专利名称：非特异杂交抑制剂、临床检查试剂和临床检查方法
技术领域：
本发明涉及在临床检查等领域中，测定检体中测定对象的核酸关联物质时抑制非特异杂交的抑制剂，利用该抑制剂的临床检查试剂，以及临床检查方法。
背景技术：
在临床检查领域中，一直采用杂交法检测DNA、RNA等核酸关联物质。该方法包括使标记的检体与固定了DNA等的固相接触，该固定的DNA含有与测定对象的核酸关联物质互补的序列，然后洗去测定对象的核酸关联物质以外的物质，最后测定结合在固相上的标记物质的活性。
在临床检查的领域中，用杂交法对测定对象的核酸关联物质进行测定时，要求准确地识别核酸关联物质的序列。
众所周知以前用杂交法测定检体时，为了抑制非特异性杂交，添加十二烷基硫酸钠(缩写为SDS)、N-月桂酰肌氨酸(缩写为N-LS)等表面活性剂；牛血清白蛋白(缩写为BSA)、酪蛋白等蛋白质。但是，表面活性剂和蛋白质对非特异性杂交几乎没有抑制效果，因此不能准确地识别核酸关联物质的序列。
此外，Patrick等(Nature Biotechnology，17，365-370(1999))提出在DNA芯片表面施加电流，抑制DNA的SNPs(单核苷酸多态性)的方法。但该方法必须有专用的DNA芯片，不能适用于现有的所有DNA芯片。
另一方面，将含有磷酰基胆碱类似基团的聚合物用于临床检查领域的研究正在进行。已知含有磷酰基胆碱基团的聚合物由于其结构类似来源于生物体膜的磷脂，血液相容性、补体失活、生物体物质非吸附性等的生物体相容性优良，而且具有防污性、保湿性等优良的性质。因此，以开发有效利用这些功能的生物有关材料为目的的聚合物的合成及其用途的研究开发正在积极地进行。特开平7-5177号公报、特开平7-83923号公报、特开平10-114800号公报中，公开了利用含有磷酰胆碱基团的聚合物抑制容器对蛋白质的吸附，进行高精度临床检查的技术。
但是，尚不知道通过使用含有磷酰胆碱基团聚合物中特定的聚合物，可以准确地识别核酸关联物质的序列，亦即能够抑制非特异性杂交。
发明公开本发明的目的在于提供一种非特异性杂交抑制剂，能提高杂交时反应的准确性，抑制非特异性杂交。
本发明的另一目的在于提供一种临床检查试剂，能够抑制以临床检查为目的进行杂交时的非特异性杂交，效率高且以高精度检测出测定对象的核酸关联物质。
本发明的另一目的在于提供一种临床检查方法，能够抑制临床检查中的非特异性杂交，容易且以高精度检测出测定对象的核酸关联物质。
根据本发明，提供一种非特异性杂交抑制剂，包括具有非特异性杂交抑制功能的聚合物(H)，该聚合物在分子内具有羧基和砜基中的至少1种以及磷酰胆碱类似基团，重均分子量为1000-5000000。
根据本发明，还提供包含上述抑制剂和检查试剂的临床检查试剂。
此外，根据本发明还提供一种临床检查方法，包括以下步骤步骤(1)，在上述抑制剂的存在下，在规定的核酸关联物质与检查试剂进行杂交的规定条件下，使检体和与规定的核酸关联物质杂交的检查试剂接触；步骤(2)，检测步骤(1)中通过与检查试剂杂交生成的反应物。
发明的最佳实施方式本发明的抑制剂包括特定分子量的具有非特异性杂交抑制功能的聚合物(H)，该聚合物在分子内具有羧基和砜基中的至少1种和磷酰胆碱类似基团(缩写为PC基)。
对于聚合物(H)中羧基和砜基中的至少1种与PC基的含量比没有特别限定，只要是表现出非特异性杂交的抑制作用的比例即可；可以根据制备聚合物(H)时后面所述的各种单体的种类、其比例以及聚合物(H)的分子量等适当选择。
聚合物(H)只要含有上述必须的基团，且具有特定的分子量，具有抑制非特异性杂交的作用，也可以含有其它基团。作为其它基团的实例，例如磷酸、三甲铵内酯、伯胺、仲胺、叔胺、季铵、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、4-丁内酰胺(2-吡咯烷酮)、4-丁内酰亚胺(2-羟基-1-吡咯啉)、6-己内酰胺(ε-己内酰胺)、聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷的嵌段共聚物或无规共聚物等各种基团。另外，作为其它基团，还可例举由下述各种疏水性单体衍生而来的基团。
在聚合物(H)中，其它基团的比例可以在不影响本发明所要求的目的的范围内，或进一步提高本发明所要求的目的的范围内，适当选择决定。
聚合物(H)的分子量按重均分子量计，通常为1000-5000000，优选为10000-2000000。该分子量低于1000时，难以充分抑制非特异性杂交，分子量超过5000000时，由于粘度变得过高，恐怕会抑制杂交，因此不太优选。
