本发明涉及一种VEGF与PDGFRβ双特异性融合蛋白，包含其药物组合物及其用途。
背景技术：
：老年性黄斑变性(AMD)是一种致残、致盲性疾病。其主要影响黄斑区或视网膜中负责高视敏度视力的中心区域，并且是导致老年人不可逆性视力丧失的原因。据统计，全世界超过3000万人罹患此病。随着中国人口老龄化逐渐加剧，目前该疾病已严重危害我国人民群众的生命健康。AMD有两种形式，干性AMD和湿性AMD。虽然干性AMD更常见，但一般导致较轻的、较缓慢的视力丧失。湿性AMD患者的视网膜之下生成新血管。当感光细胞和视网膜色素上皮细胞(RPE)细胞慢慢退化时，血管趋于从脉络膜中的正常位置发展到视网膜之下的异常位置。这种异常的新血管生长被称为脉络膜新生血管(CNV)。这些异常血管渗漏流血，导致出血、肿胀、瘢痕组织和严重的视力丧失。只有10％左右的AMD患者是湿性类型，但是却大约占AMD所导致的失明总数的90％。湿性老年视黄斑变性(AMD)已经成为65岁以上老年人失明的首要威胁。目前批准用于治疗湿性AMD的治疗方法包括激光凝固法、光动力疗法和用于降低过剩VEGF的水平、或阻断VEGF生成的抗血管药物疗法。根据部位，有时可以使用激光治疗来破环湿性AMD中形成的异常血管。只有15％的湿性AMD适合采用激光治疗，因为血管不能离黄斑部的中内区域太近。激光是光束，由血液色素、药物和PRE细胞所吸收，并转化为热能而烧灼异常血管。由于刺激物依然没有被去除，新生血管形成时常反复，导致视力丧失。光动力疗法主要通过静脉注入光敏药物，继而采用特定波长的非热能激光照射脉络膜新生血管病灶，将光敏药物活化。用光动力疗法治疗湿性AMD，只能稳定或降低湿性AMD视力下降的风险。由于并非对因治疗，光动力疗法不能阻止复发的可能，一般需要多次治疗。而且，治疗后要避光48小时，以免发生光敏反应，造成皮肤灼伤。因此，给患者带来很多痛苦。血小板衍生生长因子家族包括血小板生长因子(PDGF)和血管内皮细胞因子(VEGF)。每种生长因子均可由多种细胞产生，其受体均为酪氨酸激酶(RTK)型受体。血小板衍生生长因子家族成员包括：PDGFA、PDGFB、PDGFC、PDGFD、胎盘生长因子(Placentalgrowthfactor，PGF)以及血管内皮生长因子(VEGF、VEGF41、VEGFB、VEGFC、FIGF(也作VEGFD))等。VEGF是血管内皮细胞强有力和特有的促有丝分裂原，可促进血管生成过程的所有环节。在几个研究血管生成的体内试验中，VEGF均可诱导血管新生。在对体外培养的血管和淋巴管内皮细胞的试验中，VEGF能促进内皮细胞增殖、迁移及管状结构形成。VEGF可以增加毛细血管及后微静脉的渗透性。皮肤或肌肉注射后，能迅速诱导连续性的内皮结构破坏(XieK，WeiD，HuagS.Transcriptionalanti-angiogenesistherapyofhumanpancreaticcancer[J].CytokineGrowthFactorRev2006，17：147-156)。各VEGF受体(VEGFR)的作用有所不同。VEGFR-2起着调节内皮生长、分化、渗透性的作用；而VEGFR-1则与调节内皮细胞移动、聚集有关，并且通过VEGFR-2抑制信号的传导。VEGFR-3对于血管发育可能也有作用，但更独特的是其在淋巴管组织中表达，可能对淋巴系统生成有重要作用(JoukovV，PajusolaK，KaipainenA，etal.AnovelvascularendothelialgrowthfactorVEGF-CisaligandfortheFlt4andKDRreceptortyrosinekinases[J].EMBOJ，2003，15(2)：290-298)。VEGF通过VEGFR发挥生物学效应。VEGF与VEGFR结合，使VEGFR二聚体化、自我磷酸化，通过多个细胞内途径传递信号(包括MAPK、PI3激酶、Ras和磷脂酶C途径等)，最终发挥作用。迄今，已发现VEGF有3个受体VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1)和VEGFR-3(Flt-4)。前两者主要在内皮细胞中表达，在肿瘤细胞中也有表达，而VEGFR-3主要在淋巴管组织中表达。其中前2个受体与VEGF-A亲和力高，属酪氨酸激酶家族。与VEGF-A结合导致其本身二聚化、胞内段酪氨酸自磷酸化、随后激活下游信号蛋白而发挥其生理功能。前两者主要在内皮细胞中表达，在肿瘤细胞中也有表达，而VEGFR-3主要在淋巴管组织中表达(OhH.Anovelmolecularmechanisminvolvingneuropilin-1forvascularendothelialgrowthfactor-inducedretinalangiogenesis.NipponGakkaiZasshi.2003-Nov：107(11)：651-656)。已知VEGF是与眼内病症有关的新血管生成过程中关键的调节因子。眼液中VEGF水平与糖尿病患者和其它缺血性视网膜病患者的活性血管增生水平密切相关。其它研究证明了在AMD患者脉络膜新生血管膜中存在VEGF。目前批准的用于治疗湿性AMD的抗血管药物，目的在于中和VEGF的作用，从面阻断血管新生。例如：辉瑞的哌加他尼钠(Pegaptanib，商品名Macugen)，其活性成分哌加他尼钠是一种由28个核苷酸组成的“aptamer”，其三维结构使其能与细胞外的血管内皮生长因子受体(VEGF)结合，抑制VEGF与相应的受体结合。需要每六周经玻璃体内注射施用；诺华的兰尼单抗(Ranibizumab，商品名Lucentis)，Lucentis中的活性成分兰尼单抗是一种与VEGF结合的抗体片段，需要每个月进行玻璃体内注射；拜耳的艾力亚(VEGF-Trap-eye，商品名Eylea)，其活性成分阿普西柏是一种与VEGF结合的多肽片段，需要头三个月每个月注射，之后每两个月注射施用。但目前的标准药物治疗对相当一部分患者无效，比如目前标准的Ranibizumab治疗只能提高1/3患者的视力，10％患者对该治疗无反应；另外，大概70％患者经过抗VEGF治疗后无明显的视力增加。目前的药物治疗还存在适应性抗性，也就是患者在经过一段时间治疗后对该治疗药物产生了抗性。同时由于目前的治疗是通过眼内注射，每一次注射都不仅产生昂贵的治疗费用，也会引起眼内感染，出血以及视网膜脱离，其中最值得重视的并发症是眼内感染。一旦感染，后果不堪设想，有可能会失明。因此注射频度的降低对于药物的发展亦有重要意义。因此，这个领域需要更有效的治疗，克服抗VEGF治疗的抗性，以及延长抗VEGF药物作用的时间(不需要一个月或者两个月的眼底注射)，以期更有效，更安全。血小板衍生因子PDGF是创伤愈合过程中较早出现的生长因子之一。在创面愈合的全过程中起重要作用，主要表现在促进创面愈合方面。常见的PDGF是由两条多肽链通过二硫键连接而成的同型或异型二聚体，这使PDGF具有多种形式的二聚体结构，即PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC以及PDGF-DD。PDGF必须与细胞膜上的相应受体结合后才能发挥其生物学效应。PDGF受体(PDGFR)由两种亚单位α及β构成，其分子量为170～180KD。二者与PDGF结合力相差很大，α单位与PDGFa链及b链有较高的亲和力，而β亚单位仅与b链有高亲和力。所以α亚单位可与PDGF-AA、PDGF-AB及PDGF-BB结合，β亚单位仅与PDGF-BB及PDGF-AB结合。PDGFR是一种跨膜糖蛋白，具有酪氨酸蛋白激酶活性。由细胞外N端与PDGF特异识别的结构域、跨膜的中间疏水结构域和细胞内C端具有酪氨酸蛋白激酶活性的结构域组成。当PDGF与细胞表面的PDGFR结合后，促使受体分子二聚化；激活细胞内结构域酪氨酸残基自身磷酸化，或促使激活特殊靶蛋白的酪氨酸残基磷酸化；从而将信号传入细胞内，经级联式放大效应调控细胞的生命活动(包括靶细胞的分裂增殖)。由此，阻止PDGF结合或PDGFR二聚化的PDGFR拮抗剂，可用于治疗或预防与PDGFR通路相关的疾病。