专利名称：拐枣多糖的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种拐枣多糖的分离纯化方法，属于中药技术领域。
背景技术：
拐枣(Hovenia cerba Lindl.)为鼠李科拐枣属落叶乔木，俗称犋子、钩子、鸡脚爪、万字果、万寿果、龙爪。它全身都是宝，是一种果、药、材兼用的名贵树，有广阔的开发前景。果实中含葡萄糖及苹果酸钙，种子含枳犋皂苷，具有镇静、抗惊厥和降血压等功效。肉质可治风湿，有清热利利尿止渴降火解毒功效，树皮可活血，舒筋解毒，果梗性甘平，有健胃补血的作用，无毒，主治头风，润五脏利大小便。木质部含二羧酸三萜类化合物枳犋子酸 (Hobeniaaced, C3tlH8tlO5)。朱炯波等采用蒽酮-硫酸比色法测定其多糖含量为13.83%，目前国内外对拐枣活性多糖的作用研究尚未见报道。多糖是天然有机化合物中的大分子物质，某些活性多糖有抗肿瘤和增强免疫功能的作用，一些多糖则具有复杂的控制细胞分裂和分化、调节细胞生长与衰老等多方面功能， 改性的多糖则有抗HIV感染的作用，一些重要的生理过程如炎症反应，受体识别，免疫反应等都与多糖分子密切相关。已有的大量药理研究表明，植物多糖，特别是中药中的多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗感染、降血糖等多种生理活性，其原生药大多属补益类中药。 虽然目前有很多合成化疗药物，但它们在杀死癌细胞的同时也同样累及正常细胞，临床上表现出很多副作用，特别是化疗药物对患者的免疫系统造成损害，但植物药的遗传毒性不太明显，表明中草药在抗癌抗突变方面有其独特的优势和广阔的应用前景。因此，多糖类免疫调节剂在肿瘤上的治疗很有吸引力。离子交换树脂是一种多孔性交联聚合物，具有较高的比表面积，因而具有优良的吸附能力。离子吸附树脂属于两相结构聚合物相和孔。聚合物相是由众多的纳米级聚合物微粒堆积而成的，微粒之间是孔。通过调整合成的方法可以调节为例大小，已寄孔径和比表面积等，从而使树脂具有不同的吸附性能。此外，吸附树脂按表面性质又可分为非极性、 中极性、极性和强极性四种。不同的表面性质使吸附树脂具备不同的吸附机理和吸附性能， 因此使树脂获得多方面的用途。有研究表明，用交换树脂代替常用的活性炭进行脱色，不但可加快过滤速度，而且脱色效果也好，同时还达到去杂的目的，从而提高产品的质量。树脂除脱色外，同时具有离子作用，能与溶液中的离子起离子交换反应，加上通用树脂还有较强的配位体基团(_0H、-NH3)，能对金属离子起络合作用，从而除去溶液中的金属离子，起着去杂的作用。现有多糖脱色技术常采用活性炭脱色，虽价格低廉，但操作时必须使用粉末活性炭，存在脱色后溶液中的炭残渣难以完全出去的致命缺点；双氧水脱色需目的产物具有稳定性、不易氧化的特点，但由于双氧水脱色法是直接氧化提取液中的色素，并未脱除，且有可能将多糖链状结构破坏，氧化后的色素仍然作为杂质留在提取液中，并不能保证其最后品质。本发明采用离子交换树脂处理能力大，范围广，脱色率高，使得多糖保留率高，可再生重复利用，成本较低。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种拐枣多糖的分离纯化方法，从拐枣中经热水浸提、 醇沉、离心DEAE纤维素柱层析除杂、离子交换树脂柱脱色、半透膜透析并干燥得成品。该方法提取得到较高纯度的拐枣活性多糖。为达到上述目的，本发明采用了以下技术措施拐枣多糖的分离纯化方法，其特征在于包括下列步骤(1)多糖提取液制备将拐枣粉碎，加热水浸提2-3次，浸提M-48小时，过滤，合并浸提液，浓缩得拐枣浸膏；(2)醇沉将拐枣浸膏加入3-5倍80-90%的食用乙醇搅拌5_15分钟后静置沉淀， 离心过滤除去上清液，收集沉淀物；(3)除杂、脱色将离心沉淀物用热水搅拌溶解，上DEAE纤维素柱，0-0. 5mol/ LNaCl溶液梯度洗脱，再上离子交换树脂柱吸附脱色，下柱液过滤后用半透膜透析，干燥即得成品。所述步骤O)中离心机的转速为5000-10000rpm。