聚合物(H)可以通过以下方法制备，例如，使含有PC基的单体(缩写为PC单体)以及含有砜基的单体(以下缩写为SA单体)和/或含有羧基的单体(以下缩写为CA单体)，或者根据需要与疏水性单体等其它单体，通过自由基聚合法等使其聚合而成。聚合时使用的单体并不限于一种，也可以使用2种以上。
作为PC单体，例如式(1)表示的单体等。
式(1)中，X表示2价的有机残基，Y表示碳原子数1-6的亚烷基氧，Z表示氢原子或R5O(C＝O)-。其中，R5表示碳原子数1-10的烷基或碳原子数1-10的羟烷基。R1表示氢原子或甲基，R2、R3和R4是相同或不同的基团，表示氢原子、碳原子数1-6的烷基或羟烷基。m为0或1，n为1-4的整数。
作为上述X，例如-C6H4-、-C6H10-、-(C＝O)O-、-O-、-CH2O-、-(C＝O)NH-、O(C＝O)-、-O(C＝O)O-、-C6H4O-、-C6H4CH2O-、-C6H4(C＝O)O-。作为上述Y，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基。上述Z的R5，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基或癸基等碳原子数1-10的烷基，或者羟甲基、2-羟乙基、3-羟丙基、2-羟丙基、4-羟丁基、2-羟丁基、5-羟戊基、2-羟戊基、6-羟己基、2-羟己基、7-羟庚基、2-羟庚基、8-羟辛基、2-羟辛基、9-羟壬基、2-羟壬基、10-羟癸基、2-羟癸基等碳原子数1-10的羟烷基。
作为PC单体，例如2-((甲基)丙烯酰氧基)乙基-2′-(三甲基铵)乙基磷酸酯、3-((甲基)丙烯酰氧基)丙基-2′-(三甲基铵)乙基磷酸酯、4-((甲基)丙烯酰氧基)丁基-2′-(三甲基铵)乙基磷酸酯、5-((甲基)丙烯酰氧基)戊基-2′-(三甲基铵)乙基磷酸酯、6-((甲基)丙烯酰氧基)己基-2′-(三甲基铵)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)乙基-2′-(三乙基铵)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)乙基-2′-(三丙基铵)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)乙基-2′-(三丁基铵)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)乙基-2′-(三环己基铵)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)乙基-2′-(三苯基铵)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)乙基-2′-(三甲醇铵)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)丙基-2′-(三甲基铵)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)丁基-2′-(三甲基铵)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)戊基-2′-(三甲基铵)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)己基-2′-(三甲基铵)乙基磷酸酯、2-(乙烯氧基)乙基-2′-(三甲基铵)乙基磷酸酯、2-(烯丙氧基)乙基-2′-(三甲基铵)乙基磷酸酯、2-(对乙烯基苯甲氧基)乙基-2′-(三甲基铵)乙基磷酸酯、2-(对乙酰基苯甲酰氧基)乙基-2′-(三甲基铵)乙基磷酸酯、2-(苯乙烯氧基)乙基-2′-(三甲基铵)乙基磷酸酯、2-(对乙烯基苯甲基)乙基-2′-(三甲基铵)乙基磷酸酯、2-(乙烯氧基羰基)乙基-2′-(三甲基铵)乙基磷酸酯、2-(烯丙氧基羰基)乙基-2′-(三甲基铵)乙基磷酸酯、2-(丙烯酰氨基)乙基-2′-(三甲基铵)乙基磷酸酯、2-(乙烯基羰基氨基)乙基-2′-(三甲基铵)乙基磷酸酯、乙基-(2′-三甲基铵乙基磷酰基乙基)富马酸酯、丁基-(2′-三甲基铵乙基磷酰基乙基)富马酸酯、羟乙基-(2′-三甲基铵乙基磷酰基乙基)富马酸酯、乙基-(2′-三甲基铵乙基磷酰基乙基)马来酸酯、丁基-(2′-三甲基铵乙基磷酰基乙基)马来酸酯、羟乙基-(2′-三甲基铵乙基磷酰基乙基)马来酸酯。
