专利名称：制备α-1蛋白酶抑制剂的方法
技术领域：
本发明提供用色谱法包括疏水作用色谱法(HIC)来纯化α-l蛋白酶抑制剂 (α-1ΡΙ)的方法。在该方法中，对包含α-IPI的溶液使用疏水作用色谱法(HIC)。HIC之 前和/或之后可以有一个或多个其它纯化步骤。
背景技术：
α -IPI是具有约55，000道尔顿分子量的糖蛋白。该蛋白是数个低聚糖单元与其 共价结合的单个多肽链。α-IPI是内源蛋白酶的抑制剂，比如胰蛋白酶，糜蛋白酶，胰弹性 酶，皮肤胶原酶，肾素，尿激酶和多形核淋巴细胞蛋白酶。α-IPI目前在医疗上用来治疗患有基因引起的α-IPI缺乏的患者。在这种病症 中，给予α-IPI以抑制肺中的淋巴细胞弹性酶。淋巴细胞弹性酶分解肺中的外源蛋白。当 存在的α-IPI数量不足以调节弹性酶活性时，弹性酶则分解肺组织。该失衡状况随时间将 引起慢性肺组织损伤和气肿。已将α-IPI成功用于治疗上述形式的气肿。对α -IPI的需求一般超过可获得的供给。用于治疗用途的α -IPI目前纯化自人 血浆。该蛋白质来源是有限的，因此导致低供给量。为了使α -IPI的可获得供给量最大化， 从人血浆纯化α-IPI的方法应具有尽可能高的收率。分离自人血浆的α-IPI纯度也很关 键，原因是痕量杂质能够刺激接受α-IPI的患者的免疫应答。最后，用现有技术从人血浆 纯化α-IPI的方法需要大量时间从其它蛋白、病毒等分离α-1ΡΙ。全部上述因素(也即， 低收率、长生产时间和低纯度)都导致α-IPI供给不足。因此需要，改进α -IPI收率和纯度的纯化α -IPI的有效工业规模方法。
发明概要在一方面，本发明提供在包含α-1蛋白酶抑制剂和其它蛋白的水溶液中纯化 α -1蛋白酶抑制剂的方法。该方法包括a)调节水溶液的pH、离子强度和蛋白质浓度，使得活性α _1蛋白酶抑制剂不结合 至离子交换树脂但溶液中的其它蛋白却结合至离子交换树脂；b)将溶液通过离子交换树脂，收集含有α -1蛋白酶抑制剂的流过物；和c)将步骤b)的流过物与至少一种HIC介质的疏水吸附剂接触。在又一方面中，本发明提供自含有α-1蛋白酶抑制剂的水溶液纯化α-l蛋白酶 抑制剂的方法，该方法包括a)通过沉淀从水溶液除去污染性蛋白部分以便获得含有α _1蛋白酶抑制剂的纯 化溶液；b)将纯化溶液通过阴离子交换树脂，使得α -1蛋白酶抑制剂结合至该阴离子交
c)从阴离子交换树脂洗脱α -1蛋白酶抑制剂以获得含有α _1蛋白酶抑制剂的洗 脱液；d)将洗脱液通过阳离子交换树脂；e)收集来自阳离子交换树脂的含有α _1蛋白酶抑制剂的流过物；和f)将步骤c)洗脱液或步骤e)的流过物与至少一种HIC介质的疏水吸附剂接触。在某些方面中，本发明提供在包含α-l蛋白酶抑制剂和其它蛋白的水溶液纯化 α -1蛋白酶抑制剂的方法，该方法包括a)调节水溶液的pH、离子强度和蛋白质浓度；b)将溶液通过离子交换树脂和收集含有α -1蛋白酶抑制剂的流过物；和c)将步骤b)流过物与至少一种HIC介质的疏水吸附剂接触。在其它方面中，本发明提供经纯化的α -1蛋白酶抑制剂和/或包含α _1蛋白酶 抑制剂的组合物，其中α-l蛋白酶抑制剂用本发明描述的方法纯化。发明详述定义术语“吸附剂”如本文所用是指至少一种附缀于固体载体的分子，或者至少一种本 身就是用来进行色谱法比如疏水作用色谱法的固体的分子。在疏水作用色谱法的情况下， 吸附剂是疏水官能团。“色谱法”是指通过将混合物与吸附剂接触将混合物中的化学性质不同的分子彼 此分离，其中一类分子可逆结合至或吸附至吸附剂上。在吸附性或保持性更强的那些分子 未被释放的条件下，在吸附剂上吸附性或保持性最弱的分子就已自吸附剂释放出来。可以通过各种机械技术(也称为方法或程序)本发明的任意或全部色谱步骤。例 如，色谱法可以在柱中进行。该柱可以这样运行加压或不加压，由顶部至底部或由底部至 顶部。柱中的液体流向可以在色谱法过程期间逆转。色谱法还可以用批量方法进行，其中 通过包括重量法、离心或过滤的任意适宜方法将固体介质自用来加载、洗涤和洗脱样品的 液体分开。色谱法还可以通过将样品与相比其它分子更强烈地吸收或保留样品中某些分子 的滤器接触来进行。因此，尽管本发明的各种实施方式在色谱法的情况下可以描述为例如在柱中进 行，但是应理解使用柱仅是数种可以使用的色谱模式之一，而本发明用柱的描述并非将本 发明的应用限制为柱色谱法，因为本领域技术人员也可以容易地将此教导用于其它模式， 比如使用批量方法或滤器的那些。“疏水作用色谱法(HIC) ”是在作为蛋白质分离基础的含水盐溶液中运用特定的具 可逆疏水相互作用的生物分子的色谱法。