专利名称：多孔性生物可分解高分子的交联方法
技术领域：
本发明涉及一种多孔性生物可分解高分子的制备方法，且特别涉及一种多孔性生物可分解高分子的新交联方法。
一般天然可分解高分子制备成多孔性基材的方法多以冷冻干燥法(freeze drying)制备，少数是以临界点干燥法(critical point drying)或自然干燥法(air drying)制备。当多孔性生物可分解高分子制备出来必须再进行化学交联，经过化学交联处理过才可增加高分子的机械性能及增加高分子的抗酶分解能力，否则，制备出的多孔性高分子短时间内就会被分解，无法达到应有的效果。
专利文献报导，对于具蛋白质结构而含有多量氢键的生物高分子进行交联反应一般有物理及化学方法两种方式。其中物理方法有加热脱水[参考Wang M-C等人，1994]及照射UV[参考Weadock K.S.等人，1995]光或γ-射线等方式，其结果常有交联程度不高且不均匀的象现，因此在应用上相当的受限。至于化学方法又可分为液相及气相两种方式[参考Yannas等人，1980]。
1.溶液相交联方式将多孔性高分子浸泡于含有化学交联剂的溶液中，经过化学反应后，利用其它溶液清洗，将残留的未反应的交联剂清洗掉，再利用冷冻干燥的方式，制备出多孔性基材。
2.气相交联方式将多孔性高分子放置于含化学交联剂溶液的上方，将含化学交联剂的溶液加热，使多孔性高分子在充满化学交联剂的蒸气压中进行化学反应，当化学反应进行完毕，利用空气气体来清洗多孔性高分子，使未反应的化学交联剂清洗干净。
溶液相与蒸气相交联这两种方式是最常应用的交联方式，但是都有其缺陷。溶液相交联的缺陷为，需经过再一次的冷冻干燥，耗时且步骤繁杂，而且破坏了原先基材的孔洞结构和型态。气相交联的缺陷为，常会造成交联程度的不均匀，有的地方过度交联，有的地方交联程度不够，而且，常常会存在交联剂的残留问题，难以去除。例如商业上常用戊二醛作气相交联，然而戊二醛易有残留且残留剂易引发局部组织钙化反应和引起细胞毒性反应等[参考Trowbridge E.A.等人，1988与Speer，D.P.等人，1980]。
综合以上方法可知，利用传统方式完成交联反应，存在不是交联程度不够，就是有化学品残留、操作时间过长久及步骤烦杂等问题。因此本专利提出以超临界流体(例如scCO2)技术来进行开放式多孔性生物可分解高分子的交联反应，以解决上述问题。
可引入本发明作为参考文件的现有技术如下1.美国专利号5,629,353，其利用芳香族单体与苯乙烯混合，并加入交联剂(cross-linking agent)进行聚合反应。交联剂为多官能基的酰基卤(acyl halides)与卤化苯甲酸(benzylic halids)。将共聚合物胶体(copolymer gel)浸置于溶剂内，把未反应的单体和交联剂去除，再利用二氧化碳超临界流体与溶剂置换出来，加热至临界干燥温度(critical point temperature)即可出现开放式的细孔(opencellednanopore)；2.美国专利号5,710,187，其将多种的芳香族单体和巨单体(包括2，6-二甲基亚苯基氧化物、苯乙烯、甲基苯基硅氧烷)混合，并加入催化剂与交联剂进行聚合反应。将共聚合物胶体浸置于溶剂内，把未反应的单体和交联剂去除，再利用二氧化碳超临界流体与溶剂置换出来，加热至临界干燥温度即可出现开放式的细孔。此种交联过的小孔洞聚合物可应用于分离薄膜(separation membrane)；3.美国专利号4,873,218，其利用不同比例的聚羟基苯(polyhydroxybenzene)和甲醛(formaldehyde)加入催化剂，催化剂为碳酸钠。化合物混合后成为气凝胶(aerogel)，加热至高温即可成为低密度多孔性胶体；4.美国专利号4,997,804，其将间苯二酚-甲醛气凝胶加入碳酸钠混合后成为气凝胶，加热至高温即可成为低密度多孔性胶体，密度范围为30～100mg/cc。