其中，优选2-((甲基)丙烯酰氧基)乙基-2′-(三甲基铵)乙基磷酸酯，特别是2-(甲基丙烯酰氧基)乙基-2′-(三甲基铵)乙基磷酸酯(即，2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酰胆碱)(缩写为MPC)，因其容易获得，而更为优选。此外，这里(甲基)丙烯酰基是指甲基丙烯酰基和/或丙烯酰基。
PC单体可以用公知的方法制备。例如，可以按照特开昭54-63025号公报中所述的使2-羟乙基甲基丙烯酸酯和2-溴乙基磷酰二氯化物在叔碱存在下反应，并使得到的化合物与叔胺反应的方法；以及特开昭58-154591号公报中所述的使含有羟基的聚合性单体与环状磷化合物反应后，用叔胺开环的公知方法进行制备。
作为SA单体，例如2-甲基丙烷磺酸酯、2-二甲基丙烷磺酸酯、苯乙烯磺酸酯、2-磺基乙基甲基丙烯酸酯。其中优选2-甲基丙烷磺酸酯、2-二甲基丙烷磺酸酯、苯乙烯磺酸酯。
作为CA单体，例如(甲基)丙烯酸、3-戊烯酸、4-戊烯酸、3-丙烯氧基丙酸、2-(甲基)丙烯酰氧基乙基苯二甲酸酯。优选甲基丙烯酸和丙烯酸。
作为疏水性单体，可以例举式(2)表示的单体。
式(2)中，R6表示氢原子或甲基，L1表示-C6H4-、-C6H10-、-(C＝O)O-、-O-、-(C＝O)NH-、-O(C＝O)-或-O(C＝O)O-，L2表示氢原子、-(CH2)g-L3或((CH2)p-O)h-L3。g和h表示1-24的整数，p表示3-5的整数， L3表示氢原子、甲基、-C6H5、-OC6H5。
作为疏水性单体，例如(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸2-乙基己酯、(甲基)丙烯酸十二烷基酯、(甲基)丙烯酸十八烷基酯等直链或支链烷基(甲基)丙烯酸酯；(甲基)丙烯酸环己酯等环状烷基(甲基)丙烯酸酯；(甲基)丙烯酸苯甲酯、(甲基)丙烯酸苯氧基乙酯等(甲基)丙烯酸芳环基酯；聚(甲基)丙烯酸丙二醇酯等聚(甲基)丙烯酸亚烷二醇酯；苯乙烯、甲基苯乙烯、氯甲基苯乙烯等苯乙烯类单体；甲基乙烯基醚、丁基乙烯基醚等乙烯基醚类单体；醋酸乙烯酯、丙酸乙烯酯等乙烯酯类单体。优选例举甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸十二烷基酯。
作为聚合物(H)，可以例举使含有PC单体通常为5-95mol％，优选10-90mol％，以及SA单体和CA单体中的至少一种通常为5-95mol％，优选10-90mol％的单体组合物聚合得到的聚合物；或者使含有PC单体通常为5-90mol％，优选10-85mol％，以及SA单体和CA单体中的至少一种通常为5-90mol％，优选10-85mol％，以及疏水性单体通常为5-60mol％，优选5-50mol％的单体组合物聚合得到的聚合物中，具有上述特定分子量的聚合物。
其中，SA单体和CA单体中的至少一种是指分别单独含有SA单体或CA单体的场合，或两者均含有的场合等所有方式。此外，上述各种单体组合物也可以含有除PC单体、SA单体、CA单体以及疏水性单体以外的其它单体。单体组合物中，其它单体的含量比例通常为10mol％以下，优选5mol％以下，有时也优选不含其他单体。
上述单体组合物中，如果PC单体以及SA单体和CA单体中至少一种均低于5mol％时，抑制非特异性杂交的效果不充分，所以不优选。该聚合物(H)可以采用常规的自由基共聚进行制备。
本发明的抑制剂只要含有该聚合物(H)即可。使用时，可以采用下述方法等，即，将聚合物(H)添加混合到杂交时的系统中，使聚合物(H)通常达到0.0001-20重量％，优选0.001-10重量％。聚合物(H)低于0.0001重量％时，恐怕不能充分发挥非特异性杂交抑制效果，超过20重量％时，由于系统的粘度过高，恐怕会阻碍杂交反应，因此不优选。
在不影响本发明的效果的范围内，本发明的抑制剂也可以含有表面活性剂、溶剂、防腐剂等其他成分。此外，本发明的抑制剂的形态可以为粉末状或溶液状，但在使用时优选溶液状态。
本发明的临床检查试剂是包含本发明抑制剂和检查试剂的检查试剂盒。该检查试剂只要是与作为测定对象的规定核酸关联物质杂交的核酸关联物质，并没有特别的限定，根据测定对象，例如可以使用公知临床检查试剂中所用的检查试剂。
核酸关联物质是指1个或2个以上分子的磷酸与碳水化物分子，例如戊糖或己糖结合，且该分子分别与例如由腺嘌呤等嘌呤衍生的碱基、或由胸腺嘧啶等嘧啶衍生的碱基结合的1个或2个以上的任意化合物群。特别是自然发生的核酸分子包括基因组DNA、基因组RNA以及各种不同类型的RNA，如mRNA、tRNA和rRNA，也包括cDNA，还包括合成的DNA或者自然发生的DNA与合成DNA的杂交体。
