专利名称：PCL-g-PGMA/明胶复合材料在细胞转染中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种PCL-g-PGMA/明胶复合材料在细胞转染中的应用。
背景技术：
自从 Matyjaszewsk(Szwarc, M. ；Levy, M. ；Milkovich, R. Journal of theAmerican Chemical Society 1956, 78, 2656-2657)和王锦山提出了一种活性/可控的自由基聚合方法以来，原子转移自由基聚合(简称ATRP) —直都在聚合物材料的制备及改性上发挥着极其重要的作用。与此同时，表面接枝作为一种简单、高效的改性方法在功能性材料的制备中也应用甚广。在此启发下，表面引发的原子转移自由基聚合方法很快吸引了材料学研究者的目光，并很快将大量的研究工作投入到利用表面引发原子转移自由基聚合法制备环境敏感(Friebe, A. ；Ulbricht, M. Macromolecules 2009,42,1838-1848.)、抗菌( Yao,F. ；Fu,G. -D. ；Zhao,J. ；Kang,E. -T. ；Neoh,K. G. Journal of Membrane Science 2008,319,149-157)、抗污染(Xu，F.J. ；Zhao, J. P. ；Kang,E. T. ；Neoh,K. G. ；Li, J. Langmuir 2007,23,8585-8592)、细胞粘附(Xu F J,ffang Z H, Yang W T. Biomaterials, 2010 (31) :3139-3147)等功能膜中。聚己内酯(PCL)支架具有一定的功能特性和力学性能，但为了实现基因转染等研究还必须满足医用功能性和细胞粘附性等严峻的基本要求。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。目前非病毒介导的转染技术中，转染效率最高的方法当属阳离子聚合物。该类转染物质介导的细胞转染具有广谱、细胞毒性小、性能稳定等特点，而且不受培养液中的血清和抗生素的干扰，比脂质体介导的转染方法更方便，因而在转染技术领域逐渐占据主流地位。但是目前的瓶颈在于如何进一步提高阳离子聚合物介导的细胞转染效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种PCL-g-PGMA/明胶复合材料在细胞转染中的应用。由于PCL-g-PGMA/明胶复合材料既可以直接吸附细胞，也可以吸附PEI/DNA或其他阳离子转染试剂/DNA复合物，因此本发明提供了一种新型细胞转染方法将转染试剂/核酸复合物与待转染细胞混合置于PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜上，培养，得到目的转染细胞。具体分为下述三种方法(如图3所示)A方式为PCL-g-PGMA/明胶复合材料上粘附细胞后直接进行转染；包括下述步骤将细胞于转染前12-24小时接种到PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜上，培养，再将转染试剂/核酸复合物滴加在所述细胞上，室温至37°C孵育24-48小时使细胞转染，得到目的转染细胞。B方式为PCL-g-PGMA/明胶复合材料上吸附待转染核酸(如PEI/pDNA复合物)后再粘附细胞实现细胞的被动转染；包括下述步骤将包含待转染核酸的溶液滴加在PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜，孵育1-6小时；接着将细胞滴加在所述PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜上，室温_37°C孵育24-48小时，得到目的转染细胞。C方式为PCL-g-PGMA/明胶复合材料上吸附待转染核酸(如PEI/pDNA复合物)后再粘附细胞实现细胞的第一次转染，12-24小时后再进行第二次转染；包括下述步骤1)将转染试剂/核酸复合物滴加在PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜上，孵育1-6小时；接着将细胞滴加在所述PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜上，孵育使细胞进行第一次转染；2)弃去原培养基，加入新鲜的培养基，再将包含待转染核酸的溶液滴加在细胞上，孵育使细胞进行第二次转染。第一次转染中，孵育的温度为室温至37°C，时间12-24小吋。第二次转染中，孵育的温度为室温至37°C，时间12-24小吋。 在上述转染中，所述转染试剂/核酸复合物中的转染试剂为聚こ烯亚胺，核酸为DNA片段或重组质粒；所述细胞为真核细胞。 通过获得PCL-g-PGMA/明胶复合材料支架，可以实现细胞的两次转染，大大提高了基因转染的效率。