所述步骤(3)中纤维素柱采用DEAE-23、DEAE-52。所述步骤(3)中离子交换树脂可选苯乙烯系树脂和丙烯酸系树脂或两者混合树月旨。苯乙烯系树脂可采用Asmit 265P、Duolite A171P阴离子树脂；丙烯酸系树脂可采用 Asmit295, DoliteA172、IRA958S、A860 阴离子树脂。所述步骤C3)中半透膜为截留分子量4000-10000的半透膜透析袋，透析对-48小时。所述步骤(3)中干燥方法可采用冷冻干燥或喷雾干燥中的一种。本发明的特点1)拐枣经热水浸提、醇沉、除杂、脱色、干燥等步骤，得到拐枣多糖，制备方法简单，易于实施；2)离子交换树脂脱色效果好，产品纯度高；3)为拐枣的应用提供了有利的技术手段，制得的拐枣多糖可用于对其活性的进一步研究，并为拐枣多糖药物和保健品提供了大量原料，促进了拐枣的经济发展。下面将结合具体实施方式
进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
具体实施例方式实施例1 将阴干的拐枣粉碎成80目粗粉，置于提取罐中，加入10倍90-100°C热水恒温浸泡提取，反复提取3次，每次M小时，合并提取液，浓缩得浸膏；向浸膏中加入3倍体积量的90 %食用乙醇，搅拌5分钟后静置沉淀，离心过滤除去上清液，收集沉淀物，将沉淀物用热水搅拌溶解，上DEA-23纤维素柱，0-0. 5mol/LNaCl溶液梯度洗脱，将预处理好的Asmit 265P阴离子交换树脂装柱，洗脱液浓缩至0. 3kg/L，以2BV/h上柱，收集下柱液，过滤后浓缩至最小体积，将浓缩液装入截留分子量4000的半透膜透析袋透析48小时，喷雾干燥即得拐枣多糖，所得拐枣多糖纯度达70%左右。实施例2:
将阴干的拐枣粉碎成100目粗粉，置于提取罐中，加入14倍90-100°C热水恒温浸泡提取，反复提取2次，每次48小时，合并提取液，浓缩得浸膏；向浸膏中加入4倍体积量的85%食用乙醇，搅拌15分钟后静置沉淀，离心过滤除去上清液，收集沉淀物，将沉淀物用热水搅拌溶解，上DEAE-52纤维素柱，0-0. 5mol/LNaCl溶液梯度洗脱，将预处理好的Asmit 265P和Asmit295混合阴离子交换树脂装柱，洗脱液浓缩至0. 44kg/L，以2BV/h上柱，收集下柱液，过滤后浓缩至最小体积，将浓缩液装入截留分子量7000的半透膜透析袋透析M小时，喷雾干燥即得拐枣多糖，所得拐枣多糖纯度达70%左右。实施例3 将阴干的拐枣粉碎成80目粗粉，置于提取罐中，加入13倍90-100°C热水恒温浸泡提取，反复提取3次，每次M小时，合并提取液，浓缩得浸膏；向浸膏中加入4倍体积量的 90%食用乙醇，搅拌10分钟后静置沉淀，离心过滤除去上清液，收集沉淀物，将沉淀物用热水搅拌溶解，上DEAE-52纤维素柱，0-0. 5mol/LNaCl溶液梯度洗脱，将预处理好的Duolite A171P阴离子交换树脂装柱，洗脱液浓缩至0. 38kg/L，以2BV/h上柱，收集下柱液，过滤后浓缩至最小体积，将浓缩液装入截留分子量4000的半透膜透析袋透析36小时，冷冻干燥即得拐枣多糖，所得拐枣多糖纯度达70%左右。实施例4 将阴干的拐枣粉碎成60目粗粉，置于提取罐中，加入10倍90-100°C热水恒温浸泡提取，反复提取2次，每次36小时，合并提取液，浓缩得浸膏；向浸膏中加入4倍体积量的80%食用乙醇，搅拌15分钟后静置沉淀，离心过滤除去上清液，收集沉淀物，将沉淀物用热水搅拌溶解，上DEAE-52纤维素柱，0-0. 5mol/LNaCl溶液梯度洗脱，将预处理好的Dolite A172阴离子交换树脂装柱，洗脱液浓缩至0. 5kg/L,以2BV/h上柱，收集下柱液，过滤后浓缩至最小体积，将浓缩液装入截留分子量6000的半透膜透析袋透析48小时，喷雾干燥即得拐枣多糖，所得拐枣多糖纯度达70%左右。实施例5 将阴干的拐枣粉碎成40目粗粉，置于提取罐中，加入12倍90-100°C热水恒温浸泡提取，反复提取2次，每次48小时，合并提取液，浓缩得浸膏；向浸膏中加入3倍体积量的 90%食用乙醇，搅拌15分钟后静置沉淀，离心过滤除去上清液，收集沉淀物，将沉淀物用热水搅拌溶解，上DEAE-23纤维素柱，0-0. 