专利名称：一种微生物多糖及其生产方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及发酵的方法合成所需化合物，具体属于一种微生物多糖及其生产方法，以及该多糖的应用。
背景技术：
自然界的生物多糖来自植物、动物和微生物，根据其生物学功能可分为贮存多糖、结构多糖和具有特殊功能的多糖，许多研究表明，各类多糖在生命活动中都发挥着十分重要的作用。近些年来，活性多糖，尤其是微生物活性多糖成为科学研究和应用开发的热点，微生物活性多糖，除了其对微生物自身的生物学意义外，更重要是它的特殊结构和性质，决定了它在人们生活和生产中具有广泛而重要的用途，依照其结构与性质的不同，分别作为免疫功能增强剂、食品添加剂、增稠剂、悬浮剂和化工凝固剂、润滑剂、絮凝剂、凝胶剂等，广泛用于医药、食品、石油、轻工、化工等多个领域，在经济建设与人民生活中发挥着重要作用。
目前，国内外对于微生物活性多糖的研究主要集中在开发生产菌株、探索代谢途径、构建基因工程菌、创建发酵工艺及调控方法、测定产品结构与性能、鉴定产品生物活性、研究产品构效关系等方面，并且已经取得了较大进展。
微生物多糖主要包括真菌多糖和细菌多糖。真菌多糖的研究始于20世纪50年代，60年代以后因其具有免疫促进作用而引起人们的兴趣，随后人们陆续发现它具有更多的生物活性，不仅可以抗病菌、抗病毒、预防和治疗肿瘤与艾滋病等，还可以抗辐射、抗凝血、降血糖等调节人体生理功能。尤其在治疗免疫功能低下症、癌症和艾滋病方面取得了令人鼓舞的临床效果。许多真菌活性多糖，如香菇多糖、茯苓多糖、云芝多糖、裂褶菌多糖等已被开发，一些已被临床采用，一些正在进行临床试验。
已开发的细菌多糖种类远比真菌多糖要少得多，且主要集中在细菌胞外多糖方面。至于细菌胞内多糖，目前仅进行基础理论研究。与真菌多糖相比，细菌胞外多糖是通过液态深层发酵的方式来生产，呈现出周期短，产量高，规模大和产品用途广等特点。
近些年来，已经用于工业化发酵生产的细菌胞外多糖主要有黄原胶(Xanthan gum)、热凝多糖(Curdlan)和结冷胶(Gellan gum)，它们在采油、轻工业、印染、造纸、纺织、陶瓷、涂料等行业均具有重要用途。
有关细菌多糖的生物活性作用，近年来陆续开始有些报道。在Chin J MicrobiolImmunol，13(6)442(2003)中报道了一种乳酸菌胞外多糖具有增强细胞免疫功能的作用。在微生物学报，43(2)251(2003)中报道了一种乳酸菌胞外多糖对荷瘤小鼠具有增强免疫功能的作用，经摇瓶液态发酵试验，该多糖的最高产量达0.1g/L。公开号CN1425063A专利公开了一株乳酸菌突变株，该乳酸菌株在编码α-磷酸葡萄糖变位酶的基因突变后可过度产生胞外多糖，经摇瓶发酵其多糖产量是突变前的2.5倍，但其发酵水平仅达0.044g/L。另外，CN1104504C号专利公开了一种利用土壤杆菌1202菌株生产胞外多糖的生产工艺，该多糖也是经摇瓶液态发酵获得，试验表明该多糖具有免疫增强和抗肿瘤活性。
综上所述，微生物多糖的开发生产研究已取得一定进展，其现状与特点如下(1)已开发的真菌多糖，多数具有免疫增强作用。然而从野生真菌子实体中直接提取多糖受到自然资源的严格限制，通过人工栽培子实体或液态发酵菌丝体的方式生产多糖，周期长、产量低、成本高，致使每支多糖含量仅0.1g的针剂售价达40～200元。(2)细菌胞外多糖可通过发酵方式大规模工业化生产，已投入生产的主要有黄原胶、热凝多糖和结冷胶等，但未报道有免疫活性作用，目前主要用在食品与化工等方面。(3)已报道可合成具有免疫活性的细菌胞外多糖有乳酸菌和土壤杆菌1202菌株的胞外多糖，但尚处在摇瓶试验阶段，且产量偏低。因此，开发具有免疫活性和可以实施大规模工业化发酵生产的细菌胞外多糖，无论对于保障人们身体健康，还是对于促进经济建设都是当务之急。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有免疫活性的微生物多糖；其生产方法简单，生产菌株性状优良，能利用廉价原料；这种微生物多糖能够用来制备提高免疫功能的药品。