术语“污染物”如本文所用是指任意外源或不良分子，特别是存在于被纯化的靶标 蛋白质样品中的异于被纯化的靶标蛋白质的生物学大分子比如DNA、RNA或蛋白质。污染物 包括，例如生物学流体中不希望的蛋白，来自用于表达被纯化的靶标蛋白质的细胞的宿主 细胞蛋白质，在先前亲和色谱法步骤期间可以泄漏入样品中的用于亲和色谱法步骤的吸收 剂之一部分的蛋白，和靶标蛋白质本身的错误折叠变种、二聚体或聚集体。本发明提供制备α -IPI的新方法，其中该方法包括牵涉疏水作用色谱法(HIC)的正交纯化步骤，其提供令人惊讶地高的α -IPI产品总收率和纯度。在一方面中，本发明提供在包含α-Ι蛋白酶抑制剂和其它蛋白的水溶液中纯化 α -1蛋白酶抑制剂的方法，该方法包括a)调节水溶液的pH、离子强度和蛋白质浓度；b)将溶液通过离子交换树脂，收集含有α -1蛋白酶抑制剂的流过物；和c)将步骤b)的流过物与至少一种HIC介质的疏水吸附剂相接触。在又一方面中，本发明提供在包含α -IPI和其它蛋白的水溶液中纯化α -IPI的 方法。该方法包括a)调节水溶液的pH、离子强度和蛋白质浓度，使得活性α -IPI不结合至离子交换 树脂但溶液中的其它蛋白却结合至离子交换树脂；b)将溶液通过离子交换树脂，收集含有α -IPI的流过溶液；和c)将步骤b)的流过溶液与至少一种HIC介质的疏水吸附剂相接触。在一种实施 方式中，离子交换树脂是强离子交换树脂。在一种实施方式中，步骤a)和b)提供自含蛋白质的水溶液通过阳离子交换色谱 媒介上的流过色谱法纯化α-IPI的过程，其条件是PH、离子强度和蛋白质浓度足以确保活 性α -IPI不结合至介质(或离子交换树脂)而其它包括无活性的(或变性的)α -IPI的 蛋白却结合至介质(或离子交换树脂)。ΡΗ、离子强度和蛋白质浓度对α-IPI结合至阳离 子交换树脂的影响描述于美国专利No. 5，610，观5，通过援引将其全部公开内容引入本文。 另外，离子交换色谱法还描述于美国专利No. 6，462，180，通过援引将其全部公开内容引入 本文。在优选的实施方式中，方法包括下述步骤(1)将蛋白质溶液透析或透析过滤直至约0. 1至lOmmho/cm的离子强度；(2)将溶 液PH调节至约彡6. 0 ； (3)将蛋白质溶液调节至约彡IOmg蛋白质/mL ； (4)将溶液通过阳离 子交换色谱树脂；和( 收集色谱法的流过级分(例如上述步骤(b)的流过溶液)，其是经 纯化的α-IPI。该程序适用范围广阳离子色谱法用于任意数目的原料，也即CohnFrac t i on Effluent II+III，Cohn Fraction IV-1糊剂(目前优选的原料)和经纯化的α-1ΡΙ，仍可 获得经实质纯化的产品。作为大规模生产药品的选择，可以加入包括病毒灭活的各种额外步骤以优化收 率、改善病毒安全性以及确保规则依从性。这些步骤可以包括但不限于(1)在弱离子交换树脂(DEAE)上进行初始色谱法；(2)在强阴离子交换树脂(QAE)上进行初始色谱法；(3)在溶液中运用无水加热法或巴氏杀菌法进行病毒灭活；(4)进行病毒排阻过滤以除去可能的病毒污染物；(5)进行化学处理比如用于病毒灭活的溶剂清洁剂处理；和(6)在色谱法之前进行沉淀步骤以部分地纯化原料。在一种实施方式中，方法还包括大于一次地进行步骤a)和b)，其中在最终步骤a) 之前对溶液进行病毒灭活步骤。HIC
一般地，HIC是基于与疏水吸附剂的相对疏水相互作用强度来分离蛋白的方法。 疏水性一般定义为非极性化合物与一般为水溶液的极性环境间的互斥作用。疏水"相互作 用"本质上是极性环境从该极性环境排斥非极性(也即，疏水)化合物并迫使疏水组分相 互团聚的倾向。因此，牵涉HIC的α -IPI纯化可以基于α -IPI相对缺少与疏水吸附剂的 疏水相互作用的特殊性质。按照本发明，能通过“流过方案”来应用HIC，其中可迫使溶液中的污染物但不是 α -IPI吸附性结合或与附缀于固体载体的疏水官能团(吸附剂)聚集。Α.流过方案在一种实施方式中，含有α -IPI的离子交换树脂流过溶液能够与疏水吸附剂接 触，其条件足以引起污染物(或尽可能多的污染物)结合至吸附剂，而α-l蛋白酶抑制剂 (和可能的一些污染物)不结合并作为HIC流过级分流过。在一种实施方式中，溶液是来自 阴离子交换树脂的包含α-IPI的洗脱液。在又一实施方式中，溶液是包含α-IPI的阳离 子交换流过溶液。一般地，HIC这样进行将含有α -IPI的溶液加载至包含缓冲剂和/或盐的水 溶液中的HIC柱。