专利名称：一种具有免疫增强活性的茶树菇胞内粗多糖的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种具有免疫增强活性的茶树菇胞内粗多糖的制备方法。属生物工程 技术领域。
背景技术：
茶树菇属担子菌纲，粪锈伞科，田菇属，又名茶菇、油茶菇、神菇。是近年来发展起 来的一种食用菌新品种。茶树菇营养丰富，蛋白质含量高，含有人体必需的氨基酸，并且有 丰富的B族维生素和钾、钠、钙、镁、铁、锌等矿质元素。中医认为该菇性平、甘温、无毒，具有 较高的药用价值，有清热、平肝、明目、健脾的功效。其提取物多糖对小白鼠肉瘤S-180和艾 氏腹水癌的抑制率高达80-90%，是一种集营养、保健、理疗于一身的绿色食品。研究表明， 茶树菇深层发酵获得的菌丝体所含的主要营养成分以及氨基酸与人工栽培的子实体相似。 为深层发酵茶树菇产多糖提供了理论依据。目前，人们获得真菌多糖的途径主要是从真菌子实体提取而得，但随着需求量的 增大，野生资源有限，人工栽培周期长且容易污染杂菌，受病虫害侵蚀，而菌丝体培养周期 短，染菌少，故应该探索在生物反应器内进行液体深层发酵以获取胞内多糖的途径，为开辟 工业化液体深层发酵生产真菌多糖提供可靠依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有免疫增强活性的茶树菇胞内粗多糖的制备方法。本发明的技术方案为将茶树菇子实体通过组织分离法接入固体斜面培养基上培 养，待长好后移至摇瓶种子液体培养基中培养，将培养好的种子液接入摇瓶发酵液体培养 基培养。发酵结束后，离心获得湿菌丝体，勻浆，湿菌丝体经过勻浆，热水浸提，上清液浓缩， 乙醇沉淀，脱蛋白，脱色，透析后冷冻干燥得到茶树菇胞内粗多糖。本发明发明的茶树菇胞内粗多糖经初步的研究确认，基本无毒，具有显著的免疫 增强活性。可以作为原料应用于保健食品等领域。具体来说，首先，我们发现市售茶树菇可以经过组织分离法在平板上长出菌丝体。 通过深层发酵获得湿菌丝体经过勻浆，热水浸提，上清液浓缩，乙醇沉淀，脱蛋白，脱色，透 析后冷冻干燥得到茶树菇胞内粗多糖。由此奠定了以茶树菇为原料通过深层发酵获得胞内 粗多糖的基础。上述过程中，斜面培养基为PDA培养基，摇瓶种子培养基为PDA1L加磷酸二氢 钾lg，硫酸镁0. 5g，牛肉膏2g，蛋白胨lg，pH6. 0，发酵培养基为玉米粉2g/100mL、酵母粉 0. 3g/100mL、磷酸二氢钾 0. 2g/100mL、硫酸镁 0. 05g/100mL,培养条件为起始 pH6. 0，250mL 三角瓶装培养基100mL于25°C，150r/min，振荡培养7d，多糖提取方法为将湿菌丝体勻浆， 热水80°C -90°C浸提，加水量为4倍体积湿菌丝体，总提取时间为10h，提取3次，提取液浓 缩后加入3倍体积95%乙醇在4°C醇析，沉淀物用蒸馏水复溶后Sevage法去除游离蛋白， H202脱色、蒸馏水透析，冷冻干燥后得到茶树菇胞内粗多糖。
