一种富硒猴头菌菌丝体多糖的精制工艺的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种富硒猴头菌菌丝体多糖的精制工艺。它与常见的猴头菇多糖在结构组成上有较大的不同，目前对于猴头菌菌丝体多糖的相关研究少有报道。利用本发明生产的猴头菌菌丝体，在菌丝体的生长过程中添加硒元素，提取菌丝体多糖之后，既能够发挥猴头菌菌丝体多糖类物质的生物活性作用，同时，也可以发挥硒元素的微量元素调节功能。所以，本发明制备的富硒猴头菌菌丝体多糖能够在食品抗菌添加剂、降糖药品添加剂、机体免疫调节保健品等方面具有广阔的应用前景。
【专利说明】—种富砸猴头菌菌丝体多糖的精制工艺
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种富硒猴头菌菌丝体多糖的精制工艺，属于微生物发酵工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]作为生命物质构成的主要成分之一，针对生物体内多糖的研究已经开展的十分深入，多糖分子的功能主要集中在两方面，一方面，多糖分子可以作为信息分子进行机体内部生物信息的传递，因此，这类多糖分子具有种类多、含量少、结构复杂、信息量大的特点。另一方面，多糖分子可以作为细胞和细胞外间质的主要构成成分，这类多糖的种类较少，但是，每种多糖分子的含量较多，其结构规则复杂，颗粒大小具有宏观不均一性。同时，多糖也是一类天然高分子化合物，它是由醛糖或酮糖通过糖苷键连接在一起的多聚物，是一切有生命的有机体必不可少的成分，与维持生物体的机能密切相关。经过近二十多年来的大量研究证明，多糖具有广泛的生物学活性，如抗肿瘤、免疫调节、抗感染、抗病毒、抗凝血、降血糖、抗辐射、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成、控制细胞分裂和分化、调节细胞的生长与衰老等，而且多糖作为药物应用过程的毒性极小，因而，多糖的活性研究已引起人们的极大兴趣。
[0003]目前，活性多糖的研究对象主要包括植物类、动物类、真菌类、细菌类、地衣类、藻类、花粉类多糖等等，研究方法涉及各种化学方法以及仪器分析方法，研究范围涉及多糖的分离纯化、理化性质、结构分析、免疫学、毒理学、药效学以及医学临床治疗应用等，可以说是针对多糖物质的研究已经达到了种类繁多、研究深入、应用广泛的程度。开展多糖资源的开发、多糖分子结构的分析、多糖药理作用等方面的研究，对于进一步丰富多糖物质的物种资源、探索多糖分子的生物学活性都具有十分重要的意义，因而，多糖的研究已经成为分子生物学、药剂学等领域中的热 点研究内容之一。猴头菌属于担子菌门、猴头菌科，是著名的药食两用真菌，其营养丰富，有“山珍猴头、海味燕窝”的美称。一般认为，猴头菌的主要活性物质为多糖、多肽和脂肪族酰类物质，其中猴头多糖一直是研究的热点。猴头多糖属于食药两用真菌多糖的一种，药理研究证明，猴头菌多糖能够增强腹腔巨噬细胞的吞噬功能、提高机体耐缺氧能力、提高肌体免疫力、提高心血输出量、抑制肿瘤细胞生长、抗衰老、抗突变、抗氧化，对辐射损伤有保护作用，还对胃粘膜有较好的保护作用。因而，针对猴头多糖进行细致的研究具有十分重大的意义。
