专利名称：含有来自乙肝病毒x蛋白的肽抗原的脂质体的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及其中含有新型肽抗原的脂质体，这些肽抗原在调节人体针对乙肝病毒(HBV)的免疫反应中发挥作用，更具体地说，本发明涉及对应于来自HBV X蛋白中抗原表位的肽类群，这些肽能诱导产生针对上述病毒的细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)或免疫耐受性；本发明还涉及含有所述肽类群的pH-敏感性脂质体，所述肽类群能够激发细胞免疫从而产生特异于上述病毒的CTL。
现有技术当人体受HBV感染时，会激发各种生理反应来清除该病毒。在这些反应中，最重要的反应之一就是破坏或清除已受感染的细胞，最终导致病毒感染的恢复。已受感染细胞的破坏离不开另一种被成为CTL的具有细胞毒性的细胞。CTL展示细胞毒性的前提条件是它们必须首先识别入侵病毒蛋白中的一些肽。通常，病毒蛋白在受感染细胞内合成，然后通过细胞内的降解过程转化为含8～15个氨基酸的短肽。因此，当上述的一些肽与胞内主要组织相容性复合体(“MHC”)以结合体的形式出现在细胞表面时，CTL能够识别它们从而破坏受感染的细胞。另一方面，MHC分为Ⅰ类和Ⅱ类MHC，与Ⅱ类MHC相比，已知Ⅰ类MHC在诱导CTL方面发挥重要作用。但是，有报道指出在病毒蛋白降解产生的众多肽中，能够为CTL所识别的蛋白(肽)的位点仅限于其中含有特异性氨基酸序列的肽(参见Fremont，D.等人，《科学》257919-926(1992)；Matsumura，M.等人，《科学》257929-934(1992))。
因此，发现这些特异性位点的氨基酸序列就可以化学合成并制备出具有相应氨基酸序列的肽，所以可以用这些肽人工诱导产生能够特异性地识别人体内肝炎病毒的CTL或者调节免疫抑制等其他免疫应答，从而有效地预防及治疗由肝炎病毒诱发的疾病。
在这些认识的基础上，许多的研究人员都致力于从肝炎病毒蛋白降解产生的肽中发现能够为CTL所识别的肽的氨基酸序列。因此，已经发现了几个特异性的氨基酸序列，并预期会进一步发现更多的序列。此外，为了将这些肽应用于肝炎-相关疾病的预防和治疗中，就需要同时使用尽可能多的肽，这些肽的效能可能各不相同，这取决于肽的种类。因此，发现这些肽的氨基酸序列具有十分重要的意义。
现已报道过能被CTL识别并可用于预防和治疗乙肝的肽主要来自HBV的S(表面抗原)蛋白和C(核心)蛋白。但是，尽管一系列使用转基因小鼠的试验都清楚地揭示出X蛋白与HBV-相关的肝癌直接有关(参见Hoyhne等人，EMBO J.，91137-1145(1990)；Kim等人，《自然》，351317-320(1991))，但是至今来自X蛋白的肽还未见报道，X蛋白是一个HBV的抗原蛋白。
另一方面，当磷脂分散在水中时，极性的头部基团朝向水，而疏水的尾部通过疏水作用聚集在一起，自发地形成双层球状密闭囊泡，称为“脂质体”。这样的脂质体已经广泛地用作药物传递系统中的载体以及生物膜的研究模型(参见Lee，J.W.and Kim，H.，Arch.Biochem.Biophys.，297354(1992)；Hahn，K.H.and Kim，H.，生物化学杂志，110635(1991)；Yun，C.H.and Kim，H.，生物化学杂志，105406(1989)；Kim，J.and Kim，H.，《生物化学》，257867(1986)；Kim，J.and Kim，H.，韩国生物化学杂志，18403(1985))。
最近，已有报道说脂质体可以用于免疫学领域，从而加速了用脂质体作为疫苗或佐剂的载体的研究(参见Rooijen，NV.，《疫苗》，111170(1993))。通常，当静脉内注入脂质体时，它们很容易被血液中富含的巨噬细胞(“MO”)捕获，巨噬细胞在脂质体抗原的加工以及抗原的免疫处理工程中发挥着重要的作用。
