可用于治疗前列腺癌的缀合物的制作方法

专利名称：可用于治疗前列腺癌的缀合物的制作方法
背景技术：
在1996年，预计在美国的317，000位男子中诊断出前列腺癌，42，000位美国男性死于该病(Garnick，M.B.(1994).The Dilemmas ofProstate Cancer.Scientific American，4月72-81)。因此，前列腺癌是在美国男性中最常诊断出的恶性肿瘤(除皮肤癌之外)，是该组别中与癌症相关的第二大死因(次于肺癌)。
前列腺特异性抗原(PSA)是一种单链33kDa糖蛋白，几乎仅由人前列腺上皮产生，在人精液中的水平为0.5-2.0 mg/ml(Nadji，M.，Taber，S.Z.，Castro，A.等(1981)Cancer 481229；Papsidero，L.，Kruiyana，M.，Wang，M.等(1981).JNCI 6637；Qui，SD.，Young，C.Y.F.，Bihartz，D.L.等(1990)，J.Urol.1441550；Wang，M.C.，Valenzuela，L.A.，Murphy，G.P.等(1979).Invest.Urol.17159)。单个糖单位连接于45号天冬酰胺残基上，构成总分子量的2-3kDa。PSA是具有胰凝乳蛋白酶样特异性的蛋白酶(Christensson，A.，Laurell，CB.，Lilja，H.(1990).Eur.J.Biochem.194755-763)。已经表明，PSA主要负责通过蛋白水解精子包载凝胶中的主要蛋白精液凝胶蛋白(Semenogelin)Ⅰ和精液凝胶蛋白Ⅱ以及纤连蛋白而溶解射精时形成的凝胶结构(Lilja，H.(1985).J.Clin.Invest.761899；Lilja，H.，Oldbring，J.，Rannevik，G.等(1987).J.Clin.Invest.8028l；McGee，R.S.，Herr，J.C.(1988).Biol.Reprod.39499)。PSA介导的对凝胶形成蛋白的蛋白水解产生几种可溶性精液凝胶蛋白Ⅰ和精液凝胶蛋白Ⅱ片段以及可溶性纤连蛋白片段，同时使射精物液化并释放出逐渐游动的精子(Lilja，H.，Laurell，CB.(1984).Scand.J.Clin.Lab.Invest.44447；McGee，R.S.，Herr，J.C.(1987).Biol.Reprod.37431)。此外，PSA可以蛋白水解降解IGFBP-3(胰岛素样生长因子结合蛋白3)，允许IGF特异性地刺激PSA分泌细胞的生长(Cohen等，(1992)J.Clin.Endo.& Meta.751046-1053)。
与α1-抗胰凝乳蛋白酶复合的PSA是血清PSA的主要分子形式，可能构成检测到的血清PSA的多至95％(Christensson，A.，Bj_rk，T.，Nilsson，O.等(1993)J.Urol.150100-105，Lilja，H.，Christensson，A.，Dahlén，U.(1991)Clin.Chem.371618-1625；Stenman，U.H.，Leinoven，J.，Alfthan，H.等(1991).Cancer Res.51222-226)。暗示前列腺组织(正常的、良性增生的或恶性组织)主要释放成熟的酶活性形式的PSA，因为与α1-抗胰凝乳蛋白酶形成复合物需要这种形式(Mast，A.E，Enghild，J.J.，Pizzo，S.V.等(1991).Biochemistry 301723-1730；Perlmutter，D.H.，Glover，G.I.，Rivetna，M.等(1990).Proc.Naatl.Acad.Sci.USA 873753-3757)。因此，人们认为在前列腺PSA分泌细胞的微环境中，所述PSA被加工为不与任何抑制性分子复合的其成熟酶活性形式，并以该形式分泌。PSA也与α2-巨球蛋白形成稳定的复合物，但因为这导致PSA包囊并完全丧失PSA表位，所以不清楚这种复合物形成的体内重要性。一种游离的非复合形式的PSA构成少部分血清PSA(Christensson，A.，Bj_rk，T.，Nilsson，O.等(1993).J.Urol.150100-105；Lilja，H.，Christensson，A.，Dahlén，U.(1991).Clin.Chem.371618-1625)。该形式血清PSA的大小与精液中PSA的大小相似(Lilja，H.，Christensson，A.，Dahlén，U.(1991).Clin.Chem.371618-1625)，但尚不清楚这种游离形式的血清PSA可能是一种酶原；是一种内部切割的无活性形式的成熟PSA；还是表现出酶活性的PSA。然而，这种游离形式的血清PSA表现出酶活性看来是不可能的，因为与检测的游离33 kDa形式PSA的血清水平相比，血清中未反应的α1-抗胰凝乳蛋白酶和α2-巨球蛋白的摩尔浓度均有相当大(100-1000倍)的过量(Christensson，A.，Bj_rk，T.，Nilsson，O.等(1993).J.Urol.150100-105；Lilja，H.，Christensson，A.，Dahlén，U.(1991).Clin.Chem.371618-1625)。
PSA的血清测量结果可用来监测前列腺腺癌的治疗(Duffy，M.S.(1989)Ann.Clin.Biochem.26379-387；Brawer，M.K.和Lange，P.H.(1989).Urol.Suppl.511-16；Hara，M.和Kimura，H.(1989).J.Lab.Clin.Med.113541-548)，尽管在良性前列腺增生和随后的前列腺手术创伤中也已经报道了高于正常的血清PSA浓度(Lilja，H.，Christensson，A.，Dahlén，U.(1991).Clin.Chem.371618-1625)。也已知前列腺转移瘤也分泌免疫学反应性PSA，因为在前列腺切除的表现出广泛转移性的前列腺癌患者中可监测到高水平的血清PSA(Ford，T.F，Butcher，D.N.，Masters，R.W.等(1985).Brit.J.Urology 5750-55)。因此，可以被PSA蛋白水解活性活化的细胞毒性化合物应该是前列腺细胞特异性的，并且是分泌PSA的前列腺转移瘤特异性的。
本发明的目的是提供可用于治疗前列腺癌的新型抗癌组合物，它包含可被游离前列腺特异性抗原(PSA)选择性蛋白水解切割、与长春花生物碱细胞毒性药物缀合的寡肽。
本发明的另一目的是提供治疗前列腺癌的方法，该方法包括给予所述新型抗癌组合物。
理想的是，当将含所述PSA蛋白水解切割位点的所述寡肽或者直接或者通过化学接头连接于长春花生物碱药物并且所述寡肽是完整的时候，所述长春花生物碱药物的细胞毒性活性大大降低或没有。此外还理想的是，当于所述寡肽被游离PSA切割的肽键处蛋白水解切割所连接的寡肽并随后由内源氨肽酶水解时，所述长春花生物碱药物的细胞毒性活性显著提高，或返回至未修饰的长春花生物碱药物的活性。
而且，最好是所述寡肽选自这样的寡肽，当与游离酶活性型PSA存在下的寡肽切割相比时，它们在被游离PSA切割之前，在非PSA蛋白水解酶(诸如人血清内源性的那些酶)存在下不被酶切或被酶切的速率比存在游离酶活性PSA时低得多。已经发现，所述寡肽与长春花生物碱药物或与可选接头的连接点的氨基酸优选仲氨基酸，选自脯氨酸、3-羟基脯氨酸、3-氟脯氨酸、2-哌啶酸、3-羟基哌啶酸、2-氮杂环丁烷、3-羟基-2-氮杂环丁烷、肌氨酸等。所述寡肽与长春花生物碱药物或与可选接头的连接点的氨基酸更优选环状氨基酸，选自脯氨酸、3-羟基脯氨酸、3-氟脯氨酸、哌啶酸、3-羟基哌啶酸、2-氮杂环丁烷、3-羟基-2-氮杂环丁烷等。
由于上述原因，对于所述寡肽，理想的是包含一段短肽序列，最好小于10个氨基酸。所述寡肽更优选包含7个或6个氨基酸。因为所述缀合物最好包含一段短氨基酸序列，所以所述缀合物的溶解性可能在更大程度上受所述细胞毒性药物组分的总疏水特性影响。因此，可以将具有亲水取代基的氨基酸掺入所述寡肽序列中，或可以选择N末端保护基团，以抵销或消除所述细胞毒性药物的这种疏水作用。
尽管这不是实施本发明的该方面必不可少的，但本发明的一个优选实施方案是一种缀合物，其中所述寡肽和所述可选化学接头(如果有的话)由于游离PSA和该组织附近存在的任何其它天然蛋白水解酶的蛋白水解活性而与所述细胞毒性药物分离，由此把所述细胞毒性药物、或保留所述寡肽/接头的部分但保留细胞毒性的细胞毒性药物提呈到蛋白水解切割部位的生理环境中。
不用说，无论是通过直接共价结合还是通过化学接头缀合于所述细胞毒性药物的所述寡肽，不需要是被游离PSA识别程度最高并且最容易被游离PSA蛋白水解切割的寡肽。因此，将根据被游离PSA选择性蛋白水解切割以及由这种切割产生的所述细胞毒性药物蛋白水解的残留缀合物(或在认为是理想的情况下，为未修饰的细胞毒性药物)的细胞毒性活性这两方面，来选择选定用于掺入这种抗癌组合物的寡肽。在蛋白水解性PSA切割方面使用的术语“选择性的”是指本发明寡肽组分被游离PSA切割的速率高于包含随机氨基酸序列的寡肽的切割速率。因此，本发明的寡肽组分是游离PSA的优选底物。术语“选择性的”也表示所述寡肽在所述寡肽的两个特定氨基酸之间被游离PSA蛋白水解切割。
