专利名称：用deae-5pw阴离子-离子交换色谱和疏水作用色谱纯化硫代磷酸寡脱氧核苷酸的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及寡脱氧核苷酸纯化领域，特别是硫代磷酸寡脱氧核苷酸的纯化。
现有技术描述过去几年来，在为治疗目的的选择性基因调节领域中，使用修饰的磷酸酯骨架寡脱氧核苷酸作为反义寡核苷酸已得到越来越多的关注。现已将几种类型修饰的磷酸酯键，例如，膦酸甲酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、掺入到反义寡核苷酸中并对此进行了研究。例如Erickson和Izant(Eds.)“基因调节(Gene Regulation)反义RNA和DNA生物学”(Raven出版社，纽约，1992)。已发现硫代磷酸寡脱氧核糖核苷酸能抑制免疫缺陷病毒[Agrawal等“全美科学通报”(Proc.Natl.Aca d.Sci.USA)85，7079(1988)；Agrawal等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，7790(1989)；Agrawal等，“改进的药物释放综述”(AdvancedDrug Delivery Reviews)6，251(R，Juliano，Ed.，Elsevier，Amsterdam，1991)；Agrawal等，“癌症和艾滋病反义核酸治疗展望”(Prospects for AntisenseNucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS)，143(E.Wickstrom，Ed.，Wiley/Liss，New York，1991)；和Zamecnikl和Agrawal“艾滋病研究年度回顾”(Annual Review of AIDS Research)，301(Koff等，Eds.，Dekker，NewYork，1991)]，并能抑制组织培养中的流感病毒(Leiter等，Proc.Natl.Acad，Sci.USA 87，3420-3434(1990))。另外，各种基础研究均集中在硫代磷酸寡脱氧核糖核苷酸(例如，Agrawal等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，1401(1990)和Eckstein和Gish，Trends Biochem.Sci.14，97(1989))；酶抑制研究(Mujumdar等，“生物化学”28，1340(1989))；癌基因表达的调节(Reed等，“癌症评述”50，6565(1990))和IL-1表达(Manson等，Lymphokine Res.9，35(1990))上。
自动合成仪已经是获得寡核苷酸的一种非常有价值的工具。寡核苷酸是分步合成的，每隔一定时间向新生成的寡核苷酸链上加上一种单体。在每一反应周期中尽管加入核苷酸单体，但还有2-3％的反应不能进行。因此所得产物一般是不同长度寡核苷酸的不均匀混合物。例如，在典型的链长为20个单元的产物合成中，该20个单元产物只代表50～60％回收率的寡核苷酸产物。
而且，在固相载体上制备寡脱氧核苷酸需要将寡脱氧核苷酸从载体上解脱下来。将该寡聚物从载体上解脱下来一般是用浓氢氧化铵处理该固相。常规下再用例如旋转蒸发器在减压下去除该氢氧化铵。但是这种去除氢氧化铵的方法不宜用于大规模分离寡脱氧核苷酸。
对于很多目的(例如治疗或诊断)来说，化合物的纯度是极其重要的。因此有兴趣开发纯化寡核苷酸的色谱技术。因为就其治疗上应用的药效而言，关键多数在于如何纯化硫代磷酸寡核苷酸的问题。
纯化寡脱氧核苷酸的常规方法是使用反相液相色谱。这种方法需要有防爆装置，因为一般在洗脱缓冲液中使用了乙腈。
硫代磷酸寡脱氧核苷酸纯化的方法已有报导。Agrawal等“色谱杂志”(J.Chromatography)509，396(1990)报导了使用反相柱高效液相色谱分离硫代磷酸寡核苷酸。在该项研究中，Agrawal等将硫代磷酸寡核苷酸转化成其磷酸二酯对应物，然后进行HPLC分析。使用该方法能在强阴离子交换柱(Partisphere SAX柱)上分析含有10个或更少核苷酸的硫代磷酸寡核苷酸。但是因为与SAX基质发生强的相互作用，不能分析比10个核苷酸多的硫代磷酸寡核苷酸。
Metelev和Agrawal，“分析生物化学”(Anal.Biochem.)200，342(1992)报导了在弱阴离子交换柱(Partisphere WAX)上进行硫代磷酸寡脱氧核糖核苷酸的离子交换HPLC分析，其中弱阴离子交换剂使用了与Partisphere硅石键连的二甲基氨基丙基官能团。离子交换容量为0.18meq/g的这种基质与阴离子的相互作用比用强阴离子交换基质所观察到的相互作用更弱。该项研究的作者发现，对于长度达25个核苷酸的硫代磷酸寡核苷酸来说，分离作用有长度依赖性。而且n-1峰可与主峰很好分离。他们还发现，尽管用较小梯度能获得更好的分离效果，但用相同梯度也可分离30个核苷酸和35个核苷酸的硫代磷酸寡核苷酸。