另外，可以用于诱导CTL应答的方法最近已发展起来，CTL应答特异性地针对pH-敏感性脂质体中所使用的特定蛋白或肽(参见Readdy，R.等人，免疫方法杂志，141157(1991)；Zhou，F.等人，免疫方法杂志，145143(1991)；Nair，S.等人，J.Exp.Med.，175609(1992)；Harding，C.V.等人，免疫学杂志1472860(1991)；Zhou，F.and Huang，L.，《疫苗》，111139(1993))，而且pH-敏感性脂质体已被广泛地用作蛋白或肽抗原的载体及佐剂系统，用来制备亚单位疫苗。在这一点上，本发明人已经报道了一种用于制备pH-敏感性脂质体的方法，该脂质体允许抗癌药物的选择性转运(参见Choi，M.J.等人，生物化学杂志，112694(1992))。
发明概述根据本发明，在来自HBVX蛋白的众多肽中，提供了一系列可被CTL特异性识别的肽。而且，还提供了其中含有来自HBV X蛋白的肽抗原的pH-敏感性脂质体。本发明人发现所述脂质体可以用于开发上述治疗性制剂，该试剂通过激发细胞免疫而生成特异于上述HBV肽抗原的CTL，从而达到预防和治疗HBV-相关疾病的目的。
因此，本发明的一个主要目的是提供来自HBV X蛋白的肽抗原，该肽抗原可被CTL识别并对病毒表现出细胞毒性。
本发明的另一个目的是提供pH-敏感性脂质体，其中含有上述能够激发细胞免疫的肽抗原。
附图简述结合附图，可以从下列给出的描述中清楚地理解出本发明的上述及其他目的和特征，其中
图1显示了在T2细胞表面表达的MHC Ⅰ类分子的变化，用荧光强度来表示。
图2图示了CTL针对T2细胞的细胞毒性。
图3(A)显示的是用人肝细胞癌接种的裸鼠的致瘤性。
图3(B)显示的是，在以来自HBV X蛋白的肽抗原激发的CTL处理后裸鼠中的肿瘤清除情况。
发明详述基于此前发现的结合到MHC Ⅰ类分子上的肽具有特异性的氨基酸序列，从HBV X蛋白的全长氨基酸序列中，测定出具有结合MHC Ⅰ类分子潜能的肽的序列。也就是说，由于能够结合HLA-A2这样一种人MHC Ⅰ类分子的肽在C-末端或N-端第二位上具有亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸(参见Matsumura，M.等人，《科学》，257929-934(1992))，所以从HBV X蛋白的全长氨基酸序列中筛选出满足上述条件的氨基酸序列，在该分子三维结构的基础上，从HBV X蛋白降解后产生的众多肽中，选择出具有结合HLA-A2潜能的肽，即能够通过结合人MHCⅠ类分子而激发CTL应答的肽抗原(参见下列表1)。然后，根据这样测定出的氨基酸序列，化学合成出肽。下列表1中给出了来自HBVX蛋白的肽，即X3、X4、XS、X6和X7的氨基酸序列。
表1HBV X蛋白降解后产生的肽中可被CTL识别的肽的位置及氨基酸序列
*氨基酸序列根据IUPAC-IBU命名系统缩写。
本发明不仅包括上述9个氨基酸组成的肽，而且还包括在这些肽的N-或C-末端添加1～5个氨基酸得到的肽以及它们的功能等同物。在本发明中，“功能等同物”一词可以用来指代在上述肽的氨基酸序列中取代1或2个氨基酸后得到的所有的肽。例如，取代包括下列的氨基酸组合，例如Gly，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg；和，Phe，Tyr。
为了制备出其中含有来自HBV X蛋白的肽抗原的pH-敏感性脂质体，按照6∶4～8∶2，最优选7∶3的摩尔比混合磷脂酰乙醇胺-β-油酰基-γ-棕榈酰(POPE)和胆甾醇半琥珀酸酯(CHOH)，或者按照3∶3∶4～4∶4∶2，最优选3.5∶3.5∶3的摩尔比混合POPE、磷脂酰乙醇胺(PE)和CHOH，最终形成磷脂薄膜。然后，把这些制备得到的脂质体加入到含有上述来自HBV X蛋白的肽抗原的缓冲溶液中。在这一点上，通过采用摩尔比为1∶5～1∶25，最优选1∶20，来混合一种或多种肽抗原和磷脂而制备出含有上述来自HBV X蛋白的肽抗原的脂质体。根据本发明制备的pH-敏感性脂质体还可以进一步包括上限为1摩尔％的单磷酰脂质A作为磷脂。
本发明的脂质体囊括了能激发人CTL应答的肽抗原，可用作这些肽的载体的pH-敏感性脂质体也能够激发出特异性地针对病毒的CTL应答，上述被囊括入脂质体中的肽来自该病毒。自然地，这已经清楚地表明含有上述肽的pH-敏感性脂质体能够激发人的细胞免疫。