目前认为中和VEGF的手段效果有限，主要是因为附在血管上的周细胞(vascularmuralcells)在缺少VEGF的情况下保护了血管。因此在中和VEGF的基础上，如果能够阻断周细胞对血管的保护，就能够克服抗VEGF治疗的抗性，更有效的治疗老年黄斑变性。技术实现要素：为了达到以上目的，本发明提供一种双特异性融合蛋白，包括VEGF结合肽和PDGFRβ结合肽。VEGF结合肽可以位于PDGFRβ结合肽的上游；反之亦然。在本发明一个优选的实施方案中，所述的双特异性融合蛋白，其中还包括免疫球蛋白的Fc段。Fc段的作用在于，作为多聚化成分，使得融合蛋白多聚化。Fc段可以位于VEGF结合肽的上游或下游；可以位于PDGFRβ结合肽的上游或下游；或位于VEGF结合肽和PDGFRβ结合肽之间。在本发明又一个优选的实施方案中，所述免疫球蛋白的Fc段是免疫球蛋白IgG的Fc段。在本发明又一个优选的实施方案中，所述的双特异性融合蛋白，其中所述的Fc段的氨基酸序列选自SEQIDNO：7、SEQIDNO：8或SEQIDNO：9。在本发明又一个优选的实施方案中，所述的双特异性融合蛋白，其中所述的VEGF结合肽包含VEGFR胞外结构域。在本发明又一个优选的实施方案中，所述的VEGFR是Flt-1。在本发明又一个优选的实施方案中，所述的VEGFR是Flk-1。在本发明又一个优选的实施方案中，所述的VEGFR是Flt-4。在本发明又一个优选的实施方案中，所述的VEGFR胞外结构域是Flt1的免疫球蛋白结构域2，和Flk1或Flt4的免疫球蛋白结构域3。在本发明又一个优选的实施方案中，所述的VEGFR胞外结构域的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。在本发明又一个优选的实施方案中，所述的PDGFRβ结合肽的氨基酸序列选自SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5或SEQIDNO：6中的一个或多个。其中SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5为PDGFRβ结合肽中的重链CDR序列，SEQIDNO：6为PDGFRβ结合肽中的轻链CDR序列。当选自其中的多个序列时，优选SEQIDNO：6与SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5之一的组合。在本发明又一个优选的实施方案中，所述的双特异性融合蛋白还包括隔区，隔区的氨基酸序列选自：SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14或SEQIDNO：15。在本发明又一个优选的实施方案中，所述的双特异性融合蛋白还包括氨基酸序列如(GGGGS)n所示的隔区，其中n为1-10，优选2-5。在本发明又一个优选的实施方案中，所述的双特异性融合蛋白的氨基酸序列选自：SEQIDNO：19至SEQIDNO：24。本发明还涉及一种PDGFRβ抗体衍生物，包括PDGFRβ结合肽和免疫球蛋白的Fc段。在本发明又一个优选的实施方案中，PDGFRβ抗体衍生物所述的PDGFRβ结合肽定义如上；PDGFRβ抗体衍生物还包括如上定义的隔区。在本发明又一个优选的实施方案中，所述的PDGFRβ抗体衍生物氨基酸序列为SEQIDNO：18。本发明还涉及一种如上所述的双特异性融合蛋白或PDGFRβ抗体衍生物的制备方法，包括：构建表达载体，将表达载体转化至宿主细胞，表达载体在宿主细胞中进行表达获得表达前体，表达前体分泌到细胞外得到所述的双特异性融合蛋白。在一些实施方案中，将编码如SEQIDNo.19-24所示融合蛋白的多核苷酸，或编码如SEQIDNo.18所示PDGFRβ抗体衍生物的多核苷酸引入质粒构建表达载体，所述质粒可以是现有技术中任何适于在宿主细胞中表达的质粒，包括但不限于pcDNA3.1(+)。在一些实施方案中，通过现有技术中的公知方法将表达载体转化至宿主细胞，例如转化、转染等。在适当的培养条件下培养宿主细胞，获得表达前体。表达前体分泌到细胞外得到如SEQIDNo.19-24所示的融合蛋白，或如SEQIDNo.18所示的PDGFRβ抗体衍生物。本发明还涉及一种如上所述的双特异性融合蛋白或PDGFRβ抗体衍生物的表达前体，其中所述表达前体由信号肽和所述双特异性融合蛋白或PDGFRβ抗体衍生物组成；所述信号肽的氨基酸序列选自SEQIDNO：16或SEQIDNO：17；优选所述信号肽位于所述双特异性融合蛋白或PDGFRβ抗体衍生物的N端。本发明进一步提供一种编码如上所述的表达前体产物的多核苷酸，优选DNA。本发明进一步提供一种含有如上所述的多核苷酸的表达载体。本发明进一步提供一种包含如上所述的表达载体的宿主细胞。在本发明一个优选的实施方案中，所述的宿主细胞为细菌，优选为大肠杆菌。在本发明又一个优选的实施方案中，所述的宿主细胞为酵母细胞，优选为毕赤酵母或酿酒酵母。本发明进一步提供一种药物组合物，其含有如上所述的双特异性融合蛋白或PDGFRβ抗体衍生物和可药用载体。在本发明一个优选的实施方案中，其中所述的药物组合物为一种可注射的溶液，其中所述的双特异性融合蛋白、PDGFRβ抗体衍生物，或可药用载体是溶解形式的。本发明还涉及上述的双特异性融合蛋白在制备用于治疗哺乳动物中与抑制VEGF和PDGFRβ双靶点相关的疾病或病症的药物中的用途。所述哺乳动物是人类。本发明还涉及所述的双特异性融合蛋白、PDGFRβ抗体衍生物在制备抑制VEGF和PDGF信号通路的药物中的用途。本发明还涉及上述的PDGFRβ抗体衍生物在制备用于治疗哺乳动物中与抑制PDGFRβ靶点相关的疾病或病症的药物中的用途。所述哺乳动物是人类。本发明还涉及所述的PDGFRβ抗体衍生物在制备抑制PDGF信号通路的药物中的用途。在本发明一个优选的实施方案中，药物用途中所述的疾病或病症是眼睛的疾病、或其它任何能够通过抑制VEGF和/或PDGF信号通路改善的疾病，比如肿瘤和糖尿病视网膜病变。在本发明又一个优选的实施方案中，药物用途中所述的眼睛的疾病或病症是年龄相关的黄斑变性，优选湿性老年性黄斑变性。本发明还涉及一种治疗湿性AMD的方法，其包括给予所需患者治疗有效量的如上所述的双特异性融合蛋白或PDGFRβ抗体衍生物，或如上所述的药物组合物。附图说明图1：VTEP-0对PDGFRbb诱导的PDGFRβ和AKT磷酸化的抑制效果。图2：VTEP-13对PDGFRbb诱导的PDGFRβ和AKT磷酸化的抑制效果。图3：VTEP-15对PDGFRbb诱导的PDGFRβ和AKT磷酸化的抑制效果。图4：VTEP-17对PDGFRbb诱导的PDGFRβ和AKT磷酸化的抑制效果。图5：VTEP-22对PDGFRbb诱导的PDGFRβ和AKT磷酸化的抑制效果。图6：VTEP-17对PDGFR配体PDGFRbb诱导的PDGFR磷酸化的抑制率。图7：VTEP-17对PDGFR配体PDGFRbb诱导的AKT磷酸化的抑制率。图8：VTEP-13对VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞增殖的抑制效果。图9：VTEP-17对VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞增殖的抑制效果。图10：VTEP-22对VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞增殖的抑制效果。图11：模型小鼠眼部脉络膜新生血管面积，表示VTEP-17对激光诱导脉络膜新生血管生成小鼠模型中脉络膜新生血管生成的抑制作用。具体实施方式为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。定义本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。