬菌体制剂用于在下一步即位点特异性诱变中除去活化肽编码DNA。
在自动DNA合成仪上合成用于诱变除去活化肽编码DNA的单链DNA片段，所合成的DNA片段如下5′-GCGCAGTCACCTGAAACGACTCATTGATGGGAAGATGA-3′在37℃下，将约30微微摩尔(1μl)上述单链DNA片段(“突变寡核苷酸”)和1.5μl(7.5微微摩尔)M13通用引物(由Boehringer-Mannheim Biochemical(BMB)，7941 Castleway Drive，P.O.Box 50816，Indianapolis，IN 46250出售)分别用5单位T4多核苷酸激酶(Pharmacia，P-L Biochemicals，Inc.，800 Centennial Avenue，Piscataway，NJ 08854)在含有1μl 1mMATP的10μl 1X激酶缓冲液(100mM Tris-HCl，pH＝8.3;100mM DDT;100mM MgCl2)中处理30分钟，接着在65℃保温10分钟，然后冰冻。激酶处理后的DNA用于下述诱变步骤。
在诱变操作的第一步，使诱变寡核苷酸和M13通用引物与单链噬菌体DNA退火。进行退火反应时，将300毫微克(0.5μl)单链噬菌体M13mp18-HE1加到1微微摩尔(1.2μl)通用引物、1微微摩尔(0.3μl)突变寡核苷酸、2μl10X退火缓冲液(100mMTris-HCl，pH7.5;1mMEDTA;500mMNaCl)，及16μl水中，混合物在80℃下保温2分钟，然后在50℃保温5分钟，最后使混合物冷却到室温。
一旦寡核苷酸退火，噬菌体DNA便在DNA聚合酶作用下由引物延伸而形成双链DNA。进行延伸反应时，在退火的DNA混合物中加入3μl 10X延伸缓冲液(500mM Tris-HCl，pH＝8;1mM EDTA;120mM MgCl2);3μl 10X连接酶缓冲液;1.5μl 0.2mM DTT;3μl dNTP混合物(每种dNTP 0.5mM);1.2μl 25mM ATP;0.5μl Klenow酶(5U/μl，BMB);1μl T4DNA连接酶(400U，NEB);19.8μl H2O。延伸反应物在室温下保温30分钟，然后在37℃下保温4小时，然后在4℃下过夜。
用苯酚-氯仿提取并用乙醇和乙酸钠(NaOAc)沉淀DNA使反应停止。离心收集DNA，并再悬浮于40μl S1缓冲液(0.3M NaCl;0.03M NaOAc，pH＝4.5;0.3mM ZnCl2)中。据报道下述S1处理对位点特异性诱变操作很有益。但本发明者发现S1处理无显著长处，所以在本文随后的实例所述的构建方案中完全省去了S1处理。
将DNA溶液等分到两个试管中，并在其中一个试管中加入100单位(BMB)S1核酸酶。S1反应物在室温下保温5分钟，用TE-饱和的苯酚-氯仿(50∶50)提取反应混合物终止反应。用NaOAc和乙醇从反应混合物及非S1处理样品中沉淀出DNA。
将DNA沉淀再悬浮于60μl H2O中，并根据构建噬菌体M13mp18-HE1时所用的方法用于转化大肠杆菌K12 JM101，只是不向平板中加IPTG或X-Gal。利用突变寡核苷酸的一小部分5′-TGAAACGACTCATTGA-3′(经放射标记)作探针以噬菌斑和斑点吸印杂交选择突变体。挑出几个呈现阳性杂交的噬菌斑，分别接种到2ml对数生长期大肠杆菌K12 JM101的培养物中。这些培养物在37℃下通气培养约6小时，然后如上面对噬菌体M13mp18-HE1所述，用这些培养物来制备单链DNA。
利用双脱氧测序法(J.H.Smith，1980，MethodsinEnzymology65560-580)测定单链DNA的顺序。借助所期望的突变鉴定出几个噬菌体。缺失活化肽编码顺序的噬菌体定名为噬菌体M13mp18-HE2。噬菌体M13mp18-HE2中的突变使其大小比天然编码顺序减少了36bp，可利用这一差异来简化含突变区DNA的鉴定。制备噬菌体M13mp18-HE2的RF形式用于随后的构建。
C.由噬菌体M13mp18-HE2和质粒pLPC最后构建质粒pLAPC基本上按照实例1A的方法，将RF型噬菌体M13mp18-HE2的诱变的SstⅠ-SalⅠ(～0.7kb)限制片断从噬菌体上切下并分离。然而，如下所述，～100μl含有～0.1μg所需～0.7kb片段的溶液在1∶2稀释的低胶凝点琼脂糖中未通过任何纯化柱，而直接用于进行连接反应而产生质粒pLAPC。
将以下三个DNA片段连接在一起形成质粒pLAPC上述噬菌体M13mp18-HE2的～0.7kbSstⅠ-SalⅠ限制片段，及来自质粒pLPC的两个DNA片段。实例2描述了质粒pLPC的构建方案。质粒pLPC的限制位点和功能图谱示于附图1。由于质粒pLPC上的SalⅠ、SstⅠ和EcoRⅠ限制酶识别位点定位的原因，制备所需EcoRⅠ-SalⅠ和EcoRⅠ-SstⅠ限制片段时必须分别进行消化。
为了制备EcoRⅠ-SstⅠ片段，将在25μl水中的约40μg质粒pLPC加入10μl 1mg/ml BSA、10μl 10X Core缓冲液TM(BRL)、5μl限制酶EcoRⅠ(50U，BRL)、5μl限制酶SstⅠ(25U，BRL)、45μlH2O，所得反应物在37℃下保温1.5小时。通过乙醇沉淀及离心收集SstⅠ-EcoRⅠ消化的质粒pLPCDNA。将SstⅠ-EcoRⅠ消化的DNA再悬浮于水中，然后上到～0.6%低胶凝点琼脂糖凝胶上，电泳分离DNA片段。
为了制备EcoRⅠ-SalⅠ片段，先用限制酶ApaⅠ处理在9μl水中的约15μg质粒pLPC，以消除由于相同大小的限制片段造成的污染。在质粒pLPC DNA溶液中加入约10μl 10X ApaⅠ缓冲液(60mM NaCl;60mM Tris-HCl，pH＝7.4;60mM MgCl2;60mM DTT)、10μl 1mg/ml BSA、69μl H2O、2μl限制酶ApaⅠ(50U，NEB)，所得反应物在37℃下保温1小时。然后在ApaⅠ消化的质粒pLPC DNA溶液中加入15μl 2M NaCl、69μl H2O、8μl限制酶SalⅠ(NEB)、8μl限制酶EcoRⅠ(NEB)，所得反应物在37℃下保温1小时。先用苯酚，然后用氯仿提取ApaⅠ-SalⅠ-EcoRⅠ消化的质粒pLPC DNA，然后通过用乙醇沉淀和离心收集，最后再悬浮于25μl H2O中。然后，将DNA上到～0.6%低胶凝点琼脂糖凝胶上，电泳分离DNA片段。
如实例1A所述，从凝胶上切下～3.76kbEcoRⅠ-SalⅠ限制片段和～2.0kbEcoRⅠ-SstⅠ限制片段，加入等体积10mMTris-HCl，pH＝7.6使凝胶片熔化。于是，在～200μl10mMTris-HCl，pH＝7.6中得到约2μg质粒pLPC的～3.76kbEcoRⅠ-SalⅠ限制片段，该缓冲液中还含有熔化的琼脂糖。在另一份200μl含琼脂糖的10mMTris-HCl，pH＝7.6的缓冲液中得到约2μg质粒pLPC的～2.0kbEcoRⅠ-SalⅠ限制片段。
分别将约12.5μl两个纯化的限制片段(质粒pLPC的～3.76kbEcoRⅠ-SalⅠ限制片段和～2.0kbEcoRⅠ-SstⅠ限制片段)的溶液加入20μl噬菌体M13mp18-HE2的～0.7kb SstⅠ-SalⅠ限制片段、10μl 1mg/ml BSA、10μl 10mM ATP、10μl 10X连接酶缓冲液、2μl(～800U，NEB)T4DNA连接酶、23μl H2O，所得连接反应物在15℃下保温过夜。连接后的DNA构成了所要的质粒pLAPC。质粒pLAPC与质粒pLPC(图1)的不同仅在于缺失了活化肽编码DNA。
为了检查质粒的结构，并得到大量的质粒pLAPC以进行真核细胞的转化及进一步的构建，用含有质粒pLAPC的连接后的DNA转化大肠杆菌K12RV308(得自NRRL，登记号NRRLB-15624)。
