专利名称：：聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属化合物及其合成方法，涉及聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物及其合成方法，以及聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
：肿瘤一直是直接威胁人类健康的重大疾病，肿瘤化疗由于药物本身缺乏分子耙向性，因而出现治愈率低、毒副作用巨大等重大治疗问题。通过合适的载体技术，将药物直接靶向病变组织(器官)、细胞是解决癌症化疗治愈率低和毒副作用的重要手段之一。目前国内外的科学家通过载体技术在肿瘤药物的组织(器官)和细胞靶向上取得了一定的进展，但并没有取得突破性的疗效，其本质在于绝大多数抗肿瘤药物的分子作用耙点位于细胞内，因此肿瘤细胞内药物分子作用靶点(亚细胞器)靶向性载体材料技术的研究开发是突破癌症化疗瓶颈的关键。靶向载体的设计主要包括载体的病灶脏器耙向性，以及在此基础上穿越病灶脏器内的病灶细胞靶向，从而完成针对药物分子靶标的亚细胞器耙向。早期的组织器官耙向，利用微粒的小粒径被动耙向到肝等组织，通过"增强的透过及滞留效应"(enhancedpermeabilityandretentioneffect)聚集到肿瘤组织等。当前，研究者利用肿瘤细胞表面某些受体(如叶酸受体)过度表达的特性，将配体修饰载体材料成功应用于肿瘤的靶向治疗。从而达到肿瘤细胞的耙向，提高细胞内的抗肿瘤药物浓度，增强抗肿瘤药物本身的疗效。近年来，聚合物胶团在药物制剂学、生物医学及高分子领域已经引起了人们广泛的重视。聚合物胶团是由两亲性的嵌段或接枝共聚物在水性介质中自聚形成，具有核-壳结构。其疏水性链段构成胶团的内核，亲水性链段形成胶团的外壳。疏水核可为难溶性药物提供储库的作用；亲水性外膜保持胶团在水性环境中的稳定性，并可进行理化性质修饰以达到特定的目的，如胶团的主动耙向等。聚合物胶团作为一种药物传输系统，有许多优势通过调整材料的溶解性、pH值、Zeta电位等可以控制药物在生物体内的释放；由于胶团粒径很小，故可穿过血脑屏障、网状内皮组织系统，也可促进肠胃黏膜等的良好吸收，到达大尺寸粒子无法通过的部位，达到被动靶向的目的；聚合物胶团骨架对药物的保护和屏蔽作用，可在一定程度上避免药物的分解，保持药物的稳定性，降低药物的毒性；与脂质体相比，聚合物胶团的载药量较高；聚合物材料的多样性，使得以聚合物为载体的药物制剂亦多样化，能满足各种使用需求。有报道指出，在药物载体中进行亲水性的聚乙二醇修饰，可以减少血浆蛋白对载体的吸附作用，同时可减少巨噬细胞对药物载体的吞噬作用，使载体在循环系统中的半衰期延长。基于此在聚合物胶团的亲水外壳上进行聚乙二醇修饰，可以减少血浆蛋白对聚合物胶团的调理作用，从而减少巨噬细胞对聚合物胶团的摄取，延缓聚合物胶团从血浆中被清除的过程。通过"增强的透过及滞留效应"，可进一步提高聚合物胶团在肿瘤组织的被动靶向功能。本发明在我们前期的研究工作基础上，利用壳寡糖脂肪酸嫁接物形成的胶团，进行表面聚乙二醇修饰，合成了可以避免网状内皮系统识别的长循环性壳寡糖脂肪酸嫁接物，并应用于抗肿瘤药物的制备。
发明内容本发明的一个目的是提供聚乙二醇修饰的壳寡糖脂肪酸嫁接物，其具有代表性的结构通式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中x，y为聚合度；n=12-22;壳寡糖的分子量为1100kDa，脱乙酰度为70-100%;壳寡糖链上的部分自由氨基被聚乙二醇取代。本研究中所采用的壳寡糖脂肪酸嫁接物己在发明专利ZL2005100507981中公开，所述的荧光标记疏水改性壳寡糖聚合物，具有以下结构通式壳寡糖的分子量小于200kDa，壳寡糖链上的部分自由氨基被烷基取代，氨基取代度为150%，其中R,为荧光基团，R2为垸基链，n为壳寡糖的聚合度，带有正电荷，zeta电位在580mV，粒径在51000nm，共价结合荧光分子。其中的疏水改性壳寡糖聚合物通过以下步骤实现取分子量450kDa，壳聚糖,在556(TC和pH5.0条件下搅拌溶解，按纤维素酶与壳聚糖重量比为0.5:IOO加入纤维素酶降解，过滤除去杂质，以超滤膜超滤分级，滤液冷冻干燥，得分子量小于200kDa的低分子量壳寡糖，凝胶渗透色谱法测定分子量，取上述壳寡糖水溶液，按照壳寡糖、脂肪酸、交联偶合剂碳二亚胺摩尔比1:150:150，控制5(TC9(TC，反应548小时，终反应液透析纯化，冷冻干燥得到疏水改性壳寡糖。本发明的第二个目的是提供壳寡糖脂肪酸嫁接物胶团的聚乙二醇修饰方法，通过以下方案实现分别称取适量壳寡糖脂肪酸嫁接物和端醛基化聚乙二醇(端醛基化聚乙二醇和壳寡糖脂肪酸的摩尔比例分别为1:5、1:1、5:1、10:1、20:1中的一种)，加入50ml蒸馏水后探头超声20次使溶解(400w，工作2秒，间歇3秒)，室温下400rpm搅拌过夜后停止反应，将反应产物置于透析袋中(截留分子量为7000Da，SpectrumLaboratories(光谱实验室)，LagunaHills(旧金山)，CA(加尼福利亚州))透析48小时，以除去未反应的端醛基化聚乙二醇，然后将透析液冷冻干燥，得聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物固体粉末。