本发明的寡肽组分被游离前列腺特异性抗原(PSA)选择性识别，并且能够被游离前列腺特异性抗原的酶活性蛋白水解切割。这种寡肽包含选自以下的寡聚物a) AsnLyslleSerTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.)，b) LysIleSerTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO. 2)，c) AsnLysIleSerTyrTyr｜Ser(SEQ.ID.NO.3)，d) AsnLysAlaSerTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.4)，e) SerTyrGln｜SerSer(SEQ.ID.NO.5)；f) LysTyrGln｜SerSer(SEQ.ID.NO.6)；g) hArgTyrGln｜SerSer (SEQ.ID.NO.7)；h) hArgChaGln｜SerSer(SEQ.ID.NO.8)；i) TyrGln｜SerSer(SEQ.ID.NO.9)；j) TyrGln｜SerLeu (SEQ.ID.NO.10)；k) TyrGln｜SerNle(SEQ.ID.NO.11)；l) ChgGln｜SerLeu(SEQ.ID.NO.12)；m) ChgGln｜SerNle(SEQ.ID.NO.13)；n) SerTyrGln｜Ser (SEQ.ID.NO.14)；o) SerChgGln｜Ser(SEQ.ID.NO.15)；p) SerTyrGln｜SerVal(SEQ.ID.NO.16)；q) SerChgGln｜SerVal(SEQ.ID.NO.17)；r) SerTyrGln｜SerLe； (SEQ.ID.NO.18)；s) SerChgGln｜SerLeu(SEQ.ID.NO.19)；t) HaaXaaSerTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.20)；u) HaaXaaLysTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.21)；v) HaaXaahArgTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.22)；w) HaaXaahArgChaGln｜Ser(SEQ.ID.NO.23)；x) HaaTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.24)；y) HaaXaaSerChgGln｜Ser (SEQ.ID.NO.25)；z) HaaChgGln｜Ser(SEQ.ID.NO.26)；其中Haa是用亲水部分取代的环状氨基酸，hArg是高精氨酸，Xaa是任一氨基酸，Cha是环己基丙氨酸，而Chg是环己基甘氨酸。
在本发明的一个实施方案中，所述寡肽包含选自以下的寡聚物a) SerSerTyrGln｜SerAla(SEQ.ID.NO.27)；b) SerSerChgGln｜SerSer(SEQ.ID.NO.28)；c) SerSerTyrGln｜SerAla(SEQ.ID.NO.29)；d) SerSerChgGln｜SerSer(SEQ.ID.NO.30)；e) 4-HypSerSerTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.31)；f) 4-HypSerSerChgGln｜Ser(SEQ.ID.NO.32)；h) AlaSerTyrGln｜SerSer (SEQ.ID.NO.33)；i) AlaSerChgGln｜SerSer(SEQ.ID.NO.34)；j) AlaSerTyrGln｜SerAla (SEQ.ID.NO.35)；k) AlaSerChgGln｜SerAla(SEQ.ID.NO.36)；l) 4-HypAlaSerTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.37)；m) 4-HypAlaSerChgGln｜Ser(SEQ.ID.NO.38)；其中4-Hyp是4-羟基脯氨酸，Xaa是任一氨基酸，hArg是高精氨酸，Cha是环己基丙氨酸，而Chg是环己基甘氨酸。
在本发明的一个更优选的实施方案中，所述寡肽包含选自以下的寡聚物SerSerChgGln｜SerAlaPro(SEQ.ID.NO.39)；SerSerChgGln｜SerSerPro(SEQ.ID.NO.40)；SerSerChgGln｜SerAla4-Hyp(SEQ.ID.NO.41)；SerSerChgGln｜SerSer4-Hyp(SEQ.ID.NO.42)；AbuSerSerChgGln｜SerPro(SEQ.ID.NO.43)；AbuSerSerChgGln｜Ser4-Hyp (SEQ.ID.NO.44)；SerSerSerChgGln｜SerLeuPro(SEQ.ID.NO.45)；SerSerSerChgGln｜SerValPro(SEQ.ID.NO.46)；SerAlaSerChgGln｜SerLeu4-Hyp (SEQ.ID.NO.47)；S erAlaSerChgGln｜SerValPro(SEQ.ID.NO.48)；(N-甲基-Ser)SerSerChgGln｜SerLeuPip(SEQ.ID.NO.49)；(N-甲基-Ser)SerSerChgGln｜SerValPip(SEQ.ID.NO.50)；4-HypSerSerTyrGln｜SerSerPro(SEQ.ID.NO.51)；4-HypSerSerTyrGln｜SerSer4-Hyp(SEQ.ID.NO.52)；4-HypSerSerTyrGln｜SerSerPro(SEQ.ID.NO.53)；4-HypSerSerTyrGln｜SerSerSer(SEQ.ID.NO.54)；4-HypSerSerTyrGln｜Ser4-Hyp(SEQ.ID.NO.55)；4-HypSerSerChgGln｜SerPro(SEQ.ID.NO.56)；4-HypSerSerChgGln｜SerSerPro(SEQ.ID.NO.57)；4-HypSerSerChgGln｜SerLeu(SEQ.ID.NO.58)；4-HypSerSerChgGln｜SerVal(SEQ.ID.NO.59)；4-HypAlaSerChgGln｜SerValPro(SEQ.ID.NO.60)；4-HypAlaSerChgGln｜SerSerPip(SEQ.ID.NO.61)；4-HypSerSerChgGln｜Ser(SEQ.ID.NO.62)；4-HypSerSerChgGln｜SerGly(SEQ.ID.NO.63)；SerSerChgGln｜SerGly (SEQ.ID.NO.64)；3-PalSerSerTyrGln｜Ser4-Hyp (SEQ.ID.NO.65)；3-PalSerSerChgGln｜SerPro (SEQ.ID.NO.66)；(3，4-DiHyp)SerSerTyrGln｜SerSerPro(SEQ.ID.NO.67)；和(3，4-DiHyp)SerSerTyrGln｜SerSer4-Hyp(SEQ.ID.NO.68)；其中Abu是氨基丁酸，4-Hyp是4-羟基脯氨酸，Pip是2-哌啶酸，3，4-DiHyp是3，4-二羟基脯氨酸，3-Pal是3-吡啶基丙氨酸，Sar是肌氨酸，而Chg是环己基甘氨酸。
上文和本发明详述中其它地方所用的短语“包含氨基酸序列的寡聚物”描述了约3-约100个氨基酸残基、在其氨基酸序列中包含所述的特定氨基酸序列、并因此在所述氨基酸序列中被游离PSA蛋白水解切割的寡聚物。所述寡聚物最好有5-10个氨基酸残基。因此，例如以下寡聚物hArgSerAlaChgGlnlSerLeu(SEQ.ID.NO.69)包含氨基酸序列ChgGlnlSerLeu(SEQ.ID.NO.12)；而因此应该属于本发明范围内。而寡聚物hArgSer4-HypChgGlnlSerLeu(SEQ.ID.NO.70)包含氨基酸序列4-HypChgGlnlSerLeu(SEQ.ID.NO.71)；因此属于本发明范围内。不用说，这类寡聚物不包括精液凝胶蛋白Ⅰ和精液凝胶蛋白Ⅱ。
肽化学领域的普通技术人员容易认识到，生物活性寡肽中的某些氨基酸可以被其它同系的、电子等排的和/或等电子的氨基酸取代，其中原始寡肽的生物活性在修饰的寡肽中仍然保存。某些非天然氨基酸和修饰的天然氨基酸也可以用来取代本发明寡肽中的相应的天然氨基酸。因此，例如酪氨酸可以被3-碘酪氨酸、2-甲基酪氨酸、3-氟酪氨酸、3-甲基酪氨酸等取代。此外，例如赖氨酸可以用N’-(2-咪唑基)赖氨酸等取代。下表的氨基酸取代是说明性的，不是限制性的原始氨基酸取代氨基酸Ala Gly，AbuArg Lys，鸟氨酸Asn GlnAsp GluGlu AspGln AsnGlv AlaIle Val，Leu，Met，Nle，NvaLeu Ile，Val，Met，Nle，NvaLys Arg，鸟氨酸Met Leu，Ile，Nle，Val鸟氨酸Lys，ArgPhe Tyr，TrpSer Thr，Abu，Hyp，AlaThr Ser，Abu，HypTrp Phe，TyrTyr Phe，TrpVal Leu，Ile，Met，Nle，Nva因此，可以用本领域技术人员熟知的技术合成例如以下寡肽，预期以下寡肽可以被游离PSA蛋白水解切割AsnArgIleSerTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.72)AsnLysValSerTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.73)AsnLysMetSerTyrGln｜SerSer(SEQ.ID.NO.74)AsnLysLeuSerTyrGln｜SerSer(SEQ.ID.NO.75)AsnLyslleSerTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.76)GlnLyslleSerTyrGln｜SerSer(SEQ.ID.NO.77)．Asn4-HypIleSerTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.78)Asn4-HypValSerTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.79)4-HypAlaSerTyrGln｜SerSer(SEQ.ID.NO.80)(3，4-二羟基脯氨酸)AlaSerTyrGln｜SerSer(SEQ.ID.NO.81)3-羟基脯氨酸SerChgGln｜Ser(SEQ.ID.NO.82)4-HypAlaSerChgGln｜SerSer(SEQ.ID.NO.83)在氨基酸序列中包括的符号“｜”指出该序列中所述寡肽被游离PSA蛋白水解切割的点。