本发明提供的一种微生物多糖，是采用保藏号为CCTCC M 205108的锦鸡儿根瘤菌菌种，在合适的培养基和培养条件下，发酵制得。
所述的菌种锦鸡儿根瘤菌(Rhizobium sp.N613)，菌株的细胞形态为杆状(见图1)，不产生芽孢，革兰氏阴性，能与相应的豆科植物有效结瘤，共生固氮。经发酵试验证明，该菌株具有基质范围宽、生长速率快、生产性状稳定等优良的生产性状，当该菌株生长在葡萄糖等碳水化合物的培养基上时，在细胞生长的同时便合成胞外多糖，到稳定期随着氮源物质浓度的降低，会利用碳源基质合成并在细胞外大量积累胞外多糖，其多糖的发酵类型属于部分生长关联型。该菌株分离自植物锦鸡儿根部。该菌种保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 205108。
所述的培养基，包括斜面固体培养基和液体发酵培养基，培养基组分及其含量按g/L计。
斜面固体培养基葡萄糖5～10，(NH4)2SO40.3～0.8，KH2PO4·12H2O 0.3～0.61，K2HPO40.2～0.39，NaCl0～0.1，酵母水解粉0.5～1，H3BO30.002，Na2MoO40.002，琼脂20～23，余量为水；培养基pH7.0～7.2。
液体发酵培养基糖(葡萄糖、蔗糖或淀粉水解液)10～30，(NH4)2SO40.8～3.0，KH2PO4·12H2O0.61～1.22，K2HPO40.39～0.78，NaCl0～0.1，酵母水解粉0.5～2，H3BO30.002，Na2MoO40.002，余量为水；培养基pH7.0～7.2。
其中淀粉水解液制备取淀粉20g，加水80mL，制成淀粉乳，调节pH6.5，加热糊化后，加入20000U/mL的α-淀粉酶0.05mL，在95℃水浴中液化2h，再加入50000U/g的糖化酶0.02g，调pH至4.5，在60℃水浴条件下水解6h，过滤，将滤液减压浓缩至30mL。用3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量0.5g/mL。
本发明微生物多糖生产方法，包括斜面种子培养、摇瓶种子培养、种子罐种子培养、液态发酵和多糖产物分离纯化等。具体生产方法包括如下步骤(1)斜面种子培养将保藏号为CCTCC M 205108的锦鸡儿根瘤菌接种到斜面固体培养基上，在30℃培养箱中培养18h～24h，制得斜面种子；(2)摇瓶种子培养将斜面种子接入液体培养基中，在28℃～31℃条件下，摇床培养16h～18h，制得摇瓶种子液；(3)种子罐种子培养将摇瓶种子液按7％～10％的接种量接入种子罐液体培养基中，装料系数0.7，控制温度28℃～31℃、pH7.0～7.2，保持溶氧饱和度10％以上，培养24h～30h，制得种子罐种子液；(4)分批发酵将种子罐种子液按7％～10％的接种量接入液体培养基中，装料系数0.7，控制温度28℃～31℃、pH7.0～7.2，保持溶氧饱和度10％以上，培养30h～32h，收集发酵液；(5)多糖的提取将发酵液稀释、离心分离，将离心液浓缩至1/6～1/12体积，用食用酒精沉淀，将沉淀物用水溶解，再经酒精沉淀、真空干燥后，得多糖产品，并回收酒精。
所述的步骤(4)可以是补料分批发酵将种子罐种子液按7％～10％的接种量接入液体发酵培养基中，装料系数0.7，控制温度28℃～31℃、pH7.0～7.2，保持溶氧饱和度10％以上，培养25～30h，开始补加糖，控制发酵液中糖浓度在15g/L-35g/L，发酵培养到48-56h，收集发酵液。
本发明微生物多糖经过动物免疫学试验证明其具有免疫活性，可用来制备提高免疫功能的药品。
此外，本发明微生物多糖还有望作为食品或化工领域的增稠剂、悬浮剂等。
本发明采用的检测方法①细胞干重基于培养液中无颗粒性的营养物质，在发酵过程中我们采用分光光度法在600nm波长处测定细胞悬液的吸光值，然后再根据吸光值与细胞干重曲线折算成细胞浓度。
②还原糖(葡萄糖或淀粉水解糖)测定3，5-二硝基水杨酸法。
③蔗糖测定蒽酮法④多糖的测定苯酚硫酸法。
⑤铵离子测定改良靛酚蓝比色法。
⑥无机磷的测定钼酸铵比色法。
⑦分子量的测定凝胶过滤层析法。