5mol/LNaCl溶液梯度洗脱，将预处理好的Duolite A171P和Dolite A172混合阴离子交换树脂装柱，洗脱液浓缩至0. 40kg/L,以2BV/h上柱， 收集下柱液，过滤后浓缩至最小体积，将浓缩液装入截留分子量5000的半透膜透析袋透析 24小时，冷冻干燥即得拐枣多糖，所得拐枣多糖纯度达70%左右。实施例6 将阴干的拐枣粉碎成50目粗粉，置于提取罐中，加入13倍90-100°C热水恒温浸泡提取，反复提取3次，每次30小时，合并提取液，浓缩得浸膏；向浸膏中加入3倍体积量的 85%食用乙醇，搅拌10分钟后静置沉淀，离心过滤除去上清液，收集沉淀物，将沉淀物用热水搅拌溶解，上DEAE-23纤维素柱，0-0. 5mol/LNaCl溶液梯度洗脱，将预处理好的A860阴离子交换树脂装柱，洗脱液浓缩至0. 34kg/L，以2BV/h上柱，收集下柱液，过滤后浓缩至最小体积，将浓缩液装入截留分子量10000的半透膜透析袋透析36小时，冷冻干燥即得拐枣多糖，所得拐枣多糖纯度达70%左右。
实施例7:将阴干的拐枣粉碎成60目粗粉，置于提取罐中，加入15倍90-100°C热水恒温浸泡提取，反复提取2次，每次M小时，合并提取液，浓缩得浸膏；向浸膏中加入4倍体积量的 80%食用乙醇，搅拌15分钟后静置沉淀，离心过滤除去上清液，收集沉淀物，将沉淀物用热水搅拌溶解，上DEAE-52纤维素柱，0-0. 5mol/LNaCl溶液梯度洗脱，将预处理好的IRA958S 阴离子交换树脂装柱，洗脱液浓缩至0. 35kg/L,以2BV/h上柱，收集下柱液，过滤后浓缩至最小体积，将浓缩液装入截留分子量7000的半透膜透析袋透析48小时，冷冻干燥即得拐枣多糖，所得拐枣多糖纯度达70%左右。
权利要求
1.拐枣多糖的分离纯化方法，其特征在于包括下列步骤(1)多糖提取液制备将拐枣粉碎，加热水浸提2-3次，浸提M-48小时，过滤，合并浸提液，浓缩得拐枣浸膏；(2)醇沉将拐枣浸膏加入3-5倍80-90%的食用乙醇搅拌5-15分钟后静置沉淀，离心过滤除去上清液，收集沉淀物；(3)除杂、脱色将离心沉淀物用热水搅拌溶解，上DEAE纤维素柱，0-0.5mol/LNaCl溶液梯度洗脱，再上离子交换树脂柱吸附脱色，下柱液过滤后用半透膜透析，干燥即得成品。
2.根据权利要求1所述分离纯化方法，其特征在于所述步骤O)中离心机的转速为 5000-10000rpm。
3.根据权利要求1所述分离纯化方法，其特征在于所述步骤(3)中纤维素柱采用 DEAE-23、DEAE-52。
4.根据权利要求1所述分离纯化方法，其特征在于所述步骤(3)中离子交换树脂可选苯乙烯系树脂和丙烯酸系树脂或两者混合树脂。苯乙烯系树脂可采用Asmit 265P、 DuoliteA171P阴离子树脂；丙烯酸系树脂可采用AsmiU95、DoliteA172、IRA958S、A860阴离子树脂。
5.根据权利要求1所述分离纯化方法，其特征在于所述步骤(3)中半透膜为截留分子量4000-10000的半透膜透析袋，透析M-48小时。
6.根据权利要求1所述分离纯化方法，其特征在于所述步骤(3)中干燥方法可采用冷冻干燥或喷雾干燥中的一种。
全文摘要
本发明公开一种拐枣多糖的分离纯化方法，其特征在于其具体步骤为1)将原材料粉碎，热水浸提、过滤、浓缩得拐枣浸膏；2)将拐枣浸膏加醇沉淀、离心得拐枣粗多糖；3)用适量热水溶解拐枣粗多糖，以DEAE纤维素柱层析除杂、离子交换树脂柱脱色、半透膜透析并干燥得成品。采用本发明生产拐枣多糖颜色纯白、杂质少、纯度高，此外离子交换树脂对拐枣多糖提取液进行脱色处理，脱色效果好，多糖保留率高。
文档编号C08B37/00GK102477104SQ201010557750
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月25日 优先权日2010年11月25日
发明者刘东锋, 李法庆 申请人:苏州宝泽堂医药科技有限公司