本发明的第三个目的是提供聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物胶团作为长循环性载体在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的有益之处是所制备得到的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物，具有在水性介质中通过自聚集形成胶团的特性，聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物的临界胶团浓度在15pg/ml左右，明显低于一般表面活性剂的临界胶团浓度。可显著减少壳寡糖脂肪酸嫁接物胶团在巨噬细胞中的摄取，并且随着聚乙二醇修饰比例的增加，胶团在巨噬细胞中的摄取逐渐减少。聚乙二醇修饰后，胶团对肝癌细胞HepG2和永生化正常肝细胞BRL-3A的摄取没有显著影响。以丝裂霉素C为模型药物制备的，嫁接物胶团给药系统的抗肿瘤药效学研究表明，聚乙二醇修饰的壳寡糖脂肪酸嫁接物胶团负载丝裂霉素C后，细胞毒性作用可以与负载丝裂霉素C的壳寡糖脂肪酸嫁接物胶团保持在同一水平，与游离丝裂霉素C相比，药效提高了14倍左右。图h聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团在巨噬细胞RAW264.7中的定量摄取。图2:聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团在肝癌细胞HepG2中的定量摄取。图3:聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团在永生化正常肝细胞BRL-3A中的定量摄取。图4:聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物(A)、壳寡糖硬脂酸嫁接物(B)和端醛基化聚乙二醇(C)的氢谱核磁共振图谱。具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例一1、聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团的制备与理化性质测定利用端醛基化聚乙二醇中具有强反应活性的醛基与嫁接物中壳寡糖主链上未被硬脂酸取代的氨基之间的席夫反应，合成聚乙二醇修饰的嫁接物。精密称取壳寡糖-硬脂酸嫁接物200mg，端醛基化聚乙二醇2.68mg(端醛基化聚乙二醇和壳寡糖-硬脂酸嫁接物的摩尔比例为1:5)，溶于50mL去离子水中，探头超声20次(400w，工作2s间歇3s)，室温下磁力搅拌(400rpm)过夜，将反应产物置于透析袋中(截留分子量为7000Da，SpectrumLaboratories,LagunaHills,CA)中，透析48h，以除去未反应的端醛基化聚乙二醇，然后将透析液冷冻干燥，得聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸聚合物固体粉末。经微粒粒度与表面电位测定仪测定，1.0mg/mL该嫁接物胶团在PBS中的粒径为119.2土7.5nm，表面电位为14.5±5.8mV。采用芘荧光法，测得嫁接物胶团在PBS中的临界胶团浓度为12.5pg/ml。2、聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团在不同细胞系中的摄取研究取聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物10mg，精密称定，溶于2mL去离子水中，探头超声20次(400w,工作2s间歇3s)后，加入200异硫氰基荧光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)的乙醇溶液(2.0mg/mL)，在避光与磁力搅拌(400rpm)条件下，连续反应24h。将终反应液置透析袋(截留分子量为7000Da，SpectrumLaboratories,LagunaHills，CA)中，用去离子水透析24h，除去未反应的FITC。透析液冷冻干燥，得到聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物的荧光标记产物。取RAW264.7、HepG2、BRL-3A细胞，在含有10%胎牛血清的DMEM(RAW264.7和HepG"和含有10%新生牛血清的1640培养液(BRL-3A)中连续培养(5。/。C02,37。C孵箱)。取对数生长期，胰酶消化后用培养液稀释，按每孔lx105个细胞的密度接种于24孔培养板(NalgeNuneInterational，Naperville,IL，USA)孵箱内培养24h。在培养液中加入异硫氰基荧光素标记的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团溶液孵育。胶团浓度控制为100pg/ml。培养1.5，3，6，12，24h后，用PBS润洗细胞，然后用胰酶消化。收集细胞消化液，探头超声20次(400w，工作2s间歇3s)，得到细胞裂解液。