专利名称：新的普遍存在的钾离子通道蛋白和其基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及在人和鼠的各种组织中表达的新ATP敏感性钾离子通道蛋白huKATP-1和ruKATP-1，和编码它们的基因。所述蛋白和基因可用作钾离子通道相关疾病如糖尿病、高血压和内分泌不足的诊断和治疗药剂。
已知糖尿病的病因主要是胰腺β-细胞中胰岛素分泌失调。因此阐明胰岛素分泌的分子机制可望在弄清糖尿病的起因和开发治疗糖尿病的治疗药方面起重要作用，但还不清楚这种分子机制的详情。
现已清楚，存在于细胞膜上的ATP敏感性钾离子通道(KATP通道)，通过结合细胞中代谢状态和膜电压在细胞功能如分泌和肌肉收缩中起重要作用。
KATP通道首先于983年发现于心肌[Noma，A.，Nature 305147(1983)]，而后证实其存在于各种组织中，如胰腺β-细胞[Cook，D.L.等，Nature 311271(1984)，Misler，S.等，Proc，Natl.Acad.Sci.U.S.A.837119(1986)]、垂体[Bernardi，H.等，Proc.Natl.Acad.U.S.A.，901340(1993)]、骨骼肌[Spruce，A.E.等，Nature，316736(1985)]和脑。
另外，已表明这种KATP通道存在分子不均一性[Ashcroft，F.M.，Annu.Rev.Neurosci.1197(1988)]。
尤其在胰腺β-细胞中，由葡萄糖代谢产生的ATP通过关闭KATP通道造成去极化引起钙离子从钙通道流入，从而造成胰岛素的分泌。显然，KATP通道在调节胰岛素分泌中起重要作用。
KATP通道属于具有内向整流电生理性质的钾离子通道家族。根据氨基酸序列一致性，具有内向整流电生理性质的钾离子通道家族分为四个亚族，ROMK1，IRK1，GIRK1和cKATP-1。
但在胰腺β-细胞中还没有阐明KATP通道的分子构架。另外，没有公开过本发明的新ATP敏感性钾离子通道(huKATP-1和ruKATP-1)的详细蛋白结构和关于与其他蛋白形成复合物的资料，例如与磺酰脲结合蛋白。
为了分离、鉴定一种新的膜通道并进行功能分析，需要很复杂的技术，如分子生物学技术、细胞生物学技术和电生理技术。
正是如此，本发明者充分利用这些技术分离了编码在哺乳动物不同组织中表达的新KATP通道(uKATP-1)的人和鼠基因组和cD-NA，还鉴定了这些通道蛋白的氨基酸序列(参见
图1、2、3和4)。所鉴定uKATP-1通道蛋白在非洲蟾蜍卵母细胞和哺乳动物细胞系中表达。
电生理分析表明uKATP-1是一种显示内向整流作用的ATP敏感性钾离子通道。这种uKATP-1通道在包括人和鼠的哺乳动物组织中普遍表达，并参与基础能量代谢中膜电压的保持。
如上所述，本发明涉及在哺乳动物中普遍存在的ATP敏感性钾离子通道(uKATP-1)，还包括这种ATP敏感性钾离子通道蛋白，编码它们的已鉴定的DNA序列，其中含有这种序列的质粒，以及其中已转入了这种质粒的重组细胞(转化子)。另外，本发明包括分离的uKATP-1蛋白和重组蛋白，它们的相关物质如拮抗剂和激动剂，包括诊断剂和基因治疗药的药物设计。
人源huKATP-1由324个氨基酸残基组成(见图4)，分子量为47,965，而鼠源的uKATP-1由424个氨基酸残基组成(见图4)，分子量为47,960。这两个钾离子通道显示98％的氨基酸序列一致性，这种显著的同源性使我们可以假定uKATP-1在哺乳动物细胞中起共同的、基础结构和功能作用。首先，uKATP-1参与膜电压和能量代谢，这提示它可用作在异常、极端代谢条件下(包括内分泌疾病，如糖尿病、饥饿和局部缺血)防止紊乱的物质。
例如，局部缺血开始过程中由uKATP-1开和关引起的钙离子流入和流出与局部缺血紊乱密切相关。换句话说，打开和关闭uKATP-1的激动剂和拮抗剂可能构成抗局部缺血紊乱的抑制性药物。