将50ml大肠杆菌K12 RV308在L液体培养基中的培养物培养到在590nm处的光密度(O.D.)为～0.6。将培养物在冰上冷却10分钟，离心收集细胞。将细胞沉淀再悬浮于25ml冷的10mM NaCl中。再通过离心沉淀细胞，将沉淀再悬浮于25ml冷的30mM CaCl2中，在冰上保温30分钟。再离心收集细胞，并再悬浮于2.5ml冷的30mM CaCl2中。
将200μl该细胞悬浮液与含有质粒pLAPC的连接后的DNA混合，并在冰上保温60分钟。然后将混合物在42℃下培养2分钟，接着在室温下培养10分钟。将约10ml2XTY液体培养基加到细胞-DNA混合物中，然后将细胞放在125ml培养瓶中在空气培养摇床上37℃下培养2小时。
将细胞混合物的等分试样铺在含有100μg/ml氨苄青霉素的TY-琼脂(TY液体培养基加15g/l琼脂)平板上，然后将平板在37℃下培养过夜。大肠杆菌K12RV308/pLAPC转化体通过其质粒DNA的限制酶分析来证实。基本根据实例1A的方法，从大肠杆菌K12RV308/pLAPC转化体得到质粒DNA，与实例1A不同的是用50μg/ml氨苄青霉素作选择性试剂而不是用四环素。
实例2质粒pLAPC的构建在质粒pLAPC的构建中，以质粒pLPC作中间载体(参见实例1C)。质粒pLPC包括一个编码BK病毒增强子和腺病毒2晚期启动子的DNA片段，该启动子的定位能够驱动人C蛋白的表达。质粒pLAPC的构建方案实质上导致了质粒pLPC上的人C蛋白编码顺序由另一个已除去活化肽编码DNA的人C蛋白编码顺序所代替。
质粒pLPC和pLAPC上的BK增强子/腺病毒后期启动子表达调控顺序为美国专利申请第06/849，999号(1986.4.9提交，代理律师案号X-6606)的主题。美国专利申请第06/849.999号公开了由于大DNA病毒的直接早期基因产物即腺病毒的E1A基因产物的存在，大大刺激了质粒pLPC(因而也刺激了pLAPC)的表达调控顺序的活性。
下面叙述质粒pLPC的构建方案。附图1图示了质粒pLPC的整个构建方案。简言之，实例2A描述了BK病毒DNA的分离，由该DNA可得到BK增强子。实例2B叙述了质粒pBKneo1的构建方案，质粒pBKneo1是由BK增强子插入质粒pdBPV-MMTneo而得到的质粒。实例2C叙述了质粒pLPcat的构建方案，质粒pLPcat是由腺病毒2后期启动子插入质粒pSV2cat而得到的质粒。实例2D叙述了质粒pBLcat的构建方案，质粒pBLcat含有能刺激腺病毒后期启动子活性的BK增强子。实例2E描述了C蛋白表达载体质粒pL133的构建方案，该方案以原料质粒pHC7开始，进行中间质粒pSV2-HPC8的构建，最后构建出质粒pL133。最后，实例2F叙述了质粒pLPC的构建方案，该质粒含有插入到质粒pL133中而驱动人C蛋白表达的质粒pBLcat的BK增强子/腺病毒后期启动子表达调控顺序。
A.BK病毒DNA的制备BK病毒得自美国典型培养物保藏中心，登记号为ATCC VR-837。所提供的病毒为冻干形式，将其再悬浮于Hank氏平衡盐(Gibco，3175 Staley Road，Grand Island，NY 14072)中，使其效价约为105噬菌斑形成单位(pfu)/ml。制备BK病毒DNA所选择的宿主为初生人胚肾(PHEK)细胞，该细胞可从Flow Labora-tories，Inc.，7655 Old Springhouse Road，McLean，VA 22101得到，目录号0-100，也可从M.A.Bioproducts得到，目录号70-151。
用约5个含有约106个PHEK细胞的汇合单层的75mm2聚苯乙烯瓶来制备病毒。向每个瓶中加入约1ml效价为105pfu/ml的BK病毒，在37℃下培养1小时，然后加入新鲜培养基(Dulbecco氏修改的Eagle培养基，Gibco，Grand Island，NY 14072，添加10%胎牛血清，将感染的细胞在37℃下培养10-14天或直到观察到病毒的完全的致细胞病变效应。不同细胞系和不同病毒的致细胞病变效应不同，但这种效应一般都包括细胞的集扰、结块、从培养皿上脱落。
通过3次冻-融循环，将病毒从细胞中释放出来，以5000xg离心除去细胞碎片。取1升上清液，加入100gPEG-6000，在4℃下保温该溶液24小时，以5000xg离心20分钟沉淀并收集病毒。将沉淀以1/100的原始体积溶于0.1XSSC缓冲液中(1XSSC＝0.15MNaCl和0.015M柠檬酸钠，pH＝7)。在试管中将病毒悬浮液铺到15ml饱和KBr溶液上，以75，000xg离心3小时。离心后，KBr溶液中有两条明显的条带。较低的条带含有完整的病毒颗粒，收集该条带，并在Scphadex
G-50柱(Sigma Chamical Co.，St.Louis，MO 63178)上脱盐，利用TE(10mM Tris-HCl，pH＝7.8，1mM EDTA)作洗脱缓冲液。
在从柱中得到的纯化病毒颗粒的溶液中加入十二烷基硫酸钠(SDS)至浓度为1%;加入链霉蛋白酶
(Sigma)至浓度为100μg/ml，将溶液在37℃下保温2小时。然后向溶液中加入氯化铯至密度为1.56g/ml，向溶液中加入溴化乙锭至终浓度为100μg/ml。将溶液在Sorvoll 865转子(Dupont Co.，Newton，CT 06470)或相似的垂直转子中以260，000xg离心24小时。离心后，分离病毒DNA条带并用100mM Tris-HCl，pH＝7.8饱和的异戊醇提取5次。然后将BK病毒DNA溶液对TE缓冲液透析，直到DNA的260nm/280nm光吸收比在1.75到1.90之间。将NaCl浓度调到0.15M，加入2倍体积的乙醇，在-70℃下保温溶液至少2小时，以12，000xg离心溶液10分钟沉淀出DNA。将所得的BK病毒DNA沉淀以1mg/ml的浓度悬浮于TE缓冲液中。BK病毒的限制位点和功能图谱示于附图1。
B.质粒pBKneo1的构建大肠杆菌K12HB101/pdBPV-MMTneo细胞以冰冻干燥形式得自美国典型培养物保藏中心登记号为ATCC37224。将冰冻干燥的细胞铺在含有100μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂板上，在37℃下培养得到单菌落分离菌。
用一个大肠杆菌K12HB101/pdBPV-MMTneo菌落接种1升含有50μg/ml氨苄青霉素的L液体培养基(每升含10g胰蛋白胨、10g NaCl、5g酵母提取液)，在空气摇床上37℃下培养，直到O.D.590为～1个光吸收单位，这时，向培养物中加入150mg氯霉素。继续培养约16小时。氯霉素的加入抑制了蛋白质的合成，进而抑制了细胞分裂，但允许质粒继续复制。接着，基本根据实例1A所述的方法由该培养物制备质粒pdBPV-MMTneo DNA。
将由该方法得到的～1mg质粒pdBPV-MMTneoDNA悬浮于1mlTE缓冲液中，并贮存于-20℃下。如果需要大量纯度很高的质粒DNA则一般利用实例1A所述的质粒分离方法。该方法经修饰可快速得到较少量的、不很纯的DNA(这在筛选具有特定质粒的转化体时是需要的)，即仅用约5ml培养细胞，在适当减量的溶胞缓冲液中溶解细胞，用苯酚和氯仿提取代替离心步骤。
如上所述制备的约5μg(5μl)质粒pdBPV-MMTneo DNA和5μg(5μl)BK病毒DNA分别在含有2μl 10X BamHⅠ缓冲液(1.5M NaCl;60mM Tris-HCl，pH＝7.9;60mM MgCl2;1mg/ml BSA)、1μl(～10单位)限制酶BamHⅠ、7μl H2O的溶液中在37℃下消化2小时。用等体积苯酚提取一次，用氯仿提取两次而终止反应。然后将每个BamHⅠ消化的DNA沉淀，离心收集，并再悬浮于5μl H2O中。
向BamHⅠ消化的质粒pdBPV-MMTneo(1μl)和BamHⅠ消化的BK病毒DNA(1μl)的混合液中加入约1μl 10X连接酶缓冲液。向DNA混合液中加入1μl(～5单位)T4DNA连接酶和6μl水，所得的反应物在16℃下保温过夜。连接后的DNA构成了所需的质粒pBKneo1和pBKneo2，它们的区别仅在于BK病毒DNA的取向不同。质粒pBKneo1的限制位点和功能图谱示于附图1。