本发明中所用的PCL-g-PGMA/明胶复合材料是按照下述方法制备得到的I)制备聚ε -己内酷(PCL)膜；2)将所述聚ε -己内酯膜置于1，6己ニ胺的丙醇溶液中浸泡，得到部分端基为氨基的聚ε -己内酯膜PCL-NH2 ;将膜取出，依次用こ醇、水、こ醇进行清洗并干燥；3)将步骤2)得到的干燥膜PCL-NH2置于由2_溴-异丁基酰溴(BIBB)、三こ胺和正己烷组成的混合溶液中进行酯化反应，得到表面溴化的聚ε -己内酯膜PCL-Br ;将膜取出，依次用こ醇、水、こ醇进行清洗并干燥；4)在无氧条件下，以步骤3)得到的干燥膜PCL-Br为引发剂、甲基丙烯酸缩水甘油酷(GMA)为接枝单体、溴化铜(CuBr2)和溴化亚铜(CuBr)为催化剂、2，2联吡啶(Bpy)为配位剂，甲醇与水的混合溶液为溶剂，进行原子转移自由基聚合反应，得到聚ε -己内酯/甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝共聚物，即PCL-g-PGMA ;将PCL-g-PGMA膜取出，依次用こ醇、水、こ醇进行清洗并干燥；5)将PCL-g-PGMA膜在明胶水溶液中浸泡，取出后用去离子水清洗并干燥，即得。其中，步骤I)中聚ε -己内酯膜具体可按照下述方法制备a)将聚ε -己内酯颗粒溶于ニ氯甲烷中，完全溶解并在超声装置中振荡除去溶液内所含气泡；b)将聚ε -己内酷溶液倒于培养皿中，用锡纸包覆并在上表面留若干针孔，置于水平台上挥发至干燥成膜。使用时，可根据需要剪切成(IcmX lcm-2cmX2cm)大小。步骤2)中所述1，6己ニ胺的丙醇溶液中1，6己ニ胺的质量浓度可为10-11%。聚ε -己内酯膜在1，6己ニ胺的丙醇溶液中浸泡的时间可为18-24小时。步骤3)中所述混合溶液中2-溴-异丁基酰溴、三こ胺和正己烷的体积比依次为(1-1.2) (1-1.2) (20-20. 5);所述酯化反应的反应温度为20_25°C，反应时间为2_3小时。步骤4)所述原子转移自由基聚合反应中，所述甲基丙烯酸缩水甘油酷、溴化铜、溴化亚铜、2，2_联吡啶、甲醇、水的配比依次为(5-5. 2)ml (O. 0084-0. 0090g) (O. 044-0.050)g (O. 0446-0. 0448)g (10-10. 2ml) (2-2. 2ml)
所述原子转移自由基聚合反应的反应温度为25_28°C，反应时间为5_60分钟。步骤5)中所述明胶水溶液中明胶的浓度为10-12. 5mg/ml。PCL-g-PGMA在明胶水溶液浸泡的温度为37-37. 5°C，浸泡的时间为24-72小时。用于固定生物分子的常见官能团包括羧基、环氧、巯基、醛基、羟基以及伯胺等。环氧基团很容易与亲核基团(比如-NH2，-SH，W&-C00H)进行开环反应。特别是PGMA，其具有丰富的环氧基团，很容易与生物分子的-NH2或-COOH官能基团进行开环反应直接耦合功能分子，同时羟基伴随形成，可为生物分子提供一个较亲水的微环境。本发明方法先将PCL支架进行胺化，再与BIBB反应，得到表面溴化的PCL，接着在水相中ATRP聚合得到亲水性表面PCL-g-PGMA，最后将明胶沉积在该表面得到高细胞吸附性的聚合物支架材料。在该聚合物支架上可以实现细胞的两次转染，大大提高了基因转染的效率。
图I为PCL、胺化的PCL以及溴化的PCL的X射线光电子能谱。图2为不同聚合时间制备的PCL-g-PGMA/明胶复合材料的X射线光电子能谱，其中，(a)PCL-g-PGMAI， (b)PCL-g-PGMA 1-gelatin, (c)PCL-g-PGMA2, (d)PCL-g-PGMA2-gelatin。图3为三种转染的示意图；其中，A、PCLPGG介导的先铺细胞后加PEI/pDNA复合物的基因转染；B、PCLPGG介导的先加PEI/pDNA复合物后铺细胞的基因转染；C、PCLPGG介导的先加PEI/pDNA后铺细胞再加PEI/pDNA的基因转染。图4为正置荧光显微镜下PCL及两种PCL-g-PGMA/明胶复合材料的细胞粘附情况。图5为正置荧光显微镜下PCL及两种PCL-g-PGMA/明胶复合材料的细胞粘附计数
后量化结果。图6为正置荧光显微镜下PCL及两种PCL-g-PGMA/明胶复合材料的细胞转染。图7为流式细胞术检测PCL及两种PCL-g-PGMA/明胶复合材料的细胞转染。
具体实施例方式下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。下述实施例中所用的PCL、BIBB、GMA的结构式如下所示PCL 结构式
OO
q _—q ■ ICHJ2 —OO j- C "O H H
-LJ·I，6 己二胺结构式NH2 (CH2) 6NH2BIBB 结构式
权利要求