与现有技术相比本发明具有以下优点和效果本发明采用锦鸡儿根瘤菌为生产菌株，以工业葡萄糖、蔗糖和淀粉水解液作为碳源，硫酸铵作为氮源，酵母水解粉作为生长因子，通过液态发酵的方式生产一种微生物多糖(REPS)，REPS产量可达10g/L～17g/L。该方法的主要特点在于菌株生长快、多糖产量高、原料来源广、培养条件适中，生产成本低。此外，生产菌种是自然界的固氮菌，即使在生产过程中不慎流入环境中也不存在生物安全性的问题。
本发明以沉淀工艺路线为基础，优化了REPS的分离纯化技术与工艺参数，建立了一套下游加工方法。此方法具有工艺简单，易于操作等优点。通过此法获得的REPS产品，收率达到90％以上，纯度达到95％以上，而且此法不会降低REPS的分子量和影响该多糖的理、化及生物学性质。
由本发明获得的REPS是一种新型活性多糖，经过动物免疫学试验证明具有增强机体免疫功能的作用，可以进一步开发为一种新型的免疫增强药物。此外，根据该多糖的理化性质，还可作为食品与化工方面的增稠剂与悬浮剂等。
图1、锦鸡儿根瘤菌[Rhizobium sp.N613(Caragana)]菌株的细胞形态图具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步说明。实施例中所采用的发酵设备为镇江东方生物工程设备技术公司生产的10L、100L自控发酵罐配套设备。
实施例1 以葡萄糖为碳源，用10L发酵罐分批发酵生产试验斜面种子培养将保藏的锦鸡儿根瘤菌菌种接种在斜面培养基上，于30℃的培养箱中培养18h，其中培养基的组成为(按g/L计)葡萄糖5，(NH4)2SO40.3，KH2PO4·12H2O 0.3，K2HPO40.2，酵母水解粉0.5，H3BO30.002，Na2MoO40.002，琼脂20，余量为水；培养基pH7.0。
摇瓶种子培养将斜面种子接入液体培养基中，28℃条件下，在150r/min摇床培养16h，作为种子液备用，其中培养基的组成为(按g/L计)葡萄糖10，(NH4)2SO40.8，KH2PO4·12H2O0.61，K2HPO40.39，酵母水解粉1，H3BO30.002，Na2MoO40.002，余量为水；培养基pH7.0。
10L发酵罐分批发酵将种子液按7.5％的接种量接入液体培养基中培养，在10L发酵罐中进行培养，培养条件装料系数0.7，控制温度28℃、pH7.0，保持溶氧饱和度10％以上。经过30小时的培养，细胞浓度为14.2g干细胞/L(即OD600为29)，多糖产量达8.2g/L。其中培养基的组成为(按g/L计)葡萄糖30，(NH4)2SO43.0，KH2PO4·12H2O1.22，K2HPO40.78，NaCl0.1，酵母水解粉2，H3BO30.002，Na2MoO40.002，余量为水；培养基pH7.0。
REPS的提取将发酵液稀释3倍，然后采用管式离心机，在离心因素为15700×g的条件下，控制流速，进行连续液固分离，弃菌体，收集离心液。离心液在60℃下减压浓缩至离心液体积的1/6，得浓缩液。然后在浓缩液中加入3倍体积的食用酒精(酒精浓度≥95％)沉淀多糖，取出絮状多糖，用水溶解，再经酒精沉淀，将絮状沉淀物在60℃条件下真空干燥，得多糖产品。经检测，收率达90％，纯度达95％，分子量为27000Da。
实施例2 以蔗糖为碳源，用10L发酵罐分批发酵生产试验斜面种子培养将保藏的锦鸡儿根瘤菌菌种接种在斜面培养基上，于30℃的培养箱中培养20h，其中培养基的组成为(按g/L计)葡萄糖7，(NH4)2SO40.5，KH2PO4·12H2O0.5，K2HPO40.3，NaCl0.1，酵母水解粉0.75，琼脂22，培养基pH7.1，其余成分同实施例1。
摇瓶种子培养将斜面种子接入液体培养基中，30℃条件下，在190r/min摇床培养17h，作为种子液备用，其中培养基的成分同实施例1。
10L发酵罐分批发酵将种子液按7.5％的接种量接入液体培养基中培养，在10L发酵罐中进行培养，培养条件装料系数0.7，控制温度30℃、pH7.1，保持溶氧饱和度10％以上。经过30小时的培养，细胞浓度达到14.9g干细胞/L(即OD600为24)，多糖产量达10.6g/L。培养基中除葡萄糖被蔗糖替代外，其余成分同实施例1。
