一种通过共混改性的细胞培养材料及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种通过共混改性的细胞培养材料及其制备方法。该细胞培养材料的原料是聚苯乙烯与羧基丁苯橡胶的共混物，并且所述细胞培养材料聚苯乙烯表面偶联RGD多肽。本发明通过共混的方法对细胞培养材料进行掺杂改性，将聚苯乙烯和离子交换树脂或者聚苯乙烯和羧基丁腈橡胶掺杂在一起，使得细胞培养板表面富含羧基，达到增大培养板的亲水能力，从而增加细胞的贴壁能力。由于本发明是利用共混的方法，提供羧基的掺杂物不会在培养板材表面溶出，因此该细胞培养材料较传统的细胞培养材料具备了保存时间更长，性能更稳定的优点。
【专利说明】一种通过共混改性的细胞培养材料及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种通过共混改性的细胞培养材料及其制备方法，属于细胞培养技术 领域。
【背景技术】
[0002] 所谓共混改性是指将两种或两种以上聚合物材料、无机材料以及助剂在一定温 度下进行机械掺混，最终形成一种宏观上均匀，而且力学、热学、光学及其他性能得到改善 的新材料的过程。聚合物的共混不仅是聚合物改性的一种重要手段，更是开发具有崭新性 能新型材料的重要途径。聚苯乙烯是由苯乙烯单体通过自由基聚合而成的，英文名称为 polystyrene,简称PS，是一种应用广泛性仅次于聚烯经和PVC的热塑性材料。聚苯乙烯 由于其透光性能好，具有较好的强度和易塑形，并且没有毒性，所以已被大量用作细胞培养 板。但聚苯乙烯表面呈疏水性，不利于细胞的黏附。随着细胞生物学的发展，对细胞培养板 的性能要求也越来越高，普通的细胞培养板对一些原代细胞及贴壁困难，易成团，易脱落， 生长缓慢的细胞扩增的效果不佳。由于大部分细胞需要黏附在一个固相界面才能生长。使 用对细胞黏附能力更强的培养板，能够减少培养时间、缩短实验周期、高效增殖特定细胞， 在细胞生物学中具有重大意义。
[0003] 国内外也有相关的研究来改性聚苯乙烯的性能，例如专利号：CN 103087916 A发 明了一种涂覆有Matrigel的细胞培养板及其制备方法和应用，其是采用等离子喷涂技术 在细胞培养板表面形成羧基表面，然后采用化学铆钉技术将Matrigel通过共价键的形成 连接到聚苯乙烯细胞培养板活培养皿表面，形成涂覆有Matrigel的细胞培养板或培养皿。 由于该培养板的基材表面采用化学相结合的表面处理方式，其表面的Matrigel不会溶出。 该培养板比通过物理包被的细胞培养板，该培养板的保存时间更长。该培养板（皿）适用于 原代细胞及少数贴壁困难，易成团，易脱落，生长缓慢的细胞培养，入神经元、LNCap、PC-12 等，可使细胞贴壁更加牢固，细胞伸展充分，获得更稳定生长状态。这种技术存在制备成本 高，操作繁琐等问题，因而无法大规模生产。
[0004] 专利CN 102911387 A发明了一种具有高细胞黏附能力的改性聚苯乙烯材料以及 制备方法。该改性聚苯乙烯材料是按照包括下述步骤的方法制备得到的：先将聚苯乙烯材 料采用灭菌袋进行密封包装，然后用Y -射线或电子束辐照，辐射后的产物即为高细胞黏 附能力的改性聚苯乙烯。其采用高剂量Y射线改性的聚苯乙烯材料，能显著提高细胞黏附 的效率，有助于生产性能更加优异的聚苯乙烯细胞培养板；高剂量Y射线处理聚苯乙烯培 养板，在改性材料增强细胞黏附的同时，对材料进行了灭菌消毒处理，改性后的材料能直接 应用与细胞培养。这种技术存在制备成本高，并且射线或电子束辐照存在概率性，因此 对细胞培养板的性能无法保证。本发明旨在公开一种新型的方法来改性聚苯乙烯来提高细 胞培养板的亲水能力。本发明主要通过混炼的办法，将聚苯乙烯分别和羧基丁苯橡胶混炼 共混，以达到提高聚苯乙烯表面亲水的能力。相比之前现有的专利发明，悠着成本低，操作 简单，产品性能稳定等优点。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种利用共混的方法改性的聚苯乙烯培养材料，其特征在 于利用共混的方法对细胞培养材料进行羧基丁苯橡胶掺杂改性，该细胞培养材料表面通过 化学健合偶联RGD短肽。