在描述本发明肽的氨基酸序列时，采用了按IUPAC-IUB标准缩写成的单字母符号，具体如下氨基酸符号丙氨酸 A精氨酸 R天冬酰胺N天冬氨酸D半胱氨酸C
谷氨酰胺Q谷氨酸 E甘氨酸 G组氨酸 H异亮氨酸I亮氨酸 L赖氨酸 K甲硫氨酸M苯丙氨酸F脯氨酸 P丝氨酸 S苏氨酸 T色氨酸 W酪氨酸 Y缬氨酸 V下列实施例对本发明做了进一步说明，但这不应该被理解为对本发明范围的限制。实施例1对X蛋白中具有结合MHC分子潜能的肽进行测定由于能够结合HLA-A2这样一种人MHC Ⅰ类分子的肽在C-末端或N-端第二位上具有亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸(参见Matsumura，M.等人，《科学》257929-934(1992))，所以首先从HBV X蛋白的全长氨基酸序列中筛选出满足上述条件的氨基酸序列，根据该分子三维结构，最终选择出具有结合HLA-A2潜能的肽(参见上述表1)。然后，根据这样测定出的氨基酸序列，按照本领域已知常规方法进行所述肽的化学合成。实施例2肽的合成以及对它们与MHC分子结合能力的测定化学合成来自HBV X蛋白的7个不同的肽，其中包括表1中列出的那些肽，并将它们溶解在磷酸盐缓冲液(下文称为“PBS”)中。为了研究这些肽能否结合与CTL诱导相关的MHC Ⅰ类分子，分别以100、64、32、16、8、4、2和1μg/ml的浓度，将各种肽添加到T2细胞系，然后在37℃反应4小时。然后，用PBS洗涤细胞以除去未反应的肽，加入抗HLA-A2.1(一种人MHC Ⅰ类分子)的BB7.2抗体，然后再在4℃反应1小时。再用PBS洗涤细胞，加入异硫氰酸荧光素(FITC)-偶联的抗-小鼠免疫球蛋白抗体，然后于4℃反应1小时。然后，用荧光细胞计(FACScan，BECTON DICKINSON)测定细胞的荧光，结果见图1。
如图1所示，发现在T2细胞表面上X3、X4、X5、X6和X7等5个肽成功地结合到MHC Ⅰ类分子上。试验中使用的肽见下列表2。
表2合成肽的氨基酸序列
*氨基酸序列根据IUPAC-IBU分子系统缩写。
试验中所使用的T2细胞系在肽的胞内转运途径中出现紊乱，因而使MHC Ⅰ类分子与肽不能正确结合而产生不稳定的分子结构，因而导致正常生长温度37℃培养过程中MHC分子的低水平表达。但是，当在含有能结合MHC分子的肽的培养基中培养T2细胞时，这些肽与T2细胞表面上的MHC分子结合从而增强了MHC分子的稳定性，这样导致MHC分子表达量的增加。由于有了这些知识，所以通过测定BB7.2抗体与细胞表面的结合程度，就可以分析出特定肽与T2细胞表面MHC分子的结合水平。实施例3测定CTL对肽的识别特定肽与MHC分子结合并不能证明该肽已被CTL识别。因此，为了研究实施例2中用于测定结合MHC的肽是否真正被能在人体内识别HBV的CTL所识别，做了进一步的试验。
也就是说，从普通的血液供体中采集抗-HBV抗体阳性(ELISA得到的数值1.0或更大)的血样并离心收获血细胞。除去血细胞中的红细胞后，向留下的白细胞中，按10μg/ml的浓度加入上述的肽，然后在CO2温箱中37℃温育，温箱中CO2浓度恒定在5％。培养2天后，向培养基中加入10个单位的白介素-2，然后继续培养细胞3天。然后，用丝裂霉素C灭活具有同样MHC的血细胞，并将其加入培养基中作为刺激细胞。接着向培养基中加入上述的肽和白介素-2，继续培养细胞7天。然后测定血细胞是否识别并破坏了表面具有特定肽的T2细胞，下面的表3及图2中分别给出了这些结果。
Table 3肽-特异性T细胞针对被合成肽致敏的靶细胞所表现出的细胞毒性
*CTL与靶细胞之比按照下列描述测定培养后的血细胞对T2细胞的破坏向T2细胞加入100μg/ml的肽，然后于37℃反应3小时。然后充分洗涤细胞以除去未反应的肽，加入放射性标记后的铬酸钠(Cr51)，在CO2温箱中于37℃反应2小时。然后，将它们用RPMI培养液充分洗涤以除去未反应的铬酸钠，再按一定比例与用PBS洗过的血细胞混合，并于37℃在CO2温箱中反应4小时。收集反应后的培养基，测量γ射线的强度，从而测定出血细胞针对T2细胞，即靶细胞所表现出的细胞毒性。