5.文献报导对于具蛋白质结构而含有多量氢键的生物高分子进行交联反应有物理及化学方法两种方式。其中物理方法有加热脱水[参考WangM-C等人，Biomaterials，15，507，1994.]及照射UV光[参考Weadock K.S.等人，J.Biomed.Mater.Res.，29，1373，1995.]或γ-射线等方式，其结果常有交联程度不高且不均匀的象现，因此在应用上相当的受限；6.文献报导有利用超临界二氧化碳流体(scCO2)来干燥多孔性胶原蛋白基材，主要是比较不同的干燥步骤，有冷冻干燥法、临界点干燥法、自然干燥法，来制作出多孔性胶原蛋白基材，并利用液相及气相两种化学交联方法交联多孔性胶原蛋白基材。[参考Dagalakis N.等人，Mater.Res.，14，511，1980.]；7.在1988年Trowbridge以浸泡过戊二醛溶液的动物心包膜[Trowbridge E.A.等人，Cardiovasc.Surg.，95，577-585，1988.]，来取代病人的心脏瓣膜，他们发现经戊二醛交联处理过的生物组织会产生过硬和钙化的现象。而当戊二醛溶液的浓度高于3至25ppm时，会对细胞产生毒性的影响，因此以戊二醛交联处理的生物组织在植入人体后，可能会对人体细胞产生毒性；8.West与Mangan曾分别在1970年[West，J.and Mangan，J.L.，Nattre，228，466-468，1970.]，以脂肪酶(lipase)和胰蛋白酶(trypsin)来分解经戊二醛(glutaraldehyde)交联处理过的叶绿蛋白(chloroplast)，他们发现通过这些酶分解交联处理后叶绿蛋白的能力都明显地降低了。
为达上述目的，本发明的特征是采用超临界流体携带交联剂进行交联反应，并利用超临界流体来有效移除未反应的交联剂。易言的，本发明的方法包括下列主要步骤(a)将一多孔性生物可分解高分子置于一装置；以及(b)将一含有交联剂的超临界流体通入该装置，以进行多孔性生物可分解高分子的交联反应。此外，在步骤(b)之后可视需要进一步包括(c)将一纯的超临界流体通入该装置，以清洗上述已交联的高分子。其中步骤(b)的超临界流体进一步包括一共溶剂。
本发明涉及一种多孔性生物可分解高分子的交联方法，其包括下列步骤(a)将一多孔性生物可分解高分子置于一装置；(b)将一含有交联剂的超临界二氧化碳通入该装置，以进行该多孔性生物可分解高分子的交联反应；以及(c)将一纯的超临界二氧化碳通入该装置，以清洗该已交联的高分子，直到该交联剂实质上从该高分子中移除为止。
本发明所述的方法可有效地解决传统交联方法中交联程度不够、操作时间长久、化学品残留及二次清洗步骤繁杂并可能造成孔洞外型改变甚至缩小等问题。且此生物可分解性多孔性高分子的交联程度、泡孔型态亦可借操作条件而做多样化改变，达到可控制其分解速度以做为不同的应用。
超临界流体为超过临界点的气体或液体。在临界点下，气体与液体具有相同的物理性质(特别是密度)，且对一特定流体而言，其临界点的温度与压力为一定值。在本发明的方法中可使用各种各样的超临界流体，例如二氧化碳、氨气(NH3)、惰性气体(如Ar)、冷媒以及低碳烷类(如丙烷)及其混合物，但其中超临界二氧化碳较佳。
本发明的方法特别适用于可分解性高分子的交联，例如亲水性生物高分子的蛋白质类如胶原蛋白、明胶及其它动物性、植物性蛋白，多醣类如透明质酸、几丁质、几丁聚醣及其它多醣体，合成类可分解的高分子，如PVA(聚乙烯醇)、PLGA(聚羟基乙酸-共-乳酸)、PLA(聚乳酸)、PGA(聚羟基乙酸)、PCL(聚己酸内酯)及其它可分解高分子，以及上述高分子的混合物或共聚物等。此外，本发明的方法亦可用于一般高分子的交联。
多孔性生物可分解高分子的孔洞型式并无特别限制，可为流道型、开孔型的开放式连通孔洞，或封闭型密闭式孔洞，或同时具有开放式一封闭式孔洞，其孔洞范围可介于500μm～0.01μm的间；其孔隙度可介于0.99～0.05的间。
目前被用来交联生物组织的交联剂包括有醛类，如甲醛、戊二醛[Nimni，M.E.，Cheung，D.，Strates，B.，Kodama，M.，Sheikh，K.，“Bioprosthesis derived from cross-linked and chemically modifiedcollagenous tissue，”in Collagen Vol.III，Florida，M.E.Nimni(ed.)，CRC Press，Boca Raton，1-38，1988]、双醛淀粉(dialdehydestarch)[Rosenberg，D.，“Dialdehyde starch tanned bovineheterograftsDeveloment，”New York，in Vascular Grafts，P.N.Sawyer and M.J.Kaplitt(eds.)，Appleton-Century-Crofts，261-270，1978]及环氧化物[参考Tu，R.，et al，1993]等。而戊二醛是目前临床上使用最多的生物组织交联剂。
