本发明属于药物领域，具体涉及新化合物及其分离方法和应用。
背景技术：
香加皮为萝摩科植物杠柳的干燥根皮，是一种传统中药，具有悠久的药用历史。有祛风湿、强筋骨的功效，用于风寒湿痹，腰膝酸软，心悸气短，下肢浮肿。中医将其主要用于治疗心力衰竭和风湿性关节炎。主产于河北、山西、河南、山东4省，以山西、河南产量为最大。药理研究表明其具有抗肿瘤、强心、抗炎、免疫调节等作用，同时具有诱导细胞分化和促进神经生长因子的作用。据文献报道香加皮化学成分主要有C21甾类、强心苷类、醛类，以及萜类。
因为中药所含有的药物成分是极其复杂的，如何能够更深入详尽的分析香加皮的具体化学成分并研究它们的具体药理作用，这对于将来临床上精确的控制用药量，避免其他药物的干扰，这对于医学界是具有深远意义的。
技术实现要素：
本发明目的是提供了一种新化合物，同时也提供了从香加皮中分离该化合物的方法和应用，该方法操作简单，在抗心肌缺血方面有不错的效果。
本发明所采用的技术方案是：
一种新化合物，有抗心肌缺血的作用，有化学结构式为
。
所述新化合物的分离方法由以下步骤组成：
A、提取：称取香加皮，用8-10倍量70%乙醇加热回流提取3次，每次2 h，合并提取液，减压回收乙醇至药液无醇味，加水稀释药液至浓度为0.3-0.6kg生药/L，过滤，得滤液；
B、大孔吸附树脂纯化：将步骤A所得滤液上大孔吸附树脂，依次以水、10%、30%、50%、70%和95%乙醇梯度洗脱，流速为10ml/min，每个浓度洗脱4倍柱体积，将95%乙醇洗脱液浓缩，干燥，回收溶剂得到浸膏；
C、制备HPLC分离：将步骤B所得浸膏用甲醇溶解后过0.45μm滤膜，以制备HPLC分离纯化，得到目标化合物。
所述步骤B的大孔吸附树脂优选为AB-8型大孔吸附树脂。
所述步骤C中色谱柱为C18柱，规格为20 mm×250 mm，5μm，流动相：甲醇-水，梯度洗脱：0~10min，40~50%甲醇，10~30min，50%甲醇，30~50min，50~60%甲醇，50~60min，60~90%甲醇，60~65min，90~40%甲醇，65~75min，40%甲醇，进样体积为400μL，收集保留时间RT=29min的洗脱液，浓缩，重结晶得到目标化合物。
作为优选方式，所述分离方法由以下步骤组成：
A、提取：称取香加皮，用8-10倍量70%乙醇加热回流提取3次，每次2 h，合并提取液，减压回收乙醇至药液无醇味，加水稀释药液至浓度为0.3-0.6kg生药/L，过滤，得滤液；
B、大孔吸附树脂纯化：将步骤A所得滤液上AB-8型大孔吸附树脂，依次以水、10%、30%、50%、70%和95%乙醇梯度洗脱，流速为10ml/min，每个浓度洗脱4倍柱体积，将95%乙醇洗脱液浓缩，干燥，回收溶剂得到浸膏；
C、制备HPLC分离：将步骤B所得浸膏用甲醇溶解后过0.45μm滤膜，以制备HPLC分离纯化，色谱柱为 C18柱，规格为20 mm×250 mm，5μm，流动相：甲醇-水，梯度洗脱：0~10min，40~50%甲醇，10~30min，50%甲醇，30~50min，50~60%甲醇，50~60min，60~90%甲醇，60~65min，90~40%甲醇，65~75min，40%甲醇，进样体积为400μL，收集保留时间RT=29min的洗脱液，浓缩，重结晶得到目标化合物。
本发明取得的技术进步是：本发明分离新化合物的方法，原料易得，是从香加皮中提取分离得到的，且具体步骤简单易操作；所得到的新化合物还未见报道，这对于中药有效成分的研究具有十分重要的意义。
本发明的新化合物为白色粉末，由正离子高分辨质谱确定其分子式为C43H70O14（[M+NH4+] m/z 测得值：828.5136，计算值：828.5110，误差：3.14ppm），香草醛-浓硫酸反应由红色变为紫色，Liebermann-Burchard 反应阳性。推测其可能为甾体类化合物。根据13C-NMR说明其苷元为21-O-甲基-Δ5-孕甾烯-3β，14β，17β，21-四醇-20-酮。
