具有唾液酸糖链的糖肽的制造方法、用于该制造方法的唾液酸糖链加成氨基酸衍生物及 ...的制作方法
【专利摘要】[问题]本发明提供了在通过Boc固相合成法合成糖肽时，位于糖链的非还原末端的唾液酸不会分解，且可在高产率下得到具有所需唾液酸糖链的糖肽的制造方法。[方案]该具有唾液酸糖链的糖肽的制造方法的特征在于，在用于Boc固相合成法的Boc-唾液酸糖链加成氨基酸衍生物中，将位于糖链的非还原末端的唾液酸的羧基以苯甲酰甲基进行保护。
【专利说明】具有唾液酸糖链的糖肽的制造方法、用于该制造方法的唾液酸糖链加成氨基酸衍生物及该糖肽
【技术领域】
[0001]本发明涉及可用于例如医药品或分析机器的标准品、学术用试剂等应用的具有唾液酸糖链的糖肽的合成方法。
【背景技术】
[0002]近年来，作为排在核酸(DNA)、蛋白质之后的第三链状生物分子，糖链分子受到注目。人体是由约60万亿个细胞所组成的一大细胞社会,所有细胞表面由糖链分子所包覆。例如ABO式血型是由细胞表面之糖链相异来决定。
[0003]糖链具有涉及细胞间的辨识或相互作用的相关功能，作为构成细胞社会的必要物质而发挥作用。细胞社会的混乱与癌、慢性疾病、感染症、老化等相关，例如已知若细胞癌化时细胞表面上之糖链结构会起变化。
[0004]此外，已知霍乱弧菌(Vibrio cholerae)或流行性感冒病毒等通过辨识某特定糖链的结合，可侵入细胞并感染。
[0005]如此糖链功能之阐明，有助于以新原理为基础的医药品或食品的开发等，期待疾病预防、对治疗之贡献等广泛应用。
[0006]糖链因具有单糖之序列、结合模式和部位、链长和分支模式、总体高级结构等等多样性，与核酸或蛋白质之结构相比，具有非常复杂的结构。因此，来自该结构之生物学信息与核酸或蛋白质相比，更多种多样。糖链的研究重要性虽已被认可，但该结构的复杂或多样性导致其处于比核酸或蛋白质的研究进展更为迟缓的状态。
[0007]于细胞膜表面或血清等存在的许多蛋白质与糖链结合。糖链与蛋白质以共价键结合的分子称为糖蛋白，由糖与蛋白质之结合模式的相异，可分为2组。其中一个为天冬酰胺(Asn)之侧链上的氨基与糖链结合的天冬酰胺结合型糖链(N-糖苷键型)。另一个为丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)的醇与糖链结合的黏蛋白结合型糖链(O-糖苷键型)。所有天冬酰胺结合型糖链具有由5个糖残基所组成的基本骨架，依据所结合之糖链的非还原末端的糖残基种类可分类为高甘露糖型、复合型、混合型等子组。另一方面，黏蛋白结合型糖链由基本骨架(核心)之相异性可分类为4组。
[0008]具有糖链的蛋白质作为糖蛋白制剂已在世界范围内被利用，但该糖蛋白仅可由主要利用生化工程的方法获得，而且由此制作的糖蛋白纯度存在过低等问题。因此，期待一种纯度高且有效率地得到目标糖蛋白的化学合成方法。特别是，在合成具有非天然氨基酸的糖肽时，无法由生物学手法直接生产。
[0009]作为肽合成法而现在被广泛使用的为1963年时由R.B.Merrifield所开发的固相合成法。固相合成法是在被称为树脂(resin)的固相上连接氨基酸建筑块(BuildingBlocks)而延长肽链的方法。当肽链的延长完成后，从固相切除肽链而得到目标物。
[0010]作为该应用而延长肽链时，通过插入结合糖链之氨基酸，可进行糖肽链的合成。