应注意的是，由于本发明是利用超临界流体来携带交联剂，而非利用交联剂的蒸气来进行交联反应，因此本发明所使用的交联剂不会受到蒸气压太低的限制，可广泛使用各种型式的交联剂。除了上述所提及的交联剂的外，其它如碳化二亚胺(carbodiimide)、异氰酸酯(isocyanates)、金属交联剂、离子交联剂、有机杂环化合物(如genipin，其为栀子素，由栀子花的果实提炼出来的一种天然物)及丙烯酸系衍生物及其混合物等，均可适用于本发明。
此外，为了促进交联剂在超临界流体的溶解度，在进入交联剂桶7的前，可装置另一含共溶剂桶(共溶剂定义包含两种或两种以上成分的混合液体)，所述共溶剂例如水相溶液、醇类溶液等。
根据本发明的特征的一，可简单地借由操作时间、交联剂浓度、压力、温度及流量的变化来控制多孔性生物可分解高分子材料的交联程度，其中交联剂的浓度可为任意浓度，需视个别交联剂种类而定，但一般以可达交联效果的最低浓度剂量为佳；压力范围为大于一大气压，需视个别交联剂种类而定；温度范围为室温至150℃，较佳在20℃～50℃之间；超临界流体的流量范围为0.1～10L/min；反应时间至少大于1分钟，通常在30分～8小时的间。
根据本发明的另一特征，在交联反应完成的后，可利用超临界流体来清洗已交联的多孔性可分解高分子，以移除未反应的交联剂。此处用来清洗用的超临界流体可与先前使用的超临界流体相同或不同，其可选自二氧化碳、氮气、惰性气体、冷媒、低碳烷类及其混合物。清洗的操作时间可持续到将交联剂实质上从高分子中完全移除为止。如此可以避免交联剂的残留造成毒性或其它问题。
根据上述方法所得的多孔性高分子可应用于药物释放、细胞生长的模板、伤口敷料、组织填补材料、可分解的日常用具即可分解的发泡体等可在生物体内或体外分解应用。
综上所述，本发明是利用超临界流体技术，进行多孔性生物可分解高分子的交联反应，以克服多孔性结构遭破坏、交联程度不均匀、化学品残留及操作时间过长等缺陷。此外本制程可简单地借由操作时间、交联剂浓度、压力、温度及流量的变化来控制多孔性生物可分解高分子材料的交联程度，并且借超临界流体冲洗出残留的交联剂而且操作简单又快速，基于这些优点使本制程更具创新的进步性以及具有实际上可进行商业化生产的效益。
首先，将一多孔性可分解高分子置于高压容器8中，设定操作温度并开启CO2泵使CO2压力及流量达设定点。接着，转动三向阀6-1，6-2使CO2流经交联剂桶7中，约1～2小时后转动三向阀6-3，6-4使含共溶剂及交联剂的CO2进入多孔性可分解高分子中至某一固定时间。当实验完成时，转动三向阀6-1，6-2，利用纯的高压CO2来清洗已交联的多孔性可分解高分子，以移除未反应的交联剂，当清洗完成后，卸除压力，从高压容器中取出多孔性生物可分解高分子，即可完成。
实施例1多孔性生物高分子的制备将去离子水加入明胶中配成1wt％溶液，搅拌完全后置放冷冻干燥机(VIS，USA)中。将温度及真空度分别设为-80℃及100毫托进行24小时冷冻抽真空干燥，使溶剂在固态下移除，以制得开放式多孔性生物高分子材料。由此操作条件所得到的多孔性材料其孔隙度＞99％。产物的孔隙度由以下方程式决定P＝[1-(D1/D2)]×100其中D1为发泡体密度，D2为真实密度，密度由密度计(Electricdencimeter，MP-200S)所测得。此多孔性材料的孔洞形式，由扫描式电子显微镜(SEM)的图形可知，其孔洞大小介于50至200μm的间，为一开放式多孔性结构(如图3所示)。
实施例2多孔性生物高分子的交联反应由实施例1所得的多孔性生物高分子进行实验，首先将多孔性生物高分子置于高压容器中，设定CO2流体经交联剂(戊二醛)槽的压力、温度及流量分别为1000psi、30℃及1L/min(系统外)以进行1小时的交联反应。待反应结束后将CO2压力调整至3000psi来清洗已交联的多孔性生物高分子1小时(Exp1)，以移除未反应的交联剂戊二醛。