适宜的缓冲液包括，但不限于柠檬酸盐，琥珀酸盐，磷酸盐，MES, ADA, BIS-TRIS Propane, PIPES, ACES，咪唑，丙二酸二乙酯，MOPS, MOPSO, TES, TRIS 缓冲剂比如 TRIS-HCl, HEPES, HEPPS, TRICINE，甘氨酸酰胺，BICINE，双甘氨肽，乙酸盐，和硼酸盐缓冲 液。可接受的盐可以包括，但不限于氯化钠，氯化铵，氯化钾，乙酸钠，乙酸铵，硫酸钠，硫酸 铵，硫氰酸铵，枸橼酸钠，磷酸钠，及其钾、镁和钙盐，和这些盐的组合。在一种实施方式中，盐包括但不限于，枸橼酸钠，氯化钠，硫酸铵，硫酸钠，和磷酸 钠，所用的盐浓度可接受范围可以是O至约2M枸橼酸钠，0至约4M氯化钠，0至约3M硫酸 铵，0至约IM硫酸钠和0至约2M磷酸钠。还能够使用其它缓冲液和盐。在加载之后，可用更多的相同加载溶液(sans蛋白)洗涤吸附剂以使得未结合至 吸附剂的任意α "I蛋白酶抑制剂流过吸附剂(追加液)。然后收集HIC流过级分和追加液中的α-l蛋白酶抑制剂。本领域技术人员不加 过度实验即可优化结合污染物但不结合α-l蛋白酶抑制剂的条件。本文所讨论的盐浓度 是示范性的，如本领域中已知，可以通过变化一种或多种参数包括，例如ΡΗ、流速和温度以 使用其它盐和盐浓度。因为ρΗ能够直接引起电荷(也即溶液中的蛋白质的疏水特性)，所以调整ρΗ可以 影响缓冲剂中的所需盐量。可以变化进行HIC的ρΗ。例如，ρΗ范围可以是约6.0至约8.0， 或另选约6. 5至7. 5。然而，更宽的范围也是可能的。B. HIC 介质优选，HIC介质包含载体和附缀于载体的吸附剂。HIC载体能够包含通过本领域技 术人员已知的任意适宜方法制备的树脂基质。通常，载体可以是适于蛋白质分离的任意物 质。另外，载体已被或能被与疏水官能团的共价连接修饰从而提供HIC介质(载体和附缀 于载体的吸附剂)。在一种实施方式中，疏水官能团是烷基(例如丄2至(6(或(8多至C1(1)。在又一实 施方式中，疏水官能团是环状，多环，或杂环芳族官能团比如例如苯基基团。本领域普通技 术人员知晓可以通过增加官能团在载体上的取代度或密度来调节疏水性。在某些实施方式中，官能团选自苯基，辛基，丙基，烷氧基，丁基，和异戊基。适宜载体可以是任意目前可获得的或今后开发的具有实施所要求保护的方法所 需特征的物质，并且可以基于任意合成的、有机的或天然的聚合物。例如，一般所用载体物 质包括有机物质比如纤维素，聚苯乙烯，琼胶糖，琼脂糖，聚丙烯酰胺聚甲基丙烯酸酯，右旋 糖酐和淀粉，和无机材料，比如炭，二氧化硅(玻璃珠或细砂)和陶瓷材料。适宜的固体载 体公开于例如 Zaborsky" Immobilized Enzymes" CRC press，1973，28-46 页表 IV，通过援 引将其关于固体载体的教导并入本文。在一种实施方式中，HIC介质包含约30至约100微米的平均小珠尺寸，约5至 约50微摩尔每ml凝胶的官能团密度，并且小珠含有4-6%交联琼胶糖。另外，HIC介 质是可商购的，比如例如基于TSK-GELEther-5PW，Pheny 1-5PW，和Butyl-NPR树脂的柱 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)。在某些实施方式中，可能需要活化载体使其与疏水官能团反应从而形成HIC介 质。因此，应理解如果载体的来源物质，例如琼胶糖，本身不适于与特定官能团反应，可以对 其进行调整或活化以使其适于进行所述反应。在平衡和色谱法之前，HIC介质(载体和附缀于载体的吸附剂)可以在选择的溶 液例如盐和/或缓冲溶液中进行预平衡。预平衡可以发挥替代用于再生和/或储存HIC介 质的溶液之功能。本领域普通技术人员应知晓预平衡溶液的组成取决于贮藏溶液和用于随 后色谱法的溶液的组成。从而，适当的预平衡溶液可以包括用于进行HIC的相同的缓冲剂 或盐。任选地，预平衡溶液可以包括较进行HIC所用要更高浓度的缓冲剂或盐。 在将包含α -1蛋白酶抑制剂的溶液施用至HIC介质之前，可将HIC介质在用来溶 解或悬浮α-1蛋白酶抑制剂的缓冲剂或盐中进行平衡。在某些实施方式中，平衡可以在溶 液中发生，该溶液包含约1至约20毫摩尔每升的枸橼酸钠和约500至约1000毫摩尔每升 的硫酸铵。平衡可以在约6. 0至约8. 6的ρΗ，优选约6. 5和7. 5的ρΗ下发生。在一种实施 方式中，平衡溶液包含浓度约10毫摩尔每升的枸橼酸钠缓冲剂，浓度约850毫摩尔每升的 硫酸铵并且PH为约7.0。任选地，可以再生HIC介质(例如，HIC柱)。