本发明属于医药
技术领域：
，涉及乙二醛酶系统的抑制剂，特别涉及一种乙二醛酶I竞争性抑制剂及其制备方法和用途。
背景技术：
：目前，临床上使用或正在研发的很多药物是通过直接或间接地抑制DNA和/或蛋白质来达到攻击肿瘤细胞的目的。这种情况下，快速分裂的正常细胞，如肠的上皮和骨髓，也同样受到不利的影响而产生强烈的副作用。人体糖代谢过程中不可避免地产生一种叫甲基乙二醛的有毒的化合物，它可以引起细胞的程序死亡。人体在长期进化过程中发展形成了乙二醛酶系统，由乙二醛酶I(glyoxalaseI,简称GlxI)和乙二醛酶II(glyoxalaseII,简称GlxII)组成，起到解毒甲基乙二醛的作用。在很多肿瘤细胞中乙二醛酶I高度表达，其抑制剂可以抑制或延缓人肿瘤细胞在裸鼠的生长，且没有明显副作用。但是，迄今开发的乙二醛酶I竞争性抑制剂的活性不够强，为了抑制小鼠肿瘤的生长，必须高剂量长期静脉注射给药。因此，如果研发出更强的竞争性抑制剂，则有望实现临床应用。乙二醛酶是以谷胱甘肽(GSH)为基质的酶系统，其功能是将细胞内有毒的甲基乙二醛通过乙二醛酶I和乙二醛酶II，有序地转化成无毒性的D-乳酸。甲基乙二醛是化学反应活性很高的α-羰醛，可以共价键的形式与蛋白质和DNA起反应，而直接影响细胞的生存。乙二醛酶I可以提高肿瘤细胞内甲基乙二醛的浓度，且快速分裂的肿瘤细胞对外来的甲基乙二醛异常敏感(Creighotonetal,DrugsoftheFuture,2000，25,385)，因此，有观点认为乙二醛酶I抑制剂可以作为抗肿瘤药物，但相关机理尚不十分清楚，有一种观点认为可能是甲基乙二醛与Hsp27蛋白质广泛地发生共价键修饰，导致细胞的分化和程序死亡(Vinceetal,J.Med.Chem.,1971,14,35)。为了印证上述假说，Creightonde等人合成了一系列过度态类似物，并认为该化合物是乙二醛酶I抑制剂(Murthyetal,J.Med.Chem.,1994，37,2161)，抑制常数(Kis)达到了10-8M，其中S-(N-对氯苯基-N-羟基甲酰)谷胱甘肽(CHG)的结构式如下：由于此类化合物含有两个羧基而难以透过细胞膜，所以实际应用时做成[甘氨酰，谷氨酰]二乙酯前体药物使用，前体药物进入细胞后被酯酶迅速水解游离出药物，继而起到肿瘤抑制作用。BBGC的二乙酯前体药物在100mg/Kg的剂量下有效抑制裸鼠荷前列腺DU-145细胞以及肺癌DMS-114细胞的肿瘤生长，而没有明显的毒副作用。CHG的二乙酯前体药物可以抑制猫白血病L1210和黑素瘤B16细胞的生长，IC50为数微摩尔浓度；在80mg/Kg的剂量下有效抑制C57BL/6(Es-1c)裸鼠荷前列腺PC-3,黑色素瘤B16,HT-29肠癌等肿瘤细胞的生长。实验结果证明了抑制乙二醛酶I能够杀伤肿瘤细胞，而且此类过度态类似物的抑制常数Ki与二乙酯前体药物的IC50值以及体内药效结果有很强的相关性(Sharkeyetal.,CancerChemotherPharmacol.,2000,46,156-166)。表1.正常细胞与肿瘤细胞中乙二醛酶的活性比较如表1中所示的肿瘤细胞中，除了脑细胞，前列腺肿瘤与膀胱癌细胞中乙二醛酶I的活性始终比大多数其他正常或肿瘤细胞高8倍或以上，但该肿瘤细胞中乙二醛酶II的活性却低。高度表达乙二醛酶I的活性可以提供补偿解毒的机理，因为肿瘤细胞旺盛的代谢所需能源严重依赖糖的分解，由此而产生额外的大量的甲基乙二醛。事实上，前列腺癌细胞对外源性的甲基乙二醛的毒性特别敏感，可能是由程序死亡的结果引起。因此，前列腺肿瘤可能对抑制乙二醛酶系统反应特别敏感。另一研究表明，乙二醛酶I的浓度在肺癌细胞里也类似于在前列腺肿瘤细胞中的高度表达。乙二醛酶I竞争性抑制剂(名称为BBGC)也能有效地抑制肺癌细胞的生长，对移植DMS114的小鼠在100mg/Kg的剂量下有显著的抑制效果，但没有明显毒副作用。