从huKATP-1和ruKATP-1与其他钾离子通道氨基酸序列的比较研究中，证实了本发明的uKATP-1属于新的一族内向整流钾离子通道，uKATP-1蛋白的中心区显示与其他内向整流钾离子通道的同源性较高。亲水性图谱表明存在两个疏水区和一个孔区，两个疏水区由两个内向整流钾离子通道的特征性跨膜区组成[Nicholas，C.G.，Trends Pharmacol.Sci.，14320(1993)，Jan，L.Y.and Jen，Y.N.，Nature，371119(1994)]。
据报道[Inagaki，N.等，J.B.C.，2705691(1995)]，ruKATP-1的第二个细胞内区中有两个潜在的cAMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点(Thr-234和Ser-385)和7个潜在蛋白激酶C依赖性磷酸化位点(Ser-224，Thr-345，Ser-354，Ser-379，Ser-385，Ser-391和Ser-397)，而在第一和第二细胞内区中分别存在一个(Thr-63)和4个潜在酪蛋白激酶II依赖性磷酸化位点(Thr-234，Ser-281，Thr-329和Ser-354)，但在分子内区中不存在N连接的糖基化位点。在huKATP-1中也有同样的发现[Inagaki，N.，等，in press(1995)]。
本发明者鉴定了huKATP-1和ruKATP-1的核苷酸序列和整个氨基酸序列，这样利用已知遗传工程技术在细菌或动物细胞中表达编码huKATP-1和ruKATP-1和其突变体的DNA，可以大量合成huKATP-1和ruKATP-1蛋白本身和其突变体。另外huKATP-1和其片段可用于huKATP-1 DNA缺乏的杂交诊断，huKATP-1的突变体可用于细胞中糖代谢的研究，尤其是胰岛素依赖性和非依赖性糖尿病的研究。
在cDNA文库和基因组文库基础上鉴定了本发明新huKATP-1和ruKATP-1的DNA。编码huKATP-1的DNA长度为约9.7kb，由三个外显子组成，存在于染色体12p11·23上。利用uKATP-1和其片段的cDNA探测基因组DNA文库可获得染色体DNA。用已知技术易于在分离的uKATP-1 DNA上进行核苷酸缺失、插入或取代来制备其突变体。
利用已知技术易于将编码其他蛋白或合成多肽的核苷酸序列连接到uKATP-1或其变体的5′和3′末端，从而制备融合蛋白或其衍生物。
例如，以前体蛋白形式制备融合蛋白并在体内或体外进行裂解，从而发挥功能；这种融合蛋白除其适宜功能外提供组织靶向和膜导向。此时，该融合蛋白含有糖链结合氨基酸，可被修饰成具有组织导向或通过加入新糖链而被激活的生理活性的衍生物。
为了产生uKATP-1、其变体或它们的衍生物，将相应的编码DNA引入可繁殖质粒中，再培养用这种质粒转化的宿主细胞。宿主细胞包括细菌、酵母和动物细胞。
原核细胞如细菌适用于脱氧核糖核苷酸的克隆。例如，来自大肠杆菌的pBR322质粒含有氨苄青霉素和四环素抗性基因，可提供鉴别转化细胞的实用工具。另外，微生物质粒含有可用于表达其自身蛋白的启动子。除原核细胞外，真核细胞如酵母也可行，质粒YRp7在糖酵母(Saccharomyces)种的酵母中表达尤其有用[Stin-chomb等，Nature，28239(1979)]。
动物细胞也可用作宿主，尤其脊椎动物细胞的培养易于操作并构成一种常规方法[Krause和Paterson，Tissue Culture，AcademicPress(1973)]。可提及的细胞系有AtT-20、Hela细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、COMSM6、COS-7等。多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猴病毒40的启动子用于控制表达质粒在这种细胞系中的功能，其中pCMV是在动物细胞表达系统中有广泛应用的一种质粒[Thomsen等，PNAS，81659(1984)]。