大肠杆菌K12 HB101细胞可以冰冻干燥形式从北方地区研究实验室得到，登记号为NRRL B-15626。将50ml L液体培养基中的大肠杆菌K12 HB101培养物培养至在650nm处的光密度(O.D.650)约为0.4个光吸收单位。将培养物在冰上冷却10分钟，离心收集细胞。将细胞沉淀再悬浮于25ml冷的100mM MgCl2中，并在冰上保温25分钟。再次离心沉降细胞，沉淀再悬浮于2.5ml冷的100mM CaCl2中，并在冰上保温30分钟。保温后，细胞便可吸收转化DNA。
将200μl该细胞悬浮液与上面制备的链接后的DNA混合，并在冰上保温30分钟。保温结束后，将细胞在42℃水浴中放置2分钟，然后再在冰上放置10分钟。离心收集细胞，再悬浮于1mlL液体培养基中，在37℃下培养1小时。将转化的细胞铺在含有100μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂平板上。大肠杆菌K12HB101/pBKneo1和大肠杆菌K12/pBKneo2转化体由其氨苄青霉素抗性表型及其质粒DNA的限制酶分析而鉴定。质粒pBKneo1的限制位点和功能图谱示于附图1A。
C.构建用于构建质粒pBLcat的中间质粒pLPcat腺病毒2(Ad2)的病毒颗粒DNA为大小约为35.94Kb的双链线性分子。在Ad2基因组的～0.32KbAccⅠ-PVuⅡ限制片段上可分离出Ad2后期启动子，这个～0.32Kb的限制片段相应于位于Ad2基因组5755位和6071位核苷酸之间的顺序。为了分离所需的～0.32KbAccⅠ-PVuⅡ限制片段，先用限制酶BalⅠ消化Ad2DNA，并分离出包括～0.32KbAccⅠ-PVuⅡ限制片段整个顺序的～2.4KbBalⅠ限制片段。然后用AccⅠ和PvuⅡ消化～2.4KbBalⅠ限制片段，得到所需的片段。
将约50μg Ad2 DNA(得自BRL)溶于80μl H2O和10μl 10X BalⅠ缓冲液(100mM Tris-HCl，pH＝7.6;120mM MgCl2;100mM DTT;1mg/ml BSA)中。向Ad2 DNA溶液中加入约10μl(～20单位)限制酶BalⅠ，所得反应物在37℃下保温4小时。
将BalⅠ消化的DNA加到琼脂糖凝胶上进行电泳，直到限制片段完全分离。用溴化乙锭稀溶液(0.5μg/ml)染色凝胶并将染色后的凝胶置于长波紫外(UV)光下观察电泳得到的DNA条带。以下叙述一种从琼脂糖中分离DNA的方法。在凝胶上所需片段的前沿切一小口，在每个小口中放一小片NA-45DEAE膜(SchleicherandSchuell，Keene，NH03431)。进一步电泳后，DNA便非共价地结合到DEAE膜上。在所需片段结合到DEAE膜上之后，取出膜，用低盐缓冲液(100mMKCl;0.1mMEDTA;20mMTris-HCl，pH＝8)冲洗。接着，将膜放在小试管中浸在高盐缓冲液(1MNaCl;0.1mMEDTA;20mMTris-HCl，pH＝8)中，然后在65℃下保温1小时，从DEAE膜上除去DNA。65℃保温后，收集保温缓冲液并用高盐缓冲液冲洗膜。合并高盐冲洗溶液和高盐保温缓冲液。
调整高盐DNA溶液的体积，使NaCl浓度为0.25M，然后向溶液中加入3倍体积的冷无水乙醇。将所得的溶液混合并在-70℃下放置10-20分钟。然后以15，000rpm离心溶液15分钟。再进行一次沉淀除去残余的盐，然后用乙醇冲洗DNA沉淀，干燥后再悬浮于20μlTE缓冲液中，构成约3μg所需的Ad2的限制片段。将所得的纯化片溶于10μlTE缓冲液中。
向Ad2的～2.4Kb BalⅠ限制片段溶液中加入约6μl H2O和2μl 10X AccⅠ缓冲液(60mM NaCl;60mM Tris-HCl，pH＝7.5;60mM MgCl2;60mM DTT;1mg/ml BSA)。向DNA溶液中加入约2μl(～10单位)限制酶AccⅠ后，反应物在37℃下保温2小时。AccⅠ消化后，利用乙醇沉淀收集DNA，并再悬浮于16μl H2O和2μl 10X PvuⅡ缓冲液(600m MNaCl;60mM Tris-HCl，pH＝7.5;60mM MgCl2;60mM DTT;1mg/ml BSA)中。向DNA溶液中加入约2μl(约10单位)限制酶PvuⅡ后，将反应物在37℃下保温2小时。
将AccⅠ-PvuⅡ消化的Ad2的～2.4Kb BalⅠ限制片段加到～0.6%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，直到含有Ad2晚期启动子的～0.32Kb AccⅠ-PvuⅡ限制片段与其它消化产物分开为止。凝胶用溴化乙锭染色，并利用紫外光进行观察，从凝胶上切下含有～0.32Kb AccⅠ-PvuⅡ的胶条，切碎，在～250μl提取缓冲液(500mM NH4OAc;10mM MgOAc;1mM EDTA;0.1% SDS)中室温下浸泡过夜。第二天早晨，将混合物离心，弃去沉淀。用乙醇沉淀上清液中的DNA，加入约2μg tRNA以保证所需片段完全沉淀出来。得到约0.2μg～0.32Kb AccⅠ-PvuⅡ限制片段，并悬浮于7μlH2O中。
为了将AccⅠ-PvuⅡ限制片段转化成AccⅠ-BclⅠ限制片段，将BclⅠ连接子连到～0.32KbAccⅠ-PvuⅡ限制片段上。由于BclⅠ连接子是平末端，所以连接子只附着于限制片段的PvuⅡ末端。用下列方法用激酶处理并制备用于连接的BclⅠ连接子(NewEng-landBiolabs)，该连接子具有下列顺序
将4μl连接子(～2μg)溶于20.15μl H2O和5μl 10X激酶缓冲液(500mM Tris-HCl，pH＝7.6，100mM MgCl2)，在90℃下保温2分钟，然后冷却到室温。向混合物中加入5μl γ-32P-ATP(～20μCi)、2.5μl 1M DTT、5μl多核苷酸激酶(～10单位)，然后在37℃下保温30分钟。然后加入3.35μl 0.01M ATP和5μl激酶，反应物继续在37℃下再保温30分钟。借助放射性ATP测定连接子是否已与靶DNA连接。
向～0.32Kb AccⅠ-PvuⅡ限制片段的溶液中加入约0.25μg(0.5μl)经激酶处理的BclⅠ连接子，然后向DNA溶液中加入1μl(～1000单位)T4DNA连接酶和1μl 10X连接酶缓冲液，将所得反应物在16℃下保温过夜。BclⅠ连接子只能连到AccⅠ-PvuⅡ限制片段的PvuⅡ末端上。后来的DNA顺序分析揭示出有4个BclⅠ连接子连到了AccⅠ-PvuⅡ限制片段的PvuⅡ末端上。通过BclⅠ消化和再连接可除去这些多余的BclⅠ连接子。但是，如果这些连接子不干扰含有这些多余连接子的载体发挥正常功能，便不除去这些多余的BclⅠ连接子。
大肠杆菌K12HB101/PSV2cat细胞以冰冻干燥的形式得自ATCC，登记号为ATCC37155。基本根据实例1A的方法从细胞中分离出质粒pSV2catDNA，与实例1A不同的是用50μg/ml氨苄青霉素代替四环素。质粒pSV2cat的限制位点和功能图谱示于附图1B。得到的1mg质粒pSV2cat DNA并溶于1ml TE缓冲液中。将约3μg(3μl)质粒pSV2cat DNA加到2μl 10X AccⅠ缓冲液和16μl H2O中，然后再向pSV2cat DNA溶液中加入3μl(约9单位)限制酶AccⅠ，所得的反应物在37℃下保温2小时。然后加入3μl 10X StuⅠ缓冲液(1.0M NaCl;100mM Tris-HCl，pH＝8.0;100mM MgCl2;60mM DTT;1mg/ml BSA)、5μlH2O，约2μl(约10单位)限制酶StuⅠ，从而用限制酶StuⅠ消化经AccⅠ消化的质粒pSV2cat DNA。将所得的反应物在37℃下保温2小时。反应物用苯酚提取一次，用氯仿提取两次而终止反应。得到约0.5μg所需片段并溶于20μl TE缓冲液中。