核酸关联物质可以是单链或双链，可以是线状或环状，例如可以是质粒，也可以是寡核苷酸或多核苷酸。另外，也包括碱基数约10个的碱基或碱基对至碱基数约2000个的碱基或碱基对(20kb)。除了这些自然发生的物质以外，还包括来源于ATCC或Gene Bank文库的物质以及合成组合物，即核酸类似物。合成核酸可以通过各种溶液或固相方法进行制备。一般优选固相合成，利用亚磷酸三酯、磷酸三酯和H-膦酸酯化学等合成核酸的方法已被广泛使用(Itakura USP4458066说明书、USP4500707说明书；Garuthers等，Genetic Engineering，41-17(1982)；Jones第2章，Atkinson等第3章以及Sproat等第4章Oligonucleotids SynthesisA Practical Approach，Gait(编)，IRL Press，Washington D.C.(1984))。
本发明的临床检查试剂中，本发明的抑制的比例可以根据临床检查方法及测定对象等适当选择，只要杂交时系统内抑制剂中聚合物(H)的比例通常为0.0001-20重量％，优选0.001-10重量％即可。
本发明的临床检查试剂也可以含有其检查试剂所必需的其他化合物，也可以包含通常用于临床检查试剂的各种添加剂、溶剂等。对该临床检查试剂的使用方法无特别的限制，例如可参照后述的本发明临床检查方法进行使用。
本发明的临床检查方法首先进行步骤(1)，即，在本发明抑制剂的存在下，在规定的核酸关联物质与检查试剂杂交的规定条件下，使检体和与规定的核酸关联物质杂交的检查试剂接触。
步骤(1)可以使用本发明的抑制剂或本发明的临床检查试剂进行。步骤(1)可以采用下述方法进行，例如，在包含检体和检查试剂的系统内添加本发明的抑制剂，并在规定条件下保持的方法；使包含检体和检查试剂的系统保持在规定条件下，向该系统内添加本发明抑制剂的方法；或者预先将本发明的抑制剂添加到检体和/或检查试剂中，然后使该检体与检查试剂在规定条件下接触的方法等。
步骤(1)可以采用例如将检查试剂固定在载体上时，或者将检查试剂固定在载体上后，添加本发明的抑制剂，并使之与检体杂交的方法进行。这时，本发明抑制剂的形态可以是溶液状态或粉末状态，但优选与反应系统迅速均化的溶液状态。
作为上述载体，例如硝酸纤维素、尼龙膜、PVDF膜等膜；聚苯乙烯、聚乙烯、玻璃、金属等制成的板或平板，但不限于此。作为在载体上固定的方法，例如静电结合的方法、利用离子性的方法、通过紫外线等与载体共价结合的方法、用交联试剂共价结合的方法。
除了上述采用载体的方法以外，步骤(1)也可以在溶液中进行。作为该方法，例如聚合酶链反应法(PCR法)、测序反应法、使用反转录酶的依赖于RNA的DNA合成反应法、采用基因工程中所用的DNA聚合酶的各种转录反应法。
步骤(1)中，规定核酸关联物质与检查试剂杂交的规定条件可以从例如作为测定对象的规定核酸关联物质为DNA时，Southern杂交的合适条件；作为测定对象的规定核酸关联物质为RNA时，Northern杂交的合适条件中适当选择。
在本发明的临床检查方法中进行步骤(2)，即，检测步骤(1)中与检查试剂杂交所生成的反应产物。
步骤(2)中，反应物的检测可以通过下述方法实施，例如，为了检测出反应物以公知的标记技术为基础进行标记，然后测定该标记的活性等。作为标记的方法，例如使用32P、14C、3H等放射性同位素的方法，使用荧光色素的方法，使用酶蛋白质的方法，使用抗各种抗原物质的抗体的方法。这些标记化合物的制备，可以例举以标记化合物作为底物通过DNA聚合酶得到的方法，或通过化学反应得到的方法等。另一方面，反应物的检测可以根据上述标记方法适当选择。例如，采用放射性同位素的方法时，可以通过闪烁计数仪或放射自显影进行检测；采用荧光色素的方法时，可以通过利用激光等的检测装置进行检测；采用酶蛋白质或各种抗原的方法时，可以通过化学发光、荧光检测、酶底物的发色等进行检测。
本发明的临床检查方法只要是至少包括上述步骤(1)和(2)的方法即可，可以利用公知的各种方法容易地实施。以下对利用Southern印迹杂交的具体例进行说明。该具体例中，对本发明的抑制剂不加以说明，但是，通过在上述各种添加时期，适宜地按上述优选的比例添加，即可实施本发明的临床检查方法。
