专利名称：一种大环多胺与聚酰胺缀合物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种化合物及其制备方法与应用，特别涉及一种大环多胺与聚酰胺缀合物及其制备方法与以其金属配合物为活性成分的核酸切割试剂。
背景技术：
设计、合成定点核酸切割试剂是当前化学和分子生物学研究的一个十分活跃的领域。含有N-甲基吡咯的寡聚酰胺能够穿透细胞膜与特定的碱基序列高亲和力地结合，并控制基因表达，是一类十分重要的化学物质(Blasko A，Browne KA，Bruice TC.J.Am.Chem.Soc.1994；1163726；2.Gottesfeld JM，Neely L，Trauger JW，Baird EE，Dervan PB.Nature 1997；387202)。因此，对寡聚酰胺类化合物的设计、合成及其生物活性的研究以及提高其分子亲合性、序列选择性和切割效率具有重要意义。
合成核酸酶是化学生物学发展迅速的一个具有挑战性的新领域，大环多胺和它的金属配合物也被合成作为仿酶催化剂(R.S.Dickins，J.A.K.Howard，C.W.Lehmann，J.Moloney，D.Parker，R.D.Peacock，Angew.Chem.1997，109，541-543；Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1997，36，521-523；S.Aime，M.Botta，S.G.Crich，B.G.Giovenzana，G.Jommi，R.Pagliarin，M.Sisti，J.Chem.Soc.，Chem.Commun.1995，1885-1886；S.Aoki，M.Shiro，T.Koike，E.Kimura，J.Am.Chem.Soc.2000，122，576-584；B.Knig，M.Pelka，H.Zieg，T.Ritter，H.Bouas-Laurent，R.Bonneau，J.-P.Desvergne，J.Am.Chem.Soc.1999，121，1681-1687；E.Kikuta，T.Koike，E.Kimura，J.Inorg.Biochem.2000，79，253-259)。
发明创造内容本发明的目的是提供一种大环多胺与聚酰胺缀合物。
本发明所提供的大环多胺与聚酰胺缀合物，是具有下述式(I)结构的4-(4-(4-(4-1，4，7，10-四氮杂环十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺。
式(I)
该大环多胺聚酰胺缀合物的分子式为C39H58N14O5。
本发明的第二个目的是提供一种制备上述大环多胺与聚酰胺缀合物的方法。
本发明所提供的制备上述大环多胺与聚酰胺缀合物的方法，包括以下步骤1)制备4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-乙酸；2)将步骤1)中制备的4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-乙酸溶于DMF(N，N-二甲基甲酰胺)中，再分别加入0.8-0.9倍于所述4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-乙酸的物质量的1-羟基苯并三氮唑(HOBt)和N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)，室温反应20-24小时；然后过滤除去二环己基脲(DCU)，保留滤液；3)制备4-(4-(4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰基)氨基N、N-二甲基丁胺；4)在步骤2)所得滤液中，加入0.8-0.9倍于步骤1)所述4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-乙酸的物质量的4-(4-(4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰基)氨基N、N-二甲基丁胺，室温反应30-36小时，过滤，残余物用硅胶H柱层析分离得淡黄色非晶形固体；5)在步骤4)所述淡黄色非晶形固体中加入5.0-6.0倍于步骤1)所述4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-乙酸的物质量的HBr，室温解析，脱除叔丁氧羰酰，再在15mL NaOH溶液(40％)中解析得到产物4-(4-(4-(4-1，4，7，10-四氮杂环十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺。
在上述制备4-(4-(4-(4-1，4，7，10-四氮杂环十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺方法中，步骤1)所述的4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-乙酸可按下述步骤制备1)在冰浴下制备浓度为0.1M溴乙酸的甲醇溶液(0.143g溴乙酸溶于10ml甲醇中，0.1M的KOH的甲醇溶液(0.056gKOH溶于10ml甲醇中)逐滴滴加浓度为0.1M溴乙酸的甲醇溶液，得到0.05M溴乙酸的钾盐悬浊液，所述溴乙酸的甲醇溶液的体积与KOH甲醇溶液的体积相等，2)在浓度为0.5M的4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷甲醇溶液20ml中，加入碳酸钾，所述碳酸钾的物质的量为所述4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷的3-5倍；然后冰浴下滴加步骤1)得到的溴乙酸钾盐悬浊液，该溴乙酸钾盐悬浊液物质的量为所述4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷的1.2-1.5倍；室温反应4-6h后40-50℃反应6-8h，溶液减压蒸去溶剂后得到固体产物；3)将所得固体产物溶于蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取，干燥，减压浓缩溶剂，柱层析得白色固体产物。