本发明提供了包括第一种成分VEGF结合肽和第二种成分PDGFRβ结合肽的双特异性融合蛋白；更具体地，提供了通过将VEGFR(Flt-1、Flk-1、Flt-4)的修饰过的胞外结构域、PDGFRβ结合肽、和IgG的Fc区嵌合所形成的新型融合蛋白。本文所采用的术语“结合肽”是指能够与靶结合的可溶性受体及其片段及其类似物；或抗体及其片段及其类似物。本发明中的VEGF结合肽是优选含有VEGFR胞外配体结合结构域(本申请中也作VEGFR胞外结构域)的多肽。胞外配体结合结构域被定义为受体的一部分，它在细胞膜中的天然构象中，是朝着细胞外定向的。它可以接触它的同源配体。所述胞外结构域不包括与受体跨膜结构域相关的疏水性氨基酸或与受体胞内结构域相关的任何氨基酸。VonHeijone公开了被本领域技术人员经常引用的用于测定一种特定受体的氨基酸是否属于胞外、跨膜或胞内结构域的详细规则(参见VonHeijone，1995，BioEssay17：25-30)。另外，网站如http://ulrec3.unil.cn/software/TMPRED-form.html能够向蛋白质化学家提供有关制备蛋白结构域的先决条件的信息。本文所采用的术语“PDGFRβ结合肽”优选包含可特异性识别并结合靶标抗原PDGFRβ的抗体所有的或一部分抗原结合位点的多肽；例如重链和/或轻链可变区的全部或部分，或者至少是重链可变区的HCDR3区。PDGFRβ结合肽包含并不限于抗体，或抗体片段，和含有抗体全部或部分抗原结合位点的类免疫球蛋白结构域。更具体地，采用US61/610905中相关定义，比如包括CDR3序列为HGGDRSY(SEQIDNO：11)的抗体序列，还可以包括序列为GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQIDNO：12)或GILPILKTPNYAQRFQG(SEQIDNO：13)的CDR2序列。本发明所述的“PDGFRβ抗体衍生物”包括PDGFRβ结合肽和免疫球蛋白的Fc段。本发明所述的“双特异性融合蛋白”是指即能特异性识别并结合VEGF抗原表位，也能特异性识别并结合PDGFRβ抗原表位的多肽。本发明所述的“双特异性融合蛋白”还可包含人IgG的Fc段。可以使用IgG的任何同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。为了增加融合蛋白的功能，Fc段也可以经过突变，或增加铰链区。用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。融合蛋白的组分可直接相互连接或通过隔区(也作连接肽)连接。通常，术语“连接肽”(或隔区、连接区)指一个或多个分子，例如核酸、氨基酸或多肽部分，它们可插入至一个或多个组分结构域之间。连接肽序列可用于在组分之间提供合意的靶标位点来使得操作变得容易。也可以提供连接肽来增强嵌合多个组分在宿主细胞中的表达、减少空间位阻，从而该组分可采取它的最佳三级结构与它的靶标分子更好地相互作用。“隔区”在本发明中用于VEGF结合肽、PDGFR抗体片段和Fc区之间的融合连接，以保证不同功能蛋白的正确折叠和稳定性。在本发明中，隔区优选为包含在一个或多个组分之间的一个或多个肽序列。这些多肽序列在1-50个氨基酸长度之间，优选在1-25之间。“隔区”更优选为(GGGGS)n，其中n为1-10，优选2-5。本发明所述的“双特异性融合蛋白的前体”也可以包含信号肽，便于蛋白由细胞内分泌到细胞外，增加其产量。本发明所述的“抗体”是指表现出所需生物学活性的任何形式的抗体。因此，它以最广义使用，具体地说，包括但不限于全长抗体，抗体结合片段或衍生物。抗体的来源包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、基因工程抗体(例如双特异性抗体)。本发明所述的“全长抗体”是指包含4条多肽链(即2条重链和2条轻链通过二硫键相互交联形成多聚体)的免疫球蛋白分子(例如IgM)。每条重链包含一段重链可变区(简称VH)和一段重链恒定区，重链恒定区包含3个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链包含一段轻链可变区(简称VL)和一段轻链恒定区，轻链恒定区包含1个结构域(CL1)。VH区和VL区可进一步包括高变区(文中也作互补决定区(CDR))。各互补决定区之间穿插着更加保守的结构域，称为框架区(FR)。本发明所述的“抗体结合片段或衍生物”包括任何一种自然发生的、酶催化获得的、合成的、或是通过基因工程得到的，可与抗原特异性结合形成复合物的多肽或糖蛋白。通常包括亲本抗体的至少部分抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)，其保留亲本抗体的至少某些结合特异性。“抗体结合片段或衍生物”可能由抗体衍生而来，例如通过适宜的标准技术包括蛋白水解或重组基因工程技术(包括对表达抗体可变区和部分恒定区的DNA进行操作和表达)对抗体全长进行改造而得。“抗体结合片段或衍生物”包括但不限于：(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)；(vi)dAb片段；和(vii)模拟抗体高变区氨基酸残基的最小识别单元(如一个分离的互补决定区(CDR))。其它工程分子如双价抗体、三价抗体、四价抗体和微抗体也在“抗体结合片段或衍生物”范围内。“Fab片段”由一条完整的轻链和重链的VH和CH1功能区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“Fab’片段”包含一条轻链和重链的VH和CH1功能区，还包含在CH1与CH2结构域之间的区域，以至于可在两个Fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键，以形成F(ab’)2分子。“F(ab’)2片段”包含二条轻链和含有CH1与CH2结构域之间的部分恒定区的两条重链，以至于在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab’)2片段由通过两条重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段组成。“Fv片段”包含轻链或/和重链的可变区VH功能区。本发明PDGFRβ结合肽优选Fv片段，一个优选实施例为PDGFRβ的重链可变区，另一优选实施例为重链可变区与轻链可变区连接的融合蛋白。术语“Fc段”指的是人免疫球蛋白链恒定区，特别是免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分，无抗原结合活性，是抗体分子与效应分子和细胞相互作用的部位。例如，免疫球蛋白Fc区可包括重链CH1、CH2、CH3、CH4的两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合。根据重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类，主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-4；IgA-1和IgA-2。“Fc区”优选包括至少一个免疫球蛋白绞链区，以及IgG的CH2和CH3区。更优选包括IgG1的一个CH2结构域，一个CH3结构域和一个免疫球蛋白绞链区，铰链区起始氨基酸位置可以变动。“Fc段”无抗原结合活性，是抗体分子与效应分子和细胞相互作用的部位。“铰链区”用于连接抗体的Fab段和Fc段。在本发明中可以将双特异性融合蛋白与Fc段连接。在本发明的实施方案中，本发明的第一种组分VEGF结合肽简称为VTE；第二种组分PDGFR结合肽简称为PDX；第三种组分IGg的Fc段简称为Fc。三种组分的组合顺序有三种：(1)VTE氨基酸序列在Fc氨基酸序列的上游，Fc氨基酸序列在PDX氨基酸序列的上游，顺序如VTE---Fc---PDX；(2)VTE氨基酸序列在PDX氨基酸序列的上游，PDX氨基酸序列在Fc氨基酸序列的上游，顺序如VTE---PDX---Fc；(3)PDX氨基酸序列在VTE氨基酸序列的的上游，VTE氨基酸序列在Fc氨基酸序列的上游，顺序如PDX---VTE---Fc。