可以例举下述方法首先，用ISOGEN(日本基因公司生产)由血液等生物体组织制备基因组DNA。然后将所得的DNA用0.7％琼脂糖凝胶电泳分离。电泳结束后，在室温下将凝胶浸入0.25N盐酸溶液中15分钟，然后再浸入0.4N的氢氧化钠溶液中，室温下轻轻震摇30分钟。在预先制好的印迹台上，顺序重叠上述制备的凝胶、Gene ScreenPlus膜(Dupont公司生产)、3MM滤纸(Whatman公司生产)、Kimtowels以及重物，放置过夜，使凝胶中的DNA转录至Gene ScreenPlus膜上。转录结束后，在室温下将Gene Screen Plus膜浸入0.5M Tris缓冲液中15分钟。在室温下干燥后，再在80℃下烘焙2小时。将所得的膜在2×SSC(0.3M氯化钠，0.03M柠檬酸钠)中震摇，然后浸入快速杂交缓冲液(Amersham Pharmacia Biotech生产)中，在65℃下震摇15分钟进行预杂交。将预先用[γ32P]-dCTP通过切口平移法制备的目的DNA探针溶液(32P标记)添加到杂交缓冲液中，65℃下杂交2小时。用0.1×SSC(0.015M氯化钠，0.0015M柠檬酸钠)在65℃下震摇15分钟。重复该操作2次，洗去不需要的探针。除去滤纸上多余的水分后，在-70℃下，使X光片在探针发出的放射线之下暴露24小时。然后将X光片显影，用光密度计对目的谱带进行定量(分子克隆实验室指南，第二版，Cold Spring Harbor laboratory Press(1989))。
实施例以下，通过实施例及比较例更详细地进行说明，但是本发明并不限于此。
合成例1将19.4g MPC和0.6g甲基丙烯酸(缩写为MA)溶解于40g水中，然后装入四颈烧瓶内，通入氮气30分钟后，在60℃下加入1.6g过氧化琥珀酸，进行8小时的聚合反应。在搅拌下，将聚合液滴加到3升的丙酮中，过滤析出的沉淀，室温下真空干燥48小时，得到14.6g聚合物粉末(缩写为聚合物(P1))。通过凝胶渗透色谱(GPC)分析聚合物(P1)的分子量。分析的条件如下以20mM磷酸缓冲液(pH7.4)作为洗脱液，以聚乙二醇作为标准物质，根据折射率进行检测。此外，用1H-NMR测定聚合物(P1)的组成比以及含有的基团。结果如表1所示。
合成例2～5除如表1所示替代合成例1中使用的单体种类及组成比例之外，与合成例1同样制备聚合物粉末。所得的聚合物粉末称为聚合物(P2)-(P5)。进行与合成例1同样的分析。结果如表1所示。
合成例6和7除如表1所示替代合成例1中使用的单体种类及组成比率，并用120g异丙醇代替40g水，用0.7g偶氮二异丁腈(缩写为AIBN)代替1.6g过氧化琥珀酸之外，与合成例1同样制备聚合物粉末。所得的聚合物粉末称为聚合物(P6)及(P7)。进行与合成例1同样的分析。结果如表1所示。另外，表1中BMA表示甲基丙烯酸丁酯。
合成例8～10除如表2所示替代合成例1中使用的单体种类及组成比率，并将过氧化琥珀酸的用量改为0.65g之外，与合成例1同样制备聚合物粉末。所得的聚合物粉末称为聚合物(P8)-(P10)。进行与合成例1同样的分析。结果如表2所示。另外，表2中MPs表示2-甲基丙磺酸。
合成例11～12除如表2所示替代合成例1中使用的单体种类及组成比率，并将水的用量改为120g、过氧化琥珀酸的用量改为0.23g之外，与合成例1同样制备聚合物粉末。所得的聚合物粉末称为聚合物(P11)-(P12)。进行与合成例1同样的分析。结果如表2所示。另外，表2中Am表示丙烯酰胺、Vp表示N-乙烯-2-吡咯烷酮、MANa表示甲基丙烯酸钠盐。
表1
表2
实施例1-1使用具有以下DNA序列，5′末端用氨基修饰的用于固定的寡聚DNA(缩写为PUC-NH2)；具有与该PUC-NH2互补序列，5′末端用生物素修饰的完全配对寡聚DNA(缩写为PUC)；5′末端用生物素修饰，包含该PUC的SNPs的错配寡聚DNA(缩写为PUC′或PUC″)。另外，PUC-NH2、PUC、PUC′和PUC″使用ESPEC OLIGO SERVICE(株)生产的产品。
PUC-NH25′-ACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGG-3′PUC5′-CCCAGTCACGACGTTGTAAA-3′
PUC′5′-CCCAGTCACCACGTTGTAAA-3′PUC″5′-CCCAGTCACGTCGTTGTAAA-3′将溶解于添加了1mM EDTA的50mM磷酸缓冲液(pH8.5)(缩写为E-NaPB)中的25pmol/ml PUC-NH2溶液，按100μl/孔添加到DNA结合96孔板中(Corning公司生产)，在4℃下温育过夜(PUC-NH2的固定化)。然后由各孔除去PUC-NH2溶液，用Dulceco’s PBS(缩写为D-PBS)洗涤三次。随后，按照200μl/孔添加已添加了3％BSA的E-NaPB溶液(缩写为B-E-NaPB)，37℃下温育1小时(封闭操作-1)。接着由各孔除去B-E-NaPB，制成固定有PUC-NH2的板。
