专利名称：中药决明子多糖类化合物的提取方法
技术领域：
本发明属于中药功能性成分提取技术领域，具体地，是涉及一种从中药决明子中提取多糖 类化合物的方法。
背景技术：
决明子(Semen Cassiae)又名草决明、还瞳子，是国家卫生部公布的既是食品又是药品 的药食同源植物。其基原为豆科植物决明(Q^^o/)to^h'a丄.)的成熟种子。决明子具有清 肝、明目、利水、通便、降压、抗菌之功(中药大辞典(上册)[M]上海科学出版社.1986.949.)。 近年来，关于决明子的研究逐渐成为热点，但多集中在对决明子蛋白质及蒽醌类成分的研究， 如提取分离以及活性测定等。多糖是由多个相同或不相同的单糖以糖苷键相连而形成的高聚 物，在自然界分布极广。60年代以来人们逐渐发现其具有复杂的、多方面的生物活性和功能， 如免疫调节功能、抗病毒、抗肿瘤、降血脂、降血糖等，且其在医药上是一种很好的佐剂(方 积年.多糖研究的现状.药学学报，1986， 21 (12): 944-950.)。决明子多糖也是决明子中具 有医疗保健作用的主要成分之一，对细胞的生长和衰老具有一定的调控作用(方一苇.具有 药理活性多糖的研究现况，分析化学，1994， 22(9):955; VliegehthartJFG， KamerlingJP， VeldinkGA.Abstraetofthel2thlnternational CarbohydrateSymPosium ， Netherlands ， VonkPublishers, 1984:566)而决明子多糖的提取分离等研究较少，邓泽元等采用热水浸提法 提取决明子水溶性多糖(邓泽元等，决明子水溶性多糖提取的研究.食品科学.2002.23(1):72), 但高温水煮容易使决明子多糖结构改变，提取方法的不足限制了决明子多糖类化合物的应用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有研究的不足，提供一种高效提纯决明子多糖类化合物的方法， 这对决明子多糖的进一步开发利用具有重要的意义。
为了达到本发明的目的，本方法采用脉冲超声辅助酶解法。具体措施如下 一种决明子多糖类化合物的提取方法，主要包括以下步骤
(1) 原料预处理将决明子烘干，粉碎，得决明子粉末；
(2) 除脂用乙醇和乙醚混合溶剂浸泡决明子粉末，脱脂，回收溶剂，残渣风干；
(3) 脉冲超声处理按固液的质量比为l:25—40将残渣溶解于水中，得到浆液，将超 声探头插入浆液的固定深度，处理25—40min;
4(4) 复合酶制剂酶解及热水浸提调节处理后的浆液的pH值为5.5 — 6.5,加入浆液质 量的0.8%—1.5%的复合酶制剂酶解决明子中的纤维素、果胶及半纤维素等成分，充分酶解后 迅速升温至70—90'C，使复合酶制剂钝化，并保温浸提0.5—1.5h，收集上清液；离心后残渣 以相同条件再浸提一次，合并上清液；所述复合酶制剂由纤维素酶和果胶酶制成；
(5) 纳滤浓縮、醇沉、洗涤、干燥将合并后的上清液纳滤浓縮，然后加入3.5—4.5倍 体积的无水乙醇使多糖沉淀下来，沉淀依次经丙酮、乙醚洗涤后，50—7(TC下真空干燥得决 明子粗多糖；
(6) 脱色和脱蛋白将粗多糖配制成水溶液，调节pH值至7.8 — 9.2，加入&02进行氧 化脱色，纳滤除去H2Cb并浓缩，脱色后的多糖溶液中加入三氯乙酸溶液使蛋白质变性,离心， 取上清；或者将粗多糖配制成水溶液，加入三氯乙酸溶液使蛋白质变性，然后离心，取上清， 调节pH值至7.8 — 9.2，加入11202进行氧化脱色；
