专利名称：：一种龙须菜活性多糖的制备方法
技术领域：
：本发明涉及海洋植物多糖的提取领域，具体地说涉及一种龙须菜多糖的制备方法。
背景技术：
：龙须菜富含海藻多糖、碘、钙、铁等多种人体必须的常、微量元素和维生素A、Bl、C等。《食疗本草》和《本草纲目》中记载龙须菜具有治甲状腺肿、水肿、泌尿器病、防溃疡等功效。日本研究证明，龙须菜有清肺通便、养颜瘦身，降血压血脂和调节身体机能等功效，并认为食用龙须菜是日本国冲绳岛人平均寿命居世界之最的主要原因。但目前对龙须菜的利用还主要用于生产琼脂和少量的作为鲍鱼饲料，琼脂的制作工艺中只保留了胶体部分，研究表明被倾倒的非胶体部分多糖含量接近90%，具有很高的免疫活性。所以对非胶体部分的进一步研究开发利用势在必行。龙须菜多糖活性的研究始于近几年，一般都采用传统的高温中性水提法，通过研究比较证明此法提取物中多为胶体部分，非胶体活性部分得率反而低，而且最关键的是得到的多糖生物活性差。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于提供一种龙须菜活性多糖的制备方法，以解决现有技术中多糖得率低、生物活性差的缺陷。本发明的原理是采用冻溶法将活性较小的胶体部分和高活性多糖进行分离。以活性为筛选指标筛选出最具活性的提取温度，区别于传统方法以得率为指标来筛选温度。研究证明提取温度是活性的主要影响因素。本发明提供了一种龙须菜活性多糖的制备方法，包括如下步骤①前处理将龙须菜于45-5(TC烘箱干燥，80-100目粉碎，备用；②多糖的提取在粉碎好的龙须菜粉末中加入30-50倍重量的水，在30-IO(TC水浴锅中浸提3-5小时；12000g离心20分钟，离心沉淀重复上述步骤，再浸提l-2次，合并滤液；③除去海藻胶将上述滤液于一20-—8(TC冷冻，过夜，然后fC溶化，12000g离心30分钟，收集上清；④提取液透析将上述上清液浓縮至1/4体积，fC下用分子截留量为1万的透析膜透析4-5天，取一万分子量以上部分；⑤干燥将上述一万分子量以上部分冷冻干燥，即获得所需的龙须菜多糖。其中所用的原料龙须菜采收于2006年'6月广州汕头；其中步骤②中对龙须菜粉末的浸提温度优选为45-55'C，最优选的浸提温度为5(TC。本发明以免疫活性为指标(大量研究表明多糖作为大分子是通过提高机体的免疫功能而达到其他活性作用的，所以选用此作为筛选指标)对不同的提取温度进行筛选，得到最佳的提取温度，并且对此温度下的提取时间、提取次数以及固液比以得率为指标进行了优化，经过优化后得率在13%以上，而且其中活性多糖的含量超过76%,'基本都在80%以上。而且本发明采用冻溶的方法将胶体和水溶性多糖分离。因为琼脂就是龙须菜中的胶体部分，所以冻溶后得到的胶体部分可以再利用。同时龙须菜在45-55t:提取得到的活性最好，所以对提取后的藻渣可以进一步进行高温提取，制备琼脂。所以本研究是不仅对目前龙须菜琼胶生产的废物再利用过程，充分利用了资源；而且也为海洋活性物质的开发利用提供了参考。通过上述制备方法可获得质量稳定、有效成分含量高的龙须菜多糖。而且所提取的多糖能明显增强淋巴细胞的增殖从而增强机体免疫活性作用。本方法是龙须菜制作琼脂过程中的废物再利用，且获得了高含量、高活性的成分。所以本制备方法是一种充分利用资源、成本低、无污染、多糖纯度高且简便、快速、高效适合工业化生产的方法。具体实施方式实施例1①前处理将龙须菜冲洗干净，于45'C烘箱干燥，80目粉碎，备用；②多糖的提取在粉碎好的龙须菜粉末中加入40倍重量的水，在50'C水浴锅中浸提4小时；12000g离心20分钟，离心沉淀重复上述步骤，再浸提1次，合并滤液；③除去海藻胶将上述滤液于一2(TC冷冻，过夜，然后4'C溶化，12000g离心30分钟，收集上清；④提取液透析将上述上清液浓縮，4'C下用透析膜透析，透析膜的分子截留量为1万；透析4-5天，取一万分子量以上部分；⑤干燥将上述一万分子量以上部分冷冻干燥，即获得所需的龙须菜多糖。制备的多糖含量为87。％，对小鼠淋巴细胞增殖率为了275%。实施例2①前处理将龙须菜于5(TC烘箱干燥，80目粉碎，备用；②多糖的提取在粉碎好的龙须菜粉末中加入40倍重量的水，在60t:水浴锅中浸提4小时；12000g离心20分钟，离心沉淀重复上述步骤，再浸提1次，合并滤液；③除去海藻胶将上述滤液于一2(TC冷冻，过夜，然后4'C溶化，12000g离心30分钟，收集上清；④提取液透析将上述上清液浓縮，fC下用透析膜透析，透析膜的分子截留量为1万；透析4-5天，取一万分子量以上部分；⑤干燥将上述一万分子量以上部分冷冻干燥，即获得所需的龙须菜多糖。