REPS提取将发酵液稀释4倍，然后采用管式离心机，在离心因素为15700×g的条件下，控制流速，进行连续液固分离，弃菌体，收集离心液。离心液在60℃下减压浓缩至离心液体积的1/9，得浓缩液。其余操作同实施例1。经检测，收率达92％，纯度达96％，分子量为28000Da。
实施例3 以淀粉水解液为碳源，用100L发酵罐分批发酵生产试验斜面种子培养将保藏的锦鸡儿根瘤菌菌种接种在斜面培养基上，于31℃的培养箱中培养24h，其中培养基的组成为(按g/L计)葡萄糖10，(NH4)2SO40.8，KH2PO4·12H2O0.61，K2HPO40.39，NaCl0.1，酵母水解粉1，琼脂23，培养基pH7.2，其余成分同实施例1。
摇瓶种子培养将斜面种子接入液体培养基中，31℃条件下，在220r/min摇床培养18h，作为种子液备用，其中培养基的成分同实施例1。
种子罐种子培养将种子液按10％的接种量接入种子罐液体培养基中培养，培养条件装料系数0.7，控制温度31℃、pH7.2，保持溶氧饱和度10％以上。经过24小时的培养，可作为100L发酵罐的种子液。其中培养基的成分同实施例1中分批发酵所用的培养基。
100L发酵罐分批发酵将种子罐种子液按10％的接种量接入液体培养基中培养，在100L发酵罐中进行培养，培养条件装料系数0.7，控制温度31℃、pH7.2，保持溶氧饱和度10％以上。经过32小时的培养，细胞浓度可达到15.2g干细胞/L(即OD600为31)，多糖产量可达10.9g/L。其中培养基的糖为淀粉水解液，其余成分同实施例1中分批发酵所用的培养基。
REPS提取将发酵液稀释6倍，然后采用管式离心机，在离心因素为15700×g的条件下，控制流速，进行连续液固分离，弃菌体，收集离心液。离心液在60℃下减压浓缩至离心液体积的1/12，得浓缩液。其余操作同实施例1。经检测，收率为94％，纯度为95％，分子量为29000Da。
实施例4 以葡萄糖作碳源，用100L发酵罐进行补料分批发酵生产试验斜面种子培养及摇瓶种子培养同实施例3。
种子发酵罐种子培养将种子液按10％的接种量接入种子罐液体培养基中培养，经过26小时的培养，可作为100L发酵罐的种子液。培养条件与培养基成分同实施例3。
100L发酵罐补料分批发酵将种子罐种子液按10％的接种量接入液体培养基中培养，在100L发酵罐中进行培养，培养条件装料系数0.7，控制温度31℃、pH7.2，保持溶氧饱和度10％以上。初始培养基的组成同实施例1中分批发酵所用的培养基。经过25小时的培养，葡萄糖消耗到15g/L时，开始采用少量多次的方式进行补加葡萄糖，糖量不超过30g/L，经48小时的发酵培养，菌体浓度可达17.4干细胞g/L，多糖产量可达16.2g/L。
REPS提取同实施例3，经检测，收率达93％，纯度达96％以上，分子量为30000Da。
实施例5 以蔗糖为碳源，用100L发酵罐补料分批发酵生产试验斜面种子培养及摇瓶种子培养同实施例3。
种子发酵罐种子培养将种子液按10％的接种量接入种子罐液体培养基中培养，经过28小时的培养，可作为100L发酵罐的种子液。培养条件与培养基成分同实施例3。
100L发酵罐补料分批发酵将种子罐种子液按10％的接种量接入液体培养基中培养，在100L发酵罐中进行培养，培养条件装料系数0.7，控制温度31℃、pH7.2，保持溶氧饱和度10％以上。初始培养基的糖为蔗糖，其余组成同实施例1中分批发酵所用的培养基。经过30小时的培养，葡萄糖消耗到15g/L时，开始采用少量多次的方式进行补加蔗糖，糖量不超过30g/L，经52小时的发酵培养，菌体浓度可达17.9干细胞g/L，多糖产量可达17.3g/L。
REPS提取同实施例3，经检测，收率为94％，纯度可达96.2％，分子量为29000Da。
实施例6 以纯品REPS为样品进行动物免疫学试验经提取后的多糖一般纯度可达95％以上，将干燥后的该多糖溶于水，制成0.05-0.1％的多糖水溶液，用Savage法处理以除去多糖水溶液中的蛋白质，处理过程如下Savage液由氯仿和正丁醇以4∶1的体积比配置而成，将多糖水溶液和Savage液以4∶1的体积比混合，并振荡30min，然后6000r/min离心10min，弃沉淀。反复处理三次后，上清液经紫外光扫描检测和SephadexG-100凝胶过滤分析，以证明多糖的纯度。上清液用3倍体积的食用酒精醇沉处理，沉淀物经真空干燥，得REPS纯品。