将约4μl AccⅠ-StuⅠ消化的质粒pSV2cat与约7μl Ad2的～0.32Kb AccⅠ-PvuⅡ(连有BclⅠ连接子)限制片段混合，加入3μl 10X连接酶缓冲液、15μl H2O和2μl(约1000单位)T4DNA连接酶，然后将连接反应物在16℃下保温过夜。连接后的DNA构成了所需的质粒pLPcat，该质粒含有Ad2后期启动子，其定位可驱动氯霉素乙酰转移酶基因的转录和表达。质粒pLPcat的限制位点和功能图谱示于附图1B。
基本根据实例2B的方法用连接后的DNA转化大肠杆菌K12HB101细胞。将转化的细胞铺在含有50μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂平板上，利用质粒DNA的限制酶分析来鉴定大肠杆菌K12HB101/pLPcat转化体。基本根据实例1A所述的质粒分离方法，从转化体中分离出质粒pLPcatDNA，用于随后的构建步骤，与实例1A不同的是用氨苄青霉素代替四环素作选择性试剂。
D.质粒pBLcat的构建将50μl含约88μg质粒pBKneo1 DNA的TE缓冲液加到7.5μl 10X AccⅠ缓冲液、30μl H2O和15μl(约75单位)限制酶AccⅠ中，将所得反应液在37℃下保温2小时。将AccⅠ消化的质粒pBKneo1 DNA加到琼脂糖凝胶上，使含有BK增强子的～1.4Kb片段与其它消化产物分离。然后从凝胶上分离出1.4Kb AccⅠ限制片段并纯化。将约5μg片段再悬浮于5μl 10X PvuⅡ缓冲液、45μl H2O和5μl(约25单位)限制酶PvuⅡ中，所得反应物在37℃下保温2小时。然后分离出PvuⅡ消化的DNA，纯化后准备进行连接。得到约2μg所需的～1.28Kb AccⅠ-PvuⅡ片段，并溶于5μl TE缓冲液中。
将约1μg质粒pLPcat DNA溶于5μl 10X AccⅠ缓冲液和40μl H2O中。向质粒pLPcat DNA溶液中加入约5μl(～25单位)限制酶AccⅠ，所得反应物在37℃下保温。用乙醇沉淀AccⅠ消化的质粒pLPcat DNA，并再悬浮于5μl 10X StuⅠ缓冲液、40μl H2O、5μl(约25单位)限制酶StuⅠ中，所得反应物在37℃下保温2小时。将AccⅠ-StuⅠ消化的质粒pLP cat DNA用乙醇沉淀数次，纯化出～4.81Kb AccⅠ-StuⅠ限制片段，该片段含有大肠杆菌复制起点和Ad2后期启动子。另一个消化产物为大小约为16bp的限制片段。得到约1μg所需的～4.81Kb限制片段，并溶于20μl TE缓冲液中。
将5μl质粒pLPcat的～4.81Kb AccⅠ-StuⅠ限制片段加到5μl质粒pBKneo1的～1.28Kb AccⅠ-PvuⅡ限制片段中。在DNA混合物中加入3μl 10X连接酶缓冲液、15μl H2O、2μl(约10单位)T4DNA连接酶后，所得的连接反应物在16℃下保温过夜。连接后的DNA构成所需质粒pBLcat。质粒pBLcat的限制位点和功能图谱示于附图1C。
基本根据实例2B所述的方法，用连接后的DNA转化大肠杆菌K12HB101细胞。大肠杆菌K12HB101/pBLcat转化体由其质粒DNA的限制酶分析来鉴定。基本根据实例1A的方法制备质粒pBLcatDNA用于随后的构建步骤，与实例1A不同的是用氨苄青霉素代替四环素作选择性试剂。
E.质粒pL133的构建质粒pL133是美国专利申请第06/699，967号(1985.2.8提交，代理律师案号为X-6737)公开并申请专利的一种人C蛋白表达载体。如下所述，可利用起始载体质粒pSV2gpt和pHC7(质粒pHC7的制备如实例1A所述)构建质粒pL133，先构建出中间载体质粒pSV2-HPC8，然后将其与质粒pSV2-β-球蛋白结合产生质粒pL133。质粒pL133的构建方案详细描述如下，并图示于，附图2。
将50μl(～50μg)质粒pHC7 DNA与5μl(～50单位)限制酶BanⅠ、10μl 10X BanⅠ反应缓冲液(1.5M NaCl;60mM Tris-HCl，pH＝7.9;60mM MgCl;1mg/ml BSA)和35μl H2O混合，并保温至消化完全。然后将BanⅠ消化的质粒pHC7 DNA在3.5%聚丙烯酰胺凝胶(29∶1，丙烯酰胺∶双丙烯酰胺)上进行电泳，直到～1.25Kb BanⅠ限制片段与其它消化产物分离。
从凝胶上切下含～1.25KbBanⅠ限制片段的凝胶区，置于试管中，捣成小碎片。向装有碎片的试管中加入1ml提取缓冲液(500mMNH4OAc、10mM MgOAc、1mM EDTA、1%SDS、10mg/ml tRNA)，将试管在37℃下放置过夜。离心沉淀细胞碎片，将上清液移入一新试管中。细胞碎片用200μl提取缓冲液洗涤一次;洗涤上清液与来自过夜提取的第一批上清液合并。使上清液通过一玻璃毛塞后，加入2倍体积的乙醇与上清液混合。将所得溶液在于冰-乙醇浴中放置～10分钟，然后离心沉淀DNA。
由该方法得到约8μg～1.25KbBanⅠ限制片段。将纯化的片段悬浮于10μlTE缓冲液中并贮存于-20℃。BanⅠ限制片段必须加入连接子进行修饰才能构建出质粒pSV2-HPC8。用于构建连接子的DNA片段利用Systec1450ADNA合成仪(SystecInc.，3816ChandlerDrive，Minneapolis，MN)或ABS380ADNA合成仪(AppliedBiosystems，Inc.，850LincolnCentreDrive，FosterCity，CA94404)来合成。本领域已知的许多DNA合成仪都可用于DNA片段的合成。此外，还可基本按照Itakura等人的方法(Itakuraetal.，Science，1981056，1977)和Crea等人的方法(Creaetal.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，755765，1978)用常规方法制备这些片段。
每种单链连接子各取500微微摩尔在20μl反应缓冲液中进行激酶处理，该反应缓冲液含有15单位(～0.5μl)T4多核苷酸激酶、2μl 10X连接酶缓冲液、10μl 500μM ATP、7.5μl H2O。将激酶反应物在37℃下保温30分钟，在100℃下保温10分钟使反应终止。为了保证激酶反应完全，将反应物在冰上冷却，向反应混合物中加入2μl 0.2M二硫苏糖醇、2.5μl 5mM ATP、15单位T4多核苷酸激酶，混合后将反应混合物在37℃下再保温30分钟。在100℃下再保温10分钟终止反应，然后在冰上冷却。
两条单链DNA连接子虽然分别用激酶处理，但在激酶反应后仍然混合在一起。为了将这两条链退火，在含有～150ml水的水浴中，将激酶反应混合物在100℃下保温10分钟。保温后，关闭水浴使其冷却到室温，该过程大约需要3小时。然后将仍装有经激酶处理的DNA试管的水浴在4℃下保温过夜，该过程使两条单链退火。所构建的连接子具有下列结构
使用前将该连接子贮存于-20℃下。
将～8μg～1.25Kb BanⅠ片段加入～50μl连接子(～500微微摩尔)、1μl T4DNA连接酶(～5单位)、10μl 10X连接酶缓冲液、29μl H2O中，混合后将所得的连接反应物在4℃下保温过夜。在65℃下保温10分钟终止连接反应。加入NaOAc到终浓度为0.3M，加入2倍体积的乙醇，在干冰-乙醇浴上冷却，然后离心该溶液使DNA沉淀出来。
将DNA沉淀溶于10μl 10X ApaⅠ反应缓冲液(60mM NaCl;60mM Tris-HCl，pH＝7.4;60mM MgCl2;60mM 2-巯基乙醇)、5μl(～50单位)限制酶ApaⅠ、85μl H2O中，将反应物在37℃下放置2小时。然后如上所述终止反应并沉淀DNA。将DNA沉淀溶于10μl 10X HindⅢ反应缓冲液、5μl(～50单位)限制酶HindⅢ、85μl H2O中，将反应物在37℃下放置2小时。HindⅢ消化后，将反应混合物加到3.5%聚丙烯酰胺凝胶上，从凝胶中分离出所需的～1.23Kb HindⅢ-ApaⅠ限制片段并进行纯化。得到约5μl所需片段，悬浮于10μl TE缓冲液中，并贮存于-20℃下。