如表2所示的7种肺癌细胞中，乙二醛酶I的表达水平越高，对其抑制剂也越敏感，即抑制所需的有效浓度也越低(Sakamotoetal,ClinicalCancerResearch,2001,7,2513)。这些研究结果表明，乙二醛酶I是治疗前列腺癌、肺癌、膀胱癌等肿瘤疾病的理想的耙标，乙二 醛酶I抑制剂可能成为治疗这类癌症的理想药物。表2.肺癌细胞中乙二醛酶I活性与对BBGC的敏感性a细胞用BBGC处理48小时.BBGC的IC50值用MTS法测得。数值为三次不同实验的平均值±标准偏差。2008年，日本理化学研究所HiroyukiOsada等证实乙二醛酶I抑制剂可以应用于骨质疏松症的治疗(PNAS,2008,vol.105,no.33,p11691-11695)。乙二醛酶I不可逆抑制剂的研发长期得不到突破，文献报导的不可逆抑制剂的亲和性很差，其Ki在0.1-0.3mM左右。技术实现要素：为解决上述问题，本发明公开了一种式Ⅰ所示的化合物及其药学上可接受的盐，其结构式如下：其中，芳环A上的R1-R5为C或杂原子，且芳环A上杂原子总数量不超过3个；R6表示无或连接在芳环A上的一个或一个以上吸电子或推电子的取代基；R7和R8同时为H或是同时为乙基；环B为取代或未取代的5-6元环，与芳环A在不同的位置拼合，同时环B上存在1个或者多个相同或者不同杂原子，杂原子可以是氮、氧、硫原子中的任意一个或多个，取代基为吸电子或推电子取代基。进一步优选地，所述芳环A为苯环，环B为噻唑环。进一步优选地，所述化合物如下所示：本发明还提供了化合物15的制备方法，它包括以下步骤：进一步优选地，它包括如下操作步骤：(1)(S)-3-氨基-2-(叔丁氧羰基氨基)丙酸与碳酸钾，氢氧化钾，氯甲酸苄酯在四氢呋喃和水的混合溶剂中，室温反应完全，得到反应液，经分离纯化得到化合物2；(2)化合物2与二环己基碳二亚胺，4-二甲氨基吡啶，叔丁醇加入到二氯甲烷中，室温反应完全，得到反应液，经分离纯化得到化合物3；(3)化合物3与钯碳加入到甲醇中，用氢气进行还原反应，经分离纯化得到化合物4；(4)Boc-L-谷氨酸-5-苄酯与烯丙基溴，N,N-二异丙基乙胺在甲苯中回流，得到反应液，经分离纯化得到化合物6；(5)化合物6在HCl/二氧六环中，于室温下反应完全，得到反应液；反应液除去溶剂，得到化合物7；(6)化合物4，化合物7，N,N’-羰基二咪唑与N-甲基吗啉在二氯甲烷中室温反应完全，得到反应液，经分离纯化得到化合物8；(7)化合物8，与四(三苯基膦)钯，吗啉在二氯甲烷中室温搅拌，薄层色谱监测反应完全，得到反应液，经分离纯化得到化合物9；(8)化合物9、甘氨酸叔丁酯盐酸盐、1-羟基苯并三唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-甲基吗啉在二氯甲烷中，于室温下反应完全，得到反应液；对反应液进行分离、纯化，得到化合物10；(9)化合物10与钯碳加入到甲醇中，用氢气进行还原反应，经分离纯化得到化合物11；(10)化合物12溶于丙酮和饱和氯化铵溶液中，然后加入锌粉，冰浴下反应完全，对反应液进行分离、纯化，得到化合物13；(11)化合物11、化合物13、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在二氯甲烷中反应完全，对反应液进行分离、纯化，得到化合物14；(12)化合物14在二氯甲烷中，加入三氟乙酸反应完全，对反应液进行分离、纯化，得到化合物15。进一步优选地，步骤(7)的反应是在氮气环境下反应的；步骤(11)的反应是在氮气环境下冰浴反应的；步骤(12)的反应是在氮气环境下冰浴进行的。