具体实施例方式下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。实例一1.菌种培养出发菌种为市售茶树菇(Agrocybe aegirit)；(1)组织分离法斜面培养基PDA培养基，含1. 5% 2. 0%琼脂，pH自然；组织分离方法将子实体外表用酒精进行表面消毒后，放入超净工作台上，用消毒 过的刀片与镊子切取菌柄与菌盖交界处组织块接入斜面培养基上，PH自然，置于25°C温度 下暗培养，5d后菌丝开始萌发，每隔2d检查1次，除去污染，选择菌丝生长速度快和长势强 的试管作为纯母种；(2)摇瓶种子培养摇瓶种子培养基PDA1L加磷酸二氢钾lg，硫酸镁0. 5g，牛肉膏2g，蛋白胨lg， pH6. 0 ；培养方法从斜面菌种中取3 4块黄豆大小相同的菌块，接种于摇瓶种子培养基 中，250mL三角瓶装培养基100mL于25°C，150r/min，振荡培养7d ；(3)摇瓶发酵培养发酵培养基玉米粉2g/100mL、酵母粉0. 3g/100mL、磷酸二氢钾0. 2g/100mL、硫酸 镁 0.05g/100mL ；培养方法将培养好的种子以15%的接种量接入摇瓶发酵培养基中25°C，150r/ min,振荡培养7d ；2.胞内粗多糖的提取湿菌丝体经过勻浆，热水浸提，提取温度80°C -90°C，加水量为4倍体积湿菌丝体， 总提取时间为10h，提取3次，提取液浓缩后加入3倍体积95%乙醇在4°C醇析。SOOOrpm离 心得沉淀物，沉淀物用蒸馏水复溶后按多糖溶液1/5的体积加入氯仿，然后加入氯仿体积 1/5的正丁醇，混合后振荡20min。蛋白质与氯仿-正丁醇生成凝胶，4000rpm离心20min， 收集上清液，反复操作8次至氯仿-正丁醇层不浑浊为止。然后在上清液中加入95%乙醇 置4°C冰箱过夜，次日离心收集沉淀。沉淀物用蒸馏水复溶后将5%的多糖溶液用NaOH调 pH至9. 0，然后滴加20%的H202 (用量为多糖溶液体积的15% )，保持PH8. 0-9. 0，4h后终 止反应，加入95%乙醇置4°C冰箱过夜，次日离心收集沉淀。沉淀物用蒸馏水复溶后取50mL 装入透析袋中，扎紧袋口，悬浮于蒸馏水中，透析48h，中间每隔12小时换水一次。冷冻干燥 后得到茶树菇胞内粗多糖。实例二对茶树菇菌丝体样品进行了氨基酸组成，单糖组成的测定，测定结果表明，茶树 菇发酵菌丝体含有17种氨基酸，其总量为16. 441g/100g菌丝体干重，必需氨基酸总量为 6. 787g/100g菌丝体干重，占氨基酸总量的41. 28%,以谷氨酸和天冬氨酸含量最高。茶树 菇菌丝体含有较高的Ca、Fe、Zn等人体易缺少的微量元素，有害重金属元素的含量较少。该 多糖所含单糖以葡萄糖为主，用苯酚_硫酸法测得多糖含量为63. 4%。茶树菇菌丝体氨基
4酸组成及含量见表1，茶树菇菌丝体微量元素含量见表2，茶树菇胞内多糖主要单糖组成及 相对质量分数见表3。 表1茶树菇菌丝体氨基酸组成及含量 表2茶树菇菌丝体微量元素含量
表3茶树菇胞内多糖主要单糖组成及相对质量分数
实例三5
以健康昆明种小白鼠(雌雄各半，4周龄，体重18_22g，由无锡市惠山江南实验动 物场提供批准号SCXK(苏)2002-0006)20只，随机分为2组空白对照组，发酵液多糖 试验组。空白对照组腹腔注射0. 5mL/只生理盐水，发酵液多糖试验组设两个计量组，分别 腹腔注射100mg/kg和200mg/kg无菌生理盐水稀释的多糖溶液。给药后，观察小鼠72h内 是否死亡，以及未来7d内的进食情况和体重变化。小鼠腹腔注射发酵液多糖两种剂量后，观察一周。结果见表4和表5。