本发明的化合物可以具有不对称中心，并可以作为外消旋体、外消旋化合物以及作为单个非对映体存在，包括光学异构体在内的所有可能的异构体均包括在本发明中。人们理解，所命名的氨基酸具有天然的“L”立体构型，除非另有说明。
在本发明中，公开的氨基酸由以下所示的常规的3字母和单字母缩写识别丙氨酸 AlaA精氨酸 ArgR天冬酰胺AsnN天冬氨酸AspD天冬酰胺或天冬氨酸 AsxB半胱氨酸CysC谷胺酰胺GlnQ谷氨酸 GluE谷胺酰胺或谷氨酸GlxZ甘氨酸 GlyG组氨酸 HisH异亮氨酸IleI亮氨酸 LeuL赖氨酸 LysK甲硫氨酸MetM苯丙氨酸PheF脯氨酸 ProP丝氨酸 SerS苏氨酸 ThrT色氨酸 TrpW酪氨酸 TyrY缬氨酸 ValV以下缩写用于说明书和附图
中，以指示所示的氨基酸和部分hR或hArg高精氨酸hY或hTyr高酪氨酸Cha 环己基丙氨酸Amf 4-氨基甲基苯丙氨酸DAP 1，3-二氨基丙基DPL 2-(4，6-二甲基嘧啶基)赖氨酸(咪唑基)K N’-(2-咪唑基)赖氨酸Me2PO3-YO-二甲基磷酸酪氨酸O-Me-Y O-甲基酪氨酸TIC 1，2，3，4-四氢-3-异喹啉甲酸DAP 1，3-二氨基丙烷TFA 三氟乙酸AA； 乙酸3PAL3-吡啶基丙氨酸4-HyP 4-羟基脯氨酸dAc-Vin 4-去乙酰长春碱Pip 哌啶酸Abu 2-氨基丁酸Nva正缬氨酸本领域众所周知并且在本发明中理解的是，肽基治疗剂诸如本发明的寡肽-细胞毒性剂缀合物最好具有用合适保护基保护的任何寡肽取代基的末端氨基部分，所述保护基诸如乙酰基、苯甲酰基、新戊酰基等。末端氨基的这种保护减少或消除这类肽基治疗剂由于温血动物血浆中存在的外源氨肽酶的作用而引起的酯促降解。这类保护基也可以包括根据亲水官能度的存在而选择的亲水保护基团。增加缀合物亲水性并因此增加缀合物溶解性的保护基团包括但不限于羟基化(hydroylated)烷酰基、多羟基化烷酰基、聚乙二醇、糖基化物(glycosylate)、糖和冠醚。N末端非天然氨基酸部分也可以减轻外源氨肽酶的这类酶促降解。
所述N末端保护基最好选自a)乙酰基； 其中R1和R2独立地选自a)氢，b)未取代的或取代的芳基、未取代的或取代的杂环基、C3-C10环烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、卤素、C1-C6全氟烷基、R3O-、R3C(O)NR3-、(R3)2NC(O)-、R32N-C(NR3)-、R4S(O)2NH、CN、NO2、R3C(O)-、N3、N(R3)2或R4OC(O)NR3-，c)未取代的C1-C6烷基，d)取代的C1-C6烷基，其中取代的C1-C6烷基上的取代基选自未取代的或取代的芳基、未取代的或取代的杂环基、C3-C10环烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、R3O-、R4S(O)2NH、R3C(O)NR3-、(R3)2NC(O)-、R32N-C(NR3)-、CN、R3C(O)-、N3、N(R3)2和R4OC(O)NR3-；或R1和R2结合形成-(CH2)s-，其中所述碳原子之一可任选地被选自以下的一个部分取代O、S(O)m、-NC(O)-、NH和-N(COR4)-；R3选自氢、芳基、取代的芳基、杂环基、取代的杂环基、C1-C6烷基和C3-C10环烷基；R4选自芳基、取代的芳基、杂环基、取代的杂环基、C1-C6烷基和C3-C10环烷基；m为0、1或2；n为1、2、3或4；p为0或1-100之间的整数；和q为0或1，前提是如果p为0，则q为1；而r为1、2或3；s为3、4或5。
本发明缀合物的某些寡肽包含先前用术语“Haa’表示的用亲水部分取代的环状氨基酸，它们也可以用下式表示 其中R5选自HO-和C1-C6烷氧基；R6选自氢、卤素、C1-C6烷基、HO-和C1-C6烷氧基；且t为3或4。
结构 代表环中具有5或6元的环胺部分，这种环胺可任选地与苯基或环己基环稠合。这种环胺部分的实例包括但不限于以下具体结构 本发明的缀合物可以具有不对称中心并可以作为外消选体、外消旋混合物和单个非对映体存在，包括光学异构体在内的所有可能的异构体均包括在本发明内。当任一可变物(例如芳基、杂环、R3等)在任一组分中出现一次以上时，每次出现时其定义与每个另一次出现的定义无关。例如，HO(CR1R2)2-代表HOCH2CH2-、HOCH2CH(OH)-、HOCH(CH3)CH(OH)-等。此外，取代基和/或可变物的组合只有当这类组合产生稳定的化合物时才是可允许的。
本文所用的“烷基”和芳烷基的烷基部分以及相似的术语是指包括具有特定碳原子数的支链和直链饱和脂族烃基；“烷氧基”代表通过氧桥连接的指定碳原子数的烷基。
本文所用的“环烷基”是指包括具有特定碳原子数的非芳族环烃基。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
“链烯基”包括具有特定碳原子数并具有一个或数个双键的基团。链烯基的实例包括乙烯基、烯丙基、异丙烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、1-丙烯基、2-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、异戊二烯基、法呢基、香叶基、香叶基香叶基等。
“炔基”包括具有特定碳原子数并具有一个三键的基团。炔基的实例包括乙炔基、2-丁炔基、2-戊炔基、3-戊炔基等。
本文所用的“卤素”或“卤代”是指氟、氯、溴和碘。
本文所用的“芳基”以及芳烷基和芳酰基的芳基部分是指包括每个环多至7元的任何稳定的单环或双环碳环，其中至少一个环为芳环。这类芳基成分的实例包括苯基、萘基、四氢萘基、2，3-二氢化茚基、联苯基、菲基、蒽基或苊基。
本文所用的术语杂环或杂环的，代表或者饱和或者不饱和的稳定的5-7元单环杂环或稳定的8-11元双环杂环，所述环由碳原子和选自N、O和S的1-4个杂原子组成，包括其中任何一个上述定义的杂环与苯环稠合的任何双环基。杂环可以连接于任何杂原子或碳原子，导致产生稳定的结构。这类杂环成分的实例包括但不限于氮杂_基、苯并咪唑基、苯并异噁唑基、苯并呋咱基、苯并吡喃基、苯并噻喃基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并二氢吡喃基、噌啉基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并噻喃基、二氢苯并噻喃基砜、呋喃基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、二氢吲哚基、吲哚基、异二氢苯并吡喃基、异二氢吲哚基、异喹啉基、异噻唑烷基、异噻唑基、异噻唑烷基、吗啉基、1，5-二氮杂萘基、噁二唑基、2-氧代氮杂_基、噁唑基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吡啶基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑基、哒嗪基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯基、间二氮杂萘基、喹啉基、喹喔啉基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、硫代吗啉基、硫代吗啉基亚砜、噻唑基、噻唑啉基、噻吩并呋喃基、噻吩并噻吩基和噻吩基。
本文所用的术语“取代的C1-C8烷基”、“取代的芳基”和“取代的杂环”包括除与该化合物其余部分的连接点外还含有1-3个取代基的部分。这类额外的取代基选自F、Cl、Br、CF3、N(C1-C6烷基)2、NO2、CN、(C1-C6烷基)O-、-OH、(C1-C6烷基)S(O)m-、(C1-C6烷基)C(O)NH-、H2N-C(NH)-、(C1-C6烷基)C(O)-、(C1-C6烷基)OC(O)-、N3、(C1-C6烷基)OC(O)NH-和C1-C20烷基。
当R1和R2结合形成-(CH2)s-时，如此定义的环状部分和含杂原子的环状部分包括但不限于 本文所用的术语“羟基化的”代表如此描述的环系统的可取代碳上被羟基部分取代。本文所用的术语“多羟基化的”代表如此描述的环系统的两个或更多可取代碳上被2、3或4个羟基部分取代。
本文所用的术语“PEG”代表含取代基、具有指定数目乙烯氧基亚单位的某些聚乙二醇。因此，术语PEG(2)代表 而术语PEG(6)代表 本文所用的术语“(d)(2，3-二羟基丙酰基)”代表以下结构 本文所用的术语“(2R，3S)2，3，4-三羟基丁酰基”代表以下结构 本文所用的术语“quinyl”代表以下结构 或其非对映体。
本文所用的术语“可铁宁基(cotininyl)”代表以下结构 或其非对映体。
本文所用的术语“没食子基(gallyl)”代表以下结构 本文所用的术语“4-乙氧基方形酸酯”代表以下结构 用于本发明缀合物中的细胞毒性剂可以选自长春花生物碱细胞毒性剂。特别有用的该类成员包括例如选自长春碱、长春新碱、异长春碱、长春地辛、维诺利宾、navelbine、环氧长春碱等或它们的光学异构体的长春花生物碱。人们理解，本发明的缀合物的所述寡肽通过连接于长春花生物碱C-4的氧原子连接。因此，某些该氧上具有乙酰基部分的长春花生物碱在偶联至所述寡肽(或可选的接头单位)之前，必须首先去乙酰基。此外，本领域技术人员可以对所需细胞毒性剂进行化学修饰，以便使该化合物的反应更便于制备本发明的缀合物。
一组优选用于本发明的4-去乙酰-长春花生物碱细胞毒性剂包括下式的药物一组式Ⅰ的长春花生物碱药物 其中R7为H、CH3或CHO；当R9和R10结合为一体时，R10为H，而R8和R9之一为乙基，而另一个为H或OH；当R9和R10一起形成一个双键时，R8为乙基；R11为氢；R12为OH、O-(C1-C3烷基)或NH2。