相应的，在本发明的实施方案中，编码VEGF结合肽的核苷酸序列位于编码PDGFR结合肽的核苷酸序列的上游。在本发明的另一种实施方案中，编码VEGF结合肽的核苷酸序列位于编码PDGFR结合肽的核苷酸序列的下游。施用方法本发明提供治疗方法，包括施用给受试者有效量的本发明的双特异性融合蛋白。在一优选的方面，所述的融合蛋白是充分纯化的，即基本没有限制其效果或产生非期望的副作用的物质。受试者优选地是哺乳动物，最优选是人。在特定的实施方案中，期望将本发明药物组合物局部施用至需要治疗的区域；这可通过例如，但不以此作为限制，在手术期间局部灌注、局部施用完成，所述的局部灌注和局部施用是例如通过注射、通过导管的方式或通过植入物的方式进行，其中的植入物是多孔的、非多孔的或凝胶状的物质，包括膜，例如硅橡胶(sialastic)膜、纤维或商业的皮肤代用品。用于实践本发明方法的组合物可以是包含本发明试剂的溶液、悬液或两者的液体。术语“溶液/悬液”指液体组合物，其中第一部分活性剂存在于溶液中而第二部分活性剂表现为颗粒的形式，所述颗粒在液体基质中悬浮。液体组合物也包括凝胶体。液体组合物可以是含水的或是以软膏剂的形式。进一步，组合物可采用固体物的形式可将该固体物放入眼睛中，例如放入眼和眼睑之间或结膜囊中，在这里释放本发明所公开的双特异性蛋白。双特异性蛋白一般可从上述固体物释放至角膜，或直接传至角膜本身，固体物一般与角膜直接接触。适合植入眼睛的固体物通常主要由生物溶蚀或非生物溶蚀聚合物组成。水溶液和/或悬液可以是滴眼液的形式。理想的活性剂的剂量可以通过施用已知数量的滴数至眼中测量。例如，对于50μl体积一滴，施用1-3滴将递送50-150μl组合物。用于实现本发明方法的含水悬液或溶液/悬液可包含一种或多种作为助悬剂的聚合物。有用的聚合物包括水溶性聚合物，如纤维素聚合物，和不可水溶的聚合物如交联的含有羧基的聚合物。本发明的含水悬液或溶液/悬液优选地是粘性的或粘膜粘附性的，或更优选地两者都是粘性的或两者都是粘膜粘附性的。诊断和筛选方法本发明的双特异性蛋白或作诊断性使用和/或用于筛选方法。例如，该双特异性蛋白可用于在临床研究阶段监控VEGF和PDGFR的水平来评价治疗效率。在另外的实施方案中，本发明方法和组合物可用于筛选具有例如太高或太低VEGF和PDGFR的水平的个体。也可用于在体内和体外筛选检测法来定量存在的非结合的VEGF和PDGFR的量，例如可用于筛选方法来鉴定能降低VEGF和PDGFR的表达的检测试剂。更一般地，本发明的双特异性蛋白可用于定量和/或分离VEGF和PDGFR的任意检测或方法。药物组合物本发明也提供包含本发明双特异性蛋白的药物组合物。这种组合物包含治疗有效量的一种或多种本发明所提供的双特异性蛋白和可药用载体。术语“可药用的”指用于动物以及更特别是用于人的中国药典或其它药典中列出的。术语“载体”指与药物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂。这种药用载体可以是无菌液体，如水或油。这些组合物可采取溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释剂等形式。此外，用于实现本发明方法的药物组合物具有与眼睛相容的PH值和摩尔渗透压浓度。实施例以下结合实施例进一步描述本发明，但这些实施例并非限制本发明的范围。本发明实施例或测试例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。一般方法分子生物学的标准方法已有描述(Maniatis等(1982)MolecularCloning，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY；Sambrood和Russell(2001)MolecularCloning，第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY；Wu(1993)RecombinantDNA，第217卷，AcademicPress，SanDiego，CA)。标准方法还见于Ausbel等，(2001)CurrentProtoclolsinMolecularBiology，第1-4卷，JohnWileyandSons，Inc.NewYork，其描述了在细菌细胞中克隆和DNA诱变(第1卷)、在哺乳动物细胞和酵母中克隆(第2卷)、复合糖和蛋白质表达(第3卷)，以及生物信息学(第4卷)。本发明提供了构建编码融合蛋白分子的多核苷酸的方法，该核酸分子被插入一种载体上，该载体在导入合适的宿主细胞之后能够表达所述融合蛋白。合适的宿主细胞包括，但不限于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。优选LonzaCHO细胞。本领域技术人员所公知的，任何用于将DNA片段插入载体中的方法，都可用于构建编码所述融合蛋白的受转录/翻译控制信号控制的表达载体。所述方法可以包括体外重组DNA和合成技术和体内重组(遗传重组)(参见Sambrook等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室；当代分子生物学方法，Ausubel等著，Greene出版协会，WileyInterscience，NY)。编码本发明融合蛋白的多核苷酸分子的表达可通过另一核苷酸序列调控，以便该融合蛋白是在用所述重组DNA分子转化过的宿主中表达。例如，本发明的融合蛋白的表达可通过本领域所公知的任何启动子/增强子元件控制。因此，根据本发明用含有本文所披露的融合蛋白的多核苷酸的能够在细菌或真菌宿主中复制的表达载体转染所述宿主，并因此控制所述多核苷酸的表达，以便产生所述融合蛋白，然后以生物学活性形式回收该融合蛋白。在发明中，生物学活性形式包括能够同时与VEGF和PDGFR结合的形式。含有本发明所述多核苷酸的表达载体可以通过三种一般方法鉴定：(a)DNA-DNA杂交，(b)“标记”基因功能的有和无，和(c)插入序列的表达。在第一种方法中，插入一种表达载体的外源基因的存在可以用含有与插入的融合蛋白序列同源的序列的探针进行DNA-DNA杂交进行检测。在第二种方法中，可以根据由于在所述载体上插入外源基因所导致的某些“标记”基因功能(例如对抗生表的抗性、转化表型等)有或无鉴定并选择重组载体/宿主系统。例如，如果所述融合蛋白DNA序列被插入所述载体的标记基因序列之内，可以通过该标记基因功能的缺乏鉴定含有该插入片段的重组体。在第三种方法中，可以通过检测由重组体所表达的外源基因产物鉴定重组表达载体。例如，所述检测可以基于所述融合蛋白的物理特性或功能特性。本发明所述细胞可以是暂时性的，优选组成型并永久地，表达所述融合蛋白。所述融合蛋白可以用任何方法纯化，以便能够随后制成稳定的、有生物学活性的融合蛋白。例如，但并非是限定，所述融合蛋白可以可溶蛋白形式从细胞中回收，或者作为包涵体形式回收。为了进一步纯化所述融合蛋白，可以使用常规的离子交换层析、疏水性相互作用层析、反相层析或凝胶过滤。实施例1.双特异性融合蛋白本发明提供了包括VEGF结合肽和PDGFRβ结合肽的双特异性融合蛋白；更具体地，提供了通过将VEGFR(Flt-1、Flk-1、Flt-4)的修饰过的胞外结构域、PDGFRβ结合肽和IgG的Fc区嵌合所形成的新型融合蛋白。在本发明的实施方案中，本发明VEGF结合肽氨基酸序列称为VTE；第二种组分PDGFR抗体，称为PDX；第三种组分IGg的Fc区称为Fc。三种组分的组合顺序有三种：(1)VTE氨基酸序列在Fc氨基酸序列的上游，Fc氨基酸序列在PDX氨基酸序列的上游，顺序如VTE---Fc---PDX，简称VFP；(2)VTE氨基酸序列在PDX氨基酸序列的上游，PDX氨基酸序列在Fc氨基酸序列的上游，顺序如VTE---PDX---Fc，简称VPF；(3)PDX氨基酸序列在VTE氨基酸序列的的上游，VTE氨基酸序列在Fc氨基酸序列的上游，顺序如PDX---VTE---Fc，简称PVF。