本发明huKATP-1和muKATP-1的DNA序列从起始密码子“ATG”开始。当重组细胞用于合成这种蛋白时，需要向目的DNA上加入ATG，从而使得易于操作。因此当在用大肠杆菌转化的原核细胞中表达时，一般合成氨基酸序列从Met开始的蛋白。根据应用目的，可从生成的蛋白中消除N-末端的Met。
与此相似，当在重组动物细胞中合成uKATP-1时，可生物合成或在N-末端含Met的蛋白或N-末端消除了Met的蛋白，两种蛋白对具体的应用目的都是有用的。
可将uKATP-1和其片段给予动物进行免疫，以产生抗体。通过动物免疫还可从分泌目的抗体的细胞产生单克隆抗体。
现在已容易大量制备uKATP-1，从而可以更好地在分子水平了解uKATP-1。因此，应用uKATP-1和其突变体或类似物可能开发出主要用于通道蛋白相关疾病的诊断或治疗试剂。
尤其，该蛋白可用于研究适于诊断学和治疗学的物质，或对uKATP-1起激动或拮抗作用的物质。例如用动物细胞检测的步骤为将uKATP-1的cDNA注入细胞中进行表达，然后加入磺酰脲以研究它们的相互作用[Kayano.T.等，J.Biol.Chem.，26513276(1990)，实例4]。
其次，已获得了关于uKATP-1 DNA序列的相关信息，从而有助于制备脱氧核糖核苷酸的部分序列。这种较短的DNA序列能够与所选基因杂交，可用作核酸探针，这种探针对在不同组织中检测cD-NA很有效。
利用uKATP-1制得的探针可用于从各种生物和其组织获得能够杂交的核酸。所得核酸可与uKATP-1的类型相同或为其异型，包括编码新蛋白的核酸。
所制探针可用于钾离子通道相关疾病的基因诊断；可对与这种探针杂交的病人核苷酸进行研究以检测疾病基因。
在此以前，钾离子通道阻断剂和开放剂已用作抗糖尿病和高血压的治疗剂。uKATP-1和其突变体、衍生物和它们的单克隆抗体，当被加工成药物制剂时，可给予病人，以通过中和由临床服用过量的这种抑断剂或开放剂引起的副作用而减轻病症。当显示uKATP-1自身功能不足时，可服用这种药剂以补偿这种uKATP-1的功能缺陷。
本发明包括可用于必需治疗方法中的基因治疗药物的制备。可将uKATP-1或其突变体和它们的衍生物的核苷酸序列引入质粒或干细胞中，然后将其给予病人，以提供用作基因治疗药物的可能性。
以下参照附图描述实施例以更详细地说明本发明。
附图中图1显示图2和3中所示碱基序列相应的氨基酸序列。
图2显示如实施例5中所得人源uKATP-1的碱基序列。
图3显示图5和6相应的氨基酸序列。
图4显示鼠源ruKATP-1的碱基序列。
图5A显示利用非洲蟾蜍卵母细胞对ruKATP-1进行电生理分析的结果。注入ruKATP-1 cDNA的卵母细胞在45mM[K+]浓缩细胞外液的条件下显示内向整流作用，但该整流作用在向细胞外液中加入300μM Ba2+时被阻断。注射水作为对照，仅观察到极小的内向电流。
图5B是钾离子浓度依赖性电流对电压的作图，从此证实uKATP-1明显为内向整流钾离子通道。
图5C是注入ruKATP-1的cRNA的卵母细胞中可逆性电压对细胞外K+浓度的对数作图，显示可逆性电压对细胞外K+浓度的依赖性。
图6是对其中表达uKATP-1的HEM239转化细胞的单通道分析，其中A代表单通道电流的记录，B是电流-电压关系，说明存在显示内向整流的K+电流。
实施例1克隆新内向整流钾离子通道(ruKATP-1)的cDNA按聚合酶链反应(PCR)方法扩增了GIRK的cDNA片段，GIRK是一种鼠G蛋白调节的内向整流钾离子通道。用32P-标记的鼠GIRK cDNA片段作为探针，对从鼠朗氏细胞岛在λgt22载体中构建的cDNA文库进行筛选。将分离的ruKATP-1cDNA切成适当的DNA片段，然后亚克隆至M13mp18或mp19中，按链终止法进行碱基测序(见图5和6)。实施例2在爪蟾卵母细胞中表达及电生理分析含全长ruKATP-1cDNA的质粒pGEM11Z用限制酶Not 1处理线性化后，用RNA聚合酶体外合成cRNA。将20ng量的cRNA注入爪蟾卵母细胞中，然后在2或3天后进行电生理分析(见图7)。如图7A和7B中所示，观察到了显示弱内向整流的K+电流。在细胞外液中加入Ba2+抑制该K+电流。实施例3对表达ruKATP-1的HEK239细胞的单通道分析在补有10％马血清的最小基本Eegle’s培养基中培养HEK239细胞。利用Lipofectamine将携带全长ruKATP-1编码cDNA的表达质粒(pCMV6b)转染到HEK239细胞中，以制备转化的HEK239细胞。对如此产生的转化细胞进行单通道分析，结果示于图8A和8B中。