将50μl(～50μg)质粒pHC7 DNA与5μl(～50单位)限制酶pstⅠ、10μl 10X PstⅠ反应缓冲液(1.0M NaCl;100mM Tris-HCl，pH＝7.5;100mM MgCl2;1mg/ml BSA)、35μl H2O混合，在37℃下保温2小时。然后基本根据上述方法将PstⅠ消化的质粒pHC7 DNA在3.5%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，纯化出所需的～0.88Kb片段。得到约5μg所需片段，悬浮于10μl TE缓冲液中，并贮存于-20℃下。
将～5μg～0.88KbPstⅠ片段加到～50μl下列连接子中并混合，该连接子在自动DNA合成仪上构建
向DNA混合物中加入约1μl T4DNA连接酶(～10单位)、10μl 10X连接酶缓冲液，29μl H2O，将所得的连接反应物在4℃下保温过夜。
在65℃下保温10分钟终止连接反应。使连接后的DNA沉淀后，将DNA沉淀溶于10μl 10X ApaⅠ反应缓冲液、5μl(～50单位)限制酶ApaⅠ、85μl H2O，将反应物在37℃下放置2小时。然后终止反应并再一次沉淀DNA。将DNA沉淀于10μl 10X BglⅡ反应缓冲液(1M NaCl;100mM Tris-HCl，pH＝7.4;100mM MgCl2;100mM 2-巯基乙醇;1mg/ml BSA)、5μl(～50单位)限制酶BglⅡ，85μl H2O中，将反应物在37℃下放置2小时。BglⅡ消化后，基本按照上述方法将反应混合物加到3.5%聚丙烯酰胺凝胶上，分离所需的～0.19Kb ApaⅠ-BglⅡ限制片段。得到约1μg所需片段，悬浮于10μl TE缓冲液中，并贮存于-20℃。
将约10μg质粒pSV2gpt DNA(ATCC37145)溶于10μl 10X HindⅢ反应缓冲液、5μl(～50单位)限制酶HindⅢ、85μl H2O中，将反应物在37℃下放置2小时。然后在反应混合物中加入NaOAc至浓度为0.25M，加入2倍体积的乙醇并在干冰-乙醇浴上保温后，离心沉淀DNA。将DNA沉淀溶于10μl 10X BglⅡ缓冲液、5μl(～50单位)限制酶BglⅡ、85μl H2O中，将反应物在37℃下放置2小时。BglⅡ消化后，将反应混合物加到1%琼脂糖凝胶上，电泳分离各片段。将凝胶用溴化乙锭染色并在紫外光下观察，将含有所需的～5.1Kb HindⅢ-BglⅡ片段的条带从凝胶上切下并置于一透析管中，继续电泳至DNA走出琼脂糖为止。含有来自透析管的DNA的缓冲液用苯酚和氯仿提取，然后沉淀DNA。将沉淀再悬浮于10μl TE缓冲液中，构成～5μg所需的质粒pSV2gpt的～5.1Kb HindⅢ-BglⅡ限制片段。
将2μl～1.23Kb HindⅢ-ApaⅠ限制片段、3μl～0.19Kb ApaⅠ-BglⅡ片段、2μl～5.1Kb HindⅢ-BglⅡ片段混合在一起，然后加10μl 10X连接酶缓冲液、1μl T4DNA连接酶(～500单位)、82μl H2O在16℃下保温过夜。连接后的DNA构成了所需质粒pSV2-HPC8，该质粒的限制位点和功能图谱示于附图2。
基本根据实例2B对大肠杆菌K12HB101所述的方法，使大肠杆菌K12RR1(NRRLB-15210)细胞成为转化感受态。用上面制备的连接后的DNA转化上述细胞，将转化混合物的等分试样涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂平板上。将琼脂平板在37℃下培养。大肠杆菌K12RR1/pSV2-HPC8转化体通过其质粒DNA的限制酶分析来证实。基本根据实例1A的方法，由转化体制备质粒pSV2-HPC8DNA，与实例1A不同的是在细胞培养过程中用氨苄青霉素而非四环素作一选择性试剂。
将50μg质粒pSV2-HPC8溶于10μl 10X HindⅢ反应缓冲液，5μl(～50单位)限制酶HindⅢ、85μl H2O中，反应物在37℃下保温2小时。HindⅢ消化后，沉淀DNA，并将DNA沉淀溶于10μl 10X SalⅠ反应缓冲液(1.5M NaCl;60mM Tris-HCl，pH＝7.9;60mM MgCl2;60mM 2-巯基乙醇，1mg/ml BSA)、5μl(～50单位)限制酶SalⅠ、85μl H2O中。将所得的SalⅠ反应混合物在37℃下保温2小时。将HindⅢ-SalⅠ消化的质粒pSV2-HPC8加到3.5%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，直至所需～0.29Kb HindⅢ-SalⅠ限制片段与其它反应产物分离。从凝胶上分离所需片段，得到约2μg片段并悬浮于10μl TE缓冲液中。
将50μg质粒pSV2-HPC8溶于10μl 10X BglⅡ反应缓冲液、5μl(50单位)限制酶BglⅡ、85μl H2O中，反应物在37℃下保温2小时。BglⅡ消化后，沉淀DNA，并将DNA沉淀溶于10μl 10X SalⅠ反应缓冲液、5μl(～50单位)限制酶SalⅠ、85μl H2O中。将所得的SalⅠ反应混合液在37℃下保温2小时。将SalⅠ-BglⅡ消化的质粒pSV2-HPC8加到3.5%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，直至所需的～1.15KbSalⅠ-BglⅡ限制片段与其它反应产物分离。从凝胶上分离出～1.15KbSalⅠ-BglⅡ限制片段，得到约8μg片段并悬浮于10μlTE缓冲液中。
将约10μg质粒pSV2-β-球蛋白DNA(NRRL B-15928)溶于10μl 10X HindⅢ反应缓冲液、5μl(～50单位)限制酶HindⅢ、85μl H2O中，将反应物在37℃下放置2小时。然后，在反应混合物中加入NaOAc使其浓度为0.25M，在加入2倍体积的乙醇并在干冰-乙醇浴中保温后，离心沉淀DNA。将HindⅢ消化的质粒pSV2-β-球蛋白溶于10μl 10X BglⅡ缓冲液、5μl(～50单位)限制酶BglⅡ、85μl H2O中，将所得混合物在37℃下放置2小时。BglⅡ消化后，将反应混合物加到1%琼脂糖凝胶上，电泳分离各片段。将所需的～4.2Kb HindⅢ-BglⅡ限制片段从凝胶上分离出来，得到约5μg所需片段并悬浮于10μl TE缓冲液中。
将2μl质粒pSV2-HPC8的～0.29Kb HindⅢ-SalⅠ片段、2μl质粒pSV2-HPC8的～1.15Kb SalⅠ-BglⅡ片段、2μl质粒pSV2-β-球蛋白的～4.2Kb HindⅢ-BglⅡ片段混合在一起，用T4DNA连接酶进行连接。连接后的DNA构成了所需的质粒pL133，质粒pL133的限制位点和功能图谱示于附图2。用连接后的DNA转化大肠杆菌K12 RR1，所需的大肠杆菌K12 RR1/pL133转化体通过其氨苄青霉素抗性表型及其质粒DNA的限制酶分析来鉴定。
F.由质粒pL133及pBLcat构建质粒pLPC将约20μg质粒pBLcat DNA溶于10μl 10X HindⅢ缓冲液和80μl H2O中。向质粒pBLcat DNA溶液中加入约10μl(～100单位)限制酶HindⅢ将所得反应物在37℃下保温2小时。将HindⅢ消化的质粒pBLcatDNA加到琼脂糖凝胶上进行电泳，直至含有BK增强子和Ad2后期启动子的～0.87KbHindⅢ限制片段与其它消化产物分离。然后，分离纯化～0.87Kb片段，并准备用于连接。得到约2μg所需片段并溶于5μlTE缓冲液中。
将约1.5μg质粒pL133 DNA溶于2μl 10X HindⅢ缓冲液和16μl H2O中。向该DNA溶液中加入约1μl(～10单位)限制酶HindⅢ，所得反应物在37℃下保温2小时。然后用TE缓冲液将DNA稀释至100μl并用～0.06单位小牛肠碱性磷酸酯酶处理，所得反应物在37℃下保温30分钟。调节该溶液使其含有1X SET(5mM Tris-HCl，pH＝7.8;5mM EDTA;150mM NaCl)、0.3M NaOAc、0.5% SDS，然后在65℃下保温45分钟。然后将HindⅢ消化的质粒pL133 DNA用苯酚提取两次，用氯仿提取一次，用乙醇沉淀，并再悬浮于10μl TE缓冲液中。