实施例3多孔性生物高分子的交联反应由实施例1所得的多孔性生物高分子进行实验，首先将多孔性生物高分子置于高压容器中，设定CO2流体经交联剂(戊二醛)槽的压力、温度及流量分别为1000psi、30℃及1L/min(系统外)以进行1小时的交联反应。待反应结束后将CO2压力调整至3000psi来清洗已交联的多孔性生物高分子3小时(Exp2)，以移除未反应的交联剂戊二醛。
将未经交联处理的实施例1所得的多孔性明胶高分子置于磷酸盐缓冲溶液(Phosphate Buffer Solution；PBS)，会立即使孔洞塌陷并溶解。但经此交联反应所得的多孔性明胶，则可在相同溶剂中保持有其原孔洞型态一段时间而不会塌陷(如图4、图5、图6所示)，足以显示交联效果相当好而且均匀度较佳。
膨润测试(Swelling Test)实验步骤1.将不同条件样品裁成等面积(约1×1.3cm)，分别置于6-井浅盘(6-well dish)中，每个条件重复作3次；2.事先测量所有样品的长和宽，并将其置放于30℃烘箱中，烘干3小时以上；3.取出样品后马上量测其重量，并记录；4.将样品浸入等量的磷酸盐缓冲溶液中，约8ml；5. 1小时、6小时、24小时的后取出，用滤纸轻轻吸干，秤重并测量其面积；6.将测量后的样品置于30℃烘箱中烘干过夜(over night)；7.烘干的样品取出后，随即测量其重量，并记录；8.计算公式膨润率(swelling ratio)％＝(Ww-Wd)/Wd×100％其中Ww样品的湿重；Wd样品的干重实验结果如图7所示，未经交联处理的多孔性明胶基材，经过PBS的浸泡，一分钟内就溶解，因此没有实验数据，经由戊二醛交联过的Exp1可膨润约13倍，Exp2可膨润约11倍，并且无解离分散现象，其显示确有交联成效。
孔性明胶基材分解实验(Degradation Test)实验步骤1.将不同条件样品裁成等面积(约1×1.3cm)，分别置于6-井浅盘中，每个条件重复作3次；2.事先测量所有样品的长和宽，并将其置放于30℃烘箱中，烘干3小时以上；3.取出样品后马上测量其重量，并记录；4.将样品浸入等量的PBS中，约8ml；5. 1小时、6小时、24小时的后取出，样品置于30℃烘箱中烘干过夜；6.烘干的样品取出后，随即测量其重量，并记录；7.计算公式保留重量比(retention weight)％＝100-[(Wd1-Wd2)/Wd1×100％]其中Wd1样品的干重；Wd2浸泡溶液后样品的干重实验结果如图8所示，未经交联处理的多孔性明胶基材，经过PBS的浸泡，一分钟内就溶解，所以没有实验数据，浸泡在PBS中，六小时后Exp1与Exp2仍可保留98％的重量，24小时后Exp1与Exp2仍可保留90％的重量。可由实验结果中明显的发现，经过交联剂交联过的明胶基材浸泡24小时还可以保留90％的重量。
细胞毒性测试目前细胞培养试验程序主要有三种方法较常被使用即直接接触(Direct Contact)，琼脂扩散(Agar Diffusion)提取法(Extraction)。本发明的细胞毒性测试采取的是ASTM F-895″Standard Test Method forAgar Diffusion Cell Culture for Cytotoxicity″操作规范。此试验方法适用于许多种形状的材料及非必须灭菌的材料，亦适用于材料数量有限的情况，例如，小的组件或粉末可以置于琼脂的上而妨碍细胞成长的情形亦可被检视，而琼脂层可作用为缓冲层以保护细胞免受试样的重压，然而由于某些材料相当重而会重压琼脂而妨碍扩散作用或造成细胞机械性伤害，对于这类材料本试验方法并不适用。当提取物无法经由琼脂或凝胶(Agarose)扩散时本试验法亦不适用。
实验结果利用中性红染剂染活细胞，由照片可见活细胞为红色，并且呈纺缍型伸展。
反应指数＝区域指数/溶解指数(Response index＝Zone index/Lysis index)判别区域描述(Zone Description)如表1，判别溶解描述(LysisDescription)如表2，实验结果如表3及图9。可明显地发现Exp2的毒性较低，证明超临界二氧化碳流体可将未反应的交联剂携带走。