用荧光分光光度计测定细胞裂解液中的荧光强度，计算细胞对聚乙二醇修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的摄取百分数，并用蛋白校正。按(1)式计算细胞对胶团的摄取量Pt(%)=Ft/F。X100%(1)其中，Pt是t时间内细胞对胶团的摄取百分数，Ft和F。分别是t时间和0时间的荧光吸收(已通过蛋白校正)。嫁接物胶团的细胞摄取结果见图1-3。孵育12h后，该胶团在巨噬细胞RAW264.7细胞中的摄取量为41.4%，与未修饰的壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团在相同时间内的摄取量(56.3%)相比，摄取量减少了15%左右，并且摄取已基本达到平衡。该胶团在肿瘤细胞HepG2以及正常细胞BRL-3A中的摄取与未修饰胶团相比，没有显著性区别。3、聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团在制备抗肿瘤药物中的应用取聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物适量，溶于PBS中，加入适量丝裂霉素C的PBS溶液，探头超声20次(400w，工作2s间歇3s)，得到负载丝裂霉素c的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团溶液，胶团溶液中嫁接物的浓度为5mg/ml，药物的包封率为30%左右。以肝癌细胞HepG2为模型细胞，负载丝裂霉素C的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团的抗肿瘤疗效通过给药系统与细胞共孵育后的IC50值(细胞的半数致死率)来评价。细胞存活率试验采用四唑盐比色法(MTTAssay)测定。细胞于24孔板预培养24h贴壁生长后，分别加入不同浓度的丝裂霉素C溶液(溶剂为PBS)和不同浓度的负载丝裂霉素C的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团，并设对照孔，每组重复3次；孵育48h后，每孔加入MTT溶液60pL孵育4h后弃去上清液，PBS溶液冲洗2次，每孔加入DMSO400pL，终止反应。将培养板水平振荡10min，用酶联检测仪在570nm处测定吸收度，按(2)式计算细胞存活率细胞存活率(％)=八57()(样品)/A57o(对照)xlOOX(2)其中A^(样品)为加入游离药物或载药胶团后的细胞的吸收度，A^(对照)为空白对照的细胞的吸收度。丝裂霉素C溶液的IC5o值为1.97士0.2pg/ml，负载丝裂霉素C的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团IC5o值为0.12i0.03pg/ml，药效提高了约14倍。与负载丝裂霉素C的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团IC5o值(0.13±0.02tig/ml)相比，聚乙二醇修饰后不影响载药胶团的抗肿瘤活性。实施例二1、聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团的制备与理化性质测定利用端醛基化聚乙二醇中具有强反应活性的醛基与嫁接物中壳寡糖主链上未被硬脂酸取代的氨基之间的席夫反应，合成聚乙二醇修饰嫁接物。精密称取壳寡糖硬脂酸嫁接物200mg，端醛基化聚乙二醇13.4mg(端醛基化聚乙二醇和壳寡糖-硬脂酸嫁接物的摩尔比例为1:1)，溶于50mL去离子水中，探头超声20次(400w，工作2s间歇3s)，室温下磁力搅拌(400rpm)过夜，将反应产物置于透析袋中(截留分子量为7000Da，SpectrumLaboratories,LagunaHills，CA)中，透析48h，以除去未反应的端醛基化聚乙二醇，然后将透析液冷冻干燥，得聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸聚合物固体粉末。经微粒粒度与表面电位测定仪测定，1.0mg/mL该嫁接物胶团在PBS中的粒径为161.2±4.8nm，表面电位为14.3±4.6mV。采用芘荧光法，测得嫁接物胶团在PBS中的临界胶团浓度为11.5ng/ml。2、聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团在不同细胞系中的摄取研究取聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物10mg,精密称定，溶于2mL去离子水中，探头超声20次(400w，工作2s间歇3s)后，加入200异硫氰基荧光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)的乙醇溶液(2.0mg/mL)，在避光与磁力搅拌(400rpm)条件下，连续反应24h。将终反应液置透析袋(截留分子量为7000Da，SpectrumLaboratories,LagunaHills，CA)中，用去离子水透析24h，除去未反应的FITC。透析液冷冻干燥，得到聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物的荧光标记产物。