融合蛋白的组分可直接相互连接或通过连接肽连接。比如在Fc上游加上5-20个氨基酸，优选5-15个氨基酸的铰链区。本发明中的VEGF结合肽是指含有VEGFR胞外结构域序列的多肽片段。例如包括Flt-1的胞外结构域D2和Flk-1的胞外结构域D3的序列(为方便命名为VTE)，序列如下：SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKSEQIDNO：1。VEGF结合肽也可以是VTE加上Fc片段，简称VEGF-Trap-Fc：SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQIDNO：2。本发明中的PDGFRβ结合肽可以是具有PDGFRβ结合活性的VH片段，序列如下(为方便命名为PDX，选自PDX1，PDX2或PDX3)：PDX1(又名XB2202VH，本发明中简称VH)：QVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFSRHAISWVRQAPGQGLEWIGGILPILKTPNYAQRFQGRVTINADESTSTVYMEMSSLRSEDTAVYYCATHGGDRSYWGQGTLVTVSSSEQIDNO：3。PDX2(XB1115VH)：QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIHGGDRSYWGQGTLVTVSSSEQIDNO：4。PDX3(XB2708VH)：QVQLVQSGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTSRSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFILFDGNNKYYADSVKGRFTISSDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHGGDRSYWGQGTLVTVSSSEQIDNO：5。PDX4(XB2202VL)：DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNWLNWYQQKPGKAPKLLIYEASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYNNVLRTFGQGTKVEIKSEQIDNO：6。本发明的Fc区包含IgG(如IgG1，IgG2，IgG3或IgG4，优选IgG1)的CH2和CH3功能区，序列如下(为方便命名为Fc)：Fc-1：CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQIDNO：7。Fc-2：CPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQIDNO：8。Fc-3：CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQIDNO：9。在Fc区前可以有铰链区，选自原始序列或其突变体，序列如下：Fc-H1：DKTHTSEQIDNO：10。Fc-H2：EPKSSDKTHTSEQIDNO：11。各组分之间可以有连接肽，序列如下：本发明所述的双特异性融合蛋白的表达前体还可以有分泌信号肽，例如：SIG1：MEFGLSWLFLVAILKGVQCSEQIDNO：16。SIG2：MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCSEQIDNO：17。本发明所述的双特异性融合蛋白，经细胞表达得到如下优选序列：VTEP-0：CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFSRHAISWVRQAPGQGLEWIGGILPILKTPNYAQRFQGRVTINADESTSTVYMEMSSLRSEDTAVYYCATHGGDRSYWGQGTLVTVSSSEQIDNO：18。序列说明：排列如Fc(hIgG1)-XB2202VH，Fc(人IgG1，Fc-3，SEQIDNO：9)通过一个连接肽(SPAC1，n＝2)连接XB2202重链可变区(PDX1，SEQIDNO：3)，组合顺序为：Fc-PDX；VTEP-13：SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFSRHAISWVRQAPGQGLEWIGGILPILKTPNYAQRFQGRVTINADESTSTVYMEMSSLRSEDTAVYYCATHGGDRSYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQIDNO：19。序列说明：排列如VEGF-Trap-XB2202-FC，VEGFTrap(VTE)通过连接肽(SPAC1，n＝2)连接XB2202重链可变区(PDX1，SEQIDNO：3)和Fc(Fc-1，SEQIDNO：7)，在PDX1与Fc之间有绞链区(Fc-H2，SEQIDNO：11)，组合顺序为：VTE-PDX-Fc；VTEP-15：SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFSRHAISWVRQAPGQGLEWIGGILPILKTPNYAQRFQGRVTINADESTSTVYMEMSSLRSEDTAVYYCATHGGDRSYWGQGTLVTVSSSEQIDNO：20。序列说明：排列如VEGF-Tarp-Fc-(G4S)4-XB2202，VEGF-TrapFc融合蛋白(VF1序列，通过铰链区Fc-H1，SEQIDNO：10，与Fc-2，SEQIDNO：6连接融合)，通过连接肽(SPAC1，n＝4)连接XB2202重链可变区(PDX1，SEQIDNO：3)，组合顺序为：VTE-Fc-PDX；VTEP-17：SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNWLNWYQQKPGKAPKLLIYEASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYNNVLRTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFSRHAISWVRQAPGQGLEWIGGILPILKTPNYAQRFQGRVTINADESTSTVYMEMSSLRSEDTAVYYCATHGGDRSYWGQGTLVTVSSSEQIDNO：21。序列说明：排列如VEGF-Tarp-FC-(G4S)5-XB2202VL-Linker-VH，VEGF-TrapFc融合蛋白通过连接肽(SPAC1，n＝4)连接XB2202的轻链可变区(PDX4，SEQIDNO：6)和重链可变区(PDX1，SEQIDNO：3)，组合顺序为：VTE-Fc-PDX；VTEP-22：QVQLVQSGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTSRSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFILFDGNNKYYADSVKGRFTISSDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHGGDRSYWGQGTLVTVSSASTKGPSGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQIDNO：22。