表1区域描述区域指数 区域描述0于试样附近或试样的下没有可检测出的区域1区域限制于试样下的面积2区域超过试样但小于0.5公分3区域超过试样0.5～1.0公分4区域超过试样1.0公分以上但并未发生于整个盘内5区域发生于整个盘内表2溶解描述溶解指数区域描述0没有可观测到的细胞毒性1小于20％区域受到影响220％～39％区域受到影响320％～59％区域受到影响420％～80％区域受到影响5大于80％区域受到影响表3细胞毒性实验结果样品 反应指数负控制组(胶乳橡胶) 4/4正控制组(聚四氟乙烯)0/0明胶0/0Exp12/3Exp21D/2虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限制本发明，任何本领域普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些允许的更动与润饰。
权利要求
1.一种多孔性生物可分解高分子的交联方法，其包括下列步骤(a)将一多孔性生物可分解高分子置于一装置；以及(b)将一含有交联剂的超临界流体通入该装置，以进行该多孔性生物可分解高分子的交联反应。
2.如权利要求1所述的方法，其中该多孔性生物可分解高分子选自蛋白质类、多醣类、合成类及其混合物或共聚物。
3.如权利要求1所述的方法，其中该多孔性生物可分解高分子具有开放式孔洞、封闭式孔洞或是同时具有开放式-封闭式孔洞。
4.如权利要求1所述的方法，其中该超临界流体选自二氧化碳、氮气、惰性气体、冷媒、低碳烷类及其混合物。
5.如权利要求1所述的方法，其中该交联剂选自醛类、环氧化物、碳化二亚胺、异氰酸酯、金属交联剂、离子交联剂、有机杂环化合物、丙烯酸系衍生物及其混合物。
6.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)的超临界流体进一步包括一共溶剂。
7.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)之后进一步包括(c)将一纯的超临界流体通入该装置，以清洗该已交联的高分子。
8.如权利要求7所述的方法，其中在步骤(c)的超临界流体与步骤(b)的超临界流体，可相同或不相同，其选自二氧化碳、氮气、惰性气体、冷媒、低碳烷类及其混合物。
9.如权利要求7所述的方法，其中在步骤(c)持续到该交联剂实质上从该高分子中移除为止。
10.一种多孔性生物可分解高分子的交联方法，其包括下列步骤(a)将一多孔性生物可分解高分子置于一装置；(b)将一含有交联剂的超临界二氧化碳通入该装置，以进行该多孔性生物可分解高分子的交联反应；以及(c)将一纯的超临界二氧化碳通入该装置，以清洗该已交联的高分子，直到该交联剂实质上从该高分子中移除为止。
11.如权利要求10所述的方法，其中该多孔性生物可分解高分子选自蛋白质类、多醣类、合成类及其混合物或共聚物。
12.如权利要求10所述的方法，其中该多孔性生物可分解高分子具有开放式孔洞、封闭式孔洞或是同时具有开放式-封闭式孔洞。
13.如权利要求10所述的方法，其中该交联剂选自醛类、环氧化物、碳化二亚胺、异氰酸酯、金属交联剂、离子交联剂、有机杂环化合物、丙烯酸系衍生物及其混合物。
14.如权利要求10所述的方法，其中步骤(b)的超临界流体进一步包括一共溶剂。
15.如权利要求10所述的方法，其中步骤(b)的超临界二氧化碳的流量范围为0.1～10L/min。
16.如权利要求10所述的方法，其中步骤(b)的操作时间大于1分钟。
17.如权利要求10所述的方法，其中步骤(b)的操作温度范围为室温至150℃。
18.如权利要求10所述的方法，其中步骤(b)的操作压力范围为大于一大气压。
全文摘要
本发明涉及一种多孔性生物可分解高分子的交联方法。该方法包括下列步骤(a)将一多孔性生物可分解高分子置于一装置；以及(b)将一含有交联剂的超临界流体通入该装置，以进行多孔性生物可分解高分子的交联反应。此外，在步骤(b)之后可视需要进一步包括(c)将一纯的超临界流体通入该装置，以清洗上述已交联的高分子，去除未反应的交联剂。本发明所述方法可有效地解决传统交联方法中交联程度不够、操作时间较长、化学品残留及二次清洗步骤繁杂并可能造成孔洞外型改变甚至缩小等问题。按本发明方法所制得的多孔性生物可分解高分子可应用于药物释放、细胞生长的模板、伤口敷料、组织填补材料、可分解的日常用具在生物体内或体外分解的应用。
文档编号C08L89/00GK1405212SQ01141768
公开日2003年3月26日 申请日期2001年9月18日 优先权日2001年9月18日
发明者赖惠敏, 李光荣, 蔡金津, 施希弦, 张原嘉 申请人:财团法人工业技术研究院