[0004]此外，关于富硒产品的开发，目前在食品、药品、保健品方面也是一个热点科研方向。硒元素是人体多种酶的活性中心，它也是人体必需的多种微量元素之一。多项研究结果表明，硒的氨基酸化合物在人体的生命活动中能够起到抵御疾病、对抗衰老、增强人体免疫功能的作用。例如，硒元素是谷胱甘肽过氧化物酶家族和硫氧还蛋白还原酶家族的活性中心，由谷胱甘肽过氧化物酶家族和硫氧还蛋白还原酶家族与硒元素结合之后，具有较强的清除氧自由基、防止脂膜过氧化的功能，是机体抗氧化体系的重要组成部分。此外，硒元素对于机体的细胞免疫和体液免疫能力的维持具有一定的支撑作用，硒元素具有保护胸腺、维持机体淋巴细胞的活性以及刺激抗体产生的作用，从而实现了增强机体免疫能力的功能。
[0005]目前，研究较多的是猴头菇多糖的生物活性，对于猴头菌菌丝体多糖的相关研究较少。因此，在猴头菌菌丝体的生长过程中添加硒元素，提取菌丝体多糖之后，既能够发挥多糖类物质的生物活性，同时也可以发挥硒的微量元素的调节功能。所以，本发明制备的富硒猴头菌菌丝体多糖能够在食品、药品、保健品方面具有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种富硒猴头菌菌丝体多糖的精制工艺。
[0007]上述富硒猴头菌菌丝体多糖的精制工艺，包括如下步骤:
[0008](1)猴头菌菌种的活化:将购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心的编号为5.0058猴头菌菌种，利用PDA固体试管培养基活化，培养条件为25°C _28°C培养箱中静置培养96小时-144小时，获得活化后的猴头菌菌种；
[0009](2)猴头菌的液体初级发酵:将步骤(1)中的活化后的猴头菌菌种，无菌条件下转接于液体初级发酵培养基中，每IL猴头菌液体初级发酵培养基含有葡萄糖20g、蛋白胨
0.3g、酵母膏0.6g、KH2P042g、MgSO4.7H201.5g、亚硒酸钠0.125g,加蒸懼水至1L,分装灭菌之后使用，转接之后在25°C _28°C培养箱中进行液体初级发酵培养15天-20天，获得猴头菌液体初级发酵产物；
[0010](3)猴头菌的液体大规模发酵；将步骤(2)获得的猴头菌液体初级发酵产物，在无菌条件下挑取一块菌丝片，转接于一个装有50mL猴头菌液体大规模发酵培养基的500mL三角瓶中，IL猴头菌液体大规模发酵培养基含有葡萄糖25g、蛋白胨0.4g、酵母膏0.6g、KH2P042g、MgSO4.7H201.5g、亚硒酸钠0.25g,加蒸懼水至1L,分装灭菌之后使用，转接之后在25°C _28°C培养箱中静置培养15天-20天，获得富硒猴头菌液体大规模发酵产物；
[0011](4)富硒猴头菌菌丝体的收集:将步骤(3)获得的富硒猴头菌液体大规模发酵产物，在无菌条件下利用8层纱布进行过滤收集菌丝体，再利用蒸馏水清洗3-5次，并且尽可能多的除掉水分，然后，将猴头菌菌丝片置于35°C _40°C干燥培养箱中进行干燥处理24小时-48小时，获得干燥处理后的猴头菌菌丝体；
[0012](5)富硒猴头菌菌丝体的粉碎:将步骤(4)获得的干燥处理后的猴头菌菌丝体，利用洁净的研钵进行研磨处理，研磨到成为较细的粉末状为止，获得富硒猴头菌菌丝体粉末；
[0013](6)富硒猴头菌菌丝体粗多糖的提取:称取步骤(5)获得的富硒猴头菌菌丝体粉末5g，在500mL的玻璃烧杯中加入150mL-250mL的蒸馏水，在恒温水浴锅中进行50°C -70°C恒温浸提3h-5h，之后，按照体积比为1:1的比例加入无水乙醇进行粗多糖的沉淀，然后，1000Orpm离心收集粗多糖，最后沉淀在35°C _40°C的恒温培养箱中进行粗多糖的干燥处理，获得富硒猴头菌菌丝体粗多糖；