例如，HIC纯化α-1之后，仍可以结 合至吸附剂的任意污染物可以通过用溶液洗脱HIC介质来释放，该溶液包含用于色谱法的 但离子强度较低以释放污染物的缓冲剂或盐蛋白的溶液。然后，可以用溶液将柱再生，该溶 液具有自色谱介质释放大部分或全部蛋白并减少或消除色谱介质中可以存在的任意微生 物污染之效果。在一种实施方式中，上述溶液可以包含氢氧化钠。还能够使用其它试剂。随 后，可以将柱冲洗并储存在能够抑制微生物生长的溶液中。上述溶液可以包含氢氧化钠，但 是其它试剂还可以是适当的。可以通过任意适当方法监测α -1蛋白酶抑制剂以及包含α -IPI的溶液中可以存 在的污染性蛋白。优选，监测技术应敏感得足以检测约2个百万分之一(ppm)(按纳克每毫 克被纯化蛋白质计)至500ppm的污染物。例如，可以用本领域熟知的方法酶联免疫吸附测 定(ELISA)来检测污染。在一种实施方式中，蛋白质污染物对包含α -IPI的溶液的污染在HIC之后能够优 选减少至少约两倍，示例性地，至少约三倍，至少约五倍，至少约十倍，至少约二十倍，至少 约三十倍，至少约四十倍，至少约五十倍，至少约六十倍，至少约七十倍，至少约80倍，至少约90倍，和至少约100倍。在又一实施方式中，上述其它蛋白质污染物对包含α-IPI的溶液的污染在HIC 之后不超过约10，OOOppm,优选不超过约2500ppm，更优选不超过约400ppm，更优选不超过 约360ppm，更优选不超过约320ppm，更优选不超过约^Oppm，更优选不超过约MOppm，更 优选不超过约200ppm，更优选不超过约160ppm，更优选不超过约140ppm，更优选不超过约 120ppm,更优选不超过约lOOppm，更优选不超过约80ppm，更优选不超过约60ppm，更优选 不超过约40ppm，更优选不超过约30ppm，更优选不超过约20ppm，更优选不超过约lOppm， 和最优选不超过约5ppm。所述污染可以为不可检测水平至约IOppm或者约IOppm至约 lOOOOppm。在又一方面中，本发明提供自含有α-IPI的水溶液纯化α-IPI的方法，其中该方 法包括(a)通过沉淀从水溶液除去污染性蛋白部分以便获得含有α _1ΡΙ的纯化溶液；(b)将纯化溶液通过阴离子交换树脂，使得α -IPI结合至阴离子交换树脂；(c)自阴离子交换树脂洗脱α -1ΡΙ，获得含有α -IPI的洗脱液；(d)将洗脱液通过阳离子交换树脂；(e)自含有α -IPI的阳离子交换树脂收集流过溶液；和(f)将步骤e)流过溶液与至少一种HIC介质的疏水吸附剂相接触。在一种实施方式中，按所述次序按顺序进行上述步骤a) "f)。HIC如上所述。在一种实施方式中，含有α-IPI的水溶液是Cohn Fraction IV-I，其中通过沉淀 从Cohn Fraction IV-I除去污染性蛋白部分以便获得含有α-IPI的纯化溶液。例如，可 以用得自Cohn-Oncley人血浆分级程序的Fraction IV-I糊剂开始纯化α -IPI。参见例 如 Ε. J. Cohn 等人，J. Amer. Chem. Soc.，68，459 (1946) ；E. J. Cohn，美国专利 No. 2，390，074 ； 和Oncley等人，J. Amer. Chem. Soc.，71，541 (1949)，通过援引将其全部公开内容并入本文。 上述Cohn-Oncley过程牵涉一系列的冷乙醇沉淀步骤、在此期间通过调节pH、离子强度、蛋 白质浓度、温度和乙醇浓度根据等电点分离特定蛋白。将通过该程序所获的Fraction IV-I 糊剂溶于缓冲溶液，加热以活化α-1ΡΙ。初始纯化步骤包括从溶解的Fraction IV_1沉淀 污染性蛋白和脂质。然后将α-IPI从溶解的Fraction IV_1溶液沉淀出来，将粗制α-IPI 通过阴离子交换树脂以除去污染性蛋白。通过在60°C于蔗糖溶液中进行巴氏杀菌法10小 时实现病毒灭活。巴氏杀菌法之后，透析过滤α-IPI，收集于NaCVNa3PO4中，无菌过滤，冻 干。FractionIV-I 一般是在约40°C能够溶于pH约9. 25至约9. 5的Tris缓冲剂中的糊剂。 还可以将盐比如氯化钠(NaCl)加入溶液。其它级分例如比如Cohn Fraction II+III也可以用作原料。在该级分中α-IPI 已溶于水溶液。在一种实施方式中，方法包括从含有α-IPI的初始溶液除去至少部分污染 性蛋白。上述污染性蛋白可以包括例如纤维蛋白原和白蛋白。例如，优选通过用聚亚烷基 二醇比如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)沉淀来除去污染性蛋白部分。