Metelev等，Ann.N.Y.Acad.Sci.(纽约科学年刊)660，321-323(1992)，报导了用离子交换HPLC分析寡核糖核苷酸和嵌合的寡核糖-寡脱氧核糖核苷酸。他们发现所研究的寡核苷酸的保持时间取决于寡核苷酸中核糖核苷酸残基的数目。另外发现寡核糖核苷酸的保持时间与其长度有关。作者指出可以纯化和分析长度高达25个核苷酸的寡核糖核苷酸。
Bigelow等，“色谱法杂志”(J.Chromatography)533，131(1990)报导了用离子对HPLC分析硫代磷酸寡核苷酸。Stec等，“色谱法杂志”326，263(1985)，和Agrawal和Zamecnik，“核酸评述”(Nucleic Acids Res.)19，5419(1990)，报导了用反相柱对含有一个或两个硫代磷酸酯核苷酸间键连的寡脱氧核糖核苷酸的HPLC分析。
这些硫代磷酸寡核苷酸纯化方法都是使用HPLC。这项技术适于少量操作，而不适于大规模工业化应用。因此，现在需要有适用于大规模制备寡核苷酸的纯化寡核苷酸的改进方法。
发明概述本发明提供纯化硫代磷酸寡脱氧核苷酸的改进方法。具体地说，本发明提供的方法适合于大规模制备硫代磷酸寡核苷酸的纯化技术。本发明纯化方法不需要使用减压去除氢氧化铵或使用常规的C-18硅胶反相液相色谱。本发明方法用疏水作用色谱或DEAE-5PW阴离子交换色谱代替这些过程。
本发明的一方面是用疏水作用色谱纯化寡脱氧核苷酸。用氢氧化铵将寡核苷酸从它们进行合成的固相载体上脱开。一般情况下，用减压旋转蒸发去除大部分氢氧化铵。然后一般用反相色谱从无DMT的寡核苷酸中分离DMT保护的寡核苷酸。但是这些技术不适用于大规模应用。本发明的这一方面是用疏水作用色谱代替单独的旋转蒸发，或代替旋转蒸发和反相色谱两者。HIC比旋转蒸发好，因为其能简单快速地去除氢氧化铵，可在大规模纯化过程中应用。如果其后进行RPLC，HIC相对于旋转蒸发来说可提高寡核苷酸的纯度，结果使RPLC柱的污垢减少，也减少了用RPLC柱纯化所碰到的困难。
当HIC代替旋转蒸发和RPLC使用时，HIC提供了一次完成两项任务(去除氢氧化铵，从无DMT的寡聚物中分离DMT保护的寡聚物)的优点。用HIC代替RPLC也减少了树脂消耗；不需要有机溶剂(用有机溶剂需要更严格的操作，包括特殊的控制、防爆环境、和蒸发设备)；提供了更快的排污过程(污染物例如未反应的单体和无用的序列)；并提高了产率。产率的提高可通过使用短柱和高线性速度而实现。
HIC也减少了使用HPLC所带来的高费用(指柱填料和设备)和一些可能出现的问题，例如HPLC柱的充料和维持的困难。可用于本发明的合适的HIC柱包括但不限于苯基-琼脂糖凝胶快流(高取代)和TSK-凝胶苯基-5PW柱。
令人感兴趣的是尽管HIC和DEAE-5PW色谱从机理上来说完全不同，但它们可为相同目的而互换使用。这两者皆可用于纯化无DMT保护的寡核苷酸。而如下面所证明的，当纯化25个核苷酸的寡核苷酸时，DEAE-5PW得到更好的产率。使用这些技术常规上可获得纯度大约98％的寡核苷酸混合物。
象HIC柱一样，使用DEAE-5PW柱纯化无DMT保护的寡核苷酸不需要进行HPLC，因此如在比较短的柱子上进行纯化一样具有相同优点，即提高产率并易于充料，而且只要简单的洗脱分级梯度，因而简化了设备要求并减少了可能发生的差错。
本发明的另一方面是用DEAE-5PW柱进行离子交换。当寡核苷酸要用于治疗用途时，所有的铵阳离子必需被取代例如用钠阳离子取代。这可用Dowex阳离子交换柱接着用交联葡聚糖凝胶过滤脱盐而实现。本发明的这方面技术是用DEAE-5PW柱代替标准的离子交换方法。与最近介绍的阴离子离子交换苯乙烯二乙烯苯聚合物载体(例如，Per Septive Biosytems，Polymer labs)相比，这种树脂比较便宜，也很坚固，足以经受在生产上应用(指颗粒大小和能经受通常使用的清洗过程)。
当使用DEAE-5PW树脂纯化寡脱氧核苷酸时，洗脱液一般具有很高的盐浓度，使得典型的交联葡聚糖凝胶过滤脱盐变得不实际和不可能。应该使用其它去除盐的技术，例如，RPLC和切向流过滤(TFF)来代替交联葡聚糖凝胶过滤。在一优选实施例中是用切向流过滤使DEAE-5PW寡核苷酸混合物脱盐。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。
发明的详细说明本发明提供了纯化硫代磷酸寡脱氧核苷酸的改进方法。具体地说，本发明提供的方法适合于大规模分离硫代磷酸寡核苷酸的纯化技术。本发明纯化方法不需要使用减压去除氢氧化铵或使用常规的C-18硅胶反相液相色谱。本发明方法用疏水作用色谱或DEAE-5PW阴离子离子交换色谱代替了上述这些方法。