在上述制备4-(4-(4-(4-1，4，7，10-四氮杂环十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺方法中，步骤3)中所述4-(4-(4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺可按下述步骤制备1)N-甲基吡咯与其1-1.2倍物质的量的CCl3COCl于室温进行酰化反应12-16小时，得到N-甲基-2-三氯己酰基吡咯；2)N-甲基-2-三氯己酰基吡咯与分别是其1.1和0.09倍物质的量的HNO3和H2SO4在-10℃进行硝化反应4小时，室温进行反应16小时，得到4-硝基-2-三氯己酰基-N-甲基吡咯；3)4-硝基-2-三氯己酰基-N-甲基吡咯与1倍的NH2CH2CH2CH2CH2N(CH3)2室温反应12-16小时，得到4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺；4)4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺在10％的钯碳催化下于与H2室温进行氢化反应，得到4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺，所述钯碳的物质的量是4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺的0.05-0.15倍；5)4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺与其0.8-1.0倍物质的量的N-甲基-2-三氯己酰基-4-硝基吡咯于0℃反应12小时，得到4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基氨基)-N、N-二甲基丁胺；6)4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基氨基)-N、N-二甲基丁胺在10％的钯碳催化下于与H2室温常压进行氢化反应24小时，得到4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基氨基)-N、N-二甲基丁胺，所述钯碳的物质的量是4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基氨基)-N、N-二甲基丁胺的0.10-0.15倍；然后再分别与1倍的PyPyCOOH(Py＝N-methylpyrrole)、1倍的HOBt和1.2倍的DCC所形成的活化酯于室温反应24小时，得到4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺。
7)在0.1mol/L(0.621g 1mmol溶于10ml)4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺的DMF溶液中，加入10％钯碳室温下催化氢化还原硝基为氨基，反应时间为24小时，过滤除去催化剂，浓缩滤液得到4-(4-(4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰基)氨基N、N-二甲基丁胺无色液体，所述10％钯碳的物质的量是4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺的0.08-0.10倍。
在上述制备4-(4-(4-(4-1，4，7，10-四氮杂环十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺方法中，步骤2)中的4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-乙酸在DMF中的浓度可为0.20-0.35M，优选为0.25M；所述羟基苯并三氮唑(HOBt)和N、N-二环己基碳二亚胺(DCC)的物质的量均与4，7，10-三叔丁氧羰酰-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-乙酸的物质量相等。
在上述制备4-(4-(4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺方法中，步骤7)中加入的4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰基)氨基N、N-二甲基丁胺可先溶于DMF中，其浓度可为0.2M；本发明的第三个目的是提供一种核酸切割试剂。
本发明所提供的核酸切割试剂，其活性成分是具有上述式(I)结构的4-(4-(4-(4-1，4，7，10-四氮杂环十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺的金属配合物。
其中，在上述核酸切割试剂中，所述金属配合物的中心离子可为Zn2+，Cu2+，La2+等金属离子。
本发明的4-(4-(4-(4-1，4，7，10-四氮杂环十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺的金属配合物具有核酸切割系统和识别系统，切割系统由大环多胺构成，识别系统由寡聚酰胺组成。本发明为进一步合成DNA定点识别及切割试剂提供了良好的基础和有效的途径，具有重要的意义。
图1为4-(4-(4-(4-1，4，7，10-四氮杂环十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺的制备过程示意2为反应15min时的电泳图谱图3为反应30min时的电泳图谱图4为反应45min时的电泳图谱具体实施方式