序列说明：排列如XB2708VH-linker-1-VEGF-Tarp-Fc，XB2708重链可变区(PDX3，SEQIDNO：5)通过一个连接肽(SPAC2)连接到VEGF-TrapFc融合蛋白，组合顺序为：PDX-VTE-FcVTEP-25：QVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFSRHAISWVRQAPGQGLEWIGGILPILKTPNYAQRFQGRVTINADESTSTVYMEMSSLRSEDTAVYYCATHGGDRSYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQIDNO：23。序列说明：排列如XB2202VH-(G4S)5-VEGF-Tarp-Fc，XB2202重链可变区通过一个连接肽(SPAC1，n＝5)连接到VEGF-TrapFc融合蛋白，组合顺序为：PDX-VTE-Fc；VTEP-26：QVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFSRHAISWVRQAPGQGLEWIGGILPILKTPNYAQRFQGRVTINADESTSTVYMEMSSLRSEDTAVYYCATHGGDRSYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNWLNWYQQKPGKAPKLLIYEASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYNNVLRTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQIDNO：24。序列说明：排列如XB2202VH-(G4S)3-VL-(G4S)5-VEGF-Tarp-Fc，为XB2202重链可变区和轻链可变区通过一个连接肽(SPAC1，n＝3)连接到VEGFTrapFc融合蛋白，组合顺序为：PDX-VTE-Fc。表1.序列组成名称组分连接肽组分连接肽组分VTEP-0Fc-3SPAC1，n＝2PDX1VTEP-13VTE1SPAC1，n＝2PDX1Fc-H2Fc-1VTEP-15VTE1Fc-H1Fc-2SPAC1，n＝4PDX1VTEP-17VTE1Fc-H1Fc-1SPAC1，n＝3PDX4，PDX1VTEP-22PDX3SPAC2VTE1Fc-H1Fc-1VTEP-25PDX1SPAC1，n＝5VTE1Fc-H1Fc-1VTEP-26PDX1SPAC1，n＝3PDX4SPAC1，n＝5VTE1，Fc-1实施例2载体构建所有PCR和克隆相关操作均按照分子克隆标准操作进行，详细参考《分子克隆》(Sambrook等，冷泉港实验室)。实验材料：真核表达载体pcDNA3.1(+)(Lifetechnologies，货号V790-20)；编码VTE蛋白(SEQIDNO：1)的核苷酸序列：由基因合成公司合成(金唯智，苏州)；编码Fc蛋白片段(SEQIDNO：7，SEQIDNO：8或SEQIDNO：9)的核苷酸序列：人源抗体重链γ1恒定区Fc片段，由基因合成公司合成(金唯智，苏州)；PDX蛋白片段(SEQIDNO：3，SEQIDNO：4，SEQIDNO：5或SEQIDNO：6)的核苷酸序列：由基因合成公司合成(金唯智，苏州)。实验方法：1、片段拼接按照VTEP-0、VTEP-13、VTEP-15、VTEP-17、VTEP-22、VTEP-25、VTEP-26各序列中VTE、Fc、PDX的顺序，并加入连接肽修饰序列，翻译成对应的核苷酸序列，进行overlapPCR，将各片段拼接成对应蛋白的核苷酸序列表达片段。2、引入酶切位点及信号肽序列：利用PCR方法在各个表达片段的5’端引入限制性内切酶KpnI位点，Kozak序列，信号肽序列；在各个片段的3’端分别引入终止密码子TGA和NotI限制性内切酶位点。最终得到的DNA序列从5’至3’端依次为：KpnI位点-Kozak序列-信号肽序列-表达片段(结构顺序包括Fc-PDX，VTE-Fc-PDX，PDX-VTE-Fc或VTE-PDX-Fc)-TGA终止密码子-NotI位点。在本发明的实施例中，VTE-0的信号肽优选SIG2的序列，其它实施例优选SIG1的序列。3.构建表达载体利用KpnI和NotI限制酶位点将各个片段分别插入质粒pcDNA3.1(+)，构建成表达载体。实施例3.蛋白表达实验方法：使用FreeStyle293细胞(GIBCO，Cat#R79007)瞬时转染表达实施例2中构建的表达载体。FreeStyle293细胞悬浮培养在培养基(Freestyle293expressionmedium，GIBCO，Ca#12338018)中，添加终浓度为1％的超低免疫球蛋白胎牛血清(UltraLowIgGFetalBovineSerum，GIBCO，Cat#16250078)。准备好实施例2中构建好的表达载体和转染试剂PEI(Polysciences，Ca#239662)，表达载体量为100μg/100ml细胞，表达载体和PEI的质量比为1∶2。转染当天细胞密度为1×106/ml。1L的FreeStyle293待转染细胞，取50mlOpti-MEM培养基(GIBCO，Cat#11058021)与表达载体混匀，静置5min，过滤；另取50mlOpti-MEM培养基与PEI混匀，静置5min，过滤。将表达载体和PEI进行混匀，静置15min。将表达载体和PEI混合物缓慢加入细胞中，置入37℃，8％CO2，130rpm摇床培养箱中培养。5天后离心收集上清进行蛋白纯化。实施例4蛋白纯化实验方法：1、亲合层析细胞培养液高速离心后收集上清，利用亲合层析进行第一步层析。层析条件：层析介质为与Fc相互作用的ProteinA或者衍生填料，如GE的Mabselect；平衡缓冲液为1×PBS(NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO42mmol/L，pH7.4)，平衡5倍柱体积；细胞上清上样结合，流速控制在样品柱上保留时间≥1min；上样结束后，利用1×PBS(pH7.4)进行清洗，直至紫外吸收回落到基线；洗脱缓冲液为0.1M甘氨酸(pH3.0)进行层析洗脱，根据紫外吸收峰收集洗脱样品，最后用1MTris(pH9.0)中和。2、体积排阻。将第一步洗脱样品超滤浓缩后进行体积排阻层析，排阻层析条件：缓冲液为1×PBS(NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO42mmol/L，pH7.4)，层析柱XK26/60Superdex200(GE)，流速4ml/min，上样体积小于5ml。根据紫外吸收合并目的蛋白峰。3：纯度检测。纯度检测采用SEC-HPLC，检测用柱为TSK-Gel2000-SWXL(TOSOH)，流速：0.7ml/min，上样量：50μl，流动相：1×PBS(NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO42mmol/L，pH7.4)。SEC-HPLC纯度大于95％。测试例测试例1PDGFR磷酸化细胞实验一、试验目的：通过Western印迹方法评估本发明的融合蛋白抑制Caki细胞中PDGFRβ和AKT(S473)磷酸化作用，测试本发明的融合蛋白具有的PDGFR抗体功能。二、试验材料：本发明样品：VTEP-0，VTEP-13，VTEP-15，VTEP-17和VTEP-22。Caki细胞：购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心，货号TCHu135；Phospho-PDGF受体β(Tyr751)(88H8)MousemAb(PDGFRβ抗体)：购自CellSignallingTechnology公司，货号#3166；重组人PDGF-BBCF(10UG)(PDGFR配体PDGFRbb)：购自R&D公司，货号220-BB-010；蛋白酶抑制剂：CompleteMiniEDTA-free购自罗氏公司，货号04693159001；磷酸化酶抑制剂：PhosSTOP购自罗氏公司，货号04906837001；McCOY′s5A培养基：购自LifeTechnologies，货号16600-082；细胞RIPA裂解液：购自碧云天生物技术研究所，货号P0013B。