[0011]固相合成法中，作为建筑块的氨基酸之氨基可由芴基甲氧基羰基(Fmoc)或叔丁氧基擬基(Boc)、苯甲氧基擬基(Cbz或Z)等保护。
[0012]其中，对于使用Boc基的固相合成法，在肽之侧链保护基的脱保护与将肽本身从树脂切出时，使用氟化氢等超强酸，由于该氟化氢之处理，在目标物的一部分含有糖链时，含该糖链的部分，特别是糖链的非还原末端的唾液酸存在容易被分解等问题。因此，对于Boc固相合成法，难以直接制造具有唾液酸糖链的目标糖蛋白。
[0013]此外，对于使用Fmoc基的固相合成法，可在碱性条件下，从氨基酸的氨基脱离Fmoc基。对此，由于Boc基可在酸性条件下从氨基酸的氨基脱保护，故在使用对碱不稳定的非天然氨基酸通过固相合成法合成肽或糖肽时，必须使用到Boc固相合成法。
[0014]非天然氨基酸虽非蛋白质构成氨基酸，但亦有在天然下存在的，且亦可通过化学合成得到。非天然氨基酸的结构多样性或取代基选择之自由度极高，利用这样的非天然氨基酸合成肽时，可望获得活体内之稳定性改善或效能提高、吸收效率提高、组织内分布的改善，或肽的三级结构之变化等，因可用于设计新颖的肽医药或功能材料之候选物质而受到注目。
[0015]此外，作为固相合成法之一，已有文献记载从树脂切离肽时，将所制作之肽转化为硫酯体(硫酯形式)的方法(例如非 专利文献I)。通过得到肽硫酯体，例如利用天然化学接合(Native Chemical LigatioruNCL法)或KCL法(Kinetically Controlled Ligation),可与其他肽链结合，可制造出较大的目标蛋白质(专利文献I及非专利文献2)。
[0016]所谓NCL法是通过连接N末端氨基酸为Cys的肽片段、与在C末端具有硫酯的肽片段，得到更大肽链的方法。此时，若使用加成糖链的肽片段，可合成糖蛋白。各片段例如可由上述固相合成法合成，在合成途中，通过结合具有均匀糖链的糖链加成天冬酰胺而不是氨基酸，可得到氨基酸序列及糖链结构均匀的糖链加成片段(专利文献2)。此外，所谓KCL法为，所要连接的两肽片段为于C末端具有硫酯时，利用反应速度之相异性，可得到较多的目标糖蛋白的方法。
[0017]因此，使用糖链加成片段进行NCL法或KCL法时，可得到可利用的均匀糖蛋白作为医药品，而不会因大批制造等而造成偏差。
[0018][在先技术文献]
[0019][专利文献]
[0020][专利文献I]国际公开公报第96/34878号手册
[0021][专利文献2]国际公开公报第2011/007747号手册
[0022][非专利文献]
[0023][非专利文献 I] Xianzhang B u.e t a 1.: TetrahedronLetters(2002)43:2419-2422
[0024][非专利文献 2] Hutloff A.et al.: Nature (1999) 397:263-266
【发明内容】
[0025]发明所要解决的问题
[0026]如上所述，对于Boc固相合成方法，期望保持唾液酸在糖链上不被分解的合成方法。发明人们发现了，在固相合成法中，通过以特定化合物对糖链上的唾液酸的羧基进行保护而合成具有唾液酸糖链的糖肽的方法。然而，在Boc固相合成法中超强酸条件下，即使使用这些保护基，也无法充分保护糖链非还原末端的唾液酸，无法在期待产率下得到具有唾液酸糖链的糖肽。
[0027]因此，本发明提供了在使用Boc基的糖肽固相合成法中，在糖链的非还原末端之唾液酸不被分解下，可在高产率下合成具有唾液酸糖链的目标糖肽的方法。