实施例1、4-(4-(4-(4-1，4，7，10-四氮杂环十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺的制备4-(4-(4-(4-1，4，7，10-四氮杂环十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺的合成过程如图1所示，具体包括以下步骤1、合成4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-乙酸1)将0.070gKOH冰浴下溶于4ml甲醇，然后逐滴滴加0.135g(1mml)溴乙酸的甲醇溶液得到溴乙酸的钾盐悬浊液；2)4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷0.472g溶于20mL甲醇中，并加入0.157g碳酸钾，将上述溴乙酸钾盐悬浊液在冰浴下滴加到反应体系中，室温反应5h后45℃下反应7h，得到溶液；3)溶液减压蒸去溶剂后得到固体，将所得固体溶于25ml蒸馏水中，用25×3ml乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，减压浓缩溶剂，以乙酸乙酯与石油醚为洗脱剂柱层析(5∶1)得白色固体4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-乙酸，产率87.7％。
2、合成4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰基)氨基N、N-二甲基丁胺1)N-甲基吡咯与其1-1.2倍物质的量的CCl3COCl于室温进行酰化反应12-16小时，得到N-甲基-2-三氯己酰基吡咯；2)N-甲基-2-三氯己酰基吡咯与分别是其1.1和0.09倍物质的量的HNO3和H2SO4在-10℃进行硝化反应4小时，室温进行反应16小时，得到4-硝基-2-三氯己酰基-N-甲基吡咯；3)4-硝基-2-三氯己酰基-N-甲基吡咯与1倍的NH2CH2CH2CH2CH2N(CH3)2室温反应12-16小时，得到4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺；
4)4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺在10％的钯碳催化下于与H2室温进行氢化反应，得到4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺，所述钯碳的物质的量是4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺的0.05-0.15倍；5)4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺与其0.8-1.0倍物质的量的N-甲基-2-三氯己酰基-4-硝基吡咯于0℃反应12小时，得到4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基氨基)-N、N-二甲基丁胺；6)lmmol 4-氨基-N-甲基吡咯-2-己酰氨基-N、N-二甲基丁胺与1mmol的4-硝基-2-三氯己酰基-N-甲基吡咯室温反应24小时，得到4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基氨基)-N、N-二甲基丁胺；7)1mmol 4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基氨基)-N、N-二甲基丁胺在10％钯碳催化下于与H2室温常压进行氢化反应24小时，得到4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基氨基)-N、N-二甲基丁胺，然后再与1mmol的PyPyCOOH、1mmol的HOBt和1mol的DCC的活化酯(反应时间为18小时)于室温下反应24小时，得到4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰基)氨基N、N-二甲基丁胺，所述10％钯碳的物质的量是4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基氨基)-N、N-二甲基丁胺的0.05-0.15倍。
3、合成4-(4-(4-(4-1，4，7，10-四氮杂环十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺1)将步骤2中制备的4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰基氨基)-N、N-二甲基丁胺(1mmol)溶于25ml DMF中，在10％钯碳催化下与H2室温进行氢化反应24小时，得到4-(4-(4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺，所述钯碳的物质的量是4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰基)氨基N、N-二甲基丁胺的0.1倍；2)将1.2mmol 4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-乙酸溶于5ml DMF中，再分别加入1.0、1.2倍于所述4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-乙酸物质的量的1-羟基苯并三氮唑(HOBt)和N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)，室温反应24-26小时；过滤除去二环己基脲(DCU)，保留滤液；
3)将2)所得滤液直接倾入1)中，室温搅拌反应24-26小时，过滤溶液，然后减压蒸馏蒸出DMF，残余物用硅胶H柱层析分离(洗脱液CH2Cl2∶CH3OH＝3.5∶1)得淡黄色固体；4)将步骤3)中得到的淡黄色固体加入到4.5mmol HBr(浓度为57％)室温解析18小时，脱除叔丁氧羰酰，然后在10mmol NaOH(40％)中解析，得到产物4-(4-(4-(4-1，4，7，10-四氮杂环十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺(C39H58N14O5)。