[0014](7)富硒猴头菌菌丝体多糖的精制:将步骤(6)获得的富硒猴头菌菌丝体粗多糖2g，利用按照体积比为25:24:1的比例配制的苯酚-氯仿-异戊醇混合液20mL，进行室温浸泡处理3h-5h，之后将混合液进行1000Orpm离心，收集上层液体，利用分子截留能力为3500KDa的透析袋对蒸馏水透析24h，之后，按照体积比为1:1的比例加入无水乙醇进行多糖的沉淀，然后，1000Orpm离心收集多糖，最后沉淀在35°C _40°C的恒温培养箱中进行多糖的干燥处理，获得富硒猴头菌菌丝体精制多糖。
[0015]本发明的优点:
[0016]本发明涉及一种富硒猴头菌菌丝体多糖的精制工艺。由该方法制备的富硒猴头菌菌丝体精制多糖既可以充分发挥猴头菌菌丝多糖的免疫调节和抗氧化、降血糖的生物活性作用，又可以发挥硒元素的微量元素调节功能，因此，它可以成为保健品微量添加剂的主要成分。同时，获得的富硒猴头菌菌丝体精制多糖，在降血糖药品的开发方面也具有良好的应用价值。
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述。
[0018]实施例1 一种富硒猴头菌菌丝体多糖的低温精制工艺。
[0019](I)猴头菌菌种的活化:将购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心的编号为5.0058猴头菌菌种，利用PDA固体试管培养基活化，培养条件为25°C _28°C培养箱中静置培养96小时-144小时，获得活化后的猴头菌菌种；
[0020](2)猴头菌的液体初级发酵:将步骤(1)中的活化后的猴头菌菌种，无菌条件下转接于液体初级发酵培养基中，每IL猴头菌液体初级发酵培养基含有葡萄糖20g、蛋白胨
0.3g、酵母膏0.6g、KH2P042g、MgSO4.7H201.5g、亚硒酸钠0.125g,加蒸懼水至1L,分装灭菌之后使用，转接之后在25°C _28°C培养箱中进行液体初级发酵培养15天-20天，获得猴头菌液体初级发酵产物；
`[0021](3)猴头菌的液体大规模发酵；将步骤(2)获得的猴头菌液体初级发酵产物，在无菌条件下挑取一块菌丝片，转接于一个装有50mL猴头菌液体大规模发酵培养基的500mL三角瓶中，IL猴头菌液体大规模发酵培养基含有葡萄糖25g、蛋白胨0.4g、酵母膏0.6g、KH2P042g、MgSO4.7H201.5g、亚硒酸钠0.25g,加蒸懼水至1L,分装灭菌之后使用，转接之后在25°C _28°C培养箱中静置培养15天-20天，获得富硒猴头菌液体大规模发酵产物；
[0022](4)富硒猴头菌菌丝体的收集:将步骤(3)获得的富硒猴头菌液体大规模发酵产物，在无菌条件下利用8层纱布进行过滤收集菌丝体，再利用蒸馏水清洗3-5次，并且尽可能多的除掉水分，然后，将猴头菌菌丝片置于35°C _40°C干燥培养箱中进行干燥处理24小时-48小时，获得干燥处理后的猴头菌菌丝体；
[0023](5)富硒猴头菌菌丝体的粉碎:将步骤(4)获得的干燥处理后的猴头菌菌丝体，利用洁净的研钵进行研磨处理，研磨到成为较细的粉末状为止，获得富硒猴头菌菌丝体粉末；
[0024](6)富硒猴头菌菌丝体粗多糖的提取:称取步骤(5)获得的富硒猴头菌菌丝体粉末5g，在500mL的玻璃烧杯中加入150mL的蒸馏水，在恒温水浴锅中进行50°C恒温浸提4h，之后，按照体积比为1:1的比例加入无水乙醇进行粗多糖的沉淀，然后，1000Orpm离心收集粗多糖，最后沉淀在35V _40°C的恒温培养箱中进行粗多糖的干燥处理，获得富硒猴头菌菌丝体粗多糖；