[0028]另外，本发明提供了在使用Boc基的具有唾液酸糖链的糖肽的固相合成法中，制造硫酯形式糖肽的方法。
[0029]解决问题的手段
[0030]为解决上述问题，本发明人们经详细研究，结果发现，通过使用苯甲酰甲基作为糖链非还原末端之唾液酸的羧基的保护基，在Boc固相合成法中可大幅度改善具有唾液酸糖链的糖肽的收率。
[0031]即，本发明涉及具有唾液酸糖链的糖肽的制造方法，含有以下步骤:
[0032](I)将具有羟基的树脂(resin)与其氨基氮以Boc基进行保护的氨基酸结合的步骤；
[0033]其中，所述结合步骤为，将前述树脂的羟基与前述氨基酸的羧基通过酯化反应进行结合的步骤。
[0034](2)通过将前述Boc基脱离而形成游离氨基的步骤；
[0035](3)将以下的⑴及(ii)的步骤至少重复进行I次的步骤:
[0036](i)通过进一步结合以Boc基保护氨基氮的其他氨基酸，使结合于树脂的氨基酸延长的步骤，
[0037]其中，该延长步骤为，将前述其他氨基酸的羧基与结合于前述树脂的氨基酸的前述游离氨基结合的步骤。
[0038](ii)通过脱离(i)中的前述Boc基而形成游离氨基的步骤；
[0039](4)以酸切断树脂的步骤，
[0040]其中步骤(1)中的前述氨基酸和/或步骤(3)的至少I次的(i)中的前述其他氨基酸为糖链加成氨基酸，该糖链加成氨基酸的糖链非还原末端中的至少I个具有唾液酸，且该唾液酸的羧基是由苯甲酰甲基保护。
[0041]进一步，本发明的具有唾液酸糖链的糖肽的制造方法的一实施方式中，其特征在于前述糖链加成氨基酸为天冬酰胺结合型糖链或黏蛋白结合型糖链。
[0042]此外，本发明的具有唾液酸糖链的糖肽之制造方法的一实施方式中，其特征在于，前述步骤(4)中，前述酸为三氟乙酸/三氟甲烷磺酸/ 二甲基硫化物/间甲酚的混合酸。
[0043]此外，本发明的具有唾液酸糖链的糖肽之制造方法的一实施方式中，其特征在于，前述步骤(1)中，前述氨基酸和/或前述步骤(3)的至少I次的(i)中的前述其他氨基酸为对碱不稳定(base-labile)的非天然氨基酸。
[0044]此外，本发明的具有唾液酸糖链的糖肽之制造方法的一实施方式中，其特征在于，前述糖链加成氨基酸中的至少I个为唾液酸糖链天冬酰胺，前述唾液酸糖链天冬酰胺具有6个以上的糖残基。
[0045]此外，本发明的具有唾液酸糖链的糖肽之制造方法的一实施方式中，其特征在于，前述糖链加成氨基酸中的至少I个为唾液酸糖链天冬酰胺，前述唾液酸糖链天冬酰胺具有9~11个糖残基。[0046]此外，本发明的具有唾液酸糖链的糖肽之制造方法的一实施方式中，其特征在于，前述糖链加成氨基酸中的至少I个为唾液酸糖链天冬酰胺，前述糖链天冬酰胺具有6个以上的糖残基，并结合有2分支型糖链。
[0047]此外，本发明的具有唾液酸糖链的糖肽之制造方法的一实施方式中，其特征在于，前述糖链加成氨基酸由式(I)表示:
【权利要求】
1.具有唾液酸糖链的糖肽的制造方法，其特征为，所述方法包含以下步骤， (1)将具有羟基的树脂(resin)与氨基氮以Boc基保护的氨基酸进行结合的步骤； 其中，所述结合步骤为，将所述树脂的羟基与所述氨基酸的羧基通过酯化反应进行结合的步骤， (2)通过使所述Boc基脱离而形成游离氨基的步骤； (3)将以下的⑴及(ii)的步骤至少重复进行I次: (i)通过进一步结合以Boc基保护氨基氮的其他氨基酸，使结合于树脂的氨基酸延长的步骤； 其中，所述延长步骤为，将所述其他氨基酸的羧基与结合于所述树脂的氨基酸的所述游离氨基结合的步骤， (?)通过使(i)中的所述Boc基脱离而形成游离氨基的步骤；以及 (4)以酸切断树脂的步骤； 其中，步骤(1)中的所述氨基酸和/或步骤(3)的至少I次的(i)中的所述其他氨基酸为糖链加成氨基酸，且该糖链加成氨基酸的糖链非还原末端中的至少I个具有唾液酸，且该唾液酸的羧基是由苯甲酰甲基保护。