如图8A和8B中所示，流经通道的外向电流被细胞内Mg2+抑制，揭示uKATP-1是一种内向整流K+通道；uKATP-1显示单通道电导为约70pS。图7表明在内-外模型中观察到的ATP对uKATP-1通道活性的影响。当向细胞膜内加入1μM ATP时通道打开，但加入1mM ATP时完全关闭。结果表明uKATP-1是一种ATP调节的KATP通道。实施例4RNA印迹分析从各种组织和细胞系提取的20μg RNA和从垂体及胸腺提取的10μg RNA，分别用甲醛变性并在1％琼脂糖凝胶上电泳，然后转移到尼龙膜上。用32P-标记的ruKATP-1 cDNA作为探针进行杂交，在几乎所有组织中观察到了uKATP-1 mRNA的表达。实施例5人源uKATP-1的cDNA和基因的克隆为了分离编码人源uKATP-1的cDNA，用32P-标记的鼠源ruKATP-1 cDNA作为探针，对人肺cDNA文库进行筛选。将形成的克隆亚克隆到M13mp18，M13mp19和pGM3Z中，然后用链终止法进行碱基测序。
权利要求
1.一种普遍存在的人源ATP敏感性钾离子通道蛋白，它具有图1所示的氨基酸序列。
2.具有编码权利要求1的氨基酸序列的碱基序列的脱氧核糖核苷酸。
3.权利要求2的脱氧核糖核苷酸，其碱基序列由图2中所示图式代表。
4.一种含有权利要求1的氨基酸序列的蛋白，其部分氨基酸残基被部分取代、插入或缺失，而不引起其生物活性的损失。
5.编码权利要求4的含所述氨基酸序列之蛋白的脱氧核糖核苷酸。
6.权利要求2或3的编码显示ATP敏感性钾离子通道蛋白生物活性的蛋白的脱氧核糖核苷酸，该脱氧核糖核苷酸含有编码其他蛋白或多肽的、在5′或3′末端与其碱基序列连接的碱基序列。
7.与人和鼠源普遍存在的ATP敏感性钾离子通道属同一族的源自其他动物的ATP敏感性钾离子通道蛋白，和编码它的脱氧核糖核苷酸。
8.含各自被置于其启动子下游的权利要求2、3、5或6的脱氧核糖核苷酸的表达质粒。
9.已用权利要求8的质粒进行了转化的生物细胞。
10.与权利要求1或4的普遍存在的ATP敏感性钾离子通道蛋白相作用的抗体。
11.权利要求10的抗体，它是单克隆抗体。
12.一种分析并检测能与权利要求1或4的普遍存在的ATP敏感性钾离子通道蛋白或其突变蛋白相作用的物质的方法。
13.权利要求12的方法，其中相互作用是通过在体外与一种物质直接连接来进行的。
14.权利要求13的方法，其中相互作用是通过激动或拮抗作用来进行的。
15.具有不同长度的探针，其通过合成权利要求2、3或5的脱氧核糖核苷酸的部分序列而制备。
16.具有不同长度的探针，其通过合成权利要求7的脱氧核糖核苷酸的部分序列而制备。
17.来自人组织和细胞的基因组文库和cDNA文库中的脱氧核糖核苷酸序列，其与权利要求15的探针相作用。
18.一种利用权利要求15或16的探针分析和检测所得脱氧核糖核苷酸序列的方法。
19.来自人和其他动物组织和细胞的基因组文库和cDNA文库的脱氧核糖核苷酸序列，其与权利要求16的探针相作用。
20.一种钾离子通道相关疾病的治疗剂，其含有权利要求1的蛋白作为活性成分。
全文摘要
本发明提供普遍存在于动物活体中的新型ATP敏感性钾离子通道蛋白，和其基因。
文档编号C07K16/00GK1157826SQ9610586
公开日1997年8月27日 申请日期1996年5月16日 优先权日1995年9月18日
发明者清野进, 稻垣畅也 申请人:清野进, 日本化学研究股份有限公司