将约5μl质粒pBLcat的～0.87Kb HindⅢ限制片段加到1.5μg(10μl)HindⅢ消化的质粒pL133中，然后向DNA溶液中加入2μl 10X连接酶缓冲液、1μl(～10单位)T4DNA连接酶、2μl H2O，所得溶液在16℃下保温过夜。连接后的DNA构成了所需的质粒pLPC。
基本根据实例2B的方法用连接后的DNA转化大肠杆菌K12HB101。将转化的细胞铺在含有氨苄青霉素的L-琼脂平板上，通过限制酶分析来检察氨苄青霉素抗性转化体的质粒DNA，以此来鉴定大肠杆菌K12HB101/pLPC转化体。编码BK增强子和Ad2后期启动子的～0.87KbHindⅢ限制片段能够以两种取向之一插入HindⅢ消化的质粒pL133，其中只有一种取向产生质粒pLPC。质粒pLPC的限制位点和功能图谱示于附图1D。
实例3质粒pLAPC-IRS的构建基本根据实例1所述的位点特异性诱变和其它用于构建质粒pLAPC的构建方案，构建质粒pLAPC-IRS。但用于构建质粒pLAPC-IRS的缓冲液和退火条件如Zoller和Smith所述(ZollerandSmith，DNA3479-489，1984)。
在质粒pLAPC-IRS的构建中，将噬菌体M13mp18-HE1(见实例1B)利用下面的诱变寡核苷酸进行位点特异性诱变5′-CGCAGTCACCTGAAACGACCCCGCCCCAGCCGCAAGCGGCGCCTCATTGATGGGAAGATG-3′得自位点特异性诱变的诱变的噬菌体定名为M13mp18-HE3。
质粒pLAPC-IRS的最后构建用类似于实例1C所述的质粒pLAPC的构建方法进行。但是，质粒pLAPC的构建利用了两个来自质粒pLAPC的限制片段。在构建质粒pLAPC-IRS时，相同的两个片段却是得自质粒pLAPC。之所以用质粒pLAPC代替质粒pLAPC作片段的来源，是为了在鉴定质粒pLAPC-IRS转化体时简化限制分析。由于质粒pLAPC和pLAPC-IRS的大小非常相近，所以很难区别质粒pLAPC-IRS和“亲本”(质粒pLAPC)。但是，由于质粒pLAPC比质粒pLAPC-IRS小，所以如果从质粒pLAPC中得到上述的两个片段，就很容易将亲本(质粒pLAPC)与所需质粒pLAPC-IRS区别开。因此，为了构建质粒pLAPC-IRS，将噬菌体M13mp18-HE3的～0.7KbSstⅠ-SalⅠ限制片段与质粒pLAPC的～3.76KbEcoRⅠ-SalⅠ限制片段和质粒pLAPC的～2.0KbEcoRⅠ-SstⅠ限制片段相连接。连接后的DNA构成了所需的质粒pLAPC-IRS，将其转化入大肠杆菌K12RV308。用所得的大肠杆菌K12RV308/pLAPC-IRS转化体来大规模制备质粒pLAPC-IRSDNA用于进行真核细胞的转化。
实例4构建腺病毒转化的人胚肾细胞系293/pLAPC-IRS和腺病毒转化的金黄仓鼠细胞系AV12/pLAPC-IRS转化体人胚肾细胞系293可从美国典型培养物保藏中心得到，登记号为ATCCCRL1573。腺病毒转化的金黄仓鼠细胞系AV12也可从美国典型培养物保藏中心得到，登记号为ATCCCRL9595。下面描述的转化方法用293细胞作宿主细胞系;但该方法普遍适用于大多数真核细胞系，包括AV12细胞系，也适用于本发明的表达载体。
293细胞得自ATCC，登记号为CRL 1573，所得细胞为含有约5.5×106个细胞的汇合单层的25mm2培养瓶，培养基为加有10%热失活马血清的Eagle氏最低必需培养基。将培养瓶在37℃下培养，培养基一星期换两次。培养基的组成为DMEM(Gibco)添加10%胎牛血清、50μg/ml庆大霉素、10μg/ml Agua MEPHYTON
维生素K1(Merck Sharp and Dohme，Merck and Co.，Inc.，West Point，PA19486)。除去培养基，用Hank氏平衡盐溶液(Gibco)冲洗，加入0.25%胰酶(含有0.2g/L EDTA)作用1～2分钟，用新鲜培养基冲洗，将细胞吸出，以1∶5或1∶10的转种比将细胞分装到新的培养瓶中进行传代培养。
在转化的前一天，以每个100mm培养皿0.7×106细胞的密度接种细胞。用溶于TE缓冲液的乙醇沉淀的无菌质粒DNA来制备2X DNA-CaCl2溶液，该溶液含有25μg/ml转化质粒DNA(对质粒pLAPC-IRS的转化，通常用两个质粒，即质粒pLAPC-IRS和含有可选择标记的质粒，讨论如下)和250mM CaCl2。制备含有280mM NaCl、50mM Hepes、1.5mM磷酸钠的2X HBSS溶液，将pH调至7.05-7.15。将2X DNA-CaCl2溶液滴加到等体积的无菌2X HBSS中。将一个带棉塞的1ml无菌塑料吸管插到含有2X HBSS的混合管中，边加DNA边通气。在室温下静置30-45分钟，使之形成磷酸钙-DNA沉淀。
接着，用一个塑料吸管轻轻抽吸，使沉淀混合，将1ml(每平皿)沉淀直接加到10ml生长培养基中，使之覆盖受体细胞。在37℃下培养4小时后，用新鲜培养基替换原培养基，使细胞再培养72小时，然后提供选择压力。对于那些不含有在真核细胞中起作用的可选择标记的质粒，如质粒pLAPC-IRS，转化方法利用下列质粒的混合物缺少可选择标记的本发明的表达载体;一个含有在真核细胞中起作用的可选择标记的表达载体。可用于这种共转化系统的许多不同载体包括质粒pSV2-dhfr(ATCC37146)、pSV2-neo(ATCC37149)、pSV2-gpt(ATCC37145)、pSV2-hyg(NRRLB-18039)。质粒pSV2-hyg赋予真核宿主细胞潮霉素抗性。借助这种共转化技术可选择含有带可选择标记质粒的细胞。对这些细胞进行进一步的检察，鉴定出同时含有两种转化质粒的细胞。当然，本发明还包括那些含有适用于真核细胞的可选择标记的表达载体，因此不需要用共转化技术。
对于用含有潮霉素抗性基因的质粒转染的细胞，将潮霉素B加到生长培养基中，使其终浓度为约200μg/ml。然后将细胞在37℃下培养2-4周，每3-4天换一次培养基。将所得的潮霉素抗性集落分别转移到培养瓶中进行特征鉴定。质粒pSV2-neo赋予新霉素抗性(也用G418来代替新霉素)，基本根据潮霉素抗性细胞的选择方法对新霉素抗性集落进行选择，不同的是加入G418至终浓度为400μg/ml。
现有的文献已充分确认，可用二氢叶酸还原酶(dhfr)基因或dhfr基因的氨甲喋呤抗性衍生物(dhfr-mtx)作可选择标记，将基因或质粒引入dhfr缺陷细胞系，继而可用氨甲喋呤扩增质粒的拷贝数。293细胞为dhfr阳性，所以含有含dhfr基因质粒的293转化体，不能仅靠dhfr阳性表型进行选择，dhfr阳性表型即为在缺少次黄嘌呤和胸腺嘧啶的培养基中生长的能力。缺乏功能性dhfr基因并用含dhfr质粒转化的细胞系，可以靠dhfr+表型进行选择。虽然还未充分研究过在dhfr生成细胞中用dhfr作可扩增的可选择标记，但文献中有证据表明在dhfr生成细胞中可以用dhfr作可选择标记并用于基因扩增。本发明并不限于表达载体上所用的可选择标记。而且，可以利用可扩增的标记基因，如金属硫因基因、腺苷脱氨酶基因或者多基因抗性基因，例如P-糖蛋白基因。
用质粒pLAPC-IRS和潮霉素抗性载体的混合物转化293和AV12细胞系，然后选择潮霉素抗性细胞，得到许多转化体。(利用质粒pSV2-neo作共转化载体并选择G418抗性细胞，得到另一些转化体。)如实例5所述分析这些转化体，确定哪些潮霉素抗性细胞含有质粒pLAPC-IRS。
