一种可大量制备碳量子点生物成像剂的方法
【专利摘要】本发明公开一种碳量子点生物的成像剂的制备方法及碳量子点生物的成像剂。本发明的制备方法是将质量比为1%-99%的丙三醇与质量比99%-1%的硅烷偶联剂比混合作为前躯体，在惰性气体保护下160℃～270℃下充分反应得到碳量子点生物成像剂。本发明具有：所制备的碳量子点生物成像剂产率高、产率大、在不同激发波长下可以激发出不同颜色的荧光；在制备过程中将产物表面钝化、表面修饰等过程一步完成；可制备薄膜器件；低细胞毒性，易溶于水或有机溶剂，可用于细胞成像、或活体成像等领域；成像剂具有耐光漂白等优点。
【专利说明】一种可大量制备碳量子点生物成像剂的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物成像剂的制备方法及用这种方法制备的成像剂，特别是一种碳量子点生物的成像剂的制备方法及碳量子点生物的成像剂。【背景技术】
[0002]荧光材料广泛应用于生物成像等领域，这类材料大致包括:荧光染料、量子点、贵金属纳米簇等。然而，目前的荧光材料在生物成像的应用方面还存在种种限制。例如，荧光染料是最早被应用于成像等领域的，但面临光漂白、光降解等问题的困扰。各种量子点的诞生貌似解决了这一难题，然而许多量子点由于合成步骤复杂，且制备产物都是剧毒物质，在生物成像领域难以获得广泛应用。近些年来，贵金属等纳米簇的异军突起有望填补这一领域的空白。但是荧光碳量子点与纳米簇相比，其制造成本、制造方法、产量及量子产率等都有很大的优势。而碳量子点独特的光电性质使其在生物成像、药物诊断、光催化、光伏器件等领域有潜在的利用价值，因此，吸引了大量的关注。与其他量子点一样，许许多多的文献都集中在合成的方法学上。最近，一系列合成碳量子点的方法被发掘，例如:热解法、不完全燃烧法、电化学剥离、强酸氧化、微波辅助、激光刻蚀、水热反应法等几大类。各种各样的前驱体被应用于碳量子点的合成，例如:石墨烯、氧化石墨、咖啡渣、柠檬酸、蜡烛灰等等。然而，在调研了各种各样的方法之后发现一个共性，当这些碳点被制备好之后需要一个表面钝化的过程，在没有这一步钝化的碳点其量子产率都非常低(1%左右)。而碳点钝化所用到的试剂经常以高聚物为主，被高聚物钝化后的碳点要想进行下一步的修饰，使其功能化就比较困难。这就会限制其广泛的应用前景。而且部分限制了碳量子点的大量生产。因此，找到一种简单、低成本、绿色、可大量生产且易功能化的方法是迫切的需要。
[0003]现有技术可参考以下文献:
(出处为(I)X.Wang, L.Cao, S.-T.Yang, F.Lu, M.J.Meziani, L.Ti an, K.ff.Sun, M.A.Bloodgood, Y.-P.Sun, Angew.Chem.1nt.Ed.2010, 49, 5310-5314.(2)J.Zhou, C.Booker, R.Li, X.Zhou, T.-K.Sham, X.Sun, Z.Ding, J.Am.Chem.Soc.2007, 129，744-745.(3)S.-L.Hu, K.-Y.Niu, J.Sun, J.Yang, N.-Q.Zhao, X.-ff.Du, J.Mater.Chem.2009, 19，484-488.(4)H.Li, Z.Kang, Y.Liu, S.-T.Lee, J.Mater.Chem.2012, 22,24230-24253.)。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种可克服现有技术不足的、可大量制备碳量子点生物成像剂的方法。
[0005]本发明的可大量制备碳量子点生物成像剂的方法是将质量比为I %_99%的丙三醇与质量比99 %_1%的硅烷偶联剂比混合作为前躯体，在惰性气体保护下160 °C~ 270 °〇下充分反应得到碳量子点生物成像剂。本发明可用的硅烷偶联剂可以是:(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷、3-氨丙基二甲氧基硅烷、异氰酸丙基二乙氧基硅烷、二乙氧基甲基硅烷或二乙氧基_2_丙烯基硅烷。
[0006]本发明的可大量制备碳量子点生物成像剂的方法中，所用的硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷。相比于其它硅烷偶联剂，由于3-氨丙基三乙氧基硅烷含有一个氨基，在形成碳量子点之后，活泼的氨基在碳量子点表面有利于功能化修饰，再者利用3-氨丙基三乙氧基硅烷制备的碳量子点的荧光量子产率更高。