(7)纳滤除去溶液中的有机溶剂与小分子杂质并浓縮，加无水乙醇并离心收集沉淀， 经丙酮、乙醚洗涤后，真空干燥即得目的多糖(决明子多糖)。
优选地，所述复合酶制剂由质量比为2—4: 2的纤维素酶和果胶酶制成；更优选为质量
比为3: 2的纤维素酶和果胶酶制成。
优选地，步骤(3)为按固液的质量比1:30将残渣溶解于水中，得到浆液，将超声探 头插入桨液的固定深度，以20kHz、 1300W，脉冲工作时间4s、间歇时间2s、 22—28'C处理 25—40min。
所述决明子多糖类化合物的提取方法，优选为，主要包括以下步骤
(1) 原料预处理将决明子65 — 80。C烘干，并于120—15(TC下烘烤5—20min，以增加 其多糖含量，粉碎，得决明子粉末；
(2) 除脂用体积比1一2:1的乙醇和乙醚混合溶剂浸泡决明子粉末24h，脱脂，回收溶
剂，残渣风干；
(3) 脉冲超声处理按固液的质量比1:30将残渣溶解于水中，得到浆液，将超声探头 插入浆液的固定深度，以20kHz、 1300W，脉冲工作时间4s、间歇时间2s、 25。C处理30min ;
(4) 复合酶酶解及热水浸提调节处理后的浆液pH值为6.0，加入浆液质量的1%_1.5 %的复合酶制剂，35 — 4(TC下反应l一2h，充分酶解后迅速升温至70 — 90'C，使复合酶制剂 钝化，并保温浸提0.5 — 1.5h，离心收集上清液；离心后的残渣以相同条件再浸提一次，合并 上清液；
(5) 纳滤浓縮、醇沉、洗涤、干燥将合并后的上清液纳滤浓縮，然后加入其体积3.5 一4.5倍的无水乙醇使多糖沉淀下来，沉淀依次经丙酮、乙醚洗涤后，50 — 7(TC下真空干燥得 决明子粗多糖；(6)脱色和脱蛋白将粗多糖配制成浓度为10wt^水溶液，用氨水调节pH值至7.8 — 9.2，加入H2Cb进行氧化脱色，纳滤除去H2Cb并浓縮至一半体积，脱色后的多糖溶液中加 入其体积的15 — 30%的、浓度为8wt。/。的三氯乙酸溶液使蛋白质变性，离心，取上清；
(7)纳滤除去溶液中的有机溶剂与小分子杂质并浓縮，加无水乙醇并离心收集沉淀， 经丙酮、乙醚洗涤后，真空干燥即得目的多糖(决明子多糖)。
本发明具有如下优点
(1) 在方法学上，首次将超声波辅助酶解的方法应用于决明子多糖成分的提取中，这为 高效提取决明子多糖提供了方法学依据。
(2) 本发明提取决明子多糖化合物在得率和多糖品质上均优于单纯热提取方法，而且大 大提高了提取效率，有效降低了能源消耗，适合工业级制备。
图1为本发明提取分离决明子多糖类化合物的总流程图； 图2为本发明多糖提取物DEAE-纤维素柱层析洗脱曲线图。
具体的实施方式
如图l所示，本发明的方法包括步骤——决明子粗多糖提取流程图，步骤——决明子多 糖混合物脱色除蛋白流程图等两大步骤。 实施例1:
本实施例所用决明子购于药房，安徽产。
一种决明子多糖类物质的提取方法，包括以下骤(可参见图1一3):
(1) 决明子原料500g经70。C烘干水分后，于140。C下烘烤10min，粉碎；
(2) 用乙醇和乙醚(体积比1:1)混合溶剂浸泡24h脱脂，分2次进行，回收溶剂， 残渣风干，即用乙醇和乙醚混合溶剂溶解原料粉末中的脂类物质从而去除其中的 脂类；
(3) 按固液比l:30(w/w)将残渣溶解于水中，得到浆液，将超声探头插入浆液的固定 深度，以20kHz、 1300W，脉冲工作时间4s、间歇时间2s、室温(25°C)处理 30min;依靠(脉冲)超声波的空化及其它次级效应可加速原料内有效成分的溶 出、扩散释放并使其充分与溶剂混合，以便于提取；