采用昆明种小鼠作为实验对象，分成高、中、低剂量组和对照组，分别给各剂量组的小鼠腹腔注射不同量(40，20，10mg·Kg-1·d-1)的REPS，给对照组注射生理盐水，连续给药10天，然后进行非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫试验，检验该多糖促进机体巨噬细胞吞噬、增强淋巴细胞增殖和提高抗体效价的能力。结果见附表1和附表2。
附表1 REPS对小鼠非特异免疫功能的影响
*P＜0.05，**P＜0.01附表2 REPS对小鼠体液免疫和细胞免疫功能的影响
*P＜0.05，**P＜0.01。
权利要求
1.一种微生物多糖，其特征在于，采用保藏号为CCTCC M 205108的锦鸡儿根瘤菌菌种，在合适的培养基和培养条件下，发酵制得。
2.按照权利要求1所述的微生物多糖的生产方法，其特征在于包括如下步骤(1)斜面种子培养将保藏号为CCTCC M 205108的锦鸡儿根瘤菌接种到斜面固体培养基上，在30℃培养箱中培养18h～24h，制得斜面种子；(2)摇瓶种子培养将斜面种子接入液体培养基中，在28℃～31℃条件下，摇床培养16h～18h，制得摇瓶种子液；(3)种子罐种子培养将摇瓶种子液按7％～10％的接种量接入种子罐液体培养基中，装料系数0.7，控制温度28℃～31℃、pH7.0～7.2，保持溶氧饱和度10％以上，培养24h～30h，制得种子罐种子液；(4)分批发酵将种子罐种子液按7％～10％的接种量接入液体培养基中，装料系数0.7，控制温度28℃～31℃、pH7.0～7.2，保持溶氧饱和度10％以上，培养30h～32h，收集发酵液；(5)多糖的提取将发酵液稀释、离心分离，将离心液浓缩至1/6～1/12体积，用食用酒精沉淀，将沉淀物用水溶解，再经酒精沉淀、真空干燥后，得多糖产品。
3.按照权利要求2所述的微生物多糖的生产方法，其特征在于所述的步骤(4)是补料分批发酵将种子罐种子液按7％～10％的接种量接入液体发酵培养基中，装料系数0.7，控制温度28℃～31℃、pH7.0～7.2，保持溶氧饱和度10％以上，培养25～30h，开始补加糖，控制发酵液中糖浓度在15g/L-35g/L，发酵培养到48-56h，收集发酵液。
4.按照权利要求2所述的微生物多糖的生产方法，其特征在于所述的斜面固体培养基组分及其含量按g/L计葡萄糖5～10，(NH4)2SO40.3～0.8，KH2PO4.12H2O 0.3～0.61，K2HPO40.2～0.39，NaCl 0～0.1，酵母水解粉0.5～1，H3BO30.002，Na2MoO40.002，琼脂20～23，余量为水。
5.按照权利要求2所述的微生物多糖的生产方法，其特征在于所述的液体培养基组分及其含量按g/L计糖10～30，(NH4)2SO40.8～3.0，KH2PO4.12H2O 0.61～1.22，K2HPO40.39～0.78，NaCl 0～0.1，酵母水解粉0.5～2，H3BO30.002，Na2MoO40.002，余量为水。
6.按照权利要求1所述微生物多糖的用途，用来制备提高免疫功能的药品。
全文摘要
一种微生物多糖，是采用保藏号为CCTCC M205108的锦鸡儿根瘤菌菌种，在以碳水化合物为碳源，以铵盐为氮源的培养基和合适的培养条件下，发酵制得。其生产方法包括斜面种子培养，摇瓶种子培养，种子罐种子培养，分批发酵或补料分批发酵，多糖的提取。通过分批发酵生产的多糖产品，其产量可达到7.7g/L～10.2g/L；通过补料分批发酵生产的多糖产品，其产量可达15.1g/L～16.2g/L。该多糖的分子量在2.7×10
文档编号C08B37/00GK1827771SQ200510048129
公开日2006年9月6日 申请日期2005年11月26日 优先权日2005年11月26日
发明者赵良启, 黄晓波, 韩勇, 史清亮, 张建国 申请人:山西大学