其中细胞毒性剂为优选的细胞毒性剂4-O-去乙酰长春碱的本发明的寡肽-细胞毒性剂缀合物可以由以下通式Ⅰa描述 其中寡肽为被游离前列腺特异性抗原(PSA)特异性识别、且能够被游离前列腺特异性抗原的酶活性蛋白水解切割的寡肽，XL选自一个键、-C(O)-(CH2)u-W-(CH2)u-O-和-C(O)-(CH2)u-W-(CH2)u-NH-；R选自a)氢 f)乙氧基方形酸酯；和g)可铁宁基；R1和R2独立地选自氢、OH、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6芳烷基和芳基；R1a为C1-C6烷基、羟基化C3-C8环烷基、多羟基化C3-C8环烷基、羟基化芳基、多羟基化芳基或芳基，R9为氢、(C1-C3烷基)-CO或氯取代的(C1-C3烷基)-CO；W选自支链或直链C1-C6烷基、环戊基、环己基、环庚基或双环[2.2.2]辛基；n为1、2、3或4；p为0或1-100之间的整数；q为0或1，前提是如果p为0，则q为1；r为1、2或3；
t为3或4；u为0、1、2或3，或其药学上可接受的盐或光学异构体。
XL最好为一个键。
在本申请的一个实施方案中，寡肽-R部分选自Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerSerPro；(SEQ.ID.NO.84)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerGly；(SEQ.ID.NO.85)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerSerSar；(SEQ.ID.NO.86)Ac-4-反式-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-Pro；(SEQ.ID.NO.87)Ac-4-反式-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-SerVal；(SEQ.ID.NO.88)Ac-4-反式-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-4-反式-L-Hyp；(SEQ.ID.NO.89)Ac-Abu-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Pro；(SEQ.ID.NO.90)羟基乙酰Abu-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Pro；(SEQ.ID.NO.91)乙酰3-PALSer-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-Pro；(SEQ.ID.NO.92)Ac-4-反式-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Val；(SEQ.ID.NO.93)Ac-4-反式-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu；(SEQ.ID.NO.94)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerSer4-反式-L-Hyp；(SEQ.ID.NO.95)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerPro；(SEQ.ID.NO.96)Ac-SerSerChgGlnSerGly；(SEQ.ID.NO.98)Ac-SerSerChgGlnSerSer-4-反式-L-Hyp；(SEQ.ID.NO.99)Ac-SerSerChgGlnSerSerPro；(SEQ.ID.NO.100)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerAla；(SEQ.ID.NO.103)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerChg；(SEQ.ID.NO.104)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerSerSar；(SEQ.ID.NO.105)Ac-SerSerChgGlnSerSerHyp；(SEQ.ID.NO.106)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerSerPro；(SEQ.ID.NO.107)Ac-AbuSerSerChgGlnSer(dSer)Pro；(SEQ.ID.NO.108)Ac-AbuSerSerChgGlnSerSerPro；(SEQ.ID.NO.109)Ac-SerSerChgGlnSerSerPro；(SEQ.ID.NO.111)Ac-4-反式-L-HypSerSerChg(dGln)SerSerPro；(SEQ.ID.NO.114)Ac-4-反式-L-HypSerSerChg(dGln)(dSer)SerPro；(SEQ.ID.NO.115)Ac-SerChgGln-SerSerPro；(SEQ.ID.NO.116)Ac-SerChgGlnSerSer-4-反式-L-Hyp；(SEQ.ID.NO.117)Ac-SerChgGlnSerSerSar；(SEQ.ID.NO.118)Ac-SerChgGlnSerSerAibPro；(SEQ.ID.NO.119)Ac-SerChgGlnSerSerN-Me-Ala；(SEQ.ID.NO.120)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerSerPip；(SEQ.ID.NO.124)和Ac-SerChgGlnSerSeRN-Me-dA；(SEQ.ID.NO.125)其中Abu为氨基丁酸，4-反式-L-Hyp为4-反式-L-羟基脯氨酸，Pip为2-哌啶酸，3，4-DiHyp为3，4-二羟基脯氨酸，3-PAL为3-吡啶基丙氨酸，Sar为肌氨酸，而Chg为环己基甘氨酸。
以下化合物为本发明寡肽-去乙酰长春碱缀合物的具体实例 其中X为 或其药学上可接受的盐或光学异构体。
用常规肽合成技术，最好用固相技术，可以由组成氨基酸合成本发明的寡肽、肽亚单位和肽衍生物(也称为“肽类”)。然后，通过反相高效液相层析(HPLC)纯化所述肽类。
肽合成的标准方法公开于例如以下著作Schroeder等，“ThePeptides”，第Ⅰ卷，Academic Press 1965；Bodansky等，“PeptideSynthesis”，Interscience Pubilshers，1966；McOmie(编辑)“ProtectiveGroups in Organic Chemistry”，Plenum Press，l973；Barany等，“ThePeptidesAnalysis，Synthesis，Biology”2，第1章，Academic Press，1980，和Stewart等，“Solid Phase Peptide Synthesis’，第2版，Pierce ChemicalCompany，1984。这些著作的技术通过引用结合到本文中。
通过标准肽技术可以掺入本发明缀合物中、具有亲水取代基的适当取代的环状氨基酸，其本身或者为市售的，或者可用本领域熟知的技术或本文所述技术容易地合成。因此，适当取代的脯氨酸的合成描述于以下论文和其中引用的参考文献中J.Ezquerra等，J.Org.Chem.602925-2930(1995)；P.Gill和W.D.Lubell，J.Org.Chem.，602658-2659(1995)；和M.W.Holladay等，J.Med.Chem.，34457-461(1991)。这些论文中的技术通过引用结合到本文中。
本发明化合物的药学上可接受的盐包括如例如由无毒无机酸或有机酸形成的本发明化合物的常规无毒盐。例如，这类常规无毒盐包括由诸如以下无机酸衍生的无毒盐盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；由诸如以下的有机酸制备的盐乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、扑酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酸基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、草酸、羟乙磺酸、三氟乙酸等。
包括含PSA切割位点的寡肽和长春花生物碱细胞毒性剂的本发明缀合物，可以用医药化学领域熟知的技术合成。例如，可以将长春花生物碱药物(vinca drug)上的羟基部分共价连接于寡肽的羧基末端，使得形成一个酯键。为此，可以利用诸如HBTU和HOBT的组合、BOP和咪唑的组合、DCC和DMAP的组合等的试剂。也可以通过形成硝基苯酯等使所述羧酸活化，并使所述羧酸在DBU(1，8-二氮杂双环[5，4，0]十一烷-7-烯)存在下进行反应。
本领域技术人员会理解，在本发明化合物的合成中，人们可能需要保护原始化合物和中间体上的各种反应性官能度，而在该分子的其它部分上进行所需反应。在所需反应完成后，或在任何所需时间，通常通过例如水解或氢解方法去除这类保护基。这类保护和去保护的步骤是有机化学中常规的步骤。关于可以用于制备本发明化合物的保护基的内容，本领域技术人员将参考Protective Groups in OrganicChemistry.，McOmie编辑，Plenum press，NY，NY(1973)；和ProtectiveGroups in Organic Synthesis，Greene编辑，John Wiley & Sons，NY，NY(1981)。