4、化合物的表征按常规方法对4-(4-(4-(4-1，4，7，10-四氮杂环十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺(C39H58N14O5)进行了核磁共振氢谱和质谱分析。结果如下氢谱1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ10.28(s，1H)，9.98(s，1H)，9.88(s，1H)，8.19(s，1H)，8.08(s，H)，7.60(s，1H)，7.28(s，1H)，7.24(s，1H)，7.19(s，1H)，7.06(s，2H)，6.84(s，H)，4.06(s，3H)，4.04(s，3H)，4.01(s，3H)，3.97(s，3H)，3.56(b，16H)，3.17(d，2H)，2.27(t，2H)，2.15(s，6H)1.67(t，2H)。
质谱ESI-MS1103(M++1)，1126(M++Na)，1142(M++K)；熔点205-206℃；元素分析(理论值)C58.38(58.34)；H7.31(7.28)；N24.48(24.42)。
实施例2、4-(4-(4-(4-1，4，7，10-四氮杂环十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺与Zn2+配合物切割Puc191)4-(4-(4-(4-1，4，7，10-四氮杂环十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺与Zn2+配合物的制备将1mmol 4-(4-(4-(4-1，4，7，10-四氮杂环十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺溶于4ml的无水甲醇中，将1mmol的高氯酸锌(溶于3ml的无水甲醇)滴加到上述溶液中，生成白色沉淀，过滤干燥得到所述4-(4-(4-(4-1，4，7，10-四氮杂环十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺与Zn2+配合物。
2)切割Puc19
将1.695mg 4-(4-(4-(4-1，4，7，10-四氮杂环十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺与Zn2+配合物加入200μL高纯水中，得到8mmol/L的切割试剂200μL。取0.4μL切割试剂(浓度为8mmol/L)，2μL pBR322(浓度为1μg/μL)，Tris-HCl缓冲液(Tris-HCl缓冲液的PH分别为7.22，7.40，7.60，7.80，8.00)37.6μL混合得到含切割试剂(浓度为0.08mmol/L)的切割体系。切割温度为37-40℃，切割时间分别为15min、30min、45min，反应完成后，进行0.5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果分别如图2、图3和图4所示，结果表明4-(4-(4-(4-1，4，7，10-四氮杂环十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺与Zn2+配合物对质粒DNA(Puc19)的切割效果极好。在切割试剂浓度为80μM时，切割时间为15min就表现出明显的切割效果，是目前世界上最好的切割试剂之一。图2、和图3中，泳道1、8为对照实验，不含切割试剂，PH为8.00，泳道2-6分别为PH 7.22，7.40，7.60，7.80，8.00的Tris-HCl缓冲液。图4中，泳道1、9为对照实验，不含切割试剂，pH为8.00，泳道2-7分别为PH 7.22，7.40，7.60，7.80，8.00，8.2。
权利要求
1.一种大环多胺与聚酰胺缀合物，是具有下述式(I)结构的4-(4-(4-(4-1，4，7，10-四氮杂环十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺。
2.一种制备4-(4-(4-(4-1，4，7，10-四氮杂环十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺的方法，包括以下步骤1)制备4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-乙酸；2)将步骤1)中制备的4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-乙酸溶于DMF中，再分别加入0.8-0.9倍于该化合物物质的量的1-羟基苯并三氮唑和N，N-二环己基碳二亚胺，室温反应20-24小时；然后过滤除去二环己基脲，保留滤液；3)制备4-(4-(4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰基)氨基N、N-二甲基丁胺；4)向步骤2)所得滤液中，加入0.8-0.9倍于所述4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-乙酸的物质的量的4-(4-(4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰基)氨基N、N-二甲基丁胺，室温反应30-36小时，过滤，残余物用硅胶H柱层析分离得淡黄色非晶形固体；5)向步骤4)所述淡黄色非晶形固体中加入5.0-6.0倍于步骤1)所述4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-乙酸的物质的量的HBr，室温解析，脱除叔丁氧羰酰，再在5mL 40％NaOH溶液中解析得到产物4-(4-(4-(4-1，4，7，10-四氮杂环十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤1)所述的4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-乙酸按以下步骤制备1)在冰浴下制备浓度为0.1M溴乙酸的甲醇溶液，0.1M的KOH的甲醇溶液逐滴滴加浓度为0.1M溴乙酸的甲醇溶液，得到0.05M溴乙酸的钾盐悬浊液，所述溴乙酸的甲醇溶液的体积与KOH甲醇溶液的体积相等，2)在浓度为0.5M的4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷甲醇溶液20ml中，加入碳酸钾，所述碳酸钾的物质的量为所述4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷的3-5倍；然后冰浴下滴加步骤1)得到的溴乙酸钾盐悬浊液，该溴乙酸钾盐悬浊液物质的量为所述4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷的1.2-1.5倍；室温反应4-6h后40-50℃反应6-8h，溶液减压蒸去溶剂后得到固体产物；3)将所得固体产物溶于蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取，干燥，减压浓缩溶剂；柱层析得白色固体产物。