将聚合物(P1)3.2wt％、PUC、PUC′或PUC″各0.2pmol/ml、以及含750mM NaCl的75mM柠檬酸钠溶液(缩写为5×SSC)，按100μl/孔添加到上述制备的固定有PUC-NH2的板内，55℃温育1小时，进行杂交。然后，由各孔除去各溶液，在55℃下用含300mM NaCl的30mM柠檬酸钠溶液(缩写为2×SSC)洗净两次。随后，按200μl/孔添加B-E-NaPB，37℃下温育30分钟(封闭操作-2)，然后由各孔除去B-E-NaPB。再按100μl/孔添加用B-E-NaPB稀释10000倍的抗生物素蛋白修饰的辣根过氧化物酶(SIGMA公司生产)(缩写为Avdin-HRP)，37℃下温育30分钟(抗生物素蛋白-生物素反应)。然后，用D-PBS洗净3次后，按100μl/孔添加HRP试剂盒的底物溶液，25℃下温育10分钟(POD-底物反应)。接着，按100μl/孔添加HRP试剂盒的反应终止液，用SPECTRAMAX250(微孔板读数器，MOLECULAR DEVICES公司生产)测定产生的450nm的吸光度。另外，HRP试剂盒使用过氧化物酶用发色试剂盒T(住友BAKELITE(株)生产)。
根据测定结果求出(PUC的吸光度)/(PUC′的吸光度)，以及(PUC的吸光度)/(PUC″的吸光度)。结果如表3所示。
实施例1-2～1-9和比较例1-1～1-2除用表3所示的各种聚合物代替聚合物(P1)以外，与实施例1-1同样进行各种测定。结果如表3所示。
比较例1-3除用含有PUC、PUC′及PUC″各0.2pmol/ml的5×SSC溶液代替含有聚合物(P1)3.2wt％、和PUC、PUC′及PUC″各0.2pmol/ml的5×SSC溶液以外，与实施例1-1同样进行测定。结果如表3所示。
比较例1-4除用含1.0％酪蛋白(SIGMA公司生产)和0.1％N-LS(和光纯药工业(株))的5×SSC溶液代替含有聚合物(P1)3.2wt％、和PUC、PUC′及PUC″各0.2pmol/ml的5×SSC溶液以外，与实施例1-1同样进行测定。结果如表3所示。
比较例1-5除用溶解了PUC、PUC′及PUC″各0.2pmol/ml、10mg/ml Ficol400(Amersham Pharmacia Biotech公司生产，商标)、10mg/ml聚乙烯吡咯烷酮、10mg/ml牛血清白蛋白和0.5％SDS的6×SSC溶液(Denhard′s溶液)代替含有聚合物(P1)3.2wt％、和PUC、PUC′及PUC″各0.2pmol/ml的5×SSC溶液以外，与实施例1-1同样进行测定。结果如表3所示。
表3
由表3可知，相对于比较例，实施例完全配对的吸光度(PUC的吸光度)/错配的吸光度(PUC′，PUC″的吸光度)的比高。亦即，通过使用实施例的抑制剂，并不抑制特异性杂交，但抑制非特异性杂交，从而更准确地进行杂交。
制造例1-1
将用5×SSC溶解的0.2mg/ml聚(赖氨酸-苯丙氨酸)按150μl/孔添加到96孔多孔板(Nunc公司生产，白色)中，室温下静置20分钟。用50mM缓冲液(pH8.3)洗净后，按200μl/孔添加用200mM磷酸缓冲液(pH8.0)溶解的650μM的2-亚氨基四氢噻吩盐酸盐，在室温下静置2小时后，用10mM磷酸缓冲液(pH7.0)洗净。
将5′末端修饰了氨基接头的固相化用寡核苷酸(Amersham PharciaBitech公司生产)(序列5′-CATTAGGGATCCAGCCGTGAATTCGTCACT-3′)溶于50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中，然后按寡核苷酸的5倍摩尔量添加溶解于二甲基甲酰氨(缩写为DMF)的N-琥珀酰亚胺基4-马来酰亚胺丁酸酯(N-succinimidyl 4-maleimidobutyrate，简称为GMBS)，37℃反应90分钟后，除去未反应的GMBS，得到马来酰亚胺化寡核苷酸。将该马来酰亚胺化寡核苷酸按25pmol/孔添加到上述用2-亚氨基四氢噻吩盐酸盐处理后的96孔多孔板中，在室温下反应90分钟。反应后，弃去上清液，按25μl/孔添加0.8mM的碘乙酰胺，室温下放置20小时。接着，用10mM磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤后，按250μl/孔添加50mM Tris-50mM氯化钠-1％BSA缓冲液，在室温下静置20小时，制成固定了寡核苷酸的板。