本发明还提供了一种化合物15DE的制备方法，它包括以下步骤进一步优选地，它包括如下操作步骤：(1)化合物2与碘乙烷，碳酸钾，加入到N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌得到反应液，经分离纯化得到化合物16；(2)化合物16与钯碳加入到乙醇中，用氢气进行还原反应，经分离纯化得到化合物17；(3)化合物17，化合物7，N,N’-羰基二咪唑与N-甲基吗啉在二氯甲烷中室温搅拌过夜，得到反应液，经分离纯化得到化合物18；(4)化合物18，与四(三苯基膦)钯，吗啉在二氯甲烷中室温搅拌，薄层色谱监测反应完全，得到反应液，经分离纯化得到化合物19；(5)化合物19、甘氨酸乙酯盐酸盐、1-羟基苯并三唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-甲基吗啉在二氯甲烷中，于室温下反应完全，得到反应液；对反应液进行分离、纯化，得到化合物20；(6)化合物20与钯碳加入到甲醇中，用氢气进行还原反应，经分离纯化得到化合物21；(7)化合物21、化合物13、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在二氯甲烷中搅拌5小时，对反应液进行分离、纯化，得到化合物22；(8)化合物22在二氯甲烷中，加入三氟乙酸，搅拌2小时，对反应液进行分离、纯化，得到化合物15DE。进一步优选地，步骤(4)的反应是在氮气环境下反应的；步骤(7)的反应是在氮气环境下冰浴反应的；步骤(8)的反应是在氮气环境下冰浴进行的。本发明还提供了所述化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗细胞增殖疾病以及骨质疏松症的药物中的用途。进一步优选地，所述药物是乙二醛酶I抑制剂。进一步优选地，所述药物是乙二醛酶I不可逆抑制剂类药物。进一步优选地，所述细胞增殖疾病为癌症。进一步优选地，所述癌症为前列腺癌、肺癌、肠癌、膀胱癌、白血病、乳腺癌、皮肤癌等恶性肿瘤以及复发的各种肿瘤。本发明还提供了所述抑制剂在制备通过不可逆抑制乙二醛酶I抑制肿瘤生长的药物中的应用。进一步地所述抑制肿瘤生长药物包括抗前列腺癌、肺癌、肠癌、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、皮肤癌、白血病恶性肿瘤的药物。优选作为治疗前列腺癌、肺癌、膀胱癌等肿瘤疾病的药物。进一步地，所述药物是乙二醛酶I抑制剂。进一步地，所述药物是乙二醛酶I不可逆抑制剂。本发明还提出了所述乙二醛酶I抑制剂在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。本发明所述药物是注射剂、冻干粉针、片剂、胶囊剂、栓剂、纳米制剂、脂质体。本发明还公开了一种药物组合物，其含有治疗有效量的本发明乙二醛酶I抑制剂和药学上可接受的载体。本发明所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，稀释剂、赋形剂如水等，或粘合剂如纤维素衍生物、明胶等，或填充剂如淀粉等，崩裂剂如碳酸钙等，或其他辅助剂量如香味剂等。所述药物组合物可采用医学领域常规的方法，将本发明乙二醛酶I抑制剂作为活性成分，与药学上可接受的载体制成各种剂型。如制备成固体制剂如片剂、粉剂、胶囊等，用于口服；制成注射液，用于注射。在各种制剂中，活性成分的重量含量可以为0.1％－99.9％。药物组合物可以通过静脉注射、皮下注射、口服方式给药，剂量可依患者的年龄、病情等进行调整。本发明还提供了一种冻干粉针剂，它是以所述的化合物及其药学上可接受的盐作为活性成分，加上药学上可以接受的辅料或辅助性成分制备而成的 冻干粉针剂。以下是本发明中常见的缩写：DMF：N,N-二甲基甲酰胺；TLC：薄层色谱；DCM：二氯甲烷；HOBt：1-羟基苯并三唑；EDC：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；NMM：N-甲基吗啉；TFA：三氟乙酸；CDI：N,N'-羰基二咪唑；DCC：二环己基碳二亚胺；DMAP：4-二甲氨基吡啶；THF:四氢呋喃。综上所述，本发明的化合物可以作为乙二醛酶Ⅰ不可逆抑制剂，对恶性肿瘤具有良好的治疗作用，该类抑制剂的制备方法简便，成本低廉，具有良好的应用前景。