本领域技术人员 已知具有相似特性的其它醇类也可以使用。PEG，用于本发明方法的优选聚亚烷基二醇，具 有的分子量为约2000至约10000，优选具有的分子量为约3000至约4000。加入溶液的PEG 为至少约2%，优选约3%至15%，和最优选11. 5%重量每体积所形成的混合物。还可以调 节溶液PH以沉淀污染性蛋白。pH—般调节为约5.0至约6.0。通过加酸比如乙酸来调节溶液PH。然后可以通过过滤、离心或本领域已知的任意其它常规方法将沉淀从溶液分离，以 获得含有α-IPI的滤液。在一种实施方式中，除去步骤a)包括下述步骤(i)自水溶液沉淀污染性蛋白部 分；和(ii)自水溶液分离污染性蛋白的沉淀部分，由此获得含有α -IPI的纯化溶液。在又 一实施方式中，沉淀步骤包括下述步骤f :(i)将聚亚烷基二醇加入水溶液；和(ii)调节水 溶液PH为约5.0至约6.0。在某些实施方式中，聚亚烷基二醇是聚乙二醇。然后在将滤液 通过阴离子交换树脂之前调节滤液电导率。离子交换树脂与蛋白质溶液间的平衡受溶液离 子强度的影响(参见，例如，Yamamato，等人，Biotechnol. Bioeng. ,25 1373-91 (1983))。因 此对滤液电导率进行调节，使得滤液中的α -IPI结合至阴离子交换树脂。该电导率在25°C 测量时一般为约2. OmS至6. OmS，但是也可需要其它电导率范围以便将α -IPI结合至阴离 子交换树脂。优选通过稀释滤液，而不是通过凝胶过滤、透析过滤或其它除盐方法来调节电 导率。优选用可以含有磷酸钠(Na3PO4)的水或能够提供ρΗ约6-7的其它缓冲液来稀释滤 液。在一种实施方式中，方法还包含下述步骤在将纯化溶液通过阴离子交换树脂之 前，将纯化溶液的PH调节为约6. 25至约7. 25。在稀释滤液之后，能够将溶液直接应用至阴离子交换树脂。与已知方法不同，在色 谱分离之前不对滤液再进行PEG沉淀或透析过滤。将稀释的滤液通过阴离子交换树脂，其 优选是季铵基乙基(QAE)树脂。尽管优选QAE色谱法，其它阴离子交换树脂比如三甲胺基 乙烷(TMAE)和二乙基氨基乙基(DEAE)也可以用于本发明方法。α -IPI结合至阴离子交换 树脂。在优选的实施方式中，将阴离子交换树脂用缓冲溶液比如Na3PO4缓冲剂进行洗涤以 除去又一部分污染性蛋白。例如，在α-IPI来源是血浆或其级分的情况下，被除去的蛋白 一般是白蛋白和转铁蛋白。在缓冲剂洗涤期间，α-IPI保持结合至阴离子交换树脂。在缓 冲剂洗涤之后，将α-IPI从阴离子交换树脂洗脱。血浆铜蓝蛋白在洗涤和洗脱期间都保持 结合至柱子。在一种实施方式中，方法还包括下述步骤在洗脱步骤e)之前，用缓冲溶液洗涤 阴离子交换树脂以从阴离子交换树脂除去污染性蛋白部分，而α-IPI保持结合至阴离子 交换树脂。在一种实施方式中，将来自阴离子交换树脂的洗脱液通过阳离子交换树脂以获 得包含α-IPI的阳离子交换树脂流过物。按照前文描述调节来自阳离子交换树脂的洗脱 液的ΡΗ、电导率和蛋白质浓度。在其它实施方式中，方法还包括自水溶液除去病毒步骤。例如，病毒灭活和/或病 毒除去也参与从含水溶液比如血浆纯化α-1ΡΙ。纯化α-IPI的已知过程运用灭活病毒的 无水加热处理。然而，该处理能使得α-IPI蛋白质变性并因此降低α-IPI的收率和/或 纯度。本发明方法无需上述加热处理步骤就使病毒灭活并除去病毒，由此增加所获α-IPI 的收率和纯度。前文描述的用11. 5% PEG沉淀污染性蛋白也是病毒除去步骤之一。用11. 5% PEG 进行沉淀从血浆级分除去包膜和未包膜病毒。该沉淀以> 41ogs的清除率除去至少四种病 毒，包括HIV-I，BVDV，PRV，和ReovirusType 3。与之相比，已知方法的无水加热过程仅获得 这些病毒中三种的彡41ogs清除率；而Reovirus Type 3仅以Ilog清除率除去。额外地， 已显示11. 5% PEG沉淀步骤获得从血浆级分除去传染性海绵状脑病(也即，TSE朊病毒)的彡 41ogs 清除率。(参见美国专利 No. 6，437，102，标题为 Method of Separating Prions from Biological Material)。任选地，通过加入非离子型清洁剂实现又一病毒灭活。该步骤优选在将溶液通过 阴离子交换树脂之前进行。用于本发明方法的非离子型清洁剂包括但不限于吐温，比如吐 温20和吐温80。吐温20是优选用于本发明方法的非离子型清洁剂。可以约0.33%至 约10%重量每体积所得混合物加入吐温20。优选以约0. 5%至约2. 