(4) 调浆液pH6.0，加入浆液质量的1.0%的复合酶制剂，4(TC下反应1.5h，迅速升 温至80。C,使复合酶制剂钝化，并保温浸提约lh;离心收集上清液，离心后的残渣以相同条件再浸提一次，该复合酶制剂由质量比为3: 2的纤维素酶和果胶 酶制成；用复合酶制剂降解决明子中的纤维素、果胶和半纤维素等成分使多糖更 容易释放溶解；
(5) 合并上清液，透过反渗透膜，即纳滤浓缩后，加入其体积4倍的无水乙醇，置于 4'C中过夜，使多糖沉淀下来，离心收集沉淀，沉淀物依次用丙酮、乙醚洗涤后， 于6(TC下真空干燥得含大量杂质的决明子粗多糖；
(6) 将粗多糖配制成质量百分比为8wtn/。的水溶液，用氨水调节pH值至7.8-8.2，加
入H202进行氧化脱色纳滤除去H202并浓缩至一半体积；脱色后的多糖溶液中加
入其体积的20X的8wt。/。的三氯乙酸，搅拌均匀，室温静置25min， 4000r/min离 心Omm，取上清，
(7) 纳滤除去溶液中的有机溶剂与小分子杂质并浓縮，加4倍体积的无水乙醇并离心 收集沉淀，经丙酮、乙醚洗涤后，真空干燥即得目的多糖(决明子多糖)
(8)DEAE-纤维素柱层析方法鉴定多糖的组分分离鉴定决明子多糖的组分及含量。
将制得的多糖样品上DEAE-纤维素柱。洗脱程序如下；首先用400ml pH6.0的磷酸盐缓 冲液洗脱；再进行梯度洗脱，梯度混合器的混合池中为400mlpH6.0的磷酸盐缓冲液，贮存 池中为等体积含lmol/L NaCl的磷酸盐缓冲液；最后用lmol/L NaCl溶液进行洗脱。洗脱流 速2ml/min，每10ml (5min)收集一管。用蒽酮-硫酸比色法隔管测定其中的多糖含量，再通 过糖醛酸的含量较正为中性糖含量，以吸光度A为纵坐标，管号为横坐标，作出决明子多糖 的洗脱曲线图(见图2)。分析洗脱曲线可知，决明子多糖提取物绝大多数为中性多糖(管号 14-32)，其余为酸性多糖(管号56-104)。通过转换后的结果可以发现，提取得到的决明子 多糖绝大多数为中性糖(14~32管)其吸光度值较大，而少部分为酸性多糖(56~104)，其 吸光度值较小。
实施例2
本实施例所述的决明子多糖类物质的提取方法，基本与实施例1相同，但得到粗多糖后
先进行除蛋白操作再进行脱色操作，具体如下
(1) 原料预处理将决明子80。C烘干，并于150。C下烘烤8min，以增加其多糖含量， 粉碎，得决明子粉末；
(2) 除脂用体积比2:1的乙醇和乙醚混合溶剂浸泡决明子粉末24h，脱脂，回收溶剂， 残渣风干；(3) 脉冲超声处理按固液的质量比1:40将残渣溶解于水中，得到浆液，将超声探头 插入浆液的固定深度，以20kHz、 1300W，脉冲工作时间4s、间歇时间2s、 25。C处理40min ;
(4) 复合酶酶解及热水浸提调节处理后的桨液pH值为6.0，加入浆液质量的1.5%的 复合酶制剂，于35'C下反应1.5h,充分酶解后迅速升温至90'C，使复合酶制剂钝化，并保温 浸提0.8h，离心收集上清液；离心后残渣以相同条件再浸提一次，合并上清液；该复合酶制
剂由质量比为4: 2的纤维素酶和果胶酶制成；
(5) 纳滤浓缩、醇沉、洗涤、干燥将合并后的上清液纳滤浓縮，然后加入其体积3.5 倍的无水乙醇使多糖沉淀下来，沉淀依次经丙酮、乙醚洗涤后，5(TC下真空干燥得决明子粗 多糖；