寡核苷酸是在固相合成后，通过在氢氧化铵中将固相载体保温而从该载体上解脱下来。从该载体上解脱下来的不仅是所要的寡核苷酸，而且也有序列断裂的寡核苷酸，即长度少于所需核苷酸序列数目的寡核苷酸也解脱了下来。这些断裂的序列是由于核苷酸单体没有完全与增长的寡核苷酸链偶联以及未反应官能位点没有完全饱和而产生的。如果将其有效地用于治疗或其它目的，必须将需要的寡核苷酸从断裂的序列中分离出来。
习惯上用旋转蒸发去除大量氢氧化铵，接着用反相液相色谱将所需的DMT保护的寡聚物(即有5′二甲氧三苯甲基保护基的寡核苷酸)与不需要的无DMT保护的寡聚物(即没有5′保护基团的寡核苷酸)分离。更具疏水性的DMT保护的寡聚物比无DMT保护的寡聚物能更紧密地与反相柱结合。
如果所需的寡核苷酸要用于治疗目的，与寡核苷酸配位的所有铵阳离子必须用阳离子交换(例如用钠离子)。这通常是通过离子交换色谱后再用交联葡聚糖凝胶脱盐来实现的。
本发明包括一些改进的方法用来分离或纯化硫代磷酸寡核苷酸。这里使用的“分离”和“纯化”两词能互换使用，并且是指这样的过程，即具有某种特定分子结构的寡核苷酸用物理方法从具有不同分子结构的寡核苷酸中分离出来，且将氢氧化铵和/或其它盐从寡核苷酸混合物中去除。具体说，本发明包括使用疏水作用色谱(HIC)和DEAE-5PW离子交换色谱分离纯化硫代磷酸寡核苷酸。
在本发明第一种实施方案中，所需的寡核苷酸是从过量氢氧化铵中分离出来，并将含有寡核苷酸的氢氧化铵溶液经过疏水作用色谱接着用反相液相色谱处理而制得。优选的是，HIC包括使含寡核苷酸的氢氧化铵通过苯基-琼脂糖凝胶快流色谱树脂或苯基-5PW色谱树脂。
在本发明的第二个实施方案中，将含寡核苷酸的氢氧化铵溶液通过疏水作用色谱而将所需寡核苷酸从过量氢氧化铵和无DMT保护的寡聚物中分离出来。优选的是用HIC处理时包括使含寡核苷酸的氢氧化铵通过苯基-琼脂糖凝胶快流色谱树脂或苯基-5PW色谱树脂。
在本发明的第三个实施方案中，用DEAE-5PW柱完成离子交换(其中铵离子被交换成钠离子)和纯化。在该实施方案中发现，该洗脱液的盐浓度通常对交联葡聚糖凝胶脱盐来说是太高，由如传统上是在进行标准的寡核苷酸离子交换之后脱盐。在该实施方案中，脱盐是通过某种能有效控制高盐浓度的合适技术来进行的。优选通过切向流过滤(TFF)来进行脱盐。TFF的优点是能调节，使具有高盐浓度(例如2M NaCl)的溶液能进行大容量脱盐。
本发明也包括制备寡核苷酸的纯化混合物的方法。本发明的该方法包括(a)用HIC去除氢氧化铵并去除没有DMT保护基的寡聚物；(b)去三苯甲基化，以去除DMT保护基；(c)DEAD-5PW阴离子交换；(d)切向流过滤；和(e)冻干。
本发明方法可用来纯化含有硫代磷酸寡核苷酸的粗混合物。这些粗混合物是用氢氧化铵从固相合成载体上刚解脱下来的或者是事先经过纯化程序但没达到要求纯度的混合物。
我们发现硫代磷酸寡核苷酸可以在DEAE-5PW离子交换柱、苯基-5PW和苯基琼脂糖凝胶柱上用5PW水溶液进行纯化，从而使硫代磷酸寡核苷酸从磷酸二酯中按高产率进行有效分离。本发明提出的方案可大规模纯化硫代磷酸寡核苷酸以取代常规纯化方法中所用的旋转蒸发器和C18硅石凝胶方案。结果减少了生产工艺的步骤，使产物达到更好的纯度和收率。
根据本发明方法，长度大约10至大约35个核苷酸的硫代磷酸寡核苷酸可以在DEAE-5PW离子交换柱、苯基琼脂糖凝胶柱或苯基-5PW柱上分离。在优选实施方案中，用本发明方法能分离大约20至大约35，优选25-30长度的硫代磷酸寡核苷酸。
根据本发明，用本发明方法分离的寡核苷酸可以少则一个，多则所有的核苷酸之间有硫代磷酸酯键连接。这里所用“硫代磷酸寡核苷酸”这一词就是这种寡核苷酸。与所描述的该硫代磷酸寡核苷酸一样大小的硫代磷酸寡核苷酸也都可通过本发明方法分离。
将寡核苷酸置于柱上在室温或接近室温温度下用梯度或非梯度缓冲液洗脱。对于用HIC进行氨溶液的纯化/制备，所用乙酸铵平衡缓冲液的浓度大约0.5至大约2.0M，优选0.75M。尽管加入乙酸铵可以使pH值稍有降低，但一般应保持高的pH值以减少三苯甲基基团的损失。已成功地使用了7.5-11.0的pH值。一般优选的pH值为10.0，因为该较大碱性的pH值能减少三苯甲基从寡核苷酸上失去。用水进行洗脱是最有效的，但在具体应用中证明了可以使用缓冲液的其它方案。分离不需要有机溶剂，但当用HIC制备寡核苷酸时，接着进行的RPLC分离可能需要包括有机溶剂的溶液。可以使用较高的柱子(其高度直径之比参见以下实施例)，而较短柱子能很好操作因而为大规模生产所选用。装柱高度可以在650 OD单位/ml，取决于洗脱条件和柱子几何条件。优选的柱负荷是装柱大约200 OD单位/ml。线性速度可以高到300cm/hr，但优选大约150cm/hr。