从上述的表3中可以看出，研究发现X3、X4、X5、X6、X7和P5被培养后的血细胞识别，其中P5是作为阳性对照的已知肽(参见Nayersina，R.等人，免疫学杂志，1504659-4671(1993))，这一结果表明本发明实施例中使用的试验方法是稳定的。实施例4含有肽抗原的pH-敏感性脂质体的制备将由POPE/CHOH(摩尔比为7∶3)或者POPE/PE/CHOH(摩尔比为3.5∶3.5∶3)组成的磷脂加入到玻璃小瓶并溶解到有机溶剂中。然后，向小瓶中导入氮气，直至小瓶中形成脂质薄膜。然后把要被囊括的含肽缓冲液(pH 8.0)加入到脂质薄膜以实现充分水合，剧烈振荡制备出多层囊泡(“MLV”)，用超声处理MLV，从中制备出单层囊泡(“SUV”)。将这样得到的SUV在室温下温育2～12个小时，用液氮快速冷冻上述的SUV，然后室温下缓慢融化，重复上述操作3～4次，制备出含有肽的脂质体。因此，以1∶20的摩尔比混合肽和磷脂，最终制备成脂质体。在此实例中，使用的肽是来自HBV X蛋白的肽抗原，并且能够通过结合MHC Ⅰ类分子激发CTL应答(见上述表1)。
下面对制备到的脂质体的物理稳定性和pH-敏感性进行研究，与传统的pH-敏感性脂质体相比，本发明的脂质体经乙醇处理后仅出现轻微的破坏，脂质体内容物仅有极少的渗漏(1)物理稳定性的测定向脂质体溶液中加入乙醇，此时通过测量浊度的变化来测定如上制备的脂质体的物理稳定性。由于乙醇处理能破坏脂质体，导致浊度减小，所以可以通过测量400nm的吸光度来测定出脂质体的稳定性。结果，发现含有本发明所述肽的脂质体的物理稳定性高于传统的pH-敏感性脂质体。
(2)pH-敏感性的测定将下述物质囊括入含有所述肽的脂质体中12.5mM 8-氨基亚萘基-1，3，6-三磺酸二钠盐(ANTS)、45mM对二甲苯双吡啶鎓溴化物(DPX)、68mM NaCl和10mM HEPES缓冲溶液(pH 8.0)，用SephadexG-50柱(1x20cm)层析除去未被囊括的ANTS和DPX，只收集脂质体溶液。用Vaskovsky′s方法(参见Vaskovsky，V.E.，Kostetsky，E.Y.andVasendin，I.M.，色谱学杂志，114129(1975))测定出脂质体中磷脂的浓度。
在测定pH-敏感性的试验中，把通过柱体的脂质体溶液的荧光强度定义为“0％渗漏度”把经Triton X-100破坏后脂质体溶液的渗漏度定义为“100％渗漏度”。向2ml pH值各不相同(7.5、6.9、6.4、5.9、5.4、4.9和4.5)的缓冲溶液中加入浓缩后的脂质体(30μM)，于37℃静置30分钟。然后，通过测量荧光，测定出pH-敏感性。在此实验中，用分光荧光计(FP-777，JASCO，Japan)在360nm激发波长和545nm发射波长处测量荧光。
结果表明，与作为对照的常规pH-敏感性脂质体相比(～80％)，含有本发明所述肽的脂质体表现出脂质体内容物渗漏度较低(～20％)。实施例5用含肽的pH-敏感性脂质体诱导细胞免疫为了研究作为肽的载体的pH-敏感性脂质体是否能激发特异性地针对作为肽来源的病毒的CTL应答，制备囊括有合成肽的pH-敏感性脂质体，以系列方式进行细胞毒性研究。由于能够结合HLA-A2这样一种人MHC Ⅰ类分子的肽的细胞免疫应该使用人源抗体来研究，所以使用来自HIV和HCV蛋白并能结合小鼠MHC Ⅰ类分子的肽(参见下列表4)进行间接试验。在这一点上，使用由POPE/CHOH(摩尔比为7∶3)组成的磷脂组合物所制备出的含有所述肽的pH-敏感性脂质体。然后，用脂质体免疫小鼠，从小鼠体内分离出T淋巴细胞，测定识别Cr51标记的靶细胞后T淋巴细胞的细胞毒性。
表4来自HIV和HCV蛋白的可被中和抗体和小鼠CTL识别的肽的氨基酸序列*
*氨基酸序列根据IUPAC-IBU分子系统缩写。