多糖试验 组，给药后lh小鼠活动减少，4h后逐渐恢复正常活动，给药后2d内进食量比对照组少，以后 的5d内小鼠食欲、精神、毛色均正常，7d后，脱颈处死，肉眼尸检未见心、肝、脾、肺、肾、等主 要脏器病变和中毒现象。观察期7d内每日称重，多糖试验组小鼠的体重在给药后2d内下 降.说明这两天小鼠的进食量减少，以后的5d内，体重逐渐恢复并不断增加，增长率超过空 白对照组。研究结果表明，在大剂量腹腔注射菌丝体多糖和发酵液多糖的情况下，未出现小 鼠死亡，也未有明显毒性反应。说明茶树菇胞内多糖无毒性或毒性很小，其最大安全剂量在 200mg/kg 以上。表4胞内多糖对小鼠体重的影响 实例四以健康昆明种小白鼠(雌雄各半，4周龄，体重18_22g，由无锡市惠山江南实验动 物场提供批准号SCXK(苏)2002-0006)25只，对所得到的胞内多糖进行免疫增强功能 测试，所得结果见表6 9。表6茶树菇胞内多糖对小鼠吞噬细胞吞噬功能的影响
6 方差分析，P < 0. 01 ；与对照组比较P < 0. 01结果表明，用药组小鼠的吞噬指数和吞噬系数与对照组比较均有不同程度增加。 说明茶树菇胞内多糖不仅能促进小鼠巨噬细胞增生，而且能激活吞噬活性，提高单核吞噬 细胞系统的吞噬功能。表7茶树菇胞内多糖对小鼠抗菌活力的影响 方差分析，P < 0. 01 ；与对照组比较P < 0. 01 ；不同剂量组间比较P < 0. 01由表7结果可知，各剂量组与空白对照組比较，均有显著性差异，茶树菇胞内多糖 能提高小鼠抗菌活力。各剂量组之间比较也有显著性差异，其中中剂量组更能有效提高小 鼠抗菌活力。表8茶树菇胞内多糖对小鼠血清溶血素的影响 方差分析，P < 0. 01 ；与对照组比较P < 0. 01溶血素(IgM)是反映体液免疫功能状况的一种方法，如果用药后溶血素生成增 多，则出现紅细胞溶血时的吸光度值增高，表明用药后机体的体液免疫作用增强。由表8结 果可知，各剂量组与空白对照組比较，均有显著性差异(P< 0.01)，这说明，茶树菇胞内多 糖对血清溶血素(IgM)的生成都有十分明显的影响，表现出较好的体液免疫增强作用。表9茶树菇胞内多糖对小鼠血清溶菌酶活性的影响 方差分析，P < 0. 01 ；与对照组比较P < 0. 01 ；不同剂量组间比较P < 0. 05结果表明，茶树菇胞内多糖对小鼠血清溶菌酶活性的影响与对照组比较均有显著 性差异，各剂量组之间也有差异且剂量越高，越能增强小鼠血清溶菌酶活性。
权利要求
一种具有免疫增强活性的茶树菇胞内粗多糖，其特征在于外观为白色粉末，是茶树菇通过深层发酵获得的湿菌丝体经过匀浆，热水浸提，离心，上清液浓缩，乙醇沉淀，脱蛋白，脱色，透析后冷冻干燥得到的。无毒，具有显著的免疫增强活性；茶树菇发酵菌丝体含有17种氨基酸，其总量为16.441g/100g菌丝体干重，必需氨基酸总量为6.787g/100g菌丝体干重，占氨基酸总量的41.28％，以谷氨酸和天冬氨酸含量最高；茶树菇菌丝体含有较高的Ca、Fe、Zn等人体易缺少的微量元素，有害重金属元素的含量较少；该多糖所含单糖以葡萄糖为主，用苯酚-硫酸法测得多糖含量为63.4％。