[0025](7)富硒猴头菌菌丝体多糖的精制:将步骤(6)获得的富硒猴头菌菌丝体粗多糖2g，按照体积比为25:24:1的比例配制的苯酚-氯仿-异戊醇混合液20mL，进行室温浸泡处理3h-5h，之后将混合液进行1000Orpm离心，收集上层液体，利用分子截留能力为3500KDa的透析袋对蒸馏水透析24h，之后，按照体积比为1:1的比例加入无水乙醇进行多糖的沉淀，然后，1000Orpm离心收集多糖，最后沉淀在35°C _40°C的恒温培养箱中进行多糖的干燥处理，获得富硒猴头菌菌丝体精制多糖。
[0026]在这种提取工艺的处理条件下，富硒猴头菌菌丝体精制多糖的得率为8.32%。
[0027]实施例2 —种富硒猴头菌菌丝体多糖的中温精制工艺。
[0028](I)猴头菌菌种的活化:将购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心的编号为
5.0058猴头菌菌种，利用PDA固体试管培养基活化，培养条件为25°C _28°C培养箱中静置培养96小时-144小时，获得活化后的猴头菌菌种；
[0029](2)猴头菌的液体初级发酵:将步骤(1)中的活化后的猴头菌菌种，无菌条件下转接于液体初级发酵培养基中，每IL猴头菌液体初级发酵培养基含有葡萄糖20g、蛋白胨
0.3g、酵母膏0.6g、KH2P042g、MgSO4.7H201.5g、亚硒酸钠0.125g,加蒸懼水至1L,分装灭菌之后使用，转接之后在25°C _28°C培养箱中进行液体初级发酵培养15天-20天，获得猴头菌液体初级发酵产物；
[0030](3)猴头菌的液体大规模发酵；将步骤(2)获得的猴头菌液体初级发酵产物，在无菌条件下挑取一块菌丝片，转接于一个装有50mL猴头菌液体大规模发酵培养基的500mL三角瓶中，IL猴头菌液体大规模发酵培养基含有葡萄糖25g、蛋白胨0.4g、酵母膏0.6g、KH2P042g、MgSO4.7H201.5g、亚硒酸钠0.25g,加蒸懼水至1L,分装灭菌之后使用，转接之后在25°C _28°C培养箱中静置培养15天-20天，获得富硒猴头菌液体大规模发酵产物；
[0031](4)富硒猴头菌`菌丝体的收集:将步骤(3)获得的富硒猴头菌液体大规模发酵产物，在无菌条件下利用8层纱布进行过滤收集菌丝体，再利用蒸馏水清洗3-5次，并且尽可能多的除掉水分，然后，将猴头菌菌丝片置于35°C _40°C干燥培养箱中进行干燥处理24小时-48小时，获得干燥处理后的猴头菌菌丝体；
[0032](5)富硒猴头菌菌丝体的粉碎:将步骤(4)获得的干燥处理后的猴头菌菌丝体，利用洁净的研钵进行研磨处理，研磨到成为较细的粉末状为止，获得富硒猴头菌菌丝体粉末；
[0033](6)富硒猴头菌菌丝体粗多糖的提取:称取步骤(5)获得的富硒猴头菌菌丝体粉末5g，在500mL的玻璃烧杯中加入150mL-250mL的蒸馏水，在恒温水浴锅中进行60°C恒温浸提4h，之后，按照体积比为1:1的比例加入无水乙醇进行粗多糖的沉淀，然后，1000Orpm离心收集粗多糖，最后沉淀在35 V -40°C的恒温培养箱中进行粗多糖的干燥处理，获得富硒猴头菌菌丝体粗多糖；