(6) 将粗多糖配制成质量百分比为8wt。/。的水溶液，加入加入水溶液体积的30°/。的浓度 为8wt。/。的三氯乙酸溶液，搅拌均匀，室温静置25min,使蛋白质变性后4000r/min离心10min， 取上清，用氨水调节pH值至7.8-8.2，加入H202进行氧化脱色(37'C下保温12h);
(7)纳滤除去溶液中的有机溶剂与小分子杂质并浓縮，加无水乙醇并离心收集沉淀，经 丙酮、乙醚洗涤后，真空干燥即得目的多糖(决明子多糖)。
按实施例l所述方法分离鉴定决明子多糖的组分及含量，结果基本相同，数据省略。
实施例3
本实施例所述的决明子多糖类物质的提取方法，具体如下
(1) 原料预处理将决明子65'C烘干，并于120。C下烘烤20min，以增加其多糖含量， 粉碎，得决明子粉末；
(2) 除脂用体积比2:1的乙醇和乙醚混合溶剂浸泡决明子粉末24h，脱脂，回收溶剂， 残渣风干；
(3) 脉冲超声处理按固液的质量比1:40将残渣溶解于水中，得到浆液，将超声探头 插入浆液的固定深度，以20kHz、 1300W，脉冲工作时间4s、间歇时间2s、 25'C处理25min ;
(4) 复合酶酶解及热水浸提调节处理后的浆液pH值为6.0，加入浆液质量的1%复合 酶制剂，于40'C下反应2h，充分酶解后迅速升温至704°C ，使复合酶制剂钝化，并保温浸提 1.5，离心收集上清液；离心后的残渣以相同条件再浸提一次，合并上清液；该复合酶制剂由 质量比为2: 2的纤维素酶和果胶酶制成；
(5) 纳滤浓縮、醇沉、洗涤、干燥将合并后的上清液纳滤浓缩，然后加入其体积3.5 倍的无水乙醇使多糖沉淀下来，沉淀依次经丙酮、乙醚洗涤后，60。C下真空干燥得决明子粗 多糖；(6)脱色和脱蛋白将粗多糖配制成浓度为10wt^水溶液，用氨水调节pH值至7.8， 加入&02进行氧化脱色，纳滤除去H202并浓縮至一半体积，脱色后的多糖溶液中加入其体 积的15%的、浓度为8wt。/。的三氯乙酸溶液使蛋白质变性，离心，取上清；
(7)纳滤除去溶液中的有机溶剂与小分子杂质并浓缩，加无水乙醇并离心收集沉淀， 经丙酮、乙醚洗涤后，真空干燥即得目的多糖(决明子多糖)。
按实施例1所述方法分离鉴定决明子多糖的组分及含量，结果基本相同，数据省略。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范 围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。
权利要求
1.一种决明子多糖类化合物的提取方法，其特征是，主要包括以下步骤(1)原料预处理将决明子烘干，粉碎，得决明子粉末；(2)除脂用乙醇和乙醚混合溶剂浸泡决明子粉末，脱脂，回收溶剂，残渣风干；(3)脉冲超声处理按固液的质量比为1∶25-40将残渣溶解于水中，得到浆液，将超声探头插入浆液的固定深度，处理25-40min；(4)复合酶酶解及热水浸提调节处理后的浆液的pH值为5.5-6.5，加入浆液质量的0.8％-1.5％的复合酶制剂，充分酶解后迅速升温至70-90℃，使复合酶制剂钝化，并保温浸提0.5-1.5h，离心并收集上清液；离心后的残渣以相同条件再浸提一次，合并上清液；所述复合酶制剂由纤维素酶和果胶酶制成；(5)纳滤浓缩、醇沉、洗涤、干燥将合并后的上清液纳滤浓缩，然后加入3.5-4.5倍体积的无水乙醇使多糖沉淀下来，沉淀依次经丙酮、乙醚洗涤后，50-70℃下真空干燥得决明子粗多糖；(6)脱色和脱蛋白将粗多糖配制成水溶液，调节pH值至7.8-9.2，加入H2O2进行氧化脱色，纳滤除去H2O2并浓缩，脱色后的多糖溶液中加入三氯乙酸溶液使蛋白质变性，离心，取上清；或者将粗多糖配制成水溶液，加入三氯乙酸溶液使蛋白质变性，然后离心，取上清，调节pH值至7.8-9.2，加入H2O2进行氧化脱色；(7)纳滤除去溶液中的有机溶剂与小分子杂质并浓缩，加无水乙醇并离心收集沉淀，经丙酮、乙醚洗涤后，真空干燥即得目的多糖类化合物。