当用HIC纯化无DMT保护的寡核苷酸时，可以使用pH范围在大约7.2至大约8.5的各种缓冲液。在优选实施方案中，使用pH大约7.5的Tris-HCl。在装载柱和平衡液中必须加入盐，如氯化钠，冲洗缓冲液浓度范围是大约1M至大约3M，优选大约3M。通过盐递减的线性或分级梯度进行洗脱。苯基琼脂糖凝胶柱优选以高流速的规格装柱。发现速度超过大约250cm/hr装载效果最好。以大约150-200cm/hr的速度洗脱是比较合适的。
当用DEAE-5PW纯化无DMT保护的寡核苷酸时，要使用缓冲液，如Tris-HCl(优选浓度大约10至大约50mM)。盐(如氯化钠)用于平衡和洗脱。优选使用0至2M的氯化钠梯度。对于较短柱子，氯化钠浓度范围优选是在0.85和2M之间。装柱的寡核苷酸溶液的pH可以在大约7.0和大约10.5之间，优选大约7.2。平衡、冲洗和洗脱缓冲液的pH可以是自大约7.2至大约8.5的范围，优选大约7.2，在一些应用中，可以向缓冲液中加入螯合剂如1mM的EDTA和有机溶剂如乙腈或乙醇。可以进行线性梯度，但用简单的分级梯度能得到极好的收率和纯度。在很多情况下，用分级梯度能得到更好的收率(线性梯度似乎会引起固定着的产物从柱上缓慢流失，经常不利于有效分离和高收率)。虽然可以使用较高的柱子，便较短的柱子有极好的效果故优选用于大规模生产。寡核苷酸柱容量稍微低于HIC树脂柱容量，最好装柱范围可高到大约200 OD单位/ml树脂，优选大约150OD单位/ml填料。最佳线性速度范围在大约50和大约150cm/hr之间，优选大约70cm/hr。
柱几何条件对平衡缓冲液盐条件的要求有十分显著的影响-与较短柱子(高度直径比较小)相比，较高柱子(较大的高度直径比)需要较高盐浓度。柱高直径比和氯化钠浓度之间的关系与产物得率有关。随着DEAE-5PW柱的高度直径之比的增加，最好提高平衡缓冲液中氯化钠盐的溶度，以获得纯化产物的较大收率。
本发明的分离方法基本上与装柱颗粒大小无关。粒度在25至90μm范围的使用效果较好。在优选实施方案中，颗粒大小是25μm-40μm或45μm-165μm。具体优选的疏水作用色谱树脂的粒度大约为90μm。
本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
实施例在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司购得Toso Haas(Montgomeryville，PA)；Amicon(Beverly，MA)；Waters(Milford，MA)；Hewlett-Packard(HP)(Palo Alto，CA)；Perkin-Elmer(Norwalk，CT)；ISCO(Lincoln NB)；Rainin(Woburn，MA)；Filtron(North-borough，MA)；Pharmacia(Piscataway，NJ)；和Biorad(Hercules，CA)。
实施例1用DEAE-5PW纯化用0.51、30μm的TSK DEAE-5PW柱(自Toso Haas购得)纯化具有CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT(GEM 91)序列的25单元寡核苷酸。树脂装入Pharmacia的5.0cm直径的玻璃柱中。用带有254nm滤器和Rainin跑兔泵的ISCO UA-5检测器控制该纯化过程。
该实施例中使用了两种来源的GEM 91(1)从交联葡聚糖凝胶G-15柱出来的GEM 91级份，接着在Filtron切向流过滤(TFF)膜上脱盐和浓缩，然后进行色谱分离；(2)两批冻干的GEM 91粉末一批是经离子交换-HPLC低纯度的，另一批是经CGE(毛细凝胶电泳)低纯度的。
GEM 91寡核苷酸按150 A260O.D(光密度)单位/ml装柱。
用含有0.85至1.0M NaCl室温pH 7.2的25mM Tris-HCl作缓冲液，在一些实验中该缓冲液还含有1mM EDTA。用含有2M NaCl、pH 7.2(室温)的25mM Tris-HCl进行洗脱，在一些实验中，洗脱液中还含有1mMEDTA。装上样品后用6柱体积(4号用4柱体积)的合适的平衡缓冲液冲洗柱子。收集级份，测定O.D.收率，用离子交换HPLC(IEX)，在一些情况下用CGE分析法分析各等份的纯度。
另外，在0.51柱子上进行纯化，为了评价柱构型的性能效果，以9ml柱规格进行三次实验。
结果见表1。用离子交换(IEX)HPLC分析百分纯度(％纯度＝硫代磷酸的百分数，包括N和N-1序列)；#5试验也有CGE数据(％纯度＝N寡核苷酸的百分数，包括硫代磷酸和磷酸二酯寡聚物)。
在9ml(2.2cm直径×2.4cm柱高)柱上进行三次实验。结果见表2。