[0006] 本发明是通过下述技术方案加以实现的，一种细胞培养材料，通过共混改性，在细 胞培养材料表面通过化学健合偶联RGD短肽。
[0007] 本发明所述的通过共混改性的细胞培养材料，制备该细胞培养材料的原料是聚苯 乙烯与羧基丁苯橡胶的共混物，并且所述所述细胞培养材料聚苯乙烯表面偶联R⑶多肽。
[0008] 本发明还公开了所述细胞培养材料的制备方法，使用EDC(碳化二亚胺）和 NHS (羟基琥珀酰亚胺）以及MES (2-吗啉乙磺酸水合物）偶联方法在培养材料表面接枝引 入多肽。所述多肽是RGD短肽，具体序列为RGDKKK。
[0009] 具体的制备步骤如下：
[0010] (1)将掺杂的粉料羧基丁苯橡胶和聚苯乙烯通过转矩流变仪进行共混；
[0011] (2)将（1)中共混的剪成小块放入压片模具的型腔里面；
[0012] (3)将液压热压机升温至210°C，等温度到210°C之后，将（2)所述模具放入液压热 压机中，启动油泵，压制成型8分钟；
[0013] (4)8分钟之后，将（3)中所述模具取出，转移到液压冷压机，冷压8分钟，取出制 品》备用；
[0014] (5)将⑷中的板材裁成直径为15mm的圆片，放入24孔细胞培养板中，备用；
[0015] (6)用电子天平称取7. 17g碳化二亚胺、4. 604g羟基琥珀酰亚胺以及 12. 1875g2-吗啉乙磺酸水合物，用50ml蒸馏水将其溶解，放入4°C冰箱，备用；
[0016] (7)将（6)中所配的溶液滴加到步骤（5)的备用制品培养板中液面要完全覆盖培 养板底部（约5滴），放入30°C烘箱2小时；
[0017] (8)将（7)中的培养板中的混合液体弃之，并将lg/L的蛋白溶液加入（7)中的细 胞培养板中，每孔2mL，并放在摇床上反应24小时；
[0018] (9)24小时过后，将（8)中的细胞培养板中的液体弃置，并用大量的PH = 7. 35的 磷酸缓冲溶液冲洗，冲洗后烘干，封存。
[0019] 将hela细胞以5X 103细胞的密度接种于24孔本发明制成的培养板培养7天并 测试细胞活力（MTT试验），通过细胞数目及细胞活性来显示细胞的生长状况。结果表明经 过本发明细胞培养板培养细胞（图4)增殖平均值显著高于未处理聚苯乙烯培养板。
[0020] 本发明通过共混的方法在细胞培养材料表面引入羧基并偶联R⑶短肽。相比其 它复杂工艺方法而言，本工艺简单易行，采用羧基丁腈橡胶因其具备良好的亲水性能，且具 有较好的生物相容性，对于在细胞培养材料表面偶联RGD短肽来增强细胞培养板的细胞贴 壁能力，实验用Hela细胞培养结果表明，可以促进细胞生长。本发明通过共混改性细胞培 养材料，相对于之前现有的专利发明，有着成本低，操作简单，产品性能稳定，易于保存等优 点。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1为细胞培养材料的实体图，其中图a为细胞培养材料的样胚，图b为细胞培 养材料裁剪之后的形状。
[0022] 图2为细胞培养材料的红外表征图。
[0023] 图3为细胞培养材料的扫描电镜扫描图。其中图a细胞培养材料的比例尺为10 微米，图b细胞培养材料的比例尺为20微米。
[0024] 图4 Hela细胞在培养材料表面生长的荧光显微镜扫描图。
【具体实施方式】
[0025] 为了更加完整的了解本发明的有点和特点，下面结合具体实施案例来进一步介绍 本发明。
[0026] 实施例一：共混改性的细胞培养材料的制备
[0027] (1)将掺杂的粉料和聚苯乙烯通过转矩流变仪进行共混；