0%和最优选1. 0%加 入吐温20。任选地，可以与吐温20 —起加入溶剂比如0. 01%至约0. 5%的磷酸三正丁基 酯(TNBP)以增进病毒灭活的有效性。用吐温20(吐温20和TNBP)的清洁剂处理以> 41ogs清除率减少包膜病毒。在一种实施方式中，病毒灭活步骤包括下述步骤(a)将清洁剂加入纯化的溶液 以获得清洁剂和纯化溶液的混合物；和(b)调节混合物pH以形成约6. 5至约8. 5。本发明 的又一实施方式任选地包括病毒除去。包膜和未包膜病毒都能够通过过滤优选纳米过滤， 或者本领域已知的任意其它过滤方法来除去。在优选的实施方式中，将含有α-IPI的得自 离子交换树脂的溶液进行纳米过滤。纳米过滤以> 41ogs清除率减少包膜和未包膜病毒。 在一种实施方式中，方法还包括自水溶液除去病毒的步骤。在又一实施方式中，病毒除去步 骤包括通过纳米过滤对水溶液进行过滤。因此，本发明方法优选包括用于除去包膜病毒和 未包膜病毒的> 41ogs清除率的两个步骤。通过下述实施例将更详尽地理解本发明的实践，本文仅以此示例并不应以任何方 式解释为限制本发明。
实施例实施例1在一种实施方式中，原料为通过Cohn-Oncley分级技术获得的本领域技术人员熟 知的Cohn Fraction IV-1糊剂。如下所述从Fraction IV-1糊剂制备水溶液。在2°C至8°C将IV-I糊剂溶于M体积的Tris缓冲剂(IV-1糊剂重量(kg)乘24)。 混合上述溶液大约4. 5小时，保持温度为2°C至8°C。在混合之后，以1. 251/min的速率加 入1. OM NaOH,将溶液pH调节至9. 25至9. 5。然后混合该溶液1小时，如果需要则重新调 节PH。然后将溶液加热至39°C至41°C，持续约60至约90分钟从而将Fraction IV-I糊剂 溶于缓冲溶液。实施例2Fraction IV-I与其它血浆级分类似含有各种蛋白，比如脂蛋白，免疫球蛋白，球 蛋白，变性蛋白等。必须将这些蛋白与α-IPI分离，但是其中某些也会结合至离子交换树 脂并因此干扰α-IPI纯化。因此，在将溶液加入阴离子交换树脂之前优选首先除去这些污 染性蛋白部分。本实施例描述除去污染性蛋白过程中的一个纯化步骤。将如上所述溶于Tris缓冲溶液的Cohn Fraction IV-1再次冷却至2 °C至 8°C。向该冷却的溶液加入NaCl至0. 11M。然后向该溶液加入11. 5 %分子量3350的 PEG(Carbowax ,Union Carbide，Danbury，Conn.；悬浮液重量(kg)乘 0. 115)。然后用 1. OM 冰乙酸将溶液PH调节至5. 10至5. 35。形成污染性蛋白和包括朊病毒蛋白的病毒的沉淀。然 后离心溶液除去沉淀，随后进行深度过滤比如Cuno CP50或SP90(Cuno，Meriden，Conn.)。该步骤也可使用其它深度过滤器。将通过离心和过滤所得的糊剂弃去。滤液含有PEG中3的 α -IPI。另选地，可以通过单独过滤加或不加助滤剂比如2. 5% Hyflo Supercel (Celite Corporation, Lompoc, Calif.)除去沉淀。实施例3在优选的实施方式中，在非离子型清洁剂或溶剂与非离子型清洁剂的组合中对如 上述实施例2所述得自PEG沉淀的滤液进行病毒灭活。用1. OM NaOH将来自上述实施例2 的滤液的PH调节至7. O至7. 2。向该溶液加入吐温20至1 % (PEG滤液重量(kg)乘10. Ig/ kg)或吐温20至0. 5 %和TNBP至0. 03 % (PEG滤液重量(kg)分别乘5. lg/kg和0. Olg/ kg)。用1. OM NaOH将pH调节至6. 9至7. 1。将该溶液保持在20°C至30°C持续6_10小时。 该处理以> 41ogs清除率减少含α -IPI溶液中的包膜病毒。实施例4然后将PEG和吐温20中含α-IPI的溶液通过阴离子交换树脂进一步纯化 α -1ΡΙ，并将其与PEG和吐温20分离。在将溶液加入阴离子交换树脂之前调节溶液电导率 以使得α-IPI结合至阴离子交换树脂。将上述实施例3所得的溶液用注射用水(WFI)稀 释直至溶液在25°C的电导率值降低至约2. OmS至约6. OmS0可以在WFI中包括额外的 吐温20以延长溶液与清洁剂的接触时间。WFI可以含有pH 6. 5的Nei3PO4QOmM)。制备 Q Sepharose (Amersham-Pharmacia Biotech, Upsala, Sweden) fast flow 柱并用20mM Na3PO4溶液于pH 6. 