取RAW264.7、HepG2、BRL-3A细胞，在含有10%胎牛血清的DMEM(RAW264.7和HepG2)和1640培养液(BRL-3A)中连续培养(5%C02,37。C孵箱)。取对数生长期，胰酶消化后用培养液稀释，按每孔^105个细胞的密度接种于24孔培养板(NalgeNuneInterational，Naperville,IL,USA)孵箱内培养24h。在培养液中加入异硫氰基荧光素标记的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团溶液孵育。胶团浓度控制为100pg/ml。培养1.5，3，6，12，24h后，用PBS润洗细胞，然后用胰酶消化。收集细胞消化液，探头超声20次(400w，工作2s间歇3s)，得到细胞裂解液。用荧光分光光度计测定细胞裂解液中的荧光强度，计算细胞对聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团的摄取百分数，并用蛋白校正。按(1)式计算细胞对胶团的摄取量Pt(%)=Ft/F。X100%(1)其中，Pt是t时间内细胞对胶团的摄取百分数，Ft和Fo分别是t时间和0时间的荧光吸收(已通过蛋白校正)。嫁接物胶团的细胞摄取结果参见图1-3。孵育24h后，该胶团在巨噬细胞RAW264.7细胞中的摄取量为29.6%，与未修饰的壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团在相同时间内的摄取量(58.4%)相比，摄取量减少了30%左右。与修饰比例为l:5聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团在24h的摄取量(45%)相比，该胶团在RAW264.7细胞中的摄取进一步减少。该胶团在肿瘤细胞HepG2以及正常细胞BRL-3A中的摄取与未修饰胶团相比，没有显著性区别。图1是FITC标记的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团在RAW264.7细胞中的摄取情况(o》壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团；(a):聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团(聚乙二醇和壳寡糖硬脂酸嫁接物的摩尔比例为1:5);(x)聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团(聚乙二醇和壳寡糖硬脂酸嫁接物的摩尔比例为l:l);(□)聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团(聚乙二醇和壳寡糖硬脂酸嫁接物的摩尔比例为5:1)。图2是FITC标记的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团在H印G2细胞中的摄取情况(o):壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团；(a):聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团(聚乙二醇和壳寡糖硬脂酸嫁接物的摩尔比例为1:5);(x)聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团(聚乙二醇和壳寡糖硬脂酸嫁接物的摩尔比例为l:l);(□)聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团(聚乙二醇和壳寡糖硬脂酸嫁接物的摩尔比例为5:1)。图3是FITC标记的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团在HepG2细胞中的摄取情况(o):壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团；(a):聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团(聚乙二醇和壳寡糖脂酸嫁接物的摩尔比例为1:5);(x)聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团(聚乙二醇和壳寡糖硬脂酸嫁接物的摩尔比例为l:l);(□)聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团(聚乙二醇和壳寡糖硬脂酸嫁接物的摩尔比例为5:1)。3、聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团的制备抗肿瘤药物中的应用取聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物适量，溶于PBS中，加入适量丝裂霉素C的PBS溶液，探头超声20次(400w，工作2s间歇3s)，得到负载丝裂霉素C的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团溶液，胶团溶液中嫁接物的浓度为5mg/ml，药物的包封率为30%左右。