结果表明，粗产品寡核苷酸可以用DEAE-5PW纯化，能得到高纯度和极好的收率。
表1纯化的收集液试验序号 条件O.D回收百分率1％纯度 产物回收百分率21平衡0.85M NaCl＋EDTA54.1 99.6 59.7装载90％IEX纯度32平衡1.0M NaCl/+EDTA 85.8 98.6 94.0装载89％IEX纯度3平衡1.0M NaCl 86.0 99.2 96.2装载89％IEX纯度4平衡1.0M NaCl 58.7 98.0 64.7装载89％IEX纯度5平衡1.0M NaCl 87.0 97.8 89.94装载89％IEX纯度， 84.777％CE纯度重复试验6 平衡1.0M NaCl78.398.290.1装载87％ IEX重复试验纯度7 平衡1.0M NaCl78.798.689.3装载87％IEX重复试验纯度8 平衡1.0M NaCl83.598.493.4装载88％IEX重复试验纯度1以最初装柱的总O.D(光密度)单位为基础的百分收率。2以最初装柱的“纯度单位”表示的产物百分收率。3IEX纯度单位＝(总的O.D.单位)×(IEX－HPLC分析的百分纯度)；CE纯度单位＝(总O.D.单位)×(CE分析的百分纯度)。CE纯度单位表明柱回收效率。4以CE数据为基础。
表2纯化收集液平衡缓冲液 O.D.百分 O.D.百分 ％纯度(IEX 产物百分中的[NaCl] 回收率(总)回收率-HPLC)回收率90.85M 109.087.097.0 94.0100.85M 101.080.097.0 86.0111.0M 113.067.099.0 73.0实施例2用疏水作用色谱进行纯化将GEM 91样品进行疏水作用色谱纯化。该样品的成份如表3所示。
表3有DMT保护 百分比CGE分析的寡核苷酸的百分比PO nn-1 n-2 n-3
62 0.4 55.2 11.4 2.8 3.5这是用Ami con 2.2cm玻璃柱、Waters 650溶剂输送系统、HP积分仪、Rainin Dynamax UV-C吸收检测器和Perkin-Elmer分光光度计，在苯基琼脂糖凝胶快流(fast flow)(高取代作用)柱上纯化的寡核苷酸。
将树脂装填到两种构型柱中的一种柱中，它们的高度∶直径比是2.2∶1或2.5∶1。
应用下面的洗脱方案(A)将装柱样品调成1.7M乙酸铵溶液，pH 10.7；用2.5M乙酸铵平衡并冲洗柱子；用0.1M乙酸铵(pH 8.5)洗脱，接着用水洗脱；(B)将装柱样品调成1.0M乙酸铵溶液，pH10.7；用1.0M乙酸铵(pH8.5)平衡并冲洗柱子；样品用水洗脱；(C)将装柱样品调成1.0M乙酸铵溶液，pH10.7；用1.0M乙酸铵(pH8.5)平衡并冲洗柱子；样品用0.01 M NaOH(pH11.5)洗脱，接着用水洗脱；(D)装柱样品调成0.75M乙酸铵溶液，pH11.0；用0.75M乙酸铵(pH8.5)平衡并冲洗柱子；样品用0.01M NaOH(pH11.5)洗脱，接着用水洗脱；用离子交换和反相(RP)HPLC方法分析冲洗和洗脱级份的等份样品。结果见表4。
表4样品 高度 装载量1速度 洗脱OD百分回收率3产物百分回收率4洗脱纯度5直径比(cm/hr)2方案 洗脱 总计洗脱总计12.2∶1 252 316 A53.2 99.264.0 86.497.822.2∶1 252 316 B66.1 101.7 96.0 102.0 80.532.2∶1 252316/158C50.9 98.880.8 93.888.042.5∶1 200316/158C55.8 100.8 80.5 85.789.852.5∶1 200316/158C62.7 99.284.8 91.183.862.5∶1 200316/158C63.9 100.0 79.7 88.277.372.5∶1 200316/158D59.1 98.382.3 86.386.382.5∶1 178316/158D66.1 95.383.9 85.987.792.5∶1 178316/158D57.9 89.876.6 80.191.1
1装柱的总OD单位/ml填料。
2样品3～9以316cm/hr装载，并以158cm/hr速度洗脱。
3OD的百分回收率＝装柱的寡核苷酸的百分回收率洗脱＝洗脱收集液中的百分回收率总计＝全部级份的百分回收率4产物百分回收率＝装柱的“DMT保护”产物的百分回收率洗脱＝洗脱收集液中“DMT保护”产物的百分回收率总计＝全部级份中“DMT保护”产物的百分回收率5以含DMT物质的百分比表示(DMT保护百分率)；以下式计算(离子交换HPLC测定的DMT保护百分率＋反相HPLC测定的DMT保护百分率)/2。