1HIV gp120中第315-329位的氨基酸序列2HIV gp120中第304-329位的氨基酸序列3HCV核心蛋白中第131～138位的氨基酸序列就HIV而言，用含有R15K或T26K的pH-敏感性脂质体免疫Balb/C小鼠，加强免疫后第4周，切割出小鼠的脾，用匀浆器将其匀化到2ml RPMI细胞培养基中。取2ml上述匀浆加入到2ml菲可(ficoll)中，1，500rpm离心30分钟。分离出位于菲可和细胞培养基之间的T淋巴细胞，加入到15ml RPMI-10培养基中，以1000rpm离心，并用RPMI-10培养基洗涤3次。将上述T淋巴细胞按5x106/ml的浓度稀释到24孔-培养板中，加入免疫过的肽抗原至终浓度为2μM。然后在CO2温箱中37℃温育，其中CO2浓度恒定在5％。培养3天后，用作效应器细胞。就HCV而言，用含有D8L肽抗原的脂质体免疫5周龄的C57BL/6小鼠，然后用上述方法分离T淋巴细胞，用作效应器细胞。另一方面，用具有与Balb/C小鼠相同MHC Ⅰ类分子的p815细胞(ATCC TIB64)作为HIV的靶细胞，用具有与C57BL/6小鼠相同MHC Ⅰ类分子的RMA细胞(参见Hosken，NA.and Bevan，M.J.，J.Exp.Med.，175719(1992))或EL4细胞(ATCC TIB39)作为HCV的靶细胞。
向每种靶细胞中加入100μM免疫肽，37℃反应16小时，用RPMI细胞培养基洗涤2遍。然后向细胞中加入放射性标记的铬酸钠(Cr51)，在CO2温箱中于37℃反应2小时，反应后，用RPMI细胞培养液将细胞充分洗涤，并按下表5所示的各种混合比例与用磷酸盐缓冲液洗涤过的效应器细胞混合，然后再在CO2温箱中于37℃反应4小时。收集反应后的培养基，测量γ射线强度，从而测定出效应器细胞针对靶细胞的细胞毒性(参见表5)。
从表5中可以看出，从用R15K、T26K和D8L肽抗原免疫后的小鼠脾中分离到的效应器细胞能够识别和杀死靶细胞。而且，还发现采用pH-敏感性脂质体，用使用了能激发CTL应答的肽抗原免疫小鼠时，能够诱导出可产生特异于病毒的CTL的细胞免疫。
表5针对靶细胞的肽-特异性CTL的细胞毒性
*靶细胞与效应器细胞之比使用含来自HIV和HCV蛋白的肽的pH-敏感性脂质体诱导细胞免疫，从这种间接试验中可以清楚地看出含有来自HBV X蛋白的肽抗原的脂质体能够诱导细胞免疫，而细胞免疫又诱导人CTL应答，这是由于来自HBV X蛋白的肽抗原能诱导人体内CTL应答(见实施例3)，而且含有这种肽的pH-敏感性脂质体也能激发针对作为肽来源的病毒的CTL应答。实施例6用HBx特异性T细胞根除人肝细胞癌又来自HBV X蛋白(即，HBx肽)的肽抗原激发的CTL是如何根除肿瘤的，下面就此进行了研究以1x107～2x107不同的细胞数量将人肝癌细胞皮下接种以Balb/C为基础的裸鼠，在该裸鼠上进行致瘤性试验。3天后可检测到肿瘤，5天后，按1.5x108细胞数目，将用HBx肽激发的CTL过继转移到以有肿瘤建成的小鼠的尾静脉中(参见图3(A))。结果发现处理2天后肿瘤开始减小，处理后第4天肿瘤完全消失(参见图3(B))。图3(A)和3(B)中，(-●-)和(-▲-)分别代表用2x107和1x106个肿瘤细胞接种，T.P.代表CTL处理的时间点。
上述内容清楚地表明，本发明提供了pH-敏感性脂质体，其中含有对应于来自HBV X蛋白中抗原表位的肽类群，这些肽能诱导产生针对上述病毒的CTL或对上述病毒产生免疫耐受，从而诱导产生针对HBV的细胞免疫。由于X3、X4、X5、X6和X7等来自X蛋白的肽抗原能够激活可识别人体内出现的HBV抗原的CTL，而且也能被CTL识别，所以含有来自HBV X蛋白肽抗原的pH-敏感性脂质体可以用于开发上述能用来预防和治疗HBV-相关疾病的治疗性制剂。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人(A)姓名牧岩生命工学研究所等(B)街道驹城面宝宁里341番地(C)城市京畿道龙仁市(D)州不适用(E)国家韩国(F)邮政编码(ZIP)449-910(G)电话号码02～741-0611(H)传真0331-281-6622(ⅱ)发明名称含有来自乙肝病毒X蛋白的肽抗原的脂质体(ⅲ)序列数目10(ⅳ)电脑可读形式(A)介质类型软盘(B)电脑IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Patentln Release#1.0.Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链形无关