以肝癌细胞HepG2为模型细胞，负载丝裂霉素C的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团的抗肿瘤疗效通过给药系统与细胞共孵育后的IC50值(细胞的半数致死率)来评价。细胞存活率试验采用四唑盐比色法(MTTAssay)测定。细胞于24孔板预培养24h贴壁生长后，分别加入不同浓度的丝裂霉素C溶液(溶剂为PBS)和不同浓度的负载丝裂霉素C的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团，并设对照孔，每组重复3次；孵育48h后，每孔加入MTT溶液60pL孵育4h后弃去上清液，PBS溶液冲洗2次，每孔加入DMSO400nL,终止反应。将培养板水平振荡10min，用酶联检测仪在570nm处测定吸收度，按(2)式计算细胞存活率细胞存活率(％)=八57()(样品)/As7。(对照)xl00X(2)其中A570(样品)为加入游离药物或载药胶团后的细胞的吸收度，A57。(对照)为空白对照的细胞的吸收度。丝裂霉素C溶液的IC5。值为1.97士0.2ng/ml，负载丝裂霉素C的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团IC5o值为0.14士0.04吗/ml，药效提高了约14倍。与负载丝裂霉素C的壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团IC5o值(0.13±0.02pg/ml)相比，聚乙二醇修饰后不影响载药胶团的抗肿瘤活性。实施例三1、聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团的制备与理化性质测定利用端醛基化聚乙二醇中具有强反应活性的醛基与嫁接物中壳寡糖主链上未被硬脂酸取代的氨基之间的席夫反应，合成聚乙二醇修饰的嫁接物。精密称取壳寡糖硬脂酸嫁接物200mg，端醛基化聚乙二醇67mg(端醛基化聚乙二醇和壳寡糖硬脂酸嫁接物的摩尔比例为5:1)，溶于50mL去离子水中，探头超声20次(400w，工作2s间歇3s)，室温下磁力搅拌(400rpm)过夜，将反应产物置于透析袋中(截留分子量为7000Da，SpectrumLaboratories,LagunaHills，CA)中，透析48h，以除去未反应的端醛基化聚乙二醇，然后将透析液冷冻干燥，得聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸聚合物固体粉末。经微粒粒度与表面电位测定仪测定，1.0mg/mL该嫁接物胶团在PBS中的粒径为171.8±9.2nm,表面电位为15.9±5.3mV。采用芘荧光法，测得嫁接物胶团在PBS中的临界胶团浓度为11.7吗/ml。聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物、壳寡糖硬脂酸嫁接物和端醛基化聚乙二醇的氢谱核磁共振图谱见参图4(图中(A):聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物、(B)壳寡糖硬脂酸嫁接物、(C)端醛基化聚乙二醇)，由图4可见聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物中出现了聚乙二醇重复单元乙二醇的质子峰(3=3-3.6);而端醛基化聚乙二醇中的醛基的质子峰(5=9.6)，没有在聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物的图谱中出现，表明聚乙二醇与壳寡糖硬脂酸嫁接物是以化学键共价结合的。2、聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团在不同细胞系中的摄取研究取聚乙二醇修饰的壳寡糖硬脂酸嫁接物10mg，精密称定，溶于2mL去离子水中，探头超声20次(400w,工作2s间歇3s)后，加入200异硫氰基荧光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)的乙醇溶液(2.0mg/mL)，在避光与磁力搅拌(400rpm)条件下，连续反应24h。将终反应液置透析袋(截留分子量为7000Da，SpectrumLaboratories,LagunaHills，CA)中，用去离子水透析24h，除去未反应的FITC。透析液冷冻干燥，得到聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物的荧光标记产物。取RAW264.7、HepG2、BRL-3A细胞，在含有10%胎牛血清的DMEM(RAW264.7和HepG2)和1640培养液(BRL-3A)中连续培养(5%C02，37。C孵箱)。取对数生长期，胰酶消化后用培养液稀释，按每孔^105个细胞的密度接种于24孔培养板(NalgeNuneInterational，Naperville，IL，USA)孵箱内培养24h。在培养液中加入异硫氰基荧光素标记的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团溶液孵育。胶团浓度控制为100]Lig/ml。培养1.5，3，6，12，24h后，用PBS润洗细胞，然后用胰酶消化。