用Waters 650溶剂输送系统、HP积分仪、Rainin Dynamax UV-C吸收检测器、1cm(Biorad)和2.2cm(Amicon)直径玻璃柱、和Perkin-Elmer分光光度计，在苯基琼脂糖凝胶快流(高取代作用)柱上纯化平均DMT保护率为62％的GEM 91氨溶液。
在苯基琼脂糖凝胶装柱之前，将脱保护的溶液调成1.7M乙酸铵溶液，pH 10.3。苯基琼脂糖凝胶事先用乙酸按平衡，用pH 7.85乙酸铵反梯度洗脱接着用水进行寡核苷酸洗脱。使用下面试验条件(A)用2.5M乙酸铵(pH 8.5)平衡并冲洗柱子；用分级梯度为8％ACN的0.1M乙酸铵(pH 7.85)、接着用水洗脱寡核苷酸；(B)用1.7M乙酸铵(pH 8.5)平衡并冲洗柱子；用1.5M-1.0M和1.0M-0M乙酸铵的连串线性梯度、接着用水洗脱寡核苷酸；(C)用7M乙酸铵(pH 8.5)平衡并冲洗柱子；用分级梯度0.5M乙酸铵、接着用线性梯度0.5-0M乙酸铵、接着用水洗脱寡核苷酸；(D)用2.6M乙酸铵(pH 8.5)平衡并冲洗柱子；用分级梯度0.5M乙酸铵、接着用线性梯度0.5-0M乙酸铵、接着用水洗脱寡核苷酸。
用离子交换和反相HPLC分析方法冲洗和洗脱等分级份。结果见表5。
表5高度直径比 装载量1线性速度 洗脱 OD回收率 产物回收率 洗脱纯度2(cm/hr) 方案(％) (％)洗脱 总计 洗脱 总计
5.4∶1192462A 46.9 106.4 75.4 78.199.72.2∶1385315B 42.4 97.766.7 83.697.82.2∶1385315C 18.9 101.5 30.2 93.199.02.2∶1252315D 32.3 96.652.5 85.397.51装柱OD单位/ml填料。
2DMT保护百分率(用离子交换HPLC的离子交换方法测定的DMT保护百分率＋用反相HPLC测定的DMT保护百分率)/2这些结果表明DMT保护的寡核苷酸可以从氨溶液和无DMT保护的寡核苷酸中纯化出来。
实施例3HIC代替旋转蒸发和RPLC将两份GEM 91样品做疏水作用色谱分离。这些样品成份如表6所示。样品3-1已经在4℃下以氨溶液形式保存，样品3-2新近制备表6样品DMT保护百分率 ％POCGEnn-1 n-2n-3163 0.456.5 10.32.82.9269 0.457.6 6.5 2.03.7用Amicon 22cm玻璃柱、Water 650溶剂输送系统、HP积分仪、Rainin Dynamax UV-C吸收检测器、和Perkin-E(mer分光光度计，在苯基琼脂糖凝胶快流(高取代作用)柱上纯化这些寡核苷酸。
将GEM 91氨溶液调成0.75M乙酸铵溶液，并以75cm/hr的速度装载到事先用0.75M乙酸铵(pH 10.2)平衡过的柱子上。装料后，用(0.75M)乙酸铵以317cm/hr速度冲洗柱子，再用水以159cm/hr冲洗柱子由此来洗脱DMT保护产物。
用离子交换和反相HPLC对冲洗和洗脱的等分进行分析。结果见表7。被洗脱下来的产物的纯度和产率相当于用反相液相色谱所达到的纯度和产率。这证明适当调节装柱和洗脱条件，用HIC在较短(低高度∶直径比)色谱柱上能获得极好产率的高纯度DMT保护产物。
表7粗产品GEM 91 OD分回收率 产物百分回收率 洗脱纯度寡聚物样品装载量1洗脱 总计洗脱总计 DMT保护百分率21200 55.8 102.1 85.085.397.51300 48.5 104.1 73.588.898.51200 56.6 96.183.588.996.02200 64.0 104.4 89.094.396.01装柱总的OD单位/ml。
2计算纯度(IEX－HPLC测定的DMT保护百分率＋RP－HPLC测定的DMT保护百分率)/2。
实施例4用HIC纯化寡核苷酸用Biorad玻璃柱(1.5cm直径)带有254nm滤器的ISCOUA-5检测器、Rainin跑兔泵、和Perkin-Elmer分光光度计，在TSK-凝胶苯基-5PW(Toso Haas)柱上和以琼脂糖为基础的苯基琼脂糖凝胶快流(高取代作用)柱(Pharmacia)上纯化GEM 91。
在2000 MWCO改进的聚醚砜滤器(Filtron，Inc.)上通过切向流过滤(TFF)，从各批产物的脱盐柱(凝胶过滤)副级分中回收GEM 91(钠盐形式)。在施加到柱子上之前将寡脱氧核苷酸溶液调节成3M NaCl的25mMTris-HCl和pH 7.4-7.5的溶液。实验条件A.苯基5PW；将3M NaCl/25mM Tris-HCl、pH 7.5中的寡核苷酸装载上柱，用线性梯度3M-0M NaCl洗脱寡聚物。
B.苯基琼脂糖凝胶；按照A中寡核苷酸相同的装柱和洗脱条件。
C.苯基琼脂糖凝胶；将3M NaCl/25mM Tris-HCl、pH 7.4中的寡核苷酸装载上柱；用分级梯度2M和1M NaCl、接着用线性梯度1M-0MNaCl洗脱寡核苷酸。