5平衡。然后将α -IPI在吐温20和PEG中的溶液加入柱 中，浓度为8-1211^的(1-1 1每毫升树脂。柱流速为125cm/hr。α-IPI结合至柱，然后用 PH 6. 5的20mMNa3P04溶液洗涤。Na3PO4缓冲剂从柱进一步除去污染性蛋白，比如白蛋白和 转铁蛋白。将PH 6. 95-7. 05的洗脱缓冲剂0. 025M Na3P04/0. IMNaCl通过柱以除去α -IPI。 收集含有α-IPI的洗脱物。血浆铜蓝蛋白仍结合至柱直至NaCl洗脱。因此，该纯化步骤实现四个目标1)自PEG分离α-IPI ;2)自吐温20分离 α -IPI ；3)纯化α -IPI ；和4)延长溶液中病毒与吐温20的接触时间。实施例5在本发明的优选实施方式中，在上述实施例4所述的Q Sepharose 色谱法之后对 含有α-IPI的水溶液进行进一步纯化步骤。该进一步纯化通过阳离子色谱法完成。制备MacroPrep High S (BioRad Laboratories，Hercules，Calif.)柱并用 20mM Na3P04/5mM NaCl缓冲剂于pH 5. 45至5. 54平衡直至柱流出物稳定地具有≤5. 60的pH。在 将得自上述实施例4方法的含有α -IPI的洗脱物加入阳离子柱之前，可以将其通过超滤和 透析过滤浓缩。然后将无水Na3PO4和NaCl加入所得浓缩物直至最终浓度为20mMNa3P04和 5mM NaCl。然后用1. OM冰乙酸将所得溶液pH调节至大约5. 50。然后将该溶液应用至柱， 比率为5mg污染物(例如，白蛋白和IgA)每毫升树脂。α -IPI不结合至树脂，而污染物却 结合至树脂。用pH 5. 45至5. 54的20mM Na3P04/5mM NaCl缓冲剂将α -IPI冲洗通过柱从 而获得含有α -IPI的溶液。实施例6为了进一步除去污染性病毒，本发明方法优选包括过滤步骤。向通过上述实施例 5过程获得的含有α-IPI的溶液加入NaCl至0.75Μ，用NaOH将pH调节至7.0。然后在 Viresolve 70 (Millipore, Bedford, Mass.)膜上用 0. 75M NaCl 进行差分透析过滤使得溶液浓缩直至体积减少至其最初体积的5% -20%。用3-5透析过滤体积的0. 75M NaCl将 α-IPI 洗涤通过 Viresolve 70 膜。过滤之后，通过超滤和透析过滤浓缩含有纯化α -IPI的所得溶液。在透析过滤之 后浓缩溶液，将浓缩的α -IPI配制为约55mg的α -IPI每毫升pH 7. 0的20mM Na3PO4和 IOOmM NaCl。可以用其它病毒过滤器比如Asahi Planova病毒过滤器替换Viresolve滤器。实施例7在上述实施例6所述的病毒过滤之后，可以对含有α -IPI的水溶液进行进一步纯 化步骤。该进一步纯化通过HIC色谱法实现。通过在pH 7. O用缓冲剂IOmM枸橼酸钠、850mM硫酸铵进行平衡制备GE Healthcare Octyl Sepharose 4FF介质柱。加入850mM硫酸铵并调pH为7. O以调节含有 α -IPI的水溶液。然后将溶液应用至Octylkpharose柱并用平衡缓冲剂将任意未结合的 蛋白质从柱洗涤出来。收集的流过物和洗涤物含有纯化α-1ΡΙ。然后超滤和透析过滤含有α-IPI的水溶液以除盐并为最终配制剂预备。无菌过 滤经配制溶液。用本领域已知方法冻干所得溶液。实施例8表1 预临床试验批次的α -1纯度
权利要求
1.在包含α-1蛋白酶抑制剂和其它蛋白的水溶液中纯化α-1蛋白酶抑制剂的方法， 该方法包括a)调节水溶液的pH、离子强度和蛋白质浓度，使得活性α-1蛋白酶抑制剂不结合至离 子交换树脂但是溶液中的其它蛋白结合至离子交换树脂；b)将溶液通过离子交换树脂并收集含有α-l蛋白酶抑制剂的流过物；和c)将步骤b)的流过物与至少一种HIC介质的疏水吸附剂相接触。
2.权利要求1的方法，其中所述疏水吸附剂是选自苯基、辛基、丙基、烷氧基、丁基、和 异戊基的官能团。
3.权利要求1的方法，其中所述接触在足以引起至少部分任意剩余污染物结合至吸附 剂的条件下发生，此时α-l蛋白酶抑制剂不结合而是作为HIC流过级分流过。
4.权利要求3的方法，其中所述条件包含IOmM枸橼酸钠和850mM硫酸铵的盐浓度。
5.权利要求1的方法，其中所述接触在足以引起至少部分任意剩余污染物结合至吸附 剂的条件下发生，此时α "I蛋白酶抑制剂不结合而是作为HIC流过级分流过。
6.权利要求1的方法，其中所述水溶液是CohnFraction IV-1。