收集细胞消化液，探头超声20次(400w，工作2s间歇3s)，得到细胞裂解液。用荧光分光光度计测定细胞裂解液中的荧光强度，计算细胞对聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团的摄取百分数，并用蛋白校正。按(1)式计算细胞对胶团的摄取量Pt(%)=Ft/FoX100%(1)其中，Pt是t时间内细胞对胶团的摄取百分数，Ft和Fo分别是t时间和0时间的荧光吸收(已通过蛋白校正)。嫁接物胶团的细胞摄取结果见图1-3。孵育24h后，该胶团在巨噬细胞RAW264.7细胞中的摄取量为17.7%，与未修饰的壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团在相同时间内的摄取量(58.4%)相比，摄取量减少了40%左右。与修饰比例为1:1聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团在24h的摄取量(29.6%)相比，该胶团在RAW264.7细胞中的摄取进一步减少。该胶团在正常细胞BRL-3A中的摄取与未修饰胶团相比，没有显著性区别；在肿瘤细胞HepG2中，12h之内该胶团的摄取与未修饰胶团相比略有减少，当孵育时间达到24h后，两者之间的摄取已没有明显差异。3、聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团在制备抗肿瘤药物中的应用取聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物适量，溶于PBS中，加入适量丝裂霉素C的PBS溶液，探头超声20次(400w，工作2s间歇3s)，得到负载丝裂霉素C的聚乙二醇修饰壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液，胶团溶液中嫁接物的浓度为5mg/ml，药物的包封率为30%左右。以肝癌细胞HepG2为模型细胞，负载丝裂霉素C的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团的抗肿瘤疗效通过给药系统与细胞共孵育后的IC50值(细胞的半数致死率)来评价。细胞存活率试验采用四唑盐比色法(MTTAssay)测定。细胞于24孔板预培养24h贴壁生长后，分别加入不同浓度的丝裂霉素C溶液(溶剂为PBS)和不同浓度的负载丝裂霉素C的聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团，并设对照孔，每组重复3次；孵育48h后，每孔加入MTT溶液60pL孵育4h后弃去上清液，PBS溶液冲洗2次，每孔加入DMSO400pL，终止反应。将培养板水平振荡10min，用酶联检测仪在570nm处测定吸收度，按(2)式计算细胞存活率细胞存活率(％)=八57()(样品)/A57o(对照)xlOOX(2)其中A57。(样品)为加入游离药物或载药胶团后的细胞的吸收度，A570(对照)为空白对照的细胞的吸收度。丝裂霉素c溶液的IQo值为1.97±0.2pg/ml，负载丝裂霉素C的聚乙二醇修饰壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团IQo值为0.11±0|ag/ml，药效提高了约14倍。与负载丝裂霉素C的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团IC5o值(0.13±0.02^ig/ml)相比，聚乙二醇修饰后不影响载药胶团的抗肿瘤活性。实施例四1、聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团的制备与理化性质测定利用端醛基化聚乙二醇中具有强反应活性的醛基与嫁接物中壳寡糖主链上未被硬脂酸取代的氨基之间的席夫反应，合成聚乙二醇修饰嫁接物。精密称取壳寡糖硬脂酸嫁接物200mg，端醛基化聚乙二醇134mg(端醛基化聚乙二醇和壳寡糖-硬脂酸嫁接物的摩尔比例为1:10)，溶于50mL去离子水中，探头超声20次(400w，工作2s间歇3s)，室温下磁力搅拌(400rpm)过夜，将反应产物置于透析袋中(截留分子量为7000Da,SpectrumLaboratories,LagunaHills,CA)中，透析48h，以除去未反应的端醛基化聚乙二醇，然后将透析液冷冻干燥，得聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸聚合物固体粉末。经微粒粒度与表面电位测定仪测定，1.0mg/mL该嫁接物胶团在PBS中的粒径为178.2±3.2nm，表面电位为15.5±4.8mV。采用芘荧光法，测得嫁接物胶团在PBS中的临界胶团浓度为12.9pg/ml。实施例五1、聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团的制备与理化性质测定利用端醛基化聚乙二醇中具有强反应活性的醛基与嫁接物中壳寡糖主链上未被硬脂酸取代的氨基之间的席夫反应，合成聚乙二醇修饰的嫁接物。