(D)拓扑学无关(ⅱ)分子类型肽(ⅵ)最初来源(A)微生物乙肝病毒(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1His Leu Ser Leu Ary Gly Leu Phe Val15(2)SEQ ID NO2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链形无关(D)拓扑学无关(ⅱ)分子类型肽(ⅵ)最初来源(A)微生物乙肝病毒(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2Val Leu His Lys Ary Thr Leu Gly Leu15(2)SEQ ID NO3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链形无关(D)拓扑学无关(ⅰ)分子类型肽(ⅵ)最初来源(A)微生物乙肝病毒(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala15(2)SEQ ID NO4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链形无关(D)拓扑学无关(ⅱ)分子类型肽(ⅵ)最初来源(A)微生物乙肝病毒(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4Cys Leu Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu1 5(2)SEQ ID NO5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链形无关(D)拓扑学无关(ⅱ)分子类型肽(ⅵ)最初来源(A)微生物乙肝病毒(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5Glu Ile Arg Leu Lys Val Phe Val Leu15(2)SEQ ID NO6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链形无关(D)拓扑学无关(ⅱ)分子类型肽(ⅵ)最初来源
(A)微生物乙肝病毒(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6Val Leu Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala15(2)SEQ ID NO7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸～(C)链形无关(D)拓扑学无关(ⅱ)分子类型肽(ⅵ)最初来源(A)微生物乙肝病毒(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7Thr Leu Pro Ser Pro Ser Ser Ser Ala15(2)SEQ ID NO8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链形无关(D)拓扑学无关(ⅱ)分子类型肽(ⅵ)最初来源(A)微生物HIV(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO8Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile1 5 10Gly Lys15(2)SEQ ID NO9的信息(ⅰ)序列特征(A)长度26个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链形无关(D)拓扑学无关(ⅱ)分子类型肽(ⅵ)最初来源(A)微生物HIV(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO9Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Arg