13C-NMR 在δ95.0-103.0 之间有3个糖基端基碳的共振信号：δ102.8，δ101.2，δ97.2，HSQC 实验指明1H-NMR中相应的三个糖基端基质子共振信号为：δ4.58（dd，J=1.8 Hz，9.6 Hz），δ4.78（dd，J=1.8 Hz，9.6 Hz），δ4.84，因此推断该化合物为21-O-甲基-Δ5-孕甾烯-3β， 14β，17β，21-四醇-20-酮的三糖苷，从偶合常数可知，糖链中三个糖都以β苷键连接，通过比较化合物1 的苷元部分与21-O-甲基-Δ5-孕甾烯-3β，14β，17β，21-四醇-20-酮 [4]，可以观察到苷化位移效应：C-2（+0.3ppm），C-3（+7.56 ppm）和 C-4（-3.54ppm），表明糖链连接在C-3 羟基上。1H-NMR 图谱表明该化合物分子式中有四个OCH3：δ3.36 (3H，s)，δ3.41 (3H，s)，δ3.42 (3H，s)，δ3.42 (3H，s)，一个双键质子：δ5.41（1H，m），13C-NMR 图谱也表明有一个双键和一个羰基（δ 210.0）。
HSQC 和HMBC 图谱上显示苷元的C-3（δ79.1）上所连质子（δ3.49）与在δ97.2 的糖基端基碳相关，同时该端基碳上的质子δ4.84与苷元的C-3（δ79.1）及糖的δ36.4碳相关，HSQC 给出与δ36.4的碳相连的质子为δ 1.57 和δ2.15，HMBC显示这两个质子与δ97.2 和δ78.6的碳有远程相关，同δ78.6有远程相关的质子还有OCH3的质子，HSQC 给出与δ78.6相连的质子为δ3.84，HMBC显示这个质子与δ83.9的碳有远程相关，HSQC 给出与δ 83.9的碳相连的氢为δ3.27，与δ83.9的质子有远程相关的碳还有δ70.0 和δ101.2（另一个糖基的端基碳）的碳，而与δ70.0的碳有远程相关的氢为δ 1.18（3H，d，J=4.8 Hz）的质子，HSQC 显示该质子与δ18.4的CH3碳相关，如此找出了糖链上内测糖的全部1H-NMR 和13C-NMR（δ97.2，36.4，78.6，83.9，70.0，18.4，58.4）数据，经与β-D-加拿大麻糖对比，推断该糖为β-D-加拿大麻糖，且其C-4 位上的羟基与中间糖基的端基碳δ101.2相连成苷。同理，找出了中间糖上的全部1H-NMR 和13C-NMR数据，并推断该糖也为β-D-加拿大麻糖。根据HSQC、HMBC推测出第三个糖结构与β-D-加拿大麻糖相似，HSQC 给出与δ81.6、δ77.0、δ73.3的碳相连的质子分别为δ3.79、δ2.96、δ 3.26，HMBC显示δ2.96（1H，m，J=9.0 Hz）的氢与δ81.6和δ73.3的碳有远程相关，根据其偶合常数说明3、4、5位的氢都处于α键上，推断该糖为β-D-夹竹桃糖。并且无剩余单糖残基，所以为外侧糖。
综合上述推断，该化合物确定为21-O-甲基-Δ5-孕甾烯-3β，14β，17β，21-四醇-20-酮-3-O-β-D-夹竹桃糖(1→4)-β-D-加拿大麻糖(1→4)-β-D-加拿大麻糖苷。经文献检索，该化合物未见报道，为新化合物。
表 1 化合物的1H，13C-NMR 数据
实验例
通过主要活性评价指标包括细胞生存活性、细胞线粒体膜电位、Ca2+-ATP酶活性等药效学指标的研究，并以盐酸地尔硫卓为阳性对照药，研究本发明的化合物具有抗心肌缺血作用。
1.选用的试剂：阳性药：盐酸地尔硫卓(DELZ) 白色粉末，分子量为450.98 D。
2.细胞种类与来源