同时，它不依赖于细胞的分裂与分化，而是作用于乙二醛酶系统从而引起肿瘤细胞的程序死亡，可大大降低毒副作用。另外，其作用机理是不可逆抑制，所以具有体内药效更加持久等优点。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。具体实施方式本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。实施例1本发明化合物15的制备合成路线如下：具体合成工艺如下：化合物2的制备将化合物1(10.00g,49.02mmol),碳酸钾(13.53g,98.04mmol)and氢氧化钾(2.75g,49.02mmol)溶于THF(90mL)和water(30mL)的混合溶剂中,冰浴下搅拌，加入苯甲氧羰酰琥珀酰亚胺(18.3g,73.53mmol)。加完后自然升至室温反应8小时。减压浓缩除去THF,水层用乙醚萃取，分液，水层用柠檬酸酸化到PH＝4，析出沉淀，二氯甲烷萃取。合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到淡黄色油状化合物2(15.57g,收率为94％)，直接用于下一步。化合物3的制备将DCC(9.78g,47.34mmol)，DMAP(0.29g,5mol％)和叔丁醇(17.54g,0.24mol)加入到200mL二氯甲烷中，电磁搅拌，冰水冷却下将化合物2(16.00g,47.34mmol；)用二氯甲烷(100mL)溶解后滴加到反应液中，自然升至室温过夜。反应结束后，过滤除去析出的沉淀，滤液分别用10％的柠檬酸溶液和饱和碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干溶剂后，用层析柱分离纯化，得无色油状物3(15.67g，收率为84％)。ESI-MSm/z：395.2[M+H]+。化合物4的制备将化合物3(5.0g，12.7mmol)溶解于甲醇(50mL)中，再加入Pd/C(0.5g,10％m)，抽真空，用氮气置换三次，然后用氮气/氢气置换三次，通入氢气后在室温下反应过夜。反应结束后，将反应液过滤，减压蒸干溶剂得无色油状4(3.1g,收率为94％)。直接用于下一步。化合物6的制备将化合物5Boc-L-谷氨酸-5-苄酯(3.0g,8.9mmol),DIPEA(3.1mL,17.80mmol)和烯丙基溴(3.87mL,44.51mmol)在甲苯中回流4小时，冷却后，减压出去甲苯，残留物溶于乙酸乙酯，分别用10％柠檬酸溶液，5％碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，用层析柱分离纯化，得淡黄色固体6(3.1g，收率为92％)。ESI-MSm/z：378.2(M+H)+。化合物7的制备冰浴下，反应瓶中加入化合物6(8.0g,21.2mmol)和HCl/二氧六环(160mL,4mol/L)。移除冰浴，室温下搅拌20min，TLC检测反应完全。室温高真空下，减压出溶剂，加入乙醚，得白色固体7(6.4g,收率为99％)。直接用于下一步。ESI-MSm/z：278.2(M+H)+。化合物8的制备将CDI(1.14g,7mmol)溶于DCM(20mL)中，氮气保护下，冰浴降温至0度，5分钟后，向上述溶液中滴加化合物7(1.99g,6.36mmol)和NMM(1.74mL，16mmol)的二氯甲烷(20mL)混合液；得到的混合物再冰浴下搅拌20分钟后，滴加化合物4(2.5g,9.56mmol)和NMM(1.74mL，16mmol)的二氯甲烷(20mL)混合液，滴加完成后，慢慢升到室温反应过夜，分别用10％柠檬酸溶液，食盐水洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，用层析柱分离纯化，得淡黄色油状8(3g，收率为84％)。ESI-MSm/z：564.2(M+H)+。