[0034](7)富硒猴头菌菌丝体多糖的精制:将步骤(6)获得的富硒猴头菌菌丝体粗多糖2g，利用按照体积比为25:24:1的比例配制的苯酚-氯仿-异戊醇混合液20mL，进行室温浸泡处理3h-5h，之后将混合液进行1000Orpm离心，收集上层液体，利用分子截留能力为3500KDa的透析袋对蒸馏水透析24h，之后，按照体积比为1:1的比例加入无水乙醇进行多糖的沉淀，然后，1000Orpm离心收集多糖，最后沉淀在35°C _40°C的恒温培养箱中进行多糖的干燥处理，获得富硒猴头菌菌丝体精制多糖。
[0035]在这种提取工艺的处理条件下，富硒猴头菌菌丝体精制多糖的得率为9.36%。
[0036]实施例3 —种富硒猴头菌菌丝体多糖的高温精制工艺。。[0037](I)猴头菌菌种的活化:将购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心的编号为
5.0058猴头菌菌种，利用PDA固体试管培养基活化，培养条件为25°C _28°C培养箱中静置培养96小时-144小时，获得活化后的猴头菌菌种；
[0038](2)猴头菌的液体初级发酵:将步骤(1)中的活化后的猴头菌菌种，无菌条件下转接于液体初级发酵培养基中，每IL猴头菌液体初级发酵培养基含有葡萄糖20g、蛋白胨
0.3g、酵母膏0.6g、KH2P042g、MgSO4.7H201.5g、亚硒酸钠0.125g,加蒸懼水至1L,分装灭菌之后使用，转接之后在25°C _28°C培养箱中进行液体初级发酵培养15天-20天，获得猴头菌液体初级发酵产物；
[0039](3)猴头菌的液体大规模发酵；将步骤(2)获得的猴头菌液体初级发酵产物，在无菌条件下挑取一块菌丝片，转接于一个装有50mL猴头菌液体大规模发酵培养基的500mL三角瓶中，IL猴头菌液体大规模发酵培养基含有葡萄糖25g、蛋白胨0.4g、酵母膏0.6g、KH2P042g、MgSO4.7H201.5g、亚硒酸钠0.25g,加蒸懼水至1L,分装灭菌之后使用，转接之后在25°C _28°C培养箱中静置培养15天-20天，获得富硒猴头菌液体大规模发酵产物；
[0040](4)富硒猴头菌菌丝体的收集:将步骤(3)获得的富硒猴头菌液体大规模发酵产物，在无菌条件下利用8层纱布进行过滤收集菌丝体，再利用蒸馏水清洗3-5次，并且尽可能多的除掉水分，然后，将猴头菌菌丝片置于35°C _40°C干燥培养箱中进行干燥处理24小时-48小时，获得干燥处理后的猴头菌菌丝体；
[0041](5)富硒猴头菌菌丝体的粉碎:将步骤(4)获得的干燥处理后的猴头菌菌丝体，利用洁净的研钵进行研磨处理，研磨到成为较细的粉末状为止，获得富硒猴头菌菌丝体粉末；
[0042](6)富硒猴头菌菌丝体粗多糖的提取:称取步骤(5)获得的富硒猴头菌菌丝体粉末5g，在500mL的玻璃烧杯中加入150mL-250mL的蒸馏水，在恒温水浴锅中进行70°C恒温浸提3h-5h，之后，按照体积比为1`:1的比例加入无水乙醇进行粗多糖的沉淀，然后，1000Orpm离心收集粗多糖，最后沉淀在35°C _40°C的恒温培养箱中进行粗多糖的干燥处理，获得富硒猴头菌菌丝体粗多糖；
[0043](7)富硒猴头菌菌丝体多糖的精制:将步骤(6)获得的富硒猴头菌菌丝体粗多糖2g，利用按照体积比为25:24:1的比例配制的苯酚-氯仿-异戊醇混合液20mL，进行室温浸泡处理3h-5h，之后将混合液进行1000Orpm离心，收集上层液体，利用分子截留能力为3500KDa的透析袋对蒸馏水透析24h，之后，按照体积比为1:1的比例加入无水乙醇进行多糖的沉淀，然后，1000Orpm离心收集多糖，最后沉淀在35°C _40°C的恒温培养箱中进行多糖的干燥处理，获得富硒猴头菌菌丝体精制多糖。