仅仅作为实例，有用的氨基保护基包括例如C1-Cl0烷酰基，诸如甲酰基、乙酰基、二氯乙酰基、丙酰基、己酰基、3，3-二乙基己酰基、γ-氯丁酰基等；C1-C10烷酯基和C5-C15芳酯基，诸如叔丁酯基、苄酯基、烯丙酯基、4-硝基苄酯基、芴基甲酯基和肉桂酯基；卤代-(C1-C10)-烷酯基，诸如2，2，2-三氯乙酯基；和C1-C15芳烷基和链烯基，诸如苄基、苯乙基、烯丙基、三苯甲基等。其它常用的氨基保护基为用β-酮基-酯制备的烯胺形式的氨基保护基，诸如乙酰乙酸甲酯或乙酰乙酸乙酯。
有用的羧基保护基可以包括例如C1-Cl0烷基，诸如甲基、叔丁基、癸基；卤代-C1-C10烷基，诸如2，2，2-三氯乙基和2-碘乙基；C5-C15芳烷基，诸如苄基、4-甲氧基苄基、4-硝基苄基、三苯基甲基、二苯基甲基；C1-C10烷酰氧基甲基，诸如乙酸基甲基、丙酸基甲基等；和诸如以下基团苯甲酰甲基、4-卤代苯甲酰甲基、烯丙基、二甲基烯丙基、三-(C1-C3烷基)甲硅烷基诸如三甲基硅烷基、β-对甲苯磺酰基乙基、β-对硝基苯硫基乙基、2，4，6-三甲基苄基、β-甲硫基乙基、苯二甲酰亚氨基甲基、2，4-二硝基-苯磺酰苯基(phenylsulphenyl)、2-硝基二苯甲基和相关的基团。
同样，有用的羟基保护基可以包括例如甲酰基、氯乙酰基、苄基、二苯甲基、三苯甲基、4-硝基苄基、三甲基甲硅烷基、苯甲酰甲基、叔丁基、甲氧基甲基、四氢吡喃基等。
关于与去乙酰长春碱结合的寡肽的优选实施方案，以下反应流程描述本发明缀合物的合成。
反应流程Ⅰ描述了本发明寡肽和长春花生物碱细胞毒性剂的缀合物的制备，其中4-去乙酰长春碱的氧连接于寡肽的C末端。尽管其它反应顺序可以用于生成这类缀合物，但已经发现，最初将单个氨基酸与所述4-氧连接以及随后将其余寡肽序列与该氨基酸连接是优选的方法。也已经发现，3，4-二氢-3-羟基4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(ODHBT)可以用来取代最后的偶联步骤中的HOAt。
反应流程Ⅱ描述了本发明寡肽缀合物的制备，其中羟基烷醇酸(hydroxy alkanolyl acid)用作长春花生物碱药物和所述寡肽之间的接头。
反应流程Ⅰ
反应流程Ⅰ(续)
反应流程Ⅱ
反应流程Ⅱ(续)
本发明的寡肽-细胞毒性剂缀合物可用于治疗恶性或良性的特征为异常细胞或细胞异常增殖的疾病，其中那些细胞的特征在于它们分泌酶活性PSA。这类疾病包括但不限于前列腺癌、良性前列腺增生、转移性前列腺癌、乳腺癌等。
将本发明的寡肽-细胞毒性剂缀合物以药用组合物的形式给予患者，所述药用组合物包含本发明的缀合物和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。所用的术语“药学上可接受的”是指可用于温血动物的治疗或诊断的那些药剂，所述温血动物包括例如人类、马、猪、牛、鼠、犬、猫或其它哺乳动物以及鸟类或其它温血动物。优选的给药模式是胃肠外给药，特别是通过静脉内、肌内、皮下、腹膜内或淋巴内途径给药。这类制剂可以采用本领域技术人员熟悉的载体、稀释剂或赋形剂制备。在该方面，请参见例如Remington’s Pharmacutical Science，第16版，1980，Mack Publishing Company，由Osol等编辑。这类组合物可以包括蛋白诸如血清蛋白例如人血清白蛋白、缓冲剂或缓冲物质诸如磷酸盐、其它盐、或电解质等。合适的稀释剂可以包括例如无菌水、等渗盐水、稀葡萄糖水溶液、多元醇或这类醇例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等的混合物。所述组合物可以含有防腐剂，诸如苯乙醇、对羟基苯甲酸甲基和丙酯、硫柳汞等。如果需要，所述组合物可以包含约0.05-约0.20％(重量)的抗氧化剂，诸如偏亚硫酸氢钠或亚硫酸氢钠。
本文所用的术语“组合物”是指包括含特定量的规定成分的产物以及由规定量的特定成分的组合物直接或间接产生的任何产物。
所述药用组合物可以为无菌注射水溶液形式。其中可以使用的可接受的载体和溶剂为水、Ringer溶液和等渗氯化钠溶液。
无菌注射制剂也可以是活性成分溶于油相中的无菌注射水包油微乳液。例如，可以将活性成分首先溶于豆油和卵磷脂的混合物中。然后将油溶液引入水和甘油的混合物中并加工形成微乳液。
可以将所述注射液或微乳液经局部大量注射引入患者的血流中。或者，给予所述溶液或微乳液的方式可能最好使得维持恒定循环浓度的本发明化合物。为了维持这种恒定浓度，可以利用连续静脉内传递装置。这种装置的一个实例为Deltec CADD-PLUSTM5400型静脉内泵。
所述药用组合物可以为用于肌内或皮下给药的无菌注射水性或油性(oleagenous)悬浮液。可以采用合适的分散剂或润湿剂以及上述悬浮剂，按照已知技术制备这种悬浮液。所述无菌注射制剂也可以是无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如作为1，3-丁二醇溶液。另外，常规上将无菌固定油类用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的固定油类，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，诸如油酸的脂肪酸可应用于注射剂的制备中。
对于静脉内给药，最好制备所述组合物，而使得给予患者的量为约0.01-约1g所述缀合物。给药量的范围最好是约0.2g-约1g所述缀合物。本发明的缀合物在很宽的剂量范围内是有效的，取决于诸如以下因素待治疗的疾病病症或待改变的生物学效应、给予缀合物的方式、患者的年龄、体重和病症以及由治疗医师决定的其它因素。因此，给予任何给定患者的量必须根据个体决定。
本领域技术人员会认识到，尽管在以下实施例中概述了具体的试剂和反应条件，但可以对其进行修改，这些修改将包括在本发明的精神和范围内。因此，提供以下制剂和实施例是为了进一步说明本发明，而不是限制性的。
实施例实施例1去乙酰长春碱-4-O-(N-乙酰-4-反式-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-Pro)酯步骤A4-去乙酰长春碱的制备在氮气下将2.40 g(2.63mmol)硫酸长春碱(Sigma V-1377)样品溶于135ml纯甲醇中，并用45ml无水肼处理，将溶液于20-25℃下搅拌18小时。将反应物蒸发至稠浆，将其在300ml二氯甲烷和150ml饱和碳酸氢钠之间分配。水层用2份100ml二氯甲烷洗涤，3份二氯甲烷层的每份再各用100ml水(2×)和饱和NaCl(1×)洗涤。合并的有机层经无水硫酸钠干燥并减压去除溶剂，得到为灰白色晶状固体的标题化合物。该物质于-20℃贮存待用。步骤B4-去乙酰长春碱-4-O-(脯氨酰基)酯的制备在氮气下将804mg(1.047mmol)4-去乙酰长春碱样品溶于3ml二氯甲烷和18ml无水吡啶中，用1.39g Fmoc-脯氨酰氯(Fmoc-Pro-Cl，Advanced Chemtech)处理，并将混合物于25℃搅拌20小时。当经HPLC分析时，显示存在未反应的起始去乙酰长春碱，再加入0.50g Fmoc-Pro-Cl，再搅拌20小时以完成反应。加入水(约3ml)以与过量的酰氯反应，然后将溶液蒸发至干，并将其分配于300ml EtOAc和150ml饱和碳酸氢钠之间，然后用饱和氯化钠洗涤2次。干燥(硫酸钠)后减压去除溶剂，得到橙褐色的残留物，向其加入30ml DMF和14ml哌啶，5分钟后减压蒸发溶液，得到橙黄色的半固体残留物。真空干燥约1小时后，向该物质加入约200ml水和100ml乙醚，然后在振摇和超声处理下滴加冰醋酸直至完全溶解，水层保持稳定的pH4.5-5.0(湿润pH范围为4-6试纸)。然后，水层用1份100ml乙醚洗涤，各乙醚层再用50ml水洗涤。合并的水层分2份经过Waters C4 Dleta-Pak柱15μM300A(A=0.1％TFA/水；B=0.1％TFA/CH3CN)制备型HPLC，梯度洗脱为95→70％A/70 min。合并的流分在浓缩时和冻干时得到标题化合物。步骤CN-乙酰-4-反式-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-WANG树脂以负载量为0.82 mmol/g的0.5mmol(0.61 g)Fmoc-Ser(t-Bu)-WANG树脂开始，在适用于基于Fmoc/叔丁基的合成的ABI 430A型肽合成仪上合成受保护的肽。该方案使用2倍过量(1.0mmol)的各种以下受保护的氨基酸Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Chg-OH、Fmoc-4-反式-L-Hyp-OH；和乙酸(双偶联)。在每个偶联循环中，用20％哌啶的N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)溶液，然后用NMP洗涤，去除Fmoc保护。采用在NMP中活化DCC和HOBt达到偶联。在合成完成时，将所述肽树脂干燥得到标题化合物。步骤DN-乙酰-4-反式-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-OH将一份0.5 mmol的上述肽树脂悬浮于25ml TFA中，然后加入水和三异丙基甲硅烷各0.625ml，然后于25℃下搅拌2.0小时。过滤切割的混合物，固体用TFA洗涤，减压去除滤液中的溶剂，并用乙醚研磨残留物得到淡黄色固体，将其经过滤和真空干燥得到标题化合物。HPLC条件，体系A柱子…Vydac 15cm#218TP5415，C18洗脱剂… 梯度(95％A→50％A)，45分钟。A=0.1％TFA/水，B=0.1％TFA/乙腈流速…1.5 ml／min。高分辨率ES/F-MS7893。步骤E去乙酰长春碱-4-O-(N-乙酰-4-反式-L-Hvp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-Pro)酯在氮气下将如上制备的得自步骤D的522 mg(0.66 mmol)肽样品和得自步骤B的555mg(约0.6 mmol)4-去乙酰长春碱4-O-(脯氨酰基)酯溶于17ml DMF中。然后，加入163mg(1.13mmol)l-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)，用2，4，6-可力丁将pH调至6.5-7(湿润范围为5-10的pH试纸)，然后冷却至0℃，加入155 mg(0.81 mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。于0-5℃继续搅拌直至经分析型HPLC(A=0.1％TFA/水，B=0.1％TFA/CH3CN)监测完成偶联，通过定期加入2，4，6-可力丁将pH维持在6.5-7.12小时后，通过加入约4ml水处理反应物，搅拌1小时后真空浓缩至小体积，将其溶于约150ml5％HOAc中，并分2次在Waters C18 Dalta-Pak柱15μM300A上进行制备型HPLC(A=0.1％TFA/水，B=0.1％TFA/CH3CN)，梯度洗脱为95→65％A/70min。合并得自2次层析的含后洗脱产物(经HPLC评估，体系A，95→65％A/30 min)的均一流分，并浓缩至约50ml的体积，使其通过约40ml AG4X4离子交换树脂(乙酸盐循环)，然后冷冻干燥得到为冻干粉的标题化合物。