化合物9的制备氮气保护下，向化合物8(1g,1.77mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液中，加入四(三苯基膦)钯(0.20g,10％mol)，然后将吗啉(1.58mL,17.76mmol) 滴加到上述混合物中。TLC监测反应完全后，减压出去溶剂，残留物溶于乙酸乙酯中，分别用1NHCl和水洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到淡黄色油状9(0.83g,收率为90％)，直接用于下一步反应。化合物10的制备氮气保护冰浴下，将化合物9(0.53g,1.01mmol),甘氨酸叔丁酯盐酸盐(0.59g,3.55mmol),HOBt(0.29g,2.13mmol),EDC(0.41g,2.13mmol)和NMM(0.58mL,5.33mmol)和加入到二氯甲烷(300mL)中，自然升至室温搅拌12h。将反应液被倒入水中，有机相依次用10％柠檬酸水溶液，饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水洗涤，有机层经无水硫酸钠干燥后过滤。滤液减压蒸干溶剂，将残留物用柱层析法分离提纯，得纯品无色油状物10(0.85g,收率为76％)。ESI-MSm/z：637.2(M+H)+。化合物11的制备将化合物10(0.60g,0.94mmol)溶解于甲醇(20mL)中，再加入Pd/C(0.1g,10％m)，抽真空，用氮气置换三次，然后用氮气/氢气置换三次，通入氢气后在室温下反应过夜。反应结束后，将反应液过滤，减压蒸干溶剂得白色固体11(0.45g,收率为87％)。化合物13的制备冰浴下，将化合物12(2g,11.1mmol)用50mL丙酮溶解至澄清,加入6mL饱和氯化铵水溶液，有白色颗粒固体析出，加纯净水至反应液再次澄清，锌粉(3.6g，0.05mol)分三次加入到圆底烧瓶中。冰浴下强力搅拌20-40min，TLC检测原料反应完全后停止反应。过滤，室温减压出丙酮，得水相悬浊液。水相用乙醚萃取三次，有机相用无水硫酸镁干燥。减压出乙醚得红色粗品化合物13(1.2g,收率为66％)。ESI-MSm/z:167.0(M+H)+；1HNMR(400MHz,CD3Cl3)δ:8.84(s,1H),8.01(d,J＝6.8Hz,1H),7.66(s,1H),7.10(d,J＝7.2Hz,1H)。化合物14的制备氮气保护冰浴下，化合物13(0.5g，3.0mmol)，化合物11(1.6g，3.0mmol)，EDC(1.6g，9.0mmol),20mL二氯甲烷加入到100mL圆底烧瓶中，搅拌反应5小时，LC-MS检测原料基本反应完全后停止反应。减压浓缩，粗品用HPLC纯化，得棕黑色固体14(1.2g,收率为83％)。ESI-HRMSm/z:717.2898(M+Na)+；1HNMR(400MHz,CD3OD)δ:9.22(s,1H),8.35(s,1H),8.06(d,J＝8.8Hz,1H),7.85(s,1H),4.32-4.35(m,1H),4.13-4.18(m,1H),3.94(dd,J＝17.6,32.8Hz,2H),3.56-3.60(m,1H),3.37-3.42(m,1H),2.79-2.88(m,2H),2.17-2.21(m,1H), 1.98-2.03(m,1H),1.43(s,18H)，1.38(s,9H)。化合物15的制备氮气保护冰浴下，14(50mg,0.07mmol)用2mL二氯甲烷溶解，加入1mL三氟乙酸，冰浴下搅拌20min，LC-MS检测原料基本反应完全后停止反应。减压浓缩，粗品用制备型HPLC分离制备，得棕黑色固体15(28mg,收率为82％)。