制造例1-2用39μg胃蛋白酶使与AFP(甲胎蛋白)反应的4.8mg抗AFP抗体克隆No.9在37℃反应30分钟后，用凝胶过滤柱色谱纯化，得到F(ab′)2级分2.4mg。接着，以F(ab′)2级分的1/20液量在所得的级分中添加0.2M 2-巯基乙醇胺，通过还原反应制备Fab′级分。
随后，将5′末端修饰了氨基接头的完全配对寡核苷酸(Amersham Pharmacia公司生产，序列5′-AGTGACGAATTCACGGCTGGATCCCTAATG-3′)和错配寡核苷酸(Amersham Pharmacia公司生产，序列5′-GATTTTAGCTCTTCTTTGGAGAAAGTGGTG-3′)分别溶于50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中，以寡核苷酸的5倍摩尔量添加用DMF溶解的GMBS，37℃反应90分钟后，除去未反应的GMBS，得到马来酰亚胺化寡核苷酸。在所得的马来酰亚胺化寡核苷酸中，按寡核苷酸的0.2倍摩尔量添加上述抗AFP抗体的Fab′级分，进行反应，通过脱盐操作，制备抗Fab′-完全配对寡核苷酸复合体(缩写为FM复合体)和抗Fab′-错配寡核苷酸复合体(缩写为MM复合体)。
实施例2-1在制造例1-1制备的固定有寡核苷酸的板中，按100μl/孔添加含有聚合物(P1)0.2wt％的FM复合体溶液和含有聚合物(P1)0.2wt％的MM复合体溶液，37℃下温育30分钟。用Tris-TritonX(以下缩写为洗涤液(X))洗净后，添加100ng/ml的AFP抗原稀释液100μl，37℃下温育1小时。用洗涤液(X)洗净后，添加发光底物AMPPD溶液200μl，37℃下温育5分钟，用荧光板读数器ARVOsx(Wallac Beltold)测定发光量。由测定结果求得(FM复合体的发光量)/(MM复合体发光量)。结果如表4所示。
实施例2-2～2-9和比较例2-1～2-3除用表4中所示的各种聚合物代替聚合物(P1)之外，与实施例2-1同样进行操作和测定。结果如表4所示。
比较例2-4除用不含聚合物(P1)的FM复合体溶液和MM复合体溶液代替含有聚合物(P1)0.2wt％的FM复合体溶液以及含有聚合物(P1)0.2wt％的MM复合体溶液之外，与实施例2-1同样进行操作和测定。结果如表4所示。
表4
由表4可知，相对于比较例，实施例FM复合体的发光量/MM复合体的发光量的比高。亦即，即使在37℃也不抑制特异性杂交，但能抑制非特异性杂交，从而更准确地进行杂交。
实施例3-1使用具有以下DNA序列，5′末端用氨基修饰的固定化用寡聚DNA(缩写为PUC2-NH2)；具有与该PUC2-NH2互补序列的PUC；5′末端用生物素修饰，含有该PUC的SNPs的错配PUC′或PUC″。另外，PUC-NH2使用ESPEC OLIGO SERVICE公司生产的产品。
PUC2-NH25′-(CH2)12TTTACAACGTCGTGACTGGG-3′在DNA结合96孔板(Corning公司生产)上，按100μl/孔添加溶解于E-NaPB中的25pmol/ml PUC2-NH2溶液，4℃下温育过夜(PUC2-NH2的固定化)。然后由各孔除去溶液，用D-PBS洗涤3次后，按20μl/孔添加B-E-NaPB，37℃下温育1小时(封闭操作-1)。由各孔除去B-E-NaPB，制成固定了PUC2-NH2的板。
在固定了PUC2-NH2的板上，按100μl/孔添加含有聚合物(P1)3.2wt％、以及PUC、PUC′和PUC″各0.2pmol/ml的5×SSC溶液，25℃下温育1小时。然后，由各孔除去各种寡聚DNA溶液，用25℃的含有0.1％SDS和300mM NaCl的30mM柠檬酸钠溶液洗涤2次。接着，按照200μl/孔添加B-E-NaPB，37℃下温育30分钟(封闭操作-2)后，由各孔除去B-E-NaPB。再按100μl/孔添加Avidin-HRP溶液，37℃下温育30分钟(抗生物素蛋白-生物素反应)，然后用D-PBS洗涤3次。接着，按100μl/孔添加HRP试剂盒的底物溶液，25℃下温育10分钟(POD-底物反应)。随后，按100μl/孔添加HRP试剂盒的反应终止液，用SPECTRA MAX250(微孔板读数器，MOLECULAR DEVICES公司生产)测定产生的450nm的吸光度。另外，HRP试剂盒使用过氧化物酶用发色试剂盒T(住友BAKELITE公司生产)。
根据测定结果求出(PUC的吸光度)/(PUC′的吸光度)，以及(PUC的吸光度)/(PUC″的吸光度)。结果如表5所示。