D.苯基琼脂糖凝胶；将3M NaCl/25mM Tris-HCl pH 7.4中的寡核苷酸装载上柱；用分级梯度1M NaCl、接着用线性梯度1M-0.7M NaCl、再接着用分级梯度0.7M和0M NaCl洗脱寡核苷酸；每个柱子的结果见表8。这些结果证明，用苯基琼脂糖凝胶快流树脂或者苯基5PW树脂可以纯化钠盐形式的寡核苷酸。
表8OD单位 产物回收率IEX(％)1产物回收率CGE(％)2洗脱回收率回收率 洗脱回洗脱 回收率 洗脱回 洗脱 回收率合并的收率纯度 合并的 收率纯度 合并的(％) 级分(％) (％)(％) 级分(％)(％)(％) 级分(％)A53.6 94.5 59.295.991.7nd ndndB74.8 100.877.095.695.877.391.8 96.3C62.5 93.0 65.294.990.163.991.7 96.7D66.0 113.968.396.1112.2 67.192.0 110.11[(级份中CGE单位数)/(装柱量中CEG单位数)]×100。
2[(级份中IEX单位数)/(装柱量中IEX单位数)]×100。
实施例5用Waters 650溶剂输送系统、HP积分仪、1cm(Biorad)和2.2cm(Amicon)直径玻璃柱和Perkin-Elmer分光光度计，在苯基琼脂糖凝胶快流(高取代作用)柱上纯化平均DMT保护率为62％的GEM 91氨溶液。
将苯基琼脂糖凝胶装填到高度直径比为5.4∶1、2.2∶1、和1∶1的三种构型柱子中的一种柱子中。
在pH 8.5的乙酸铵中平衡苯基琼脂糖凝胶柱，试验条件如下(A)不调节GEM 91氨溶液；用2.5M乙酸铵(pH 8.5)平衡柱子；用分级梯度8％乙腈(ACN)的水溶液(pH 7.85)、接着用水洗脱寡核苷酸；或者(B)在上料前将GEM 91氨溶液调成1.7M乙酸铵溶液，pH 7.85；用1.5M乙酸铵(pH 7.85)平衡柱子；用分级梯度8％ACN的水溶液、接着用水洗脱寡核苷酸。
用离子交换和反相HPLC分析冲洗和洗脱的等分级份。结果见表9。这些结果证明，苯基琼脂糖凝胶快流树脂可以用来制备用于下步RPLC中DMT保护寡核苷酸粗产物的氨溶液。
表9高度∶直径 装载量1线性速度 洗脱 OD回收率产物回收率 洗脱纯度2比 (cm/hr) 方案 (％) (％)洗脱 总计 洗脱 总计5.4∶1192 462A92.1 103.5 94.4 94.4685.4∶1450 462A80.8 104.4 97.8 97.8755.4∶1642 462A54.8 100.1 88.5 91.9805.4∶11285462A24.5 105.5 nd3nd nd1∶1 400 396A62.7 101.1 81.4 91.0811∶1 305 396A53.5 98.3 86.3 89.2721∶1 305 157A72.4 100.0 87.6 92.4751∶1 250 157A80.4 102.0 90.8 91.0702.2∶1355 396A42.1 103.5 55.1 97.2812.2∶1400 317B85.9 105.3 93.5 93.5681装载量OD单位/ml2洗脱纯度用IEX-HPLC测定实施例6使用CPG载体和自动合成仪合成GEM 91。用浓氢氧化铵将寡核苷酸从载体上解脱下来。然后基本上根据上述实施例1-6提出的方法，用苯基琼脂糖凝胶或苯基-5PW树脂，用疏水作用色谱，对寡核苷酸/氢氧化铵混合物进行色谱分析。收集含有GEM 91的所得溶液，并视情况可用制备反相液相色谱进行色谱分析。酸化合并的GEM 91级份，去除二甲氧基三苯甲基(DMT)保护基。将去三苯甲基化的GEM91悬浮于水中，并且基本上按照以上实施例1的说明，在DEAE-5PW离子交换柱上进行色谱分析，将其纯化，并转化成GEM 91的钠盐形式。然后通过切向流过滤(TFF)去除盐和任何残留的小分子杂质使寡核苷酸脱盐，然后在认定为纯化的BDS膜上去热原化。这些步骤后产物总回收率是大约70％，纯度是大约98％。因此，使用这项技术，能有效地结合HIC和DEAE 5PW色谱，从氨溶液中获得好收率的高纯度寡核苷酸。
从以上的说明中应该理解，尽管为了详细说明本发明而描述了一些具体的实施方案，但不超出本发明的构思和范围，可以进行多种改变。
序列表(1)一般情报(i)申请人puma ph.D.，patricia(ii)发明题目purification of Oligodeoxynucleotide PhosphorothioatesUsing DEAE 5 PW Anion Exchange Chromatographyand Hydrophobic Interaction Chromatography(iii)序列数1(iv)通讯地址(A)住址Allegretti & Witcoff，Ltd.