[0028] (2)将⑴中共混的剪成小块放入压片模具的型腔里面；
[0029] (3)将液压热压机升温至210°C，等温度到210°C之后，将⑵所述模具放入液压热 压机中，启动油泵，压制成型8分钟；
[0030] (4)8分钟之后，将（3)中所述模具取出，转移到液压冷压机，冷压8分钟，取出制品 (图la)，备用；
[0031] (5)将⑷中的板材裁成直径为15mm的圆片（图lb)，放入24孔细胞培养板中， 备用；图2为细胞培养材料的红外表征图，图中在1376CHT 1的锋表明材料表面已引入羧基官 能团。图3为细胞培养材料的扫描电镜扫描图，扫描电镜图显示两相相容性良好。
[0032] (6)用电子天平称取7. 17g碳化二亚胺、4. 604g羟基琥珀酰亚胺以及 12. 1875g2-吗啉乙磺酸水合物，用50ml蒸馏水将其溶解，放入4°C冰箱，备用；
[0033] (7)将（6)中所配的溶液滴加到步骤（5)的备用制品培养板中液面要完全覆盖培 养板底部（约5滴），放入30°C烘箱2小时；
[0034] (8)将（7)中的培养板中的混合液体弃之，并将lg/L的蛋白溶液加入（7)中的细 胞培养板中，每孔2mL，并放在摇床上反应24小时；
[0035] (9)24小时过后，将（8)中的细胞培养板中的液体弃置，并用大量的PH = 7. 35的 磷酸缓冲溶液冲洗，冲洗后烘干，封存。
[0036] 性能对比实验：
[0037] 在24孔板每个板中加入0.5毫升含10%小牛血清RPMI 1640(美国Gibco)培养液 中（内含0.1 %青霉素、链霉素）培养基的HeLa细胞株。将细胞悬浮液稀释至5 X103个细 胞/毫升，然后用lml的枪吸取0. 5ml细胞缓慢的逐滴滴入孔中。将接种好的24孔板放入 37°C，5% C02饱和湿度的培养箱培养72小时，加入噻唑蓝（MTT) 200毫升/孔，置C02培养 箱内培养4小时，去上清，每孔加入200微升DM S0,轻度振荡后，测定570nm处光吸收 值。细胞实验MTT代谢产物结果显示，经过上述处理的细胞培养板细胞（图4)增殖平均值 高于未处理聚苯乙烯培养板（上海禾汽玻璃仪器有限公司）10. 3%，在显微镜下观测，细 胞贴壁生长良好，形态保持稳定。
[0038] 实施例二：共混改性的细胞培养材料的制备
[0039] (1)将掺杂的粉料和聚苯乙烯通过转矩流变仪进行共混；
[0040] (2)将⑴中共混的剪成小块放入压片模具的型腔里面；
[0041] (3)将液压热压机升温至210°C，等温度到210°C之后，将（2)所述模具放入液压热 压机中，启动油泵，压制成型5-8分钟；
[0042] (4) 5-8分钟之后，将（3)中所述模具取出，转移到液压冷压机，冷压5-8分钟，取出 制品，备用；
[0043] (5)将⑷中的板材裁成直径为15mm的圆片，放入24孔细胞培养板中，备用；
[0044] (6)用电子天平称取2. 39g碳化二亚胺、1. 53g轻基琥拍酰亚胺以及4. 06g2_吗啉 乙磺酸水合物，用50ml蒸馏水将其溶解，放入4°C冰箱，备用；
[0045] (7)将（6)中所配的溶液滴加到步骤（5)的备用制品培养板中液面要完全覆盖培 养板底部（约5滴），放入30°C烘箱3小时；
[0046] (8)将（7)中的培养板中的混合液体弃之，并将0· 5g/L的蛋白溶液加入（7)中的 细胞培养板中，每孔3mL，并放在摇床上反应36小时；
[0047] (9)36小时过后，将（8)中的细胞培养板中的液体弃置，并用大量的PH = 7. 35的 磷酸缓冲溶液冲洗，冲洗后烘干，封存。
[0048] 在24孔板每个板中加入0.5毫升含10%小牛血清RPMI 1640(美国Gibco)培养液 中（内含0.1 %青霉素、链霉素）培养基的HeLa细胞株。将细胞悬浮液稀释至5 X103个细 胞/毫升，然后用lml的枪吸取0. 5ml细胞缓慢的逐滴滴入孔中。将接种好的24孔板放入 37°C，5% C02饱和湿度的培养箱培养72小时，加入噻唑蓝（MTT) 200毫升/孔，置C02培养 箱内培养4小时，去上清，每孔加入200微升DM S0,轻度振荡后，测定570nm处光吸收 值。