实施例3-2～3-9及比较例3-1～3-2除用表5所示各种聚合物代替聚合物(P1)之外，与实施例3-1同样进行操作和测定。另外，对于比较例3-1和3-2，仅求出(PUC的吸光度)/(PUC″的吸光度)。结果如表5所示。
比较例3-3除用含有PUC、PUC′和PUC″各0.2pmol/ml的5×SSC溶液代替含有聚合物(P1)3.2wt％以及PUC、PUC′和PUC″各0.2pmol/ml的5×SSC溶液之外，与实施例3-1同样进行操作和测定。结果如表5所示。
比较例3-4除用含有1.0％酪蛋白(SIGMA公司生产)及0.1％N-LS(和光纯药工业(株))的5×SSC溶液代替含有聚合物(P1)3.2wt％以及PUC、PUC′和PUC″各0.2pmol/ml的5×SSC溶液之外，与实施例3-1同样进行操作和测定。结果如表5所示。
比较例3-5除用溶解了PUC、PUC′和PUC″各0.2pmol/ml、10mg/ml Ficol 400(Amersham Pharmacia Biotech公司生产，商标)、10mg/ml聚乙烯吡咯烷酮、10mg/ml牛血清白蛋白和0.5％SDS的6×SSC溶液(Denhard′s溶液)代替含有络合物(P1)3.2wt％、以及PUC、PUC′和PUC″各0.2pmol/ml的5×SSC溶液以外，与实施例3-1同样进行测定。结果如表5所示。
表5
由表5可知，相对于比较例，实施例中完全配对的吸光度(PUC的吸光度)/错配的吸光度(PUC′、PUC″的吸光度)的比高。即，不抑制特异性杂交，而抑制非特异性杂交，从而实现更准确的杂交。
权利要求
1.一种非特异性杂交抑制剂，其中，包含具有非特异性杂交抑制功能的聚合物(H)，该聚合物在分子内含有羧基和砜基中的至少一种以及磷酰胆碱类似基团，且重均分子量为1000-5000000。
2.权利要求1所述的抑制剂，其中，磷酰胆碱类似基团是以式(1)所示的含有磷酰胆碱类似基团的单体为基础的构成基团。 (式中，X表示2价的有机残基，Y表示碳原子数1-6的亚烷氧基，Z表示氢原子或R5O(C＝O)-。其中，R5表示碳原子数1-10的烷基或碳原子数1-10的羟烷基。R1表示氢原子或甲基，R2、R3和R4是相同或不同的基团，表示氢原子、碳原子数1-6的烷基或羟烷基。m为0或1，n为1-4的整数。)
3.权利要求1所述的抑制剂，其中，聚合物(H)是使单体组合物聚合得到的聚合物，该单体组合物包括含有磷酰胆碱类似基团的单体5-95mol％、含有羧基的单体和含有砜基的单体中的至少1种5-95mol％。
4.权利要求1所述的抑制剂，其中，聚合物(H)是使单体组合物聚合得到的聚合物，该单体组合物包括含有磷酰胆碱类似基团的单体5-90mol％、含有羧基的单体和含有砜基的单体中的至少1种5-90mol％、疏水性单体5-60mol％。
5.权利要求4所述的抑制剂，其中，疏水性单体为式(2)所示的单体。 (式中，R6表示氢原子或甲基，L1表示-C6H4-、-C6H10-、-(C＝O)O-、-O-、-(C＝O)NH-、-O(C＝O)-或-O(C＝O)O-，L2表示氢原子、-(CH2)g-L3或((CH2)p-O)h-L3。g和h表示1-24的整数、p表示3-5的整数，L3表示氢原子、甲基、-C6H5、-OC6H5。)
6.一种临床检查试剂，其中，含有权利要求1所述的抑制剂以及检查试剂。
7.一种临床检查方法，其中，包括下述步骤步骤(1)，在权利要求1所述的抑制剂的存在下，在规定的核酸关联物质与检查试剂进行杂交的规定条件下，使检体和与规定的核酸关联物质杂交的检查试剂接触；步骤(2)，检测步骤(1)中通过与检查试剂杂交生成的反应物。
8.权利要求7所述的方法，其中，步骤(1)中，抑制剂的用量为使抑制剂中聚合物(H)在杂交系统中存在0.0001-20重量％的量。
全文摘要
本发明涉及能够提高杂交时反应的准确性，抑制非特异性杂交的抑制剂；临床检查试剂；以及临床检查中能够抑制非特异性杂交，容易且以高精度检测出测定对象的核酸关联物质的临床检查方法。该抑制剂和临床检查试剂包含具有非特异性杂交抑制功能的聚合物(H)，该聚合物在分子内含有羧基和砜基中的至少一种以及磷酰胆碱类似基团，其重均分子量为1000－5000000。临床检查方法包括在上述抑制剂的存在下使检体和与规定的核酸关联物质杂交的检查试剂接触的步骤。
文档编号C08F30/02GK1547615SQ02812948
公开日2004年11月17日 申请日期2002年4月25日 优先权日2001年4月26日
发明者榊秀次郎, 首藤健志郎, 土田卫, 芦原义弘, 矶村光男, 弘, 志郎, 男, 秀次郎 申请人:日本油脂株式会社