三、试验方法：1、取4块6孔板，每个孔加0.8×106个Caki细胞，37℃培养6小时，换为McCOY′s5A无血清培养基培养37℃培养过夜；2、第二天给细胞换液，每个孔加2ml无血清培养基。3、配制不同浓度样品溶液：VTEP-0，VTEP-13，VTEP-15，VTEP-17，VTEP-22，用McCOY′s5A无血清培养基稀释配制，各样品浓度见图1-图5上的第1行。如VTEP-13的加样方式依次为200、66.7、22.2、7.4、0、200nM，每孔1ml。4、37℃孵育50分钟后加PDGFR配体PDGFRbb(配体)，终浓度为40ng/ml，37℃孵育10分钟；各样品加配体的情况见图1-图5上的第2行，“+”表示所示样品按前述加入配体，“-”表示所示样品不加入配体；5、用PBS(pH7.4)洗涤2次，用细胞RIPA裂解液(含蛋白酶和磷酸化酶抑制剂)裂解细胞，BCA蛋白定量；6、电泳，8％SDS-PAGE，Western印迹。四、试验结果：结果如图1-图5所示：图1-图5中p-PDGFRβ表示该行电泳图表示测试加入样品后，细胞裂解液中磷酸化PDGFRβ的含量；p-AKT(S473)表示该行电泳为测试加入样品后，细胞裂解液中磷酸化AKT(S473)的含量；PDGFRβ表示该行电泳为测试加入样品后，细胞裂解液中磷酸化PDGFRβ与非磷酸化PDGFRβ的总含量；GAPDH表示该行电泳为测试加入样品后，细胞裂解液中看家基因GAPDH蛋白的含量。结果显示，本发明样品具有PDGFR抗体功能，均能够抑制PDGFRβ和AKT(S473)磷酸化，对PDGFRβ磷酸化抑制作用具有明显的剂量效应，对下游AKT(S473)磷酸化抑制作用也有一定的剂量效应。且抗体本身没有PDGFRβ磷酸化激动剂作用。其中VTEP-17对PDGFR配体PDGFRbb诱导的PDGFR磷酸化的抑制率IC50为3.6nm，如图6所示；VTEP-17对PDGFR配体PDGFRbb诱导的AKT(S473)磷酸化的抑制率IC50为3.2nm，如图7所示。测试例2HUVEC细胞增殖实验一、试验目的：检测本发明样品对HUVEC细胞增殖的抑制作用。二、试验材料：本发明样品：VTEP-13，VTEP-15和VTEP-22；HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)：购自ATCC，货号CRL-1730TM；LowSerumGrowthSupplement(LSGS，低浓度血清生长补充剂)：购自GIBCO，货号S-003-10；Medium200培养基：购自GIBCO，货号M-200-500；VEGF165：购自R&D，货号293-VE-010；CCK8：购自同仁化学，货号CK04。三、试验方法：1、96孔板中，每孔加入100μl含2000个HUVEC细胞的Medium200+LowSerumGrowthSupplement培养基(加LSGS的Medium200培养基)，培养板放在37℃、5％CO2培养箱中培养。2、24小时后，将Medium200+LowSerumGrowthSupplement培养基换为0.5％FBS的medium200培养基，每孔90μl。3、将样品从原始浓度开始用无血清medium200培养基三倍稀释，共稀释9个点，稀释后的样品分别与200ng/mlVEGF165，37℃、5％CO2培养箱孵育1小时。4、将步骤3中配置好的不同稀释度的样品与VEGF的混合物加至细胞中，每孔10μl，将培养板放在37℃、5％CO2培养箱中培养。5、72小时后，每孔加入10μlCCK8显色，4小时后检测CD450。四、试验结果：结果如图8-10所示，3个样品对HUVEC细胞增殖均有不同抑制作用，见表2。表2：对HUVEC细胞增殖的抑制作用名称IC50(ng/ml)VTEP-13159VTEP-17292VTEP-22220测试例3样品与PDGFRβ蛋白的反应亲和力测试一、试验目的：用Biacore，GE仪器测定本发明样品和PDGFRβ蛋白的反应亲和力(affinity)。二、实验仪器、材料与试剂本发明样品：VTEP-0，VTEP-13，VTEP-15，VTEP-17，VTEP-22，VTEP-25和VTEP-26。实验仪器：BiacoreX100，GE；实验材料：生物传感芯片CM5(Cat.#BR-1000-12，GE)；实验试剂：1)、氨基偶联试剂盒(Cat.#BR-1000-50，GE)；2)、人抗捕获试剂盒(Cat.#BR-1008-39，GE)；3)、PDGFRβ(Cat.#10514-H08H，SinoBiological)；4)、盐酸甘氨酸(pH1.5)再生溶液(Cat.#BR-1003-54，GE)；5)、HBS-EP+10倍缓冲溶液(Cat.#BR-1006-69，GE)用D.I.Water稀释至1倍(pH7.4)。三、试验方法：实验样品VTEP-0，VTEP-13，VTEP-15：按照人抗捕获试剂盒说明书中的方法将人抗捕获抗体共价偶联于CM5生物芯片上，从而亲和捕获一定量的VTE蛋白，然后于芯片表面流经一系列浓度梯度下的PDGFRβ蛋白，利用Biacore仪器实时检测反应信号获得结合和解离曲线。在实验中每个循环解离完成后，用人抗捕获试剂盒里配置的再生溶液将生物芯片洗净再生。实验样品VTEP-17，VTEP-22，VTEP-25，VTEP-26按照氨基偶联试剂盒说明书中的方法将PDGFRβ蛋白共价偶联于CM5生物芯片上，然后于芯片表面流经一系列浓度的VTE蛋白，进而利用Biacore仪器实时检测反应信号获得结合和解离曲线。使用GE的BIAevaluation软件以1∶1(Langmuir)结合模型分析所得数据，以此法测定的亲和力Kd值显示于下表3。四、实验结果本发明样品与PDGFRβ蛋白有较高的反应亲和力，结果见表3。表3：与PDGFRβ蛋白的反应亲和力编号Kd(nM)VTEP-05.9VTEP-1381VTEP-1558VTEP-172.3VTEP-223.1VTEP-2522VTEP-2649测试例4样品与VEGF蛋白的反应亲和力测试一、试验目的：用Biacore，GE仪器测定本发明样品和VEGF蛋白的反应亲和力(affinity)。二、实验仪器、材料与试剂本发明样品：VTEP-17和VTEP-22。实验仪器：BiacoreX100，GE；实验材料：生物传感芯片CM5(Cat.#BR-1000-12，GE)；实验试剂：1)氨基偶联试剂盒(Cat.#BR-1000-50，GE)；2)人抗捕获试剂盒(Cat.#BR-1008-39，GE)；3)VEGF165/VEGFA(Cat.#11066-HNAB，SinoBiological)；4)HBS-EP+10倍缓冲溶液(Cat.#BR-1006-69，GE)用D.I.Water稀释至1倍(pH7.4)。三、试验方法：按照人抗捕获试剂盒说明书中的方法将人抗捕获抗体共价偶联于CM5生物芯片上，从而亲和捕获一定量的VTE蛋白，然后于芯片表面流经一系列梯度浓度下的VEGF165蛋白，利用Biacore仪器实时检测反应信号获得结合和解离曲线。使用GE的BIAevaluation软件以1∶1(Langmuir)结合模型分析所得数据，以此法测定的亲和力Kd值显示于下表4。四、实验结果本发明样品与VEGF蛋白有较高的反应亲和力，结果见表4：表4.与VEGF蛋白的反应亲和力编号Kd(pM)VTEP-1752VTEP-22250测试例5体内的半衰期检测一、实验目的：为了检测本发明VTEP-17在大鼠体内药代动力学参数。二、实验材料与试剂：动物：180±10gSD大鼠，雌雄各半(西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物生产许可证号SCXK(沪)2008-0016)，每组6只。PDGFR-His：组成为PDGFRβ的胞外片段(人源CD140b/PDGFRb基因功能区，来自www.uniprot.org，SEQIDNO：25)加上Flag标签和his标签(序列中以横线标注)，可用领域内熟知的办法制备，如建立克隆，瞬转质粒和用镍柱纯化蛋白，经电泳验证为所要的蛋白后使用。