大鼠心肌细胞株（H9c2 (2-1)），购自于北京协和医学院。
3.主要仪器设备
4 主要试剂
5.样品配制
称取一定量的药物溶于DMSO中，配制成10-2 M 的母液，-20℃保存备用。使用前用DMSO稀释到最终作用浓度的100倍，再用无糖无血清DMEM培养基稀释成相应浓度工作液。
6.细胞培养
H9c2细胞采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，37℃，5% CO2培养箱培养。当细胞生长融合至80%时，用0.5%的胰蛋白酶消化，反复吹打制成单细胞悬液，Countess自动细胞计数仪计数后，调整细胞浓度至1.5×105个/mL，用含10%胎牛血清DMEM培养液培养，接种于96孔培养板（100 μL/孔）或6 cm培养皿（6 mL/皿），常规培养待细胞贴壁后进行实验。
7.缺血缺氧模型的建立
采用96孔板进行实验，常规培养待细胞贴壁后弃去旧培养基，换为无糖无血清DMEM培养基，置于低氧控制工作站中，在0% O2，5% CO2，95% N2条件下缺氧培养。H9c2细胞缺氧培养18 h。
8.模型细胞上的实验分组及干预方法
正常对照组（Normal）：实验时换以无血清DMEM培养基培养；
模型组 (Model)：实验时以无糖无血清DMEM培养基于0% O2，5% CO2，95% N2条件下培养；
溶剂对照组（DMSO）：加入含1% DMSO的无糖无血清DMEM培养基于0% O2，5% CO2，95% N2条件下培养；
阳性药组（DELZ）：加入含10-6 M盐酸地尔硫卓的无糖无血清DMEM培养基于0% O2，5% CO2，95% N2条件下培养。
药物干预组（以下简称药物组）：加入相应浓度的本发明药物的无糖无血清培养基于0% O2，5% CO2，95% N2条件下培养。
每个实验组设4个复孔，重复3次。
9.指标检测
9.1 细胞生存活性检测
各组细胞处理结束后，弃去旧培养基，加入含有MTS的无血清DMEM培养基（MTS溶液：培养基=1:5）100 µL，37℃孵育3 h，酶标仪450 nm处检测吸光度。实验操作按照MTS试剂检测说明书进行。利用下列公式计算各孔细胞生存活性：
9.2 细胞线粒体膜电位检测
采用96孔板进行实验，缺氧损伤结束后，采用线粒体膜电位检测试剂盒测定细胞线粒体膜电位的变化，酶标仪分别读取（560/595）nm，（485/535）nm的荧光值。利用下列公式计算各孔细胞线粒体膜电位：
9.3细胞Ca2+-ATP酶活力检测
采用6 cm培养皿进行实验，缺氧损伤结束后，弃去培养上清，胰酶消化细胞 2 min，收集细胞悬液，经超声破碎仪冰浴破碎，制备样品液，采用Ca2+-ATP酶试剂盒测定酶活性， BCA试剂盒测定蛋白浓度。酶标仪读取636 nm处的吸光度值，实验操作严格按照说明书进行。利用下列公式计算各皿细胞Ca2+-ATP酶活性：
10. 数据处理
利用相应的公式计算各个指标数据，计算结果用均数±标准差（± s）表示，采用Origin8.0软件进行绘图。
结果
1.本发明药物不同浓度模型细胞存活率的变化（± s），见表4
可见该药物在10-8M浓度时，细胞存活率比较高，因此以下实验均是采用该浓度。
2.各组对缺血缺氧心肌细胞线粒体膜电位的影响
实验结果见表5所示：与正常组比较，模型组细胞线粒体膜电位较正常组有明显下降；与模型组比较，本发明药物在10-8M浓度时能明显提高缺血缺氧心肌细胞的线粒体膜电位。且重复性较好。
表5各组细胞线粒体膜电位的变化（± s）
3、各组对缺血缺氧心肌细胞Ca2+-ATP酶活性的影响
实验结果见表6所示：与正常组比较，模型组细胞Ca2+-ATP酶活性较正常组有明显下降；与模型组比较，本发明药物在10-8M浓度时能明显提高缺血缺氧心肌细胞的Ca2+-ATP酶活性。重复性较好。