1.PCL-g-PGMA/明胶复合材料在细胞转染中的应用； 所述PCL-g-PGMA/明胶复合材料是按照包括下述步骤的方法制备得到的 1)制备聚e-己内酯膜； 2)将所述聚e-己内酯膜置于1，6己二胺的丙醇溶液中浸泡，得到部分端基为氨基的聚e -己内酯膜PCL-NH2 ;将膜取出，依次用乙醇、水、乙醇进行清洗并干燥； 3)将步骤2)得到的干燥膜PCL-NH2置于由2-溴-异丁基酰溴、三乙胺和正己烷组成的混合溶液中进行酯化反应，得到表面溴化的聚e -己内酯膜PCL-Br ;将膜取出，依次用乙醇、水、乙醇进行清洗并干燥； 4)在无氧条件下，以步骤3)得到的干燥膜PCL-Br为引发剂、甲基丙烯酸缩水甘油酯为接枝单体、溴化铜和溴化亚铜为催化剂、2，2联吡啶为配位剂，甲醇与水的混合溶液为溶剂，进行原子转移自由基聚合反应，得到聚e -己内酯/甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝共聚物，即PCL-g-PGMA ;将PCL-g-PGMA膜取出，依次用乙醇、水、乙醇进行清洗并干燥； 5)将步骤4)得到的干燥PCL-g-PGMA膜在明胶水溶液中浸泡，取出后用去离子水清洗并干燥，得到PCL-g-PGMA/明胶复合材料。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于步骤2)中所述1，6己二胺的丙醇溶液中1,6己二胺的质量浓度为10-11% ;所述浸泡的时间为18-24小时； 步骤3)中所述混合溶液中2-溴-异丁基酰溴、三乙胺和正己烷的体积比依次为(1-1.2) (1-1.2) (20-20. 5);所述酯化反应的反应温度为20-25°C，反应时间为2-3小时； 步骤4)所述原子转移自由基聚合反应中，所述甲基丙烯酸缩水甘油酯、溴化铜、溴化亚铜、2，2-联吡啶、甲醇、水的配比依次为(5-5. 2)ml (0. 0084-0. 0090)g (0. 044-0. 050) g (0. 0446-0. 0448) g (10-10. 2) ml (2-2. 2) ml ； 步骤4)中所述原子转移自由基聚合反应的反应温度为25-28°C ;反应时间为5-60分钟，优选10-30分钟； 步骤5)中所述明胶水溶液中明胶的浓度为10-12. 5mg/ml ;所述浸泡的温度为37-37. 5°C，浸泡的时间为24-72小时。
3.一种细胞转染的方法，包括下述步骤将转染试剂/核酸复合物与待转染细胞混合置于权利要求I所述PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜上，培养，得到目的转染细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法包括下述步骤将细胞于转染前接种到所述PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜上，培养；再将转染试剂/核酸复合物滴加在所述细胞上，孵育，得到目的转染细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于将所述细胞于转染前12-24小时接种到PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜上；所述孵育的温度为室温至37°C，时间24-48小时。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法包括下述步骤将转染试剂/核酸复合物滴加在所述PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜，孵育1-6小时；接着将细胞滴加在所述PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜上，室温至37°C孵育24-48小时，得到目的转染细胞。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法包括下述步骤 I)将转染试剂/核酸复合物滴加在所述PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜，孵育1-6小时；接着将细胞滴加在所述PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜上，孵育使细胞进行第一次转染；2)弃去原培养基，加入新鲜的培养基，再将包含待转染核酸的溶液滴加在细胞上，孵育使细胞进行第二次转染。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述孵育使细胞进行第一次转染中，孵育的温度为室温至37°C，时间12-24小时；所述孵育使细胞进行第二次转染中，孵育的温度为室温至37°C，时间12-24小时。
9.根据权利要求3-8中任一项所述的方法，其特征在于所述转染试剂/核酸复合物中的转染试剂为聚乙烯亚胺，核酸为DNA片段或重组质粒；所述细胞为真核细胞。
全文摘要
本发明公开了一种PCL-g-PGMA/明胶复合材料在细胞转染中的应用。由于本发明使用的PCL-g-PGMA/明胶复合材料既可以直接吸附细胞，也可以吸附PEI/DNA或其他阳离子转染试剂/DNA复合物。因此本发明在国内外首次提出如图所示的新型转染方法A方式为材料上粘附细胞后直接进行转染；B方式为材料上吸附PEI/pDNA复合物后再粘附细胞实现细胞的被动转染；C方式为材料上吸附PEI/pDNA复合物后再粘附细胞实现细胞的第一次转染，一天后再进行第二次转染。通过获得GMA功能化修饰聚合物支架，可以实现细胞的两次转染，大大提高了基因转染的效率。
文档编号C08J7/04GK102675677SQ20111022885
公开日2012年9月19日 申请日期2011年8月10日 优先权日2011年3月17日
发明者徐福建, 李春燕, 袁伟, 赵平, 马洁 申请人:中国医学科学院肿瘤研究所