2.如权利要求1所述的制造方法，其中，所述糖链加成氨基酸为天冬酰胺结合型糖链或黏蛋白结合型糖链。`
3.如权利要求1或2所述的制造方法，其中，所述步骤(4)中，所述酸为三氟乙酸/三氟甲烷磺酸/二甲基硫化物/间甲酚的混合酸。
4.如权利要求1至3中任一项所述的制造方法，其中，所述步骤(1)中的所述氨基酸和/或所述步骤(3)的至少I次的(i)中的所述其他氨基酸为对碱不稳定的非天然氨基酸。
5.如权利要求1至4中任一项所述的制造方法，其中，所述糖链加成氨基酸中的至少I个为唾液酸糖链天冬酰胺，所述唾液酸糖链天冬酰胺具有6个以上的糖残基。
6.如权利要求1至4中任一项所述的制造方法，其中，所述糖链加成氨基酸中的至少I个为唾液酸糖链天冬酰胺，所述唾液酸糖链天冬酰胺具有9~11个糖残基。
7.如权利要求1至4中任一项所述的制造方法，其中，所述糖链加成氨基酸中的至少I个为唾液酸糖链天冬酰胺，所述糖链天冬酰胺具有6个以上的糖残基，并结合有2分支型糖链。
8.如权利要求1至4中任一项所述的制造方法，其中，所述糖链加成氨基酸由下式(I)所示；
9.如权利要求1至8中任一项所述的制造方法，其中，在所述步骤(1)之前，还包括将硫醇化合物与树脂结合的步骤。
10.如权利要求9所述的制造方法，其中，在所述步骤(4)之后，还包括(5)将具有唾液酸糖链的糖肽的硫酯体与肽片段或糖肽片段连接的步骤。
11.如权利要求1至10中任一项所述的制造方法，其中，在所述前述步骤⑷的以所述酸切断所述树脂之前，还包括使标识剂反应的步骤。
12.如权利要求11所述的制造方法，其中，所述标识剂为丹磺酰卤化物。
13.如权利要求1至10中任一项所述的制造方法，其中，所述步骤(1)~(3)中的至少I个步骤中，在进行所述氨基酸的缩合反应和/或Boc基的脱离反应时，照射微波。
14.如权利要求1至13中任一项所述的具有唾液酸糖链的糖肽的制造方法，其特征为，在所述步骤(4)之后，还包括将保护所述唾液酸的羧基的苯甲酰甲基脱保护的步骤。
15.具有唾液酸糖链的糖肽，由权利要求1至14中任一项所述的制造方法所制造。
16.唾液酸糖链天冬酰胺衍生物的制造方法，其中，唾液酸糖链天冬酰胺的氨基以Boc基保护，且所述糖链的非还原末端的唾液酸的羧基以苯甲酰甲基保护，包括以下步骤: 在天冬酰胺的氨基由脂溶性保护基保护的唾液酸糖链天冬酰胺衍生物中导入苯甲酰甲基的步骤； 将导入苯甲酰甲基的唾液酸糖链天冬酰胺的脂溶性保护基脱离的步骤；以及 在脱离了脂溶性保护基的唾液酸糖链天冬酰胺中导入Boc基的步骤。
17.如权利要求16所述的制造方法，其中，所述脂溶性保护基为Fmoc。
【文档编号】C08B37/00GK103534276SQ201280012289
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2012年3月5日 优先权日:2011年3月10日
【发明者】梶原康宏, 村上真淑, 石井一之 申请人:株式会社糖锁工学研究所