ESI-HRMSm/z:483.1285(M+H)+；1HNMR(400MHz,CD3OD)δ:9.23(s,1H),8.35(s,1H),8.05(d,J＝8.8Hz,1H),7.86(s,1H),4.33-4.36(m,1H),4.14-4.17(m,1H),3.94(dd,J＝17.6,34.8Hz,2H),3.55-3.60(m,1H),3.36-3.41(m,1H),2.81-2.89(m,2H),2.17-2.22(m,1H),1.97-2.04(m,1H)。实施例2本发明化合物15DE的制备化合物16的制备在冰浴下，将化合物2(5g,14.79mmol)和碳酸钾(3.06g,22.19mmol)溶解于DMF(50mL)中，电磁搅拌，向反应瓶中滴加碘乙烷(3.45g,22.19mmol),加完后自然升至室温反应5h，TLC监测反应完全。将反应液到水(300mL)中，用乙酸乙酯(300mL×2)萃取，合并有机相，有机相用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥后过滤，减压蒸干有机溶剂，将残留物乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂搅拌分散均匀后，过滤，得浅黄色固体16(4.8 g，收率为88％)。ESI-MSm/z:389.2(M+Na)+；化合物17的制备将化合物16(4g,10.93mmol)溶解于乙醇(50mL)中，再加入Pd/C(0.5g,10％m)，抽真空，用氮气置换三次，然后用氮气/氢气置换三次，通入氢气后在室温下反应过夜。反应结束后，将反应液过滤，减压蒸干溶剂得无色油状17(2.4g,收率为94％)。直接用于下一步。化合物18的制备将CDI(1.14g,7mmol)溶于DCM(20mL)中，氮气保护下，冰浴降温至0度，5分钟后，向上述溶液中滴加化合物7(1.76g,6.36mmol)和NMM(1.74mL，16mmol)的二氯甲烷(20mL)混合液；得到的混合物再冰浴下搅拌20分钟后，滴加化合物17(2.3g,9.56mmol)和NMM(1.74mL，16mmol)的二氯甲烷(20mL)混合液，滴加完成后，慢慢升到室温反应过夜，分别用10％柠檬酸溶液，食盐水洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，用层析柱分离纯化，得淡黄色油状18(2.9g，收率为85％)。ESI-MSm/z：558.2(M+Na)+。化合物19的制备氮气保护下，向化合物18(0.95g,1.77mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液中，加入四(三苯基膦)钯(0.20g,10％mol)，然后将吗啉(1.58mL,17.76mmol)滴加到上述混合物中。TLC监测反应完全后，减压出去溶剂，残留物溶于乙酸乙酯中，分别用1NHCl和水洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到淡黄色油状19(0.83g,收率为95％)，直接用于下一步反应。化合物20的制备氮气保护冰浴下，将化合物19(0.5g,1.01mmol),甘氨酸乙酯盐酸盐(0.5g,3.55mmol),HOBt(0.29g,2.13mmol),EDC(0.41g,2.13mmol)和NMM(0.58mL,5.33mmol)加入到二氯甲烷(300mL)中，自然升至室温搅拌12h。将反应液被倒入水中，有机相依次用10％柠檬酸水溶液，饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水洗涤，有机层经无水硫酸钠干燥后过滤。滤液减压蒸干溶剂，将残留物用柱层析法分离提纯，得纯品无色油状物20(0.5g,收率为80％)。ESI-MSm/z：603.2(M+Na)+。化合物21的制备将化合物20(0.55g,0.94mmol)溶解于甲醇(20mL)中，再加入Pd/C(0.1g,10％m)，抽真空，用氮气置换三次，然后用氮气/氢气置换三次，通入氢气后在室温下反应过夜。