精密称取壳寡糖硬脂酸嫁接物200mg，端醛基化聚乙二醇268mg(端醛基化聚乙14二醇和壳寡糖硬脂酸嫁接物的摩尔比例为1:20),溶于50mL去离子水中，探头超声20次(400w，工作2s间歇3s)，室温下磁力搅拌(400rpm)过夜，将反应产物置于透析袋中(截留分子量为7000Da,SpectrumLaboratories,LagunaHills，CA)中，透析48h，以除去未反应的端醛基化聚乙二醇，然后将透析液冷冻干燥，得聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸聚合物固体粉末。经微粒粒度与表面电位测定仪测定，1.0mg/mL该嫁接物胶团在PBS中的粒径为185.2±5.5nm，表面电位为16.1±3.7mV。采用芘荧光法，测得嫁接物胶团在PBS中的临界胶团浓度为13.5pg/ml。表l聚乙二醇修饰前后壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团的粒径、表面电位与临界胶团浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注a指壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团，b、c、d指聚乙二醇修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团，聚乙二醇和壳寡糖硬脂酸嫁接物的摩尔比例分别为1:5、1:1和5:1。权利要求1.一种聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物，其特征是具有以下结构通式其中x，y为聚合度；n＝12-22；壳寡糖的分子量为1～100kDa，脱乙酰度为70-100％；壳寡糖链上的部分自由氨基被聚乙二醇取代。本研究中所采用的壳寡糖脂肪酸嫁接物被发明专利ZL2005100507981所覆盖。1.一种聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物，其特征是具有以下其中x,y为聚合度；n=12-22;壳寡糖的分子量为1100kDa，脱乙酰度为70-100%;壳寡糖链上的部分自由氨基被聚乙二醇取代。本研究中所采用的壳寡糖脂肪酸嫁接物被发明专利ZL2005100507981所覆盖。2.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物，其特征是-该聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物具有在水性介质中通过自聚集形成胶团的特性，可显著减少壳寡糖脂肪酸嫁接物胶团在巨噬细胞中的摄取，而在肝癌细胞HepG2和永生化正常肝细胞BRL-3A的摄取没有显著影响。3.权利要求1所述的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物的制备方法，其特征是由聚乙二醇的醛基与壳寡糖的氨基的席夫反应合成得到，具体步骤为分别称取适量壳寡糖脂肪酸嫁接物和端醛基化聚乙二醇，加入50ml蒸馏水后探头超声20次使溶解，室温下400rpm搅拌过夜后停止反应，将反应产物置于透析袋中透析48小时，以除去未反应的端醛基化聚乙二醇，然后将透析液冷冻干燥，得聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物固体粉末。4.根据权利要求3所述的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物的制备方法，其特征是:端醛基化聚乙二醇和壳寡糖脂肪酸的摩尔比例分别为1:5、1:1、5:1、10:1或20:1中的一种。5.根据权利要求3所述的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物的制备方法，其特征是探头超声溶解条件400w，工作2秒，间歇3秒。6.根据权利要求3所述的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物的制备方法，其特征是反应产物置于透析袋中的截留分子量选为7000Da，SpectrumLaboratories,LagunaHills，CA。7.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物在制备抗肿瘤药物中应用。全文摘要本发明提供聚乙二醇修饰的壳寡糖脂肪酸嫁接物，称取壳寡糖脂肪酸嫁接物和端醛基化聚乙二醇，加入蒸馏水超声溶解，搅拌，透析，透析液冷冻干燥，得目的物。本发明的嫁接物具有在水性介质中通过自聚集形成胶团的特性，可显著减少壳寡糖脂肪酸嫁接物胶团在巨噬细胞中的摄取，并且随着聚乙二醇修饰比例的增加，胶团在巨噬细胞中的摄取逐渐减少。研究表明胶团对肝癌细胞HepG2和永生化正常肝细胞BRL-3A的摄取没有显著影响，细胞毒性作用可以与负载丝裂霉素C的壳寡糖脂肪酸嫁接物胶团保持在同一水平，与游离丝裂霉素C相比，药效提高了14倍左右，可长循环性载体在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的结构通式如图。文档编号C08B37/08GK101293933SQ200810062568公开日2008年10月29日申请日期2008年6月17日优先权日2008年6月17日发明者杜永忠,胡富强,盼蒙,弘袁申请人:浙江大学