2.权利要求1所述的茶树菇胞外多糖的制备方法。该方法由下列步骤组成(1)菌种培养出发菌种为市售茶树菇(Agrocybe aegirit)；①组织分离法斜面培养基PDA培养基，含1. 5% 2. 0%琼脂，pH自然；组织分离方法将子实体外 表用酒精进行表面消毒后，放入超净工作台上，用消毒过的刀片与镊子切取菌柄与菌盖交 界处组织块接入斜面培养基上，PH自然，置于25°C温度下暗培养，5d后菌丝开始萌发，每隔 2d检查1次，除去污染，选择菌丝生长速度快和长势强的试管作为纯母种；②摇瓶种子培养摇瓶种子培养基:PDA1L加磷酸二氢钾lg，硫酸镁0. 5g，牛肉膏2g，蛋白胨lg，pH6. 0 ；培养方法从斜面菌种中取3 4块黄豆大小相同的菌块，接种于摇瓶种子培养基中， 250mL三角瓶装培养基100mL于25°C，150r/min,振荡培养7d ；③摇瓶发酵培养发酵培养基玉米粉2g/100mL、酵母粉0. 3g/100mL、磷酸二氢钾0. 2g/100mL、硫酸镁 0.05g/100mL ；培养方法将培养好的种子以15%的接种量接入摇瓶发酵培养基中25°C，150r/min， 振荡培养7d ；(2)胞内粗多糖的提取湿菌丝体勻浆，热水80°C-90°C浸提，加水量为4倍体积湿菌丝体，总提取时间为10h， 提取3次，提取液浓缩后加入3倍体积95%乙醇在4°C醇析，沉淀物用蒸馏水复溶后Sevage 法去除游离蛋白，H202脱色、蒸馏水透析，冷冻干燥后得到茶树菇胞内粗多糖。
3.如权利要求2所述的茶树菇胞内多糖的制备方法，其特征在于所述的Sevage法去除 游离蛋白是按多糖溶液1/5的体积加入氯仿，然后加入氯仿体积1/5的正丁醇，混合后振荡 20mi ；蛋白质与氯仿-正丁醇生成凝胶，4000rpm离心20min，收集上清液，反复操作8次至 氯仿-正丁醇层不浑浊为止。
4.如权利要求2所述的茶树菇胞内多糖的制备方法，其特征在于所述的H202脱色是将 5%的多糖溶液用NaOH调pH至9. 0，然后滴加20%的H202 (用量为多糖溶液体积的15% )， 保持PH8. 0-9. 0，4h后终止反应，加入95%乙醇置4°C冰箱过夜，次日离心收集沉淀。
5.如权利要求2所述的茶树菇胞内多糖的制备方法，其特征在于所述的透析是指4°C 醇析过夜后的离心沉淀物用蒸馏水复溶后取50mL装入透析袋中，扎紧袋口，悬浮于蒸馏水 中，透析48h，中间每隔12小时换水一次。
6.权利要求1所述的胞内多糖具有免疫增强功能。
全文摘要
本发明属生物工程技术领域，具体涉及一种具有免疫增强活性的茶树菇胞内粗多糖的制备方法。该茶树菇胞内粗多糖为白色粉末，是茶树菇通过深层发酵获得的湿菌丝体经过匀浆，热水浸提，离心，上清液浓缩，乙醇沉淀，脱蛋白，脱色，透析后冷冻干燥得到的。茶树菇发酵菌丝体含有17种氨基酸，其总量为16.441g/100g菌丝体干重，必需氨基酸总量为6.787g/100g菌丝体干重，占氨基酸总量的41.28％，以谷氨酸和天冬氨酸含量最高。茶树菇菌丝体含有较高的Ca、Fe、Zn等人体易缺少的微量元素，有害重金属元素的含量较少。该多糖所含单糖以葡萄糖为主，用苯酚-硫酸法测得多糖含量为63.4％。具有免疫增强活性，可应用于制备具有增强免疫力，抗疲劳功能的保健品。
文档编号C08B37/00GK101856372SQ20101019544
公开日2010年10月13日 申请日期2010年6月9日 优先权日2010年6月9日
发明者邓超, 邬敏辰, 陈敬华 申请人:江南大学