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于步骤3)中所述4-(4-(4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰基氨基)-N、N-二甲基丁胺按下述步骤制备1)N-甲基吡咯与其1-1.2倍物质的量的CCl3COCl于室温进行酰化反应，得到N-甲基-2-三氯己酰基吡咯；2)N-甲基-2-三氯己酰基吡咯与分别是其1.1和0.09倍物质的量的HNO3和H2SO4在-10℃进行硝化反应，得到4-硝基-2-三氯己酰基-N-甲基吡咯；3)4-硝基-2-三氯己酰基-N-甲基吡咯与1倍的NH2CH2CH2CH2CH2N(CH3)2室温反应，得到4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺；4)4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺在10％的钯碳催化下与H2在室温条件下进行氢化反应，得到4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺，所述钯碳的物质的量是4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺的0.05-0.15倍；5)4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺与其0.8-1.0倍物质的量的N-甲基-2-三氯己酰基-4-硝基吡咯于0℃反应，得到4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基氨基)-N、N-二甲基丁胺；6)4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基氨基)-N、N-二甲基丁胺在10％钯碳催化下与H2室温进行氢化反应，得到4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基氨基)-N、N-二甲基丁胺，所述10％钯碳的物质的量是4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基氨基)-N、N-二甲基丁胺的0.10-0.15倍；然后再与1倍的PyPyCOOH、1倍的1-羟基苯并三氮唑和1.2倍的N，N-二环己基碳二亚胺所形成的活化酯于室温反应24小时，得到4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺；7)将4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺溶于1mMol DMF溶液，以10％钯碳为催化剂，将其硝基氢化还原为氨基，过滤除去催化剂，浓缩滤液得到4-(4-(4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰基)氨基N、N-二甲基丁胺无色液体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤7)中加入的所述4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰基)氨基N、N-二甲基丁胺1mmol可先溶于25ml DMF，其浓度可为0.04M。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤2)中的4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-乙酸在DMF中的浓度可为0.20-0.35M；所述羟基苯并三氮唑和N、N-二环己基碳二亚胺的物质的量均与4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-乙酸的物质的量相等。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤4)中硅胶H柱层析分离的洗脱液为CH2Cl2∶CH3OH＝3.5∶1。
8.一种核酸切割试剂，其活性成分是4-(4-(4-(4-1，4，7，10-四氮杂环十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺的金属配合物。
9.根据权利要求8所述的试剂，其特征在于所述金属配合物的中心离子为Zn2+、Cu2+或La2+离子。
全文摘要
本发明公开了一种大环多胺与聚酰胺缀合物及其制备方法与应用，本发明提供的聚酰胺与大环多胺缀合物，是具有式(I)结构的4－(4－(4－(4－1，4，7，10－四氮杂环十二烷乙酰氨基－N－甲基吡咯－2－酰基)氨基－N－甲基吡咯－2－酰基)氨基－N－甲基吡咯－2－酰基)氨基－N－甲基吡咯－2－乙酰氨基)－N、N－二甲基丁胺，该缀合物的金属配合物具有切割核酸的功能，本发明为进一步合成DNA定点识别及切割试剂提供了良好的基础和有效的途径，具有重要意义。
文档编号C08G69/00GK1560112SQ20041000476
公开日2005年1月5日 申请日期2004年3月5日 优先权日2004年3月5日
发明者赵玉芬, 乔仁忠, 张祯 申请人:清华大学