制备的多糖含量为86.5%,对小鼠淋巴细胞增殖率为247%。实施例3其他步骤同实施例1-2，只是对龙须菜粉末于7CTC水浴锅中浸提，制备的多糖含量为80%，对小鼠淋巴细胞增殖率为212%。实施例4其他步骤同实施例l-2，只是对龙须菜粉末于80'C水浴锅中浸提，制备的多糖含量为87%，对小鼠淋巴细胞增殖率为227%。实施例5其他步骤同实施例卜2，只是对龙须菜粉末于9(TC水浴锅中浸提，制备的多糖含量为76%，对小鼠淋巴细胞增殖率为193%。实施例6其他步骤同实施例1-2，只是对龙须菜粉末于IOO'C水浴锅中浸提，制备的多糖含量为90%，对小鼠淋巴细胞增殖率为178%。具体的实施例1-6所提取的多糖含量和其对小鼠淋巴细胞的增殖率比较见表l:表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例7:多糖含量的检测以半乳糖为标准品，采用苯酚一硫酸法测定多糖含量(DuboisMetal.,1956)精密称取实施例1-6所制备的样品0.5g，加水提取温度水浴充分溶解，转移至100ml容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，再稀释50倍，稀释成O.lmg/ml。精密吸取以上液体2.0ml，置于15ml试管中，分别加入596苯酚溶液1.0ml，迅速加入浓硫酸5.0ml，充分振荡，使之反应充分在室温下(20-25°C)放置30分钟后，于490nm波长处测定吸光值。实施例1-6所得多糖的具体含量见表1。实施例8:制备所得龙须菜活性多糖的生物.活性检测将小鼠颈椎脱臼处死，取脾脏，用PBS冲洗34次。用100目筛在培养皿中将脾脏磨碎，磨碎后的混悬液以400Xg离心6min，吸去上清液，加入浓度为0.83%氯化氨溶液裂解红细胞，反复冲打，静置10min后400Xg离心6min，收集的细胞用PBS缓冲液冲洗数遍后，台朌蓝检查活力在95%以上。用RPMI1640将细胞稀释成2X106个/niL，加入96孔细胞培养板中，在37°。、含5%的0)2条件下培养。将180pL每mL含2xl(^个淋巴细胞的悬浮液加至96孔板中，同时加入20pL样品(样品包含空白对照PBS、阳性对照PHA和实施例l-6所制备的多糖样品)，于37'C、含5%的C02条件下培养3d,用酶标仪测定其570nm和600nm处的吸光度，然后加入20AlamarBlue试剂，再培养，变色后再测定570nm和600nm处的吸光度，然后根据AlamarBlue试剂的公式计算各种样品对细胞增殖的影响。计算公式为增殖率(％)=〔80856xAx57Q(sample)-117216xA画(sample)〕/(80856xA，(control)-117216xA應(control))x100%(公式中的sample指得是多糖样品，control指得是空白对照PBS。)实施例1-6所制备的多糖对小鼠淋巴细胞增殖率的具体数值见表1。权利要求1.一种龙须菜活性多糖的提取方法，其特征在于该方法包括如下步骤①前处理将龙须菜于45-50℃烘箱干燥，80-100目粉碎，备用；②多糖的提取在粉碎好的龙须菜粉末中加入30-50倍重量的水，在30-100℃水浴锅中浸提3-5小时；12000g离心20分钟，离心沉淀重复上述步骤，再浸提1-2次，合并滤液；③除去海藻胶将上述滤液于-20--80℃冷冻，过夜，然后4℃溶化，12000g离心30分钟，收集上清；④提取液透析将上述上清液浓缩至1/4体积，4℃下用分子截留量为1万的透析膜透析4-5天，取一万分子量以上部分；⑤干燥将上述一万分子量以上部分冷冻干燥，即获得所需的龙须菜多糖。2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤②中对龙须菜粉末的浸提温度为45-55'C。3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于步骤②中对龙须菜粉末的浸提温度为50°C。全文摘要本发明提供了一种龙须菜活性多糖的制备方法。该方法包括对龙须菜进行前处理、最佳活性温度下的多糖提取、除胶、透析和干燥等步骤。该制备方法得到的龙须菜活性多糖得率在13％左右，多糖含量超过76％，且对小鼠淋巴细胞具有较高的增殖效果，从而具有较强的免疫活性。文档编号C08B37/00GK101100488SQ200710044610公开日2008年1月9日申请日期2007年8月6日优先权日2007年8月6日发明者唐庆九,张劲松,朱地琴,潘迎捷,勇赵申请人:上海水产大学