[0007]本发明的方法中丙三醇占总体积79 %，3-氨丙基三乙氧基硅烷占总体积21 %时为最优比例，在此比例下其荧光量子产率最大，可达到35 %。
[0008]用本发明的方法可以大量制备出碳量子点生物成像剂。
[0009]将用本发明方法制备的碳量子点生物成像剂与易成膜高聚物结合可制备出的具有成膜性的聚合物或薄膜器件。
[0010]本发明的方法具有如下优点:
1、所制备的碳量子点生物成像剂产率高、产率大、在不同激发波长下可以激发出不同颜色的荧光；
2、在制备过程中将产物表面钝化、表面修饰等过程一步完成，无需现有技术需再进行钝化处理；
3、所制备的碳量子点生物成像剂可很容易地与成膜膜高聚物结合，制备出荧光碳量子点薄膜，得到薄膜器件；
4、本发明所制备的碳量子点 生物成像剂具有低细胞毒性，易溶于水或有机溶剂，可用于细胞成像、或活体成像等领域；
5、所得到的碳量子点生物成像剂具有耐光漂白的特点。
[0011]【专利附图】
【附图说明】
图1为碳量子点在365 nmLED灯照射下数码照片。
[0012]图2为碳量子点的高分辨透射电镜照片(HRTEM)。
[0013]图3为碳量子点成膜后在365 nm LED光源照射下的数码照片。
[0014]图4为碳量子点在Hela细胞中的488 nm激光激发波长下的共聚焦荧光成像照片。
[0015]图5为碳量子点利用MTT法进行的细胞毒性测试。
[0016]图6为碳量子点以斑马鱼为实验对象在488 nm激光激发下活体共聚焦荧光成像照片。
【具体实施方式】
[0017]本发明以下提供实施例详细解说。
[0018]实施例1:
a将4 mL (约占总体积21%) 3-氨基三乙氧基硅烷与15 mL丙三醇混合均匀；b将前驱体放入聚四氟乙烯的反应釜中，氩气吹扫10 min，在此氩气保护下密封；c将前驱体加热到200°C，惰性气氛中保护下进行反应30 min后冷却至室温，即得到透明、黄色液体的碳量子点生物成像剂。[0019]反应产物见图1，在365 nm LED光源激发下，本发明的碳量子点生物成像剂可以发出强烈的蓝色荧光，测得其绝对量子产率为35.4 %.因此，其出色的荧光性质可用于生物成像剂。
[0020]实施例2:
a将0.15 mL (约占总体积1%) 3-氨基三乙氧基硅烷与15 mL丙三醇混合均匀；b将前驱体放入聚四氟乙烯的反应釜中，氩气吹扫10 min，在此氩气保护下密封；c将前驱体加热到200°C，反应30 min后冷却至室温，得到的透明、黄色液体为碳量子点生物成像剂。
[0021]实施例3:
a将15 mL (约占总体积99%) 3-氨基三乙氧基硅烷与0.15 mL丙三醇混合均匀；b将前驱体放入聚四氟乙烯的反应釜中，氩气吹扫10 min，在此氩气保护下密封；c将前驱体加热到加热到200°C，反应30 min后冷却至室温，得到的透明、黄色液体为碳量子点生物成像剂。
[0022]实施例4:
a将1.5 mL (约占总体积13%) 3-氨基三乙氧基硅烷与10 mL丙三醇混合均匀； b将前驱体放入聚四氟乙烯的反应釜中，氩气吹扫10 min，在此氩气保护下密封； c将前驱体加热到200°C，反应15 min后冷却至室温，即得到碳量子点生物成像剂。
[0023]反应产物的微观形貌利用透射电子显微镜(TEM)进行表征见图2，由图可得其粒径大小约为7.2 nm。
[0024]实施例5:
a将4 mL (约占总体积13%) 3-氨基三乙氧基硅烷与15 mL丙三醇混合均匀；b将前驱体放入聚四氟乙烯的反应釜中，氩气吹扫10 min，在此氩气保护下密封；c将前驱体加热到270°C，反应15 min后冷却至室温，得到透明的黄色液体，该液体为碳量子点荧光成像剂。
[0025]实施例6:
a将4 mL (约占总体积13%) 3-氨基三乙氧基硅烷与15 mL丙三醇混合均匀；b将前驱体放入聚四氟乙烯的反应釜中，氩气吹扫10 min，在此氩气保护下密封；c将前驱体加热到160°C，反应60 min后冷却至室温，得到透明的黄色液体，该液体即为碳量子点荧光成像剂。
[0026]实施例7:
为了证明本发明中所提及该发明无需分步进行表面钝化处理，在碳量子点的制备过程中硅烷偶联剂可以钝化剂一步法完成整个反应过程，我们以此实例进行对比验证:a将4 mL (约占总体积21%) 3-氨基三乙氧基硅烷与15 mL丙三醇混合均匀；b将前驱体放入聚四氟乙烯的反应爸中，IS气吹扫10 min ；c将前驱体加热到200°C，反应30 min后冷却至室温，得到本发明的产物I。