高分辨率ES/F-MS1637.0。
实施例1A去乙酰长春碱-4-O-(N-乙酰-4-反式-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-Pro)酯乙酸盐在氮气下，将如实施例1步骤B中所述制备的4.50g(3.7mmol)4-O-(脯氨酰基)去乙酰长春碱TFA盐样品溶于300 ml DMF中，将溶液冷却至0℃。然后加入1.72g(10.5 mmol)3，4-二氢-3-羟基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(ODHBT)，用N-甲基吗啉(NMM)将pH调至7.0(湿润范围为5-10的pH试纸)，然后分次加入4.95g(5.23mmol)实施例1步骤D的N-乙酰-七肽，允许每次加入之间完全溶解。用NMM将pH再调至7.0，加入1.88g(9.8mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，然后于0-5℃搅拌溶液，直至经分析型HPLC(体系A)监测偶联完成，通过定期加入NMM将pH维持在约7。分析显示保留时间为26.3min的主要成分之后为26.1min的鉴定为标题化合物D-Ser异构体的次要成分(约10％)。20小时后，通过加入30ml水处理反应物，搅拌1小时后，真空浓缩至小体积并溶于约500ml20％HOAc中，分12次在Waters C18 Dleta-Pak柱15mM 300A(A=0.1％TFA/水；B=0.1％TFA/CH3CN)上进行制备型HPLC，梯度洗脱为95→65％A/90min，流速为80 ml/min。
合并代表全部流出液约1/4的均一流分(经HPLC评价，体系C)，并浓缩至约150ml的体积，使其通过约200ml Bio-Rad AG4X4离子交换树脂(乙酸盐循环)，然后将该流出液冷冻干燥，得到为冻干粉的标题化合物的乙酸盐保留时间(体系A)26.7min，98.9％纯度；高分辨率ES/FT-MS m/e1636.82；氨基酸组成分析20 hr，100℃，6N HCl(理e/实测)，Ser4/3.91(校正的)，Glu 1/0.92(Gln转变为Glu)，Chg 1/1.11，Hyp1/1.07，Pro 1/0.99，肽含量0/.516 mmol／mg。
再将均一流分合并并由侧流分(side fractions)进行纯化，如上通过约500ml离子交换树脂加工，得到额外量的标题化合物。
HPLC条件，体系A柱子…Vydac 15 cm#518TP5415，C18流速…1.5 ml/min洗脱剂… 梯度(95％A→50％A)，45分钟。
A=0.1％TFA/水，B=0.1％TFA/乙腈波长…214 nm，280 nmHPLC条件，体系C柱子…Vvdac 15cm#518TP5415，C18流速…1．5ml／min洗脱剂… 梯度(85％A→65％A)，30分钟。
A=0.1％TFA/水，B=0.1％TFA/乙腈波长…214 nm，280 nm表1显示用实施例1和1A所述步骤制备的其它肽-长春花生物碱药物缀合物，但利用合适的氨基酸残基和保护基团的酰化。除非另有说明，否则制备和测试所述缀合物的乙酸盐。
表1
4-反式-L-Hyp为反式4-羟基-L-脯氨酸当n＞1时，数值为均值
实施例4游离PSA对寡肽-长春花生物碱药物缀合物识别的评价将如实施例3中制备的缀合物单独溶于PSA消化缓冲液(50mM三(羟甲基)-氨基甲烷pH 7.4，140 mM NaCl)中，将该溶液以100∶1的摩尔比加入PSA中。或者，所用的PSA消化缓冲液为50 mM三(羟甲基)-氨基甲烷pH 7.4，140mM NaCl。在各个反应时间后，通过加入三氟乙酸(TFA)至最终1％(体积/体积)猝灭反应。或者，用10mM ZnCl2猝灭反应。在反相C18柱上，采用0.1％TFA/乙腈水溶液梯度经HPLC分析猝灭的反应物。然后计算用酶活性游离PSA切割50％所述寡肽-细胞毒性剂缀合物所需的时间(以分钟计)。结果示于表1。
实施例5对长春花生物碱药物肽基衍生物细胞毒性的体外测定如实施例3中所述制备的可切割的寡肽-长春花生物碱药物缀合物对已知被未修饰的长春花生物碱药物杀伤的细胞系的细胞毒性，用Alamar Blue测定进行评估。具体地说，LNCap前列腺肿瘤细胞即Colo320DM细胞(称为C320)或T47D细胞的细胞培养物用含各种浓度的给定缀合物的培养基(最终的平板孔体积为200μl)稀释。不表达游离PSA的Colo320DM细胞用作对照细胞系，以测定基于未知机制(non-mechanism)的毒性。将细胞于37℃孵育3天，将20μl Alamar Blue加入测定孔中。再孵育细胞，在加入Alamar Blue后4小时和7小时，在EL310 ELISA读板仪上于570nm和600nm的双波长下对测定板测定读数。然后相对于对照(无缀合物)培养基计算各种浓度的受试缀合物下的相对存活百分率，并测定EC50。结果示于表2。除非另有说明，否则对所述缀合物的乙酸盐进行测试。
表2
Pip为2．哌啶酸；Sar为肌氨酸；Chg为环己基甘氨酸；Abu为2-氨基丁酸；Aib为2-氨基异丁酸。
实施例6肽基．细胞毒性剂缀合物的体内效力将LNCaP．FGC或DuPRO-1细胞用胰蛋白酶处理，再悬浮于生长培养基中并以200×g离心6分钟。将细胞再悬浮于无血清α-MEM中并对其计数。然后将合适体积的含所需细胞数的该溶液转移至锥形离心管中，如前离心并再悬浮于适当体积的α-MEM-Matrigel的冷1∶1混合物中。将悬浮液在冰上保持直至接种动物。
不用麻醉而束缚Harlan Sprague Dawley雄性裸鼠(10-12周龄)，在左侧用22G针皮下注射为其接种0.5ml细胞悬浮液。小鼠或者给予约5×105DuPRO细胞或者1.5×107LNCaP.FGC细胞。
在接种所述肿瘤细胞后，按两个方案之一处理小鼠方案A接种细胞后1天，给予动物0.1-0.5ml体积的受试缀合物、长春花生物碱药物或载体对照(无菌水)。缀合物和长春花生物碱药物的剂量最初为最大非致死量，但随后滴定剂量可能较低。在5天内以24小时的间隔给予相同剂量。10天后，取出小鼠的血液样品并测定PSA的血清水平。以5-10天的间隔测定相似的血清PSA水平。在5．5周结束时，处死小鼠并测量任何存在的肿瘤的重量，再次测定血清PSA。在该测定开始和结束时测量动物的体重。方案B接种细胞后1天，取动物的血液样品并测定血清PSA水平。然后将动物按照其PSA血清水平分组。在细胞接种后14-15天，给予动物0.1-0.5ml体积的受试缀合物、长春花生物碱药物或载体对照(无菌水)。缀合物和长春花生物碱药物的剂量最初为最大非致死量，但随后滴定剂量可能较低。在5天内以24小时的间隔给予相同剂量。以5-10天的间隔测定血清PSA水平。在5．5周结束时，处死小鼠并测量任何存在的肿瘤的重量，再次测定血清PSA。在该测定开始和结束时测量动物的体重。
实施例7体外测定内源非PSA蛋白酶对缀合物的蛋白水解切割步骤A蛋白水解组织提取物的制备所有步骤均于4℃进行。处死合适的动物，分离相关组织并贮存于液氮中。用研钵和研杵将冷冻组织磨碎，将研磨的组织转移至Potter-Elvejeh匀浆器中并加入2倍体积的缓冲液A(含1.15％KCl的50mM Tris，pH 7.5)。然后用20个冲程破碎组织，首先用1个松散固定的研杵，然后用1个紧密固定的研杵。匀浆以10，000×g在吊桶式转头(HB4-5)中离心，弃去沉淀，将再次的上清液以100，000×g(Ti 70)离心。取出上清液(细胞溶胶)。
以与用于上述缓冲液A所用步骤的相同体积，将沉淀再悬浮于缓冲液B(含1.15％KCl的10mM EDTA，pH 7.5)中。将悬浮液在dounce匀浆器中匀浆并将溶液以100，000×g离心。弃去上清液，用上述所用体积的1/2将沉淀再悬浮液缓冲液C(含0.25M蔗糖的10mM磷酸钾缓冲液，pH7.4)中，并用dounce匀浆器匀浆。
用Bradford测定来测定这两种溶液(细胞溶胶和膜)的蛋白含量。然后取出等份测定物并冷冻于液氮中。将等分样品贮存于-70℃。步骤B蛋白水解切割测定对于每个时间点，将20微克肽-长春花生物碱药物缀合物以及按步骤A所述制备并经Bradford在反应缓冲液中测定的150微克组织蛋白置于缓冲液(50mM TRIS，140mMNaCl，pH 7.2)中的溶液中，溶液的终体积为200微升。测定反应进行0、30、60、120和180分钟，然后用9微升0.1M ZnCl2猝灭反应，并立即置于沸水中90秒。用VYDACC18 15cm柱，在水/乙腈(5％-50％乙腈，30分钟)中经HPLC分析反应产物。
序列表&#60110&#62Merck & Co.，Inc.