[0044]在这种提取工艺的处理条件下，富硒猴头菌菌丝体精制多糖的得率为11.84%。
【权利要求】
1.一种富硒猴头菌菌丝体多糖的精制工艺，其特征在于，包括以下步骤: (1)猴头菌菌种的活化:将购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心的编号为5.0058猴头菌菌种，利用PDA固体试管培养基活化，培养条件为25V _28°C培养箱中静置培养96小时-144小时,获得活化后的猴头菌菌种； (2)猴头菌的液体初级发酵:将步骤(1)中的活化后的猴头菌菌种，无菌条件下转接于液体初级发酵培养基中，IL猴头菌液体初级发酵培养基含有葡萄糖20g、蛋白胨0.3g、酵母膏0.6g、KH2P042g、MgSO4.7H201.5g、亚硒酸钠0.125g,加蒸懼水至1L,分装灭菌之后使用，转接之后在25°C _28°C培养箱中进行液体初级发酵培养15天-20天，获得猴头菌液体初级发酵产物； (3)猴头菌的液体大规模发酵；将步骤(2)获得的猴头菌液体初级发酵产物，在无菌条件下挑取一块菌丝片，转接于一个装有50mL猴头菌液体大规模发酵培养基的500mL三角瓶中，IL猴头菌液体大规模发酵培养基含有葡萄糖25g、蛋白胨0.4g、酵母膏0.6g、KH2P042g、MgSO4.7H201.5g、亚硒酸钠0.25g,加蒸懼水至1L,分装灭菌之后使用，转接之后在25°C _28°C培养箱中静置培养15天-20天，获得富硒猴头菌液体大规模发酵产物； (4)富硒猴头菌菌丝体的收集:将步骤(3)获得的富硒猴头菌液体大规模发酵产物，在无菌条件下利用纱布进行过滤收集菌丝体，再利用蒸馏水清洗3-5次，并且尽可能多的除掉水分，然后，将猴头菌菌丝片置于35°C _40°C干燥培养箱中进行干燥处理24小时-48小时，获得干燥处理后的猴头菌菌丝体； (5)富硒猴头菌菌丝体的粉碎:将步骤(4)获得的干燥处理后的猴头菌菌丝体，利用洁净的研钵进行研磨处理，研磨到成为较细的粉末状为止，获得富硒猴头菌菌丝体粉末； (6)富硒猴头菌菌丝体粗多糖的提取:称取步骤(5)获得的富硒猴头菌菌丝体粉末5g，在500mL的玻璃烧杯中加入150mL-250mL的蒸馏水，在恒温水浴锅中进行50°C -70°C恒温浸提3h-5h，之后，按照体积比为1:1的比例加入无水乙醇进行粗多糖的沉淀，然后，1000Orpm离心收集粗多糖，最后沉淀在35V _40°C的恒温培养箱中进行粗多糖的干燥处理，获得富硒猴头菌菌丝体粗多糖； (7)富硒猴头菌菌丝体多糖的精制:将步骤(6)获得的富硒猴头菌菌丝体粗多糖2g，按照体积比为25:24:1的比例配制的苯酚-氯仿-异戊醇混合液20mL，进行室温浸泡处理3h-5h，之后将混合液进行1000Orpm离心，收集上层液体，利用分子截留能力为3500KDa的透析袋对蒸馏水透析24h，之后，按照体积比为1:1的比例加入无水乙醇进行多糖的沉淀，然后，1000Orpm离心收集多糖，最后沉淀在35 V _40°C的恒温培养箱中进行多糖的干燥处理，获得富硒猴头菌菌丝体精制多糖。
【文档编号】C08B37/00GK103725730SQ201310733275
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】杜志强, 任大明 申请人:内蒙古科技大学