[0027]d将15 mL丙三醇四氟乙烯的反应釜中，氩气吹扫10 min。
[0028]e将前驱体加热到200°C，反应30 min后冷却至室温，得到没有加入任何硅烷偶联剂作为钝化剂的产物2。
[0029]通过荧光光谱仪表征以上两种产物的绝对量子产率分别为:产物I为35.4%，产物2 为 8.6%ο
[0030]由此可知，本发明中硅烷偶联剂作为钝化剂可以在一步中制得荧光碳量子点成像剂，其钝化后的量子产率远远高于没有加入钝化剂的产物。
[0031]实施例8:
a将1.2 g聚乙烯醇1788与7.5 mL水混合搅拌15 min。
[0032]b将2.3 mL制备好的碳量子点与聚乙烯醇水溶液混合均匀，95°C下冷凝回流60min直到聚乙烯醇彻底溶解。
[0033]c溶解后的澄清透明溶液以刮膜的方式涂覆在载玻片上，室温下放置干燥，可形成自支撑薄膜。在365 nm LED照射下发出明显的蓝色荧光，如图3所示。
[0034]实施例9:荧光碳量子点在海拉(Hela)细胞成像中应用:
a将1.5 mL碳量子点溶于13.5 mL超纯水中，剧烈搅拌后，静止12 h，离心除去沉淀；b将除去沉淀后的碳量子点稀释10倍后，以10 μ L/mL的浓度与海拉细胞培养I h ；c标记后的海拉细胞用PBS缓冲溶液冲洗两次，除去多余的碳量子点；d利用LSM700共聚焦荧光显微镜在488 nm激光光源激发下，观察碳量子点海拉细胞中的成像情况。
[0035]如图4所示，海拉细胞在共聚焦显微镜下能够清楚显现绿色的荧光，从而观测其成像情况，并且在激光照射下，500分钟左右没有任何强度的衰减。由此，本发明所得碳量子点可以作为荧光生物成像剂。
[0036]实施例10:细胞毒性测试`:`
a 分别将如下浓度的碳量子点:0 μ g/mL>228 μ g/mL、456 μ g/mL、684 μ g/mL、912μ g/mL、1140 μ g/mL与海拉细胞培养24h，以这6组海拉细胞样品作为细胞毒性测试的实验对象；
b将100 μ L，2 mg/mL的噻唑蓝(MTT)分别与步骤a中6组海拉细胞并培养2h ；c由于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，而已经死亡的细胞没有这个功能，滤除不溶于水的甲瓒结晶，将其溶于100 μ L二甲基亚砜中，观测其490 nm处的吸光度，以说明细胞存活状况。如图5所示，当碳量子点的浓度达到1140 μ g/mL后依然保持着很好的细胞活性，看见本发明所制备的荧光碳量子点生物成像剂没有任何的细胞毒性。
[0037]实施例11:
活体共聚焦荧光成像:
a将1.5 mL碳量子点溶于13.5 mL超纯水中，剧烈搅拌后，静止12 h，离心除去沉淀；b将除去沉淀后的碳量子点稀释10倍后，以10 μ L/mL的浓度与斑马鱼幼苗在28.5°C下培育24 h ；
c将此鱼苗用PBS缓冲溶液清洗2次，除去多余的碳量子点；
d利用共聚焦荧光显微镜LSM700，在488 nm激光激发下观测活体鱼苗的荧光成像情况。
[0038]如图6所示,斑马鱼鱼苗通过突光碳量子点标记后利用488 nm激光激发后显示绿色荧光，能够清晰地观测其身体各部分器官及细胞，其成像效果极佳。
【权利要求】
1.一种可大量制备碳量子点生物成像剂的方法，其特征在于将质量比为I %-99%的丙三醇与质量比99 %_1%的硅烷偶联剂比混合作为前躯体，在惰性气体保护下160 °C~270°C下充分反应得到碳量子点生物成像剂。
2.根据权利要求1所述的可大量制备碳量子点生物成像剂的方法，其特征在于所用的硅烷偶联剂为3-氨丙基二乙氧基硅烷。
3.根据权利要求2所述的可大量制备碳量子点生物成像剂的方法，其特征在于丙三醇占总体积79 %, 3-氣丙基二乙氧基硅烷占总体积21 %。
4.权利要求1或2或所述的可大量制备碳量子点生物成像剂的方法制备的碳量子点生物成像剂。
5.权利要求4所述的碳量子点生物成像剂与易成膜高聚物制备的具有成膜性的聚合物。`
【文档编号】C08L29/04GK103482605SQ201310428368
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月19日 优先权日:2013年9月19日
【发明者】王强, 黄一凡, 周鑫 申请人:兰州大学