Brady，Stephen F.
Feng，Dong-MeiGarsky，Victor M.
&#60120&#62可用于治疗前列腺癌的缀合物&#60130&#6220120Y&#60150&#6260/067，110&#60151&#621997-12-02&#60160&#62125&#60170&#62FastSEQ for Windows Version 3.0&#60210&#621&#60211&#627&#60212&#62PRT&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62全合成&#60400&#621Asn Lys Ile Ser Tyr Gln Ser1 5&#60210&#622&#60211&#626&#60212&#62PRT&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62全合成&#60400&#622Lys Ile Ser Tyr Gln Ser1 5&#60210&#623&#6021l&#627&#60212&#62PRT&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62全合成
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1．可用于治疗前列腺癌的缀合物或其药学上可接受的盐，所述缀合物包含连接于寡肽的长春花生物碱细胞毒性剂，其中所述寡肽包含的一段氨基酸序列可被游离前列腺特异性抗原选择性蛋白水解切割，其中连接方式可任选地通过一个化学接头，并且其中所述寡肽的连接点位于所述长春花生物碱细胞毒性剂4位上的氧。
2．按照权利要求1的缀合物或其光学异构体，其中所述细胞毒性剂选自以下细胞毒性剂a)长春碱b)4-去乙酰长春碱，c)长春新碱，d)异长春碱，和e)长春地辛。
3．按照权利要求2的缀合物，其中所述细胞毒性剂选自4-去乙酰长春碱。
4．按照权利要求1的缀合物，其中所述寡肽包含选自以下的寡聚物a) AsnLysIleSerTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.1)，b) LysIleSerTyrGln｜Ser(SEQ.D.NO.2)，c) AsnLysIleSerTyrTyr｜Ser (SEQ.ID.NO.3)，d) AsnLysAlaSerTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.4)，e) SerTyrGln｜SerSer(SEQ.ID.NO.5)；f) LysTyrGln｜SerSer(SEQ.ID.NO.6)；g) hArgTyrGln｜SerSer(SEQ.ID.NO.7)；h) hArgChaGln｜SerSer(SEQ.ID.NO.8)；i) TyrGln｜SerSer (SEQ．ID．NO．9)；j) TyrGln｜SerLeu (SEQ.ID.NO.10)；k) TyrGln｜SerNle(SEQ.ID.NO.11)；l) ChgGln｜SerLeu(SEQ.ID.NO.12)；m) ChgGln｜SerNle(SEQ.ID.NO.13)；n) SerTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.14)；o) SerChgGln｜Ser (SEQ.ID.NO.15)；p) SerTyrGln｜SerVal(SEQ.ID.NO.16)；q) SerChgGln｜SerVal(SEQ.ID.NO.17)；r) SerTyrGln｜SerLeu(SEQ.ID.NO.18)；s) SerChgGln｜SerLeu(SEQ.ID.NO.19)；t) HaaXaaSerTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.20)；u) HaaXaaLysTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.21)；v) HaaXaahArgTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.22)；w) HaaXaahArgChaGln｜Ser(SEQ.ID.NO.23)；x) HaaTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.24)；y) HaaXaaSerChgGln｜Ser(SEQ.ID.NO.25)；z) HaaChgGln｜Ser(SEQ.ID.NO.26)；其中Haa是用亲水部分取代的环状氨基酸，hArg是高精氨酸，Xaa是任一氨基酸，Cha是环己基丙氨酸，而Chg是环己基甘氨酸。
5．按照权利要求1的缀合物，其中所述寡肽包含选自以下的寡聚物SerSerChgGln｜SerAlaPro(SEQ.ID.NO.39)；SerSerChgGln｜SerSerPro(SEQ.ID.NO.40)；SerSerChgGln｜SerAla4-Hyp(SEQ.ID.NO.41)；SerSerChgGln｜SerSer4-Hyp(SEQ.ID.NO.42)；AbuSerSerChgGln｜SerPro(SEQ.ID.NO.43)；AbuSerSerChgGln｜Ser4-Hyp (SEQ.ID.NO.44)；SerSerSerChgGln｜SerLeuPro(SEQ.ID.NO.45)；SerSerSerChgGln｜SerValPro(SEQ.ID.NO.46)；SerAlaSerChgGln｜SerLeu4-Hyp (SEQ.ID.NO.47)；SerAlaSerChgGln｜SerValPro(SEQ.ID.NO.48)；(N-甲基-Ser)SerSerChgGln｜SerLeuPip(SEQ.ID.NO.49)；(N-甲基-Ser)SerSerChgGln｜SerValPip(SEQ.ID.NO.50)；4-HypSerSerTyrGln｜SerSerPro (SEQ.ID.NO.51)；4-HypSerSerTyrGln｜SerSer4-Hyp(SEQ.ID.NO.52)；4-HypSerSerTyrGln｜SerSerPro (SEQ.ID.NO.53)；4-HypSerSerTyrGln｜SerSerSar(SEQ.ID.NO.54)；4-HypSerSerTyrGln｜Ser4-Hyp(SEQ.ID.NO.55)；4-HypSerSerChgGln｜SerPro (SEQ.ID.NO.56)；4-HypSerSerChgGln｜SerSerPro(SEQ.ID.NO.57)；4-HypSerSerChgGln｜SerLeu(SEQ.ID.NO.58)；4-HypSerSerChgGln｜SerVal(SEQ.ID.NO.59)；4-HypAlaSerChgGln｜SerValPro(SEQ.ID.NO.60)；4-HypAlaSerChgGln｜SerSerPip(SEQ.ID.NO.61)；4-HypSerSerChgGln｜Ser(SEQ.ID.NO.62)；4-HypSerSerChgGln｜SerGly(SEQ.ID.NO.63)；SerSerChgGln｜SerGly(SEQ.ID.NO.64)；3-PalSerSerTyrGln｜Ser4-Hyp (SEQ.ID.NO.65)；3-PalSerSerChgGln｜SerPro(SEQ.ID.NO.66)；(3，4-DiHyp)SerSerTyrGln｜SerSerPro(SEQ.ID.NO.67)；和(3，4-DiHyp)SerSerTyrGln｜SerSer4-Hyp(SEQ.ID.NO.68)；其中Abu是氨基丁酸，4-Hyp是4-羟基脯氨酸，Pip是2-哌啶酸，3，4-DiHyp是3，4-二羟基脯氨酸，3-Pal是3-吡啶基丙氨酸，Sar是肌氨酸，而Chg是环己基甘氨酸。
6．按照权利要求1的缀合物，其中所述寡肽包含选自以下的寡聚物Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerSerPro；(SEQ.D.NO.84)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerGly；(SEQ.ID.NO.85)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerSerSar；(SEQ.ID.NO.86)Ac-4-反式-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-Pro；(SEQ.ID.NO.87)Ac-4-反式-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-SerVal；(SEQ.ID.NO.88)Ac-4-反式-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-4-反式-L-Hyp；(SEQ.ID.NO.89)Ac-Abu-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Pro；(SEQ.ID.NO.90)羟基乙酰Abu-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Pro；(SEQ.ID.NO.91)乙酰3-PALSer-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-Pro；(SEQ.ID.NO.92)Ac-4-反式-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Val；(SEQ.ID.NO.93)Ac-4-反式-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu；(SEQ.ID.NO.94)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerSer4-反式-L-Hyp；(SEQ.ID.NO.95)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerPro；(SEQ.ID.NO.96)Ac-SerSerChgGlnSerGly；(SEQ.ID.NO.98)Ac-SerSerChgGlnSerSer-4-反式-L-Hyp；(SEQ.ID.NO.99)Ac-SerSerChgGlnSerSerPro；(SEQ.ID.NO.100)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerAla；(SEQ.ID.NO.103)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerChg；(SEQ.ID.NO.104)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerSerSar；(SEQ.ID.NO.105)Ac-SerSerChgGlnSerSerHyp；(SEQ.ID.NO.106)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerSerPro；(SEQ.ID.NO.107)Ac-AbuSerSerChgGlnSer(dSer)Pro；(SEQ.ID.NO.108)Ac-AbuSerSerChgGlnSerSerPro；(SEQ.ID.NO.109)Ac-SerSerChgGlnSerSerPro；(SEQ.ID.NO.111)Ac-4-反式-L-HypSerSerChg(dGln)SerSerPro；(SEQ.ID.NO.114)Ac-4-反式-L-HypSerSerChg(dGln)(dSer)SerPro；(SEQ.ID.NO.115)Ac-SerChgGln-SerSerPro；(SEQ.ID.NO.116)Ac-SerChgGlnSerSer-4-反式-L-Hyp；(SEQ.ID.NO.117)Ac-SerChgGlnSerSerSar；(SEQ.ID.NO.118)Ac-SerChgGlnSerSerAibPro；(SEQ.ID.NO.119)Ac-SerChgGlnSerSerN-Me-Ala；(SEQ.ID.NO.120)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerSerPip；(SEQ.ID.NO.124)和Ac-SerChgGlnSerSerN-Me-dA；(SEQ.ID.NO.125)其中Abu为氨基丁酸，4-反式-L-Hyp为4-反式-L-羟基脯氨酸，Pip为2-哌啶酸，3，4-DiHyp为3，4-二羟基脯氨酸，3-PAL为3-吡啶基丙氨酸，Sar为肌氨酸，而Chg为环己基甘氨酸。