[0049] 细胞实验MTT代谢产物结果显示，经过上述处理的细胞培养板细胞增殖平均值高 于未处理聚苯乙烯培养板（上海禾汽玻璃仪器有限公司）6.8%。在显微镜下观测，细胞贴 壁生长良好，形态保持稳定。
【权利要求】
1. 一种通过共混改性的细胞培养材料，其特征在于，制备该细胞培养材料的原料是聚 苯乙烯与羧基丁苯橡胶的共混物，并且所述细胞培养材料聚苯乙烯表面偶联R⑶多肽。
2. 如权利要求1所述的通过共混改性的细胞培养材料，其特征在于按照以下方法制备 得到： (1) 将掺杂的羧基丁苯橡胶粉料和聚苯乙烯通过转矩流变仪进行共混； (2) 将（1)中共混物的剪成小块放入细胞培养板压片模具的型腔里面； (3) 将液压热压机升温至210°C，等温度到210°C之后，将（2)所述模具放入液压热压机 中，启动油泵，压制成型5-8分钟； (4) 5-8分钟之后，将（3)中所述模具取出，转移到液压冷压机，冷压5-8分钟，取出制 品》备用； (5) 将（4)中的板材裁成直径为15mm的圆片，放入24孔细胞培养板中，备用； (6) 用电子天平称取2. 39g-7. 17g碳化二亚胺、1. 53g-6. 906g羟基琥珀酰亚胺以及 4. 06g-18. 28g2-吗啉乙磺酸水合物，用50ml蒸馏水将其溶解，放入4°C冰箱，备用； (7) 将￠)中所配的溶液滴加到步骤（5)的备用制品培养板中液面要完全覆盖培养板 底部（约5-8滴），放入30°C烘箱2-4小时； (8) 将（7)中的培养板中的混合液体弃之，并将0. 5-2g/L的RGD多肽溶液加入（7)中 的细胞培养板中，每孔2-4mL，并放在摇床上反应24-48小时； (9) 24-48小时过后，将（8)中的细胞培养板中的液体弃置，并用大量的PH= 7. 35的磷 酸缓冲溶液冲洗，冲洗后烘干，封存。
3. 如权利要求2所述的细胞培养材料，其特征在于RGD多肽序列为RGDKKK。
4. 一种制备权利要求1所述的通过共混改性的细胞培养材料的方法，其特征在于包括 以下步骤： (1) 将掺杂的羧基丁苯橡胶粉料和聚苯乙烯通过转矩流变仪进行共混； (2) 将（1)中共混物剪成小块放入细胞培养板压片模具的型腔里面； (3) 将液压热压机升温至210°C，等温度到210°C之后，将（2)所述模具放入液压热压机 中，启动油泵，压制成型5-8分钟； (4) 5-8分钟之后，将（3)中所述模具取出，转移到液压冷压机，冷压5-8分钟，取出制 品》备用； (5) 将（4)中的板材裁成直径为15mm的圆片，放入24孔细胞培养板中，备用； (6) 用电子天平称取2. 39g-7. 17g碳化二亚胺、1. 53g-6. 906g羟基琥珀酰亚胺以及 4. 06g-18. 28g2-吗啉乙磺酸水合物，用50ml蒸馏水将其溶解，放入4°C冰箱，备用； (7) 将￠)中所配的溶液滴加到步骤（5)的备用制品培养板中液面要完全覆盖培养板 底部（约5-8滴），放入30°C烘箱2-4小时； (8) 将（7)中的培养板中的混合液体弃之，并将0. 5-2g/L的RGD多肽溶液加入（7)中 的细胞培养板中，每孔2-4mL，并放在摇床上反应24-48小时； (9) 24-48小时过后，将（8)中的细胞培养板中的液体弃置，并用大量的PH = 7. 35的磷 酸缓冲溶液冲洗，冲洗后烘干，封存。
【文档编号】C08L25/06GK104151591SQ201410366792
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年7月29日
【发明者】朱沛志, 陈金帅 申请人:扬州大学