(B)街道10 South Wacker Drive，Suite 3000(C)城市Chicago(D)州IL(E)国家USA(F)邮区60606(v)计算机可读形式(A)介质类型Floppy盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类(viii)代理人(事务所)情报
(A)姓名Greenfield ph.D.，Michael S.
(B)登记号97，142(C)参考/摘要号94，444(ix)电讯情报(A)电话(312)715-1000(B)电传(312)715-1234(2)序列鉴定号1的情报(i)序列特征(A)长度25碱基对(B)类型核酸(C)链数单链(D)拓扑结构线性(iii)假拟NO(ix)特性(A)名称/要点misc_特性(B)地址1..25(C)其它情报/注＝“所有核苷酸间连接的是硫代磷酸酯键”(xi)序列描述序列鉴定号1CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT 2权利要求
1.一种纯化无DMT保护的硫代磷酸寡核苷酸和二硫代磷酸寡核苷酸的方法，包括将该寡核苷酸混合物装到含有DEAE-5 PW阴离子交换色谱树脂的柱子上，并用含盐的洗脱缓冲液洗脱。
2.权利要求1的方法，其中寡核苷酸长度是10至大约35个核苷酸。
3.权利要求2的方法，其中的盐是氯化钠，其含量范围为大约0至大约2M，pH在大约7.0和大约10.5之间。
4.权利要求3的方法，其中氯化钠浓度是大约0.85M至大约2M。
5.权利要求3的方法，其中硫代磷酸和二硫代磷酸寡核苷酸的长度为大约20-35个寡核苷酸。
6.权利要求5的方法，其中洗脱液pH是大约7.2。
7.权利要求3的方法，进一步包括通过切向流过滤将DEAE-5 PW洗脱液脱盐。
8.权利要求1的方法，其中寡核苷酸的装柱规格为大约150 O.D.单位/ml的装载浓度。
9.一种纯化无DMT保护的硫代磷酸寡核苷酸和二硫代磷酸寡核苷酸的方法，包括将寡核苷酸混合物装到含疏水作用色谱树脂的柱子上并用盐洗脱。
10.权利要求9的方法，其中疏水作用色谱树脂是苯基-琼脂糖凝胶快流色谱树脂或苯基-5 PW色谱树脂。
11.权利要求10的方法，其中寡核苷酸长度是10至大约35个核苷酸。
12.权利要求1酸的方法，其中盐是的氯化钠，其浓度范围为大约1.0至大约3M，pH在大约7.2和8.5之间。
13.权利要求12的方法，其中氯化钠浓度是大约3M。
14.权利要求12的方法，其中硫代磷酸和二硫代磷酸寡核苷酸的长度为大约20-35个寡核苷酸。
15.权利要求12的方法，其中洗脱缓冲液pH是大约7.5。
16.权利要求9的方法，进一步包括通过切向流过滤将洗脱液脱盐。
17.一种纯化DMT保护硫代磷酸和二硫代磷酸寡核苷酸的方法，包括疏水作用色谱。
18.权利要求17的方法，其中疏水作用色谱包括使用苯基琼脂糖凝胶或TSK苯基-5PW树脂的柱色谱
19.权利要求17的方法、其中寡核苷酸长度
20.权利要求18的方法，其中盐是乙酸铵，其浓度为大约0.75M
21.一种纯化DMT保护的硫代磷酸和二硫代磷酸寡核苷酸的方法，包括用权利要求19的方法从寡核苷酸溶液中去除过量的氢氧化铵。
22.一种纯化DMT保护的硫代磷酸寡核苷酸和二硫代磷酸寡核苷酸的方法，包括用权利要求19的方法从无DMT保护的寡核苷酸中分离DMT保护的寡核苷酸。
23.一种纯化DMT保护的硫代磷酸寡核苷酸和二硫代磷酸寡核苷酸的方法，包括用权利要求19的方法从寡核苷酸溶液中去除过量的氢氧化铵，以及从无DMT保护的寡核苷酸中分离DMT保护的寡核苷酸。
全文摘要
本发明提供分离和纯化硫代磷酸寡核苷酸用的一些改进的方法。本发明的某些方面是纯化硫代磷酸寡核苷酸的一种方法，该方法包括将寡核苷酸的混合物装到含DEAE(二乙基氨基乙基)-5PW阴离子离子交换色谱树脂的柱子上，并用浓度为大约0-2M的氯化钠洗脱缓冲液洗脱。本发明的其它方面是纯化硫代磷酸寡核苷酸的另一种方法，该方法包括将寡核苷酸混合物装到含苯基-琼脂糖凝胶快流色谱树脂或苯基-5PW色谱树脂的柱子上，并用基本上无盐的洗脱缓冲液洗脱。本发明提供的这些方法能廉价、快速、以及大规模地纯化寡核苷酸的氨溶液。
文档编号C07H1/00GK1155887SQ95194675
公开日1997年7月30日 申请日期1995年6月30日 优先权日1995年6月30日
发明者帕特里夏·庞马, 丹·达菲, 保罗·达维德齐克 申请人:海布里顿公司