实例5分泌重组蛋白的细胞的鉴定方法在100mm2组织培养皿上以每个组织培养皿几百个细胞克隆的密度培养实例4获得的潮霉素抗性转化体。倒出培养基，细胞用5ml等份的Hank氏平衡盐溶液(Gibco)冲洗两次。将1ml1.8%琼脂(Sigma4型琼脂糖，目录号A3643，SigmaChemicalCo.，P.O.Box14508，St.Louis，MO63178)(47℃)与3mlDulbecco氏修改的Eagle氏(DME)盐(Gibco)(37℃)混合，制得无菌的0.45%琼脂溶液，取2ml该溶液铺在细胞上。
将若干硝酸纤维素滤膜(SchleicherandSchuell，Inc.，Keene，NH03431)煮沸，然后高压灭菌2小时除去对细胞有毒的润湿剂。然后把这些滤膜放在琼脂层上，除去气泡后，将这些平板于37℃下保温1-3小时。然后取下滤膜置于PBS(50mMTris-HCl，pH7.2，150mMNaCl)中。滤膜预先作好记号标出滤膜在培养皿上的原始取向，以便以后对集落进行鉴定。
为保持培养皿上的细胞在滤膜分析期间存活，细胞上铺一层8ml的混合物，该混合物中含有2ml1.8%琼脂(47℃)、2mlDME盐(37℃)、以及4ml含20%胎牛血清的DME盐(37℃)。然后将细胞放在37℃培养箱内。
在滤膜上进行的所有洗涤和反应都在滤膜放在摇床上时进行。首先将滤膜放在含5%牛奶的PBS中室温下保温阻断滤膜。然后用PBS冲洗滤膜4次(每次冲洗5分钟)。将10μg/ml生物素化的羊抗人C蛋白多克隆抗体在2.5%牛血清清蛋白中的溶液加到滤膜上(加入量足以覆盖滤膜)，然后于37℃下保温1小时。
可以用Kisiel所述的方法(Kisiel，J.Clin.Invest.64761，1979)进行C蛋白的纯化以便以后用来制备抗C蛋白抗体。可以用E.A.Kabat所公开的方法(E.A.Kabat，inStructuralConcepts in Immunology and Immunochemistry，1968，由Hold，Rhinehart和Winston出版)来制备多克隆抗体。单克隆抗体也适用于测定，其制备可以用Kohler和Milstein所公开的方法(Kohler and Milstein，Nature，256495，1975)，也可以用美国专利第4，696，895;EPO公告第205046号;Laurell et al.，FEBS 191(1)75，1985;Suzuki et al.，J.Biochem.97127-138，1985;以及EPO公告第138，222号所公开的方法。用于测定的抗生物素蛋白D和生物素化的辣根过氧化物酶(HRP)为VectastainTM试剂盒(Vector Laboratories，Inc.，30 Ingold Road，Burlingame，CA 94010)。生物素也得自Vector Laboratories，Inc.。
在4℃下用PBS冲洗滤膜4次。然后按厂家在VectastainTM(Vector Laboratories)试剂盒中的说明制备并加入抗生素蛋白D和生物素化辣根过氧化物酶。在4℃下使滤膜与结合有HRP的抗生物素蛋白D一起保温1小时(如果只分泌出少量蛋白，则可采用更长的保温时间即过夜);然后在4℃下用PBS冲洗滤膜4次。
为在滤膜上显示指示剂颜色，将溶于冰冷的100%甲醇中的约30mg HRP显色剂(4-氯-1-萘酚，Sigma)加到50ml PBS和30μl 30%H2O2中。将该混合液加到硝酸纤维素滤膜上，室温下保温至显色。分泌人C蛋白最多的集落将在滤膜上显现出来，它不仅颜色出现最早，而且在滤膜上的斑点较深。
滤膜已显色后，再用原始平板将滤膜重新排列，以确定哪些集落与滤膜上的斑点相联系。然后选择出分泌人C蛋白最多的集落并用来生产活化人C蛋白。
本领域专业人员应该认识到，上述测定法仅仅是说明高分泌细胞系的鉴定方法。该方法可成功地应用各种不同的测定法。例如，可以应用双抗体反应，其中用羊抗C蛋白抗体(IgG)和生物素化抗羊IgG抗体代替生物素化羊抗C蛋白抗体。该方法可成功地应用于来自任何细胞的任何分泌蛋白。
权利要求
1.一种制备重组DNA载体的方法，该方法包括将以下两个DNA化合物连接在一起(I)含有一个蛋白编码顺序的DNA化合物，该蛋白从氨基末端到羧基末端含有a)一个r-羧基化的分泌蛋白的信号肽和肽原；b)人c蛋白轻链；c)一个选自赖氨酸-精氨酸、赖氨酸-赖氨酸、或精氨酸-精氨酸的二肽；d)一个细胞连结蛋白酶切割顺序；e)人c蛋白活化重链；(II)含有一个启动子的DNA化合物，该启动子的定位在连接后能够驱动编码顺序的表达，限制条件是，所述切割顺序不是人c蛋白酶原的活化肽。
2.权利要求1的方法，其特征在于所述切割顺序的氨基酸残基顺序为PRPSRKRR，其中S为丝氨酸，P为脯氨酸，K为赖氨酸，R为精氨酸。
3.权利要求2的方法，其特征在于所述信号肽和肽原为初生人C蛋白的信号肽和肽原。
4.权利要求3的方法，其特征在于由所述DNA编码的多肽为H2N-MET TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILESER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARGALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLUGLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYSASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEUALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PROLEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILEASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLYARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASNGLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYSSER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HISPRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYSLYS ARG SER HIS LEU LYS ARG PRO ARG PRO SER ARG LYS ARG ARG LEUILE ASP GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VALLEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HISPRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYSLEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRPGLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SERLYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PROALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLYLEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THRGLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARGTHR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLUCYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALAGLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLYPRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VALSER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THRLYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYSGLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH其中ALA为丙氨酸，ARG为精氨酸，ASN为天冬酰胺，ASP为天冬氨酸，-COOH为羧基末端，CYS为半胱氨酸，GLN为谷氨酰胺，GLU为谷氨酸，GLY为甘氨酸，H2N-为氨基末端，HIS为组氨酸，ILE为异亮氨酸，LEU为亮氨酸，LYS为赖氨酸，MET为甲硫氨酸，PHE为苯丙氨酸，PRO为脯氨酸，SER为丝氨酸，THR为苏氨酸，TRP为色氨酸，TYR为酪氨酸，VAL为缬氨酸。
5.权利要求4的方法，其特征在于，该方法产生质粒pLAPC-IRS。
6.一种靠从真核宿主细胞分泌来直接生产重组活化C蛋白的方法，该方法包括(A)用一个重组DNA载体转化宿主细胞，所述载体含有(ⅰ)一个编码氨基酸残基顺序的DNA顺序，所述氨基酸残基顺序从氨基末端到羧基末端含有a)一个γ-羧基化的分泌蛋白的信号肽和肽原;b)人C蛋白轻链;c)一个选自赖氨酸-精氨酸、赖氨酸-赖氨酸或精氨酸-精氨酸的二肽;d)一个细胞连结蛋白酶切割顺序;e)人C蛋白活化重链;(ⅱ)一个启动子，其定位能够驱动所述DNA顺序的表达;(B)在允许所述DNA顺序表达的条件下培养步骤(A)中转化的所述宿主细胞;限制条件是，所述切割顺序不是人C蛋白酶原的活化肽。
7.权利要求6的方法，其特征在于所述切割顺序为PRPSRKRR，其中S为丝氨酸，P为脯氨酸，K为赖氨酸，R为精氨酸。
8.权利要求7的方法，其特征在于所述DNA顺序编码如下氨基酸残基顺序H2N-MET TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILESER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARGALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLUGLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYSASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEUALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PROLEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILEASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLYARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASNGLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYSSER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HISPRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYSLYS ARG SER HIS LEU LYS ARG PRO ARG PRO SET ARG LYS ARG ARG LEUILE ASP GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VALLEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HISPRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYSLEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRPGLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SERLYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PROALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLYLEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THRGLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARGTHR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLUCYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALAGLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLYPRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VALSER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THRLYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYSGLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH其中ALA为丙氨酸，ARG为精氨酸，ASN为天冬酰胺，ASP为天冬氨酸，-COOH为羧基末端，CYS为半胱氨酸，GLN为谷氨酰胺，GLU为谷氨酸，GLY为甘氨酸，H2N-为氨基末端，HIS为组氨酸，ILE为异亮氨酸，LEU为亮氨酸，LYS为赖氨酸，MET为甲硫氨酸，PHE为苯丙氨酸，PRO为脯氨酸，SER为丝氨酸，THR为苏氨酸。TRP为色氨酸，TYR为酪氨酸，VAL为缬氨酸。
9.权利要求8的方法，其特征在于，重组DNA表达载体为质粒pLAPC-IRS。
10.权利要求9的方法，其特征在于，所述宿主细胞为293或AV12宿主细胞。
11.权利要求10的方法，其特征在于，步骤(B)中培养的所述宿主细胞为293/pLAPC-IRS或AV12/pLAPC-IRS宿主细胞。
12.一种鉴定和分离表达并分泌一种蛋白的细胞以及定量测定该细胞所产生的蛋白相对于其它细胞的量的方法，该方法包括(a)在适当的固体基质上得到细胞群体;(b)在所述细胞上铺一层琼脂膜;(c)在所述琼脂膜上放一张硝酸纤维素膜;(d)取下所述硝酸纤维素膜，利用抗所述蛋白的抗体检验结合在所述硝酸纤维素膜上的所述蛋白。
13.权利要求12的方法，其特征在于所述蛋白为活化C蛋白。
全文摘要
描述了一种直接重组生产活化C蛋白的方法。还公开了用于该方法的DNA化合物、载体和转化体。该方法包括，用一个编码C蛋白分子的重组DNA载体转化宿主细胞并进行培养，在所述C蛋白分子中，活化肽被一个细胞连结蛋白酶切割顺序代替。
文档编号C07H21/04GK1035527SQ8810829
公开日1989年9月13日 申请日期1988年12月3日 优先权日1987年12月4日
发明者尼尔斯·乌尔里克·班, 赫特穆特·约瑟夫·埃尔里哈, 布赖恩·威廉·格林尼尔, 小斯坦利·理查德·杰斯库那斯 申请人:伊莱利利公司