在本测试中，可用于结合检测具有PDGFRβ抗体功能的片段，序列如下：LVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFSGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITVVESGYVRLLGEVGTLQFAELHRSRTLQVVFEAYPPPTVLWFKDNRTLGDSSAGEIALSTRNVSETRYVSELTLVRVKVAEAGHYTMRAFHEDAEVQLSFQLQINVPVRVLELSESHPDSGEQTVRCRGRGMPQPNIIWSACRDLKRCPRELPPTLLGNSSEEESQLETNVTYWEEEQEFEVVSTLRLQHVDRPLSVRCTLRNAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVGSSDYKDDDDKHHHHHHSEQIDNO：25。羊抗人IgG过氧化物酶偶联抗体：JacksonCat.No.：109-035-088；酶标仪：ThermoScientific。三、实验方法：1、体内给药SD大鼠6只，雌雄各半，腹腔注射给药；无菌条件下，VTEP-17溶于生理盐水中，终浓度为20μg/mL；每只大鼠IP给药，给药剂量为100μg/kg；IP组按时间点15min、30min、1hr、2hr、4hr、8hr、11hr、24hr、48hr、72hr大鼠眼底静脉取血，每次200μL(相当于取血清100μL)；收集的血样在室温下置放半小时至凝集，然后4℃下10000×g离心5分钟。收集上清，立即进行实验或样品等分放置-80℃贮存。避免反复冻融。2、用步骤1中得到的血清样品进行ELISA检测1)直接包被100ng/ml的PDGFR，4℃过夜；2)用300μl含5％脱脂乳的PBST封闭酶标板，37℃恒温封闭2h，同时封闭无包被的空白孔作对照；3)PBST洗涤3次；4)每孔加入100μl含VTEP-17的大鼠血清样品(实验前取一个大鼠血清样品，按照不同比例稀释，得到一个血清中抗体浓度正好在标准曲线中间位置的最佳稀释比例，将血清样品按照最佳稀释比例进行稀释)，37℃恒温孵育2h；5)PBST洗涤3次；6)每孔加入100μl羊抗人IgG过氧化物酶偶联抗体(1∶2500)，37℃恒温孵育1h；7)PBST洗涤3次。每孔加入100μlTMB底物，37℃恒温孵育5-10min，随后每孔加入100μl1.25MH2SO4中止反应；8)ELISA酶标仪读取450nm波长处的OD值。根据标准曲线方程和样品的OD值，计算得到样品的实际浓度。标准曲线：以VTE-17浓度(5，10，20，50和100ng/ml)为横坐标，不同浓度VTE-17对应的OD值为纵坐标，获得典型标准曲线方程，标准曲线的线性范围为5-100ng/ml。四、实验结果：按以上方法，对实施例2中得到的VTEP-17进行检测，用PhoenixTMWinNonlin6.1软件中非房室模型进行药动学计算，得到其体内半衰期(T1/2)，结果如下：表5.药代动力学测试发明人在中和VEGF的基础上引入了抗PDGFRβ的VH片段。该融合蛋白具有中和VEGF以及阻断PDGFRβ的信号通路的双重特异性，因此可以使本来对中和VEGF治疗无反应的人群得到有效的治疗，并能够克服中和VEGF药物疗法的抗性，另外有可能延长病人需要眼内注射的周期，从而会在现有基础上更好治疗老年黄斑变性。测试例6VTEP蛋白对激光诱导脉络膜新生血管小鼠模型中脉络膜新生血管生成抑制作用的研究一、试验目的：本测试例用于研究VTEP蛋白对激光诱导脉络膜新生血管生成小鼠模型中脉络膜新生血管生成的抑制作用。试验原理：本实验通过一定能量激光破坏小鼠视网膜组织中局部的Bruch’s膜，使得本该阻隔的脉络膜血供系统和视网膜血供系统相沟通，脉络膜毛细血管内皮细胞、周细胞、纤维细胞和炎症细胞等进入视网膜下和色素上皮层内，同时，伴随炎症因子、促血管生成因子产生和细胞外基质成分改变，打破局部促血管-抑血管生成因子间的平衡，促发局部新生血管生成，其中血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)介导的内皮细胞生长和胞外基质、周细胞包绕对脉络膜新生血管生成具有重要作用。二、实验材料与试剂：实验动物：成年(6-8周龄)C57BL/6J母鼠，购自上海斯莱克试验动物有限责任公司。试验仪器：图像分析仪：德国Zeiss公司KS400型氩激光发射器：LumenisSelectaDuet，美国Lumenis公司裂隙灯：苏州六六眼科手术器械：淮阴医疗器械眼科手术显微镜：美国LEICA公司载玻片、盖玻片：世泰微量注射仪及进样针：美国Parker公司，ParkerHannifinPICOSPRITZERIII试剂准备：美多丽眼药水：参天制药有限公司盐酸丙美卡因滴眼液：Alcon公司迪可罗眼膏：兴齐制药有限公司4％多聚甲醛：上海生工水合氯醛：上海生工葡聚糖荧光素钠试剂fluorescein-labeleddextran：美国Sigma-Aldrich公司封片剂(FluorescentMountingMedium)：DAKOVTEP-17(SEQIDNO：21)和VEGF-Trap(SEQIDNO：2)蛋白：用提供的溶解稀释缓冲液(PBS缓冲液)按设计分组浓度要求稀释，超净台内操作完成，分装为20ul/管4度低温保存，以备取用。GONIC粘合剂：美国DOW测试样品分组如下：Group1(g1)：PBS缓冲液Group2(g2)：VEGF-Trap10ugGroup6(g6)：VTEP-175.1ugGroup7(g7)：VTEP-1715.4ugGroup8(g8)：VTEP-1746.2ug三、实验方法：6-8周龄C57/BL6小鼠自由饮水进食，12小时明暗交替环境饲养，随机分成5组，每组8只，雌雄各半，按0.01ml/g体重腹腔注射3.5％水合氯醛进行麻醉，美多丽滴眼液涂于眼表扩瞳，待麻醉充分后于裂隙灯下行眼底激光光凝(波长532nm，能量120mw，时间0.1s，光斑直径100nm)，以激光后可见气泡生成者计为有效，其中有效激光斑距视乳头1-2PD，分别位于不同象限，每眼4-6处，即造模成功。各组分别于造模后第1天、第7天腹腔注射水合氯醛麻醉，以玻璃体腔给药方式，用微量注射仪给予相应蛋白(见实验分组设计)。激光后第14天，腹腔注射水合氯醛麻醉，解剖胸腔，暴露心脏，25mg/ml荧光素钠每只小鼠0.4ml行心腔灌注，过量麻醉处死小鼠后，取眼球，于4％福尔马林室温固定5小时。取出固定后眼球，沿角巩缘剪开，去除晶体、角膜、玻璃体，余下眼杯以视乳头为中心做放射状切口剪开，将之展平于载玻片上，小心去除视网膜，滴加封片剂，盖盖玻片完成铺片。组织片于-20度保存，隔天荧光显微镜下观察，20倍放大物镜拍下激光斑图片，以ImageproPlus计数脉络膜新生血管面积。数据处理：使用SAS9.0统计学软件进行分析，单因素方差分析(One-wayANOVA)检验，用t-test对两组间均数进行比较，P＜0.05为有统计学差异。四、实验结果：单因素方差分析显示各组有统计学差异(P＜0.02)，其中g1、g2与其余各组均有显著性差异，g6、g7、g8间无显著性差异。结果见图11：模型小鼠眼部脉络膜新生血管面积，柱状图表示均数±标准误。讨论：本实验中，VEGF-Trap具有中和VEGF作用，VTEP-17具有中和PDGF与中和VEGF的双重作用。实验结果提示这两种蛋白均能有效抑制脉络膜新生血管生成(G1与其余各组比较有统计学差异)，G2(单纯VEGF-Trap)与G6-8(不同浓度VTEP-17)间存在统计学差异，提示VTEP-17抗血管生成作用效果强于VEGF-Trap，但在此浓度跨度内计量-效应关系不明显，不同浓度VTEP-17组间抗血管生成作用无明显差异。当前第1页1 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