7.权利要求1的方法，其中步骤中a)和b)进行多于一次并在最终的步骤a)之前对溶 液进行病毒灭活步骤。
8.权利要求7的方法，其中所述病毒灭活步骤包括在大于或等于约60°C下加热α-1 蛋白酶抑制剂大于或等于约10小时。
9.权利要求7的方法，其中所述病毒灭活步骤包括加入一种或多种化学试剂。
10.权利要求7的方法，其中所述病毒灭活步骤包括将磷酸三正丁基酯和清洁剂加入 至溶液。
11.从含有α-1蛋白酶抑制剂的水溶液纯化α -1蛋白酶抑制剂的方法，该方法包括a)通过自水溶液沉淀除去部分污染性蛋白以便获得含有α-1蛋白酶抑制剂的纯化溶液；b)将上述纯化溶液通过阴离子交换树脂使得α-1蛋白酶抑制剂结合至阴离子交换树脂；c)从阴离子交换树脂洗脱α-l蛋白酶抑制剂以获得含有α-l蛋白酶抑制剂的洗脱液；d)将上述洗脱液通过阳离子交换树脂；e)收集来自阳离子交换树脂的含有α-l蛋白酶抑制剂的流过物；和f)将步骤c)的洗脱液或步骤e)的流过物与至少一种HIC介质的疏水吸附剂相接触。
12.权利要求11的方法，其中所述含有α-1蛋白酶抑制剂的水溶液是Cohn Fraction IV-I。
13.权利要求11的方法，其中所述疏水吸附剂是选自苯基、辛基、丙基、烷氧基、丁基、 和异戊基的官能团。
14.权利要求11的方法，其中所述接触在足以引起至少部分任意剩余污染物结合至吸 附剂的条件下发生，此时α "I蛋白酶抑制剂不结合而是作为HIC流过级分流过。
15.权利要求11的方法，其中所述除去步骤包括下述步骤(i)自水溶液沉淀污染性蛋 白部分；和(ii)自水溶液分离沉淀的污染性蛋白部分，由此获得所述含有α-l蛋白酶抑制剂的纯化溶液。
16.权利要求15的方法，其中所述沉淀步骤包括下述步骤(1)将聚亚烷基二醇加入水 溶液；和⑵调节水溶液PH为约5. 0至约6. 0。
17.权利要求16的方法，其中所述聚亚烷基二醇是聚乙二醇。
18.权利要求11的方法，其在洗脱步骤之前还包括下述步骤用缓冲溶液洗涤阴离子 交换树脂以自阴离子交换树脂除去污染性蛋白部分并使得α -1蛋白酶抑制剂保持结合至 阴离子交换树脂。
19.权利要求11的方法，其还包括病毒灭活步骤。
20.权利要求19的方法，其中所述病毒灭活步骤包括下述步骤(a)将清洁剂加入纯化 的溶液以获得清洁剂与纯化溶液的混合物；和(b)调节混合物pH为约6. 5至约8. 5。
21.权利要求20的方法，其中所述清洁剂是非离子型清洁剂。
22.权利要求21的方法，其中所述非离子型清洁剂是吐温20。
23.权利要求11的方法，其还包括自水溶液除去病毒的步骤。
24.权利要求23的方法，其中所述病毒除去步骤包括通过纳米过滤对水溶液进行过滤ο
25.权利要求11的方法，其在将纯化溶液通过阴离子交换树脂之前还包括稀释步骤。
26.权利要求25的方法，其中所述稀释步骤包括稀释纯化溶液，使得纯化溶液具有约 2. OmS至约6. OmS的电导率。
27.权利要求25的方法，其中所述稀释步骤包括用水稀释。
28.权利要求沈的方法，其中所述水包含磷酸钠。
29.权利要求11的方法，其在将纯化溶液通过阴离子交换树脂之前还包括将纯化溶液 的PH调节为约6. 25至约7. 25的步骤。
30.在包含α-1蛋白酶抑制剂和其它蛋白的水溶液中纯化α -1蛋白酶抑制剂的方法， 该方法包括a)调节水溶液的PH、离子强度和蛋白质浓度；b)将溶液通过离子交换树脂并收集含有α-1蛋白酶抑制剂的流过物；和c)将步骤b)的流过物与至少一种HIC介质的疏水吸附剂相接触。
31.包含α-1蛋白酶抑制剂的组合物，其中所述α-1蛋白酶抑制剂是根据权利要求 1、11或30中任一项进行纯化的。
全文摘要
用疏水作用色谱法(HIC)自包含α-1PI的溶液实现纯化α-1蛋白酶抑制剂(α-1PI)。在某些实施方式中，从包含α-1PI的初始溶液比如人血浆通过沉淀污染性蛋白实现α-1PI的纯化，随后在HIC之前进行阴离子交换树脂色谱法。在阴离子交换色谱法之后但是在HIC之前可以通过任选的阳离子交换色谱法实现进一步纯化。本发明的某些实施方式也包括通过比如纳米过滤和比如与非离子型清洁剂接触的方法进行病毒除去和/或灭活。相比已知方法，本发明方法提供血浆级分的更高收率、纯度和病原清除率。
文档编号C07K1/16GK102099369SQ200980127868
公开日2011年6月15日 申请日期2009年7月17日 优先权日2008年7月18日
发明者C·A·达德, S·A·库克, W·雷宾格 申请人:泰勒克里斯生物治疗学公司