Ile Arg Ile1 5 10Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys15 20 25(2)SEQ ID NO10的信息(ⅰ)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链形无关(D)拓扑学无关(ⅱ)分子类型肽(ⅵ)最初来源(A)微生物HCV(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO10Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu1权利要求
1．一种来自乙肝病毒X蛋白的肽，这种肽被细胞毒性T淋巴细胞所识别而表现出针对乙肝病毒的细胞毒性，所述肽的氨基酸序列为(SEQ ID NO1)H L S L R G L F V
2．一种来自乙肝病毒X蛋白的肽，这种肽被细胞毒性T淋巴细胞所识别而表现出针对乙肝病毒的细胞毒性，所述肽的氨基酸序列为(SEQ ID NO2)V L H K R T L G L
3．一种来自乙肝病毒X蛋白的肽，这种肽被细胞毒性T淋巴细胞所识别而表现出针对乙肝病毒的细胞毒性，所述肽的氨基酸序列为(SEQ ID NO3)A M S T T D L E A
4．一种来自乙肝病毒X蛋白的肽，这种肽被细胞毒性T淋巴细胞所识别而表现出针对乙肝病毒的细胞毒性，所述肽的氨基酸序列为(SEQ ID NO4)C L F K D W E E L
5．一种来自乙肝病毒X蛋白的肽，这种肽被细胞毒性T淋巴细胞所识别而表现出针对乙肝病毒的细胞毒性，所述肽的氨基酸序列为(SEQ ID NO5)E I R L K V F V L
6．一种含有肽抗原的pH-敏感性脂质体，所述脂质体通过按5∶1～25∶1的摩尔比将磷脂和一种或多种肽混合制备而成，所述肽来自乙肝病毒X蛋白并且可被细胞毒性T淋巴细胞所识别而表现出针对乙肝病霉的细胞霉性。
7．权利要求6的pH-敏感性脂质体，其中所述肽抗原选自HLSLRGLFV，VLHKRTLGL，AMSTTDLEA，CLFKDWEEL和EIRLKVFVL。
8．权利要求6的pH-敏感性脂质体，其中所述磷脂含有50％或更多的磷脂酰乙醇胺-β-油酰基-γ-棕榈酰。
9．权利要求6的pH-敏感性脂质体，其中所述磷脂是通过以6∶4～8∶2的摩尔比将磷脂酰乙醇胺-β-油酰基-γ-棕榈酰和胆甾醇半琥珀酸酯混合而制备的。
10．权利要求9的pH-敏感性脂质体，其中所述磷脂通过进一步包括上限为1摩尔％的单磷酰脂质A制备而成。
11．权利要求6的pH-敏感性脂质体，其中所述磷脂是通过以3∶3∶4～4∶4∶2的摩尔比将磷脂酰乙醇胺-β-油酰基-γ-棕榈酰、磷脂酰乙醇胺和胆甾醇半琥珀酸酯混合而制备的。
12．权利要求11的pH-敏感性脂质体，其中所述磷脂通过进一步包括上限为1摩尔％的单磷酰脂质A制备而成。
全文摘要
本发明涉及其中含有新型肽抗原的脂质体,这些肽抗原在调节人体针对乙肝病毒(HBV)的免疫反应中发挥作用,更具体地说,本发明涉及对应于来自HBVX蛋白中抗原表位的肽类群,这些肽能诱导产生针对上述病毒的细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)或免疫耐受:本发明还涉及含有所述肽类群的pH－敏感性脂质体,所述肽类群能够激发细胞免疫从而产生特异于上述病毒的CTL。由于X3、X4、X5、X6和X7等来自X蛋白的肽抗原能够激活可识别人体内出现的HBV抗原的CTL,而且也能被CTL识别,所以上述脂质体可以用于开发能用来预防和治疗HBV－相关疾病的治疗性制剂。
文档编号C07K14/02GK1286696SQ98813201
公开日2001年3月7日 申请日期1998年1月19日 优先权日1998年1月19日
发明者金泰演, 李起永, 张珍洙, 赵诚惟, 黄琉炅, 崔明俊, 郑弘锡 申请人:牧岩生命工学研究所