表6各组各组细胞Ca2+-ATP酶活性的变化
从上述结果分析可知，本发明药物能明显提高模型细胞线粒体膜电位和Ca2+-ATP酶活性，可以有效改善缺血缺氧心肌细胞的线粒体功能，具有抗心肌缺血的作用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明：
实施例1
新化合物的分离方法步骤如下：
A、提取：称取香加皮3kg，用8倍量70%乙醇加热回流提取3次，每次2 h，合并提取液，减压回收乙醇至药液无醇味，加水稀释药液至浓度为0.3kg生药/L，过滤，得滤液；
B、大孔吸附树脂纯化：将步骤A所得滤液上AB-8型大孔吸附树脂，依次以水、10%、30%、50%、70%和95%乙醇梯度洗脱，流速为10ml/min，每个浓度洗脱4倍柱体积，将95%乙醇洗脱液浓缩，干燥，回收溶剂得到浸膏；
C、制备HPLC分离：将步骤B所得浸膏用甲醇溶解后过0.45μm滤膜，以制备HPLC分离纯化，色谱柱为SunFireTM Prep C18 ，规格为20 mm×250 mm，5μm，流动相：甲醇-水，梯度洗脱：0~10min，40~50%甲醇，10~30min，50%甲醇，30~50min，50~60%甲醇，50~60min，60~90%甲醇，60~65min，90~40%甲醇，65~75min，40%甲醇，每次进样体积为400μL，收集保留时间RT=29min的洗脱液，浓缩，重结晶得到目标化合物得到目标化合物38mg；
实施例2
新化合物具体分离方法步骤如下：
A、提取：称取香加皮4kg，用10倍量70%乙醇加热回流提取3次，每次2 h，合并提取液，减压回收乙醇至药液无醇味，加水稀释药液度为0.6kg生药/L，过滤，得滤液；
B、大孔吸附树脂纯化：将步骤A所得滤液上AB-8型大孔吸附树脂，依次以水、10%、30%、50%、70%和95%乙醇梯度洗脱，流速为10ml/min，每个浓度洗脱4倍柱体积，将95%乙醇洗脱液浓缩，干燥，回收溶剂得到浸膏；
C、制备HPLC分离：将步骤B所得浸膏用甲醇溶解后过0.45μm滤膜，以制备HPLC分离纯化，色谱柱为SunFireTM Prep C18 ，规格为20 mm×250 mm，5μm，流动相：甲醇-水，梯度洗脱：0~10min，40~50%甲醇，10~30min，50%甲醇，30~50min，50~60%甲醇，50~60min，60~90%甲醇，60~65min，90~40%甲醇，65~75min，40%甲醇，每次进样体积为400μL，收集保留时间RT=29min的洗脱液，浓缩，重结晶得到目标化合物得到目标化合物50mg。
实施例3
新化合物具体分离方法步骤如下：
A、提取：称取香加皮2kg，用9倍量70%乙醇加热回流提取3次，每次2 h，合并提取液，减压回收乙醇至药液无醇味，加适量水稀释药液至度为0.5kg生药/L，过滤，得滤液；
B、大孔吸附树脂纯化：将步骤A所得滤液上AB-8型大孔吸附树脂，依次以水、10%、30%、50%、70%和95%乙醇梯度洗脱，流速为10ml/min，每个浓度洗脱4倍柱体积，将95%乙醇洗脱液浓缩，干燥，回收溶剂得到浸膏；
C、制备HPLC分离：将步骤B所得浸膏用甲醇溶解后过0.45μm滤膜，以制备HPLC分离纯化，色谱柱为SunFireTM Prep C18 ，规格为20 mm×250 mm，5μm，流动相：甲醇-水，梯度洗脱：0~10min，40~50%甲醇，10~30min，50%甲醇，30~50min，50~60%甲醇，50~60min，60~90%甲醇，60~65min，90~40%甲醇，65~75min，40%甲醇，每次进样体积为400μL，收集保留时间RT=29min的洗脱液，浓缩，重结晶得到目标化合物得到目标化合物26mg。