7．式Ⅰ的缀合物或其药学上可接受的盐或光学异构体 其中寡肽为被游离前列腺特异性抗原(PSA)特异性识别、且能够被游离前列腺特异性抗原的酶活性蛋白水解切割的寡肽，XL选自一个键、-C(O)-(CH2)u-W-(CH2)u-O-和-C(O)-(CH2)u-W-(CH2)u-NH-；R选自a)氢，b)-(C=O)R1a， f)乙氧基方形酸酯；和g)可铁宁基；R1和R2独立地选自氢、OH、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6芳烷基和芳基；R1a为C1-C6烷基、羟基化C3-C8环烷基、多羟基化C3-C8环烷基、羟基化芳基、多羟基化芳基或芳基，R9为氢、(C1-C3烷基)-CO或氯取代的(C1-C3烷基)-CO；W选自支链或直链C1-C6烷基、环戊基、环己基、环庚基或双环[2.2.2]辛基；n为1、2、3或4；p为0或1-100之间的整数；q为0或1，前提是如果p为0，则q为1；r为1、2或3；t为3或4；u为0、1、2或3。
8．按照权利要求7的缀合物或其光学异构体，其中寡肽为包含选自以下的氨基酸序列的寡聚物a) AsnLysIleSerTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.1)，b) LysIleSerTyrGln｜Ser (SEQ.ID.NO.2)，c) AsnLysIleSerTyrTyr｜Ser(SEQ.ID.NO.3)，d) AsnLysAlaSerTyrGln｜Ser (SEQ.ID.NO.4)，e) SerTyrGln｜SerSer(SEQ.ID.NO.5)，f) LysTyrGln｜SerSer (SEQ.ID.NO.6)；g) hArgTyrGln｜SerSer (SEQ.ID.NO.7)；h) hArgChaGln｜SerSer(SEQ.ID.NO.8)；i) TyrGln｜SerSer (SEQ.ID.NO.9)；j) TyrGln｜SerLeu (SEQ.ID.NO.10)；k) TyrGln｜SerNle(SEQ.ID.NO.11)；1) ChgGln｜SerLeu(SEQ.ID.NO.12)；m) ChgGln｜SerNle(SEQ.ID.NO.13)；n) SerTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.14)；o) SerChgGln｜Ser(SEQ.ID.NO.15)；p) SerTyrGln｜SerVal(SEQ.ID.NO.16)；q) SerChgGln｜SerVal(SEQ.ID.NO.17)；r) SerTyrGln｜SerLeu (SEQ.ID.NO.18)；s) SerChgGln｜SerLeu(SEQ.ID.NO.19)；t) HaaXaaSerTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.20)；u) HaaXaaLysTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.21)；v) HaaXaahArgTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.22)；w) HaaXaahArgChaGln｜Ser(SEQ.ID.NO.23)；x) HaaTyrGln｜Ser(SEQ.ID.NO.24)；y) HaaXaaSerChgGln｜Ser (SEQ.ID.NO.25)；z) HaaChgGln｜Ser(SEQ.ID.NO.26)；其中Haa是用亲水部分取代的环状氨基酸，hArg是高精氨酸，Xaa是任一氨基酸，Cha是环己基丙氨酸，而Chg是环己基甘氨酸。
9．按照权利要求8的缀合物或其光学异构体，其中Haa为反式-4-羟基-L-脯氨酸。
10．按照权利要求7的缀合物，其中所述寡肽-R选自Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerSerPro；(SEQ.ID.NO.84)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerGly；(SEQ.ID.NO.85)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerSerSar；(SEQ.ID.NO.86)Ac-4-反式-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-Pro；(SEQ.ID.NO.87)Ac-4-反式-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-SerVal；(SEQ.ID.NO.88)Ac-4-反式-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-4-反式-L-Hyp；(SEQ.ID.NO.89)Ac-Abu-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Pro；(SEQ.ID.NO.90)羟基乙酰Abu-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Pro；(SEQ.ID.NO.91)乙酰3-PALSer-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-Pro；(SEQ.ID.NO.92)Ac-4-反式-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Val；(SEQ.ID.NO.93)Ac-4-反式-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu；(SEQ.ID.NO.94)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerSer4-反式-L-Hyp；(SEQ.ID.NO.95)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerPro；(SEQ.ID.NO.96)Ac-SerSerChgGlnSerGly；(SEQ.ID.NO.98)Ac-SerSerChgGlnSerSer-4-反式-L-Hyp；(SEQ.ID.NO.99)Ac-SerSerChgGlnSerSerPro；(SEQ.ID.NO.100)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerAla；(SEQ.ID.NO.103)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerChg；(SEQ.ID.NO.104)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerSerSar；(SEQ.ID.NO.105)Ac-SerSerChgGlnSerSerHyp；(SEQ.ID.NO.106)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerSerPro；(SEQ.ID.NO.107)Ac-AbuSerSerChgGlnSer(dSer)Pro；(SEQ.ID.NO.108)Ac-AbuSerSerChgGlnSerSerPro；(SEQ.ID.NO.109)Ac-SerSerChgGlnSerSerPro；(SEQ.ID.NO.111)Ac-4-反式-L-HypSerSerChg(dGln)SerSerPro；(SEQ.ID.NO.114)Ac-4-反式-L-HypSerSerChg(dGln)(dSer)SerPro；(SEQ.ID.NO.115)Ac-SerChgGln-SerSerPro；(SEQ.ID.NO.116)Ac-SerChgGlnSerSer-4-反式-L-Hyp；(SEQ.ID.NO.117)Ac-SerChgGlnSerSerSar；(SEQ.ID.NO.118)Ac-SerChgGlnSerSerAibPro；(SEQ.ID.NO.119)Ac-SerChgGlnSerSerN-Me-Ala；(SEQ.ID.NO.120)Ac-4-反式-L-HypSerSerChgGlnSerSerSip；(SEQ.ID.NO.124)和Ac-SerChgGlnSerSerN-Me-dA；(SEQ.ID.NO.125)其中Abu为氨基丁酸，4-反式-L-Hyp为4-反式-L-羟基脯氨酸，Pip为2-哌啶酸，3，4-DiHyp为3，4-二羟基脯氨酸，3-PAL为3-吡啶基丙氨酸，Sar为肌氨酸，而Chg为环己基甘氨酸。
11．按照权利要求7的缀合物，所述缀合物选自 或其药学上可接受的盐或光学异构体。
12．按照权利要求7的缀合物，它为 或其药学上可接受的盐或光学异构体。
13．药用组合物，包含药用载体和其中分散的治疗有效量的权利要求1的化合物。
14．药用组合物，包含药用载体和其中分散的治疗有效量的权利要求7的化合物。
15．药用组合物，包含药用载体和其中分散的治疗有效量的权利要求11的化合物。
16．治疗前列腺癌的方法，包括给予有需要的哺乳动物治疗有效量的权利要求13的组合物。
17．治疗前列腺癌的方法，包括给予有需要的哺乳动物治疗有效量的权利要求14的组合物。
18．治疗前列腺癌的方法，包括给予有需要的哺乳动物治疗有效量的权利要求15的组合物。
19．治疗良性前列腺增生的方法，包括给予有需要的哺乳动物治疗有效量的权利要求13的组合物。
20．治疗良性前列腺增生的方法，包括给予有需要的哺乳动物治疗有效量的权利要求14的组合物。
21．治疗良性前列腺增生的方法，包括给予有需要的哺乳动物治疗有效量的权利要求15的组合物。
22．通过将权利要求1的化合物和药学上可接受的载体混合制备药用组合物。
23．制备药用组合物的方法，包括将权利要求1的化合物和药学上可接受的载体混合。
全文摘要
公开了包含寡肽和已知的细胞毒性剂的化学缀合物,所述寡肽的氨基酸序列可被游离前列腺特异性抗原(PSA)选择性地蛋白水解切割。本发明缀合物的特征在于将可切割的寡肽连接至已去乙酰的长春花生物碱药物的4位氧上。这类缀合物可用于治疗前列腺癌和良性前列腺增生(BPH)。
文档编号C07K14/47GK1284086SQ98813282
公开日2001年2月14日 申请日期1998年11月25日 优先权日1997年12月2日
发明者S·F·布拉迪, 冯冬梅, V·M·加斯基 申请人:麦克公司