2. 根据权利要求1所述的决明子多糖类化合物的提取方法，其特征是， 所述复合酶制剂由质量比为2—4: 2的纤维素酶和果胶酶制成。
3. 根据权利要求1所述的决明子多糖类化合物的提取方法，其特征是，所述复合酶制剂 由质量比为3: 2的纤维素酶和果胶酶制成。
4. 根据权利要求1所述的决明子多糖类化合物的提取方法，其特征是，步骤(3)为按固液的质量比1:30将残渣溶解于水中，得到浆液，将超声探头插入浆液的 固定深度，以20kHz、 1300W，脉冲工作时间4s、间歇时间2s、 22 —28。C处理25—40min。
5. 根据权利要求1所述的决明子多糖类化合物的提取方法，其特征是，步骤(4)为 调节处理后的浆液pH值为6.0，加入浆液质量的1%—1.5%的复合酶制剂，35—4(TC下反应 l一2h，充分酶解后迅速升温至70—9(TC，使复合酶制剂钝化，并保温浸提0.5 — 1.5h，离心 收集上清液；离心后的残渣以相同条件再浸提一次，合并上清液。
6.根据权利要求1所述的决明子多糖类化合物的提取方法，其特征是，主要包括以下步骤(1) 原料预处理将决明子65 — 80'C烘干，并于120—150'C下烘烤5—20min，以增加 其多糖含量，粉碎，得决明子粉末；(2) 除脂用体积比1一2:1的乙醇和乙醚混合溶剂浸泡决明子粉末24h，脱脂，回收溶 剂，残渣风干；(3) 脉冲超声处理按固液的质量比1:30将残渣溶解于水中，得到浆液，将超声探头 插入浆液的固定深度，以20kHz、 1300W，脉冲工作时间4s、间歇时间2s、 25。C处理30min;(4) 复合酶酶解及热水浸提调节处理后的浆液pH值为6.0，加入浆液质量的1%_1.5 %的复合酶制剂，充分酶解后迅速升温至70—90'C，使复合酶制剂钝化，并保温浸提0.5 — 1.5h，离心并收集上清液；离心后的残渣以相同条件再浸提一次，合并上清液；(5) 纳滤浓縮、醇沉、洗涤、干燥将合并后的上清液纳滤浓缩，然后加入其体积3.5 一4.5倍的无水乙醇使多糖沉淀下来，沉淀依次经丙酮、乙醚洗涤后，50—7(TC下真空干燥得 决明子粗多糖；(6) 脱色和脱蛋白将粗多糖配制成浓度为10wtX水溶液，用氨水调节pH值至7.8 — 9.2，加入H202进行氧化脱色，纳滤除去H202并浓縮至一半体积，脱色后的多糖溶液中加 入其体积的15 — 30%的、浓度为8wt。/。的三氯乙酸溶液使蛋白质变性，离心，取上清；(7)纳滤除去溶液中的有机溶剂与小分子杂质并浓縮，加无水乙醇并离心收集沉淀， 经丙酮、乙醚洗涤后，真空干燥即得目的多糖类化合物。
全文摘要
本发明公开了一种决明子多糖类化合物的提取方法，该方法主要包括原料预处理；除脂；脉冲超声处理；复合酶酶解及热水浸提；醇沉、洗涤、干燥；脱色和脱蛋白；纳滤沉淀，经丙酮、乙醚洗涤后，真空干燥即得目的多糖。本发明提取决明子多糖化合物在得率和多糖品质上均优于单纯热提取方法，而且大大提高了提取效率，有效降低了能源消耗，适合工业级制备。
文档编号C08B37/00GK101607997SQ20091004131
公开日2009年12月23日 申请日期2009年7月22日 优先权日2009年7月22日
发明者牟洪生, 穆洪涛, 邱燕翔, 黎海彬 申请人:广州城市职业学院