反应结束后，将反应液过滤，减压蒸干溶剂得白色固体21(0.41g,收率为90％)。ESI-MSm/z：513.2(M+Na)+。化合物22的制备氮气保护冰浴下，化合物13(0.5g，3.0mmol)，化合物21(1.47g，3.0mmol)，EDC(1.6g，9.0mmol),20mL二氯甲烷加入到100mL圆底烧瓶中，搅拌反应5小时，LC-MS检测原料基本反应完全后停止反应。减压浓缩，粗品用HPLC纯化，得棕黑色固体22(1.1g,收率57％)。ESI-HRMSm/z:661.2283(M+Na)+；1HNMR(400MHz,CD3OD)δ:9.23(s,1H),8.35(s,1H),8.05(d,J＝8.8Hz,1H),7.85(s,1H),4.35(brs,1H),4.14-4.20(m,5H),3.94(dd,J＝17.6,32.8Hz,2H),3.54-3.59(m,1H),3.34-33.41(m,1H),2.80-2.90(m,2H),2.17-2.21(m,1H),1.98-2.02(m,1H),1.42(s,9H)。1.24-1.28(m,6H)。化合物15DE的制备氮气保护冰浴下，化合物22(76mg,0.12mmol)用2mL二氯甲烷溶解，加入1mL三氟乙酸，冰浴下搅拌20min，LC-MS检测原料基本反应完全后停止反应。减压浓缩，粗品用制备型HPLC分离制备，得棕黑色固体15DE(54mg,收率84％)。ESI-HRMSm/z:539.1935(M+H)+；1HNMR(400MHz,CD3OD)δ:9.24(s,1H),8.35(s,1H),8.06(d,J＝8.8Hz,1H),7.85(s,1H),4.27-4.34(m,3H),4.17(q,J＝7.2,14Hz,2H),4.11-4.13(m,1H),3.94(dd,J＝17.6,36.4Hz,2H),3.59-3.71(m,2H),2.81-2.86(m,2H),2.20-2.25(m,1H),2.00-2.05(m,1H),1.25-1.34(m,6H)。实施例3.本发明乙二醛酶I抑制剂冻干粉针剂的制备本发明乙二醛酶I抑制剂冻干粉针剂的制备过程包括以下步骤：1)添加冻干支持剂与助溶剂：调节药液pH值至4～9，添加乙二醛酶I抑制剂一半重量的冻干支持剂甘露醇。助溶剂为注射用β-羟甲基环糊精，加入量为与乙二醛酶I抑制剂等量。乙二醛酶I抑制剂和冻干支持剂甘露醇的重量比为6∶1～3∶1。冻干支持剂选自甘露醇、木糖醇、山梨醇、氯化钠和右旋糖酐中的一种或任意两种的混合；乙二醛酶I抑制剂和β-羟甲基环糊精的重量比为10∶1～1∶1。2)除热原：加入0.1％(W/V)针剂用活性炭，在70℃下保温20分钟，过滤，加入注射用水调整药液浓度，用无菌0.45μM滤膜过滤。适宜的保温温度为40℃～100℃下保温5～30分钟。合适的针剂用活性炭质量体积百分比为0.01～0.5％(W/V)。3)冻干：将上述样品于冷冻干燥机内预冻，于-50℃深冻，同时开启真空，在20小时内，将温度升至-5℃，再用5小时，将温度升至40℃，继续保持真空5小时，即得乙二醛酶I抑制剂冻干粉针剂。上述冻干过程中适用的操作条件为，于-55～-40℃深冻，开启真空后，在5～30小时内，将温度升至-25～-5℃，再用1～10小时，将温度升至10～60℃，继续保持真空1～10小时，制得乙二醛酶I抑制剂冻干粉针剂。以下用试验例的方式说明本发明的有益效果。试验例1本发明化合物的乙二醛酶I抑制活性1、试验方法在含有酶(10单位/毫升)和不同浓度不可逆抑制剂的磷酸缓冲液放入各塑料试管管中，在25℃的水浴里温育。随时间连续采样,将各样品加到含有1.0毫升谷胱甘肽-甲基乙二醛-硫代半缩醛溶液(由谷胱甘肽和甲基乙二醛缩合而成)的比色皿中,检测反应产物在240纳米的吸光度随时间变化的速率.从产物的起始速率,可以计算酶的催化活性。从剩余酶活性的对数值随时间的改变的斜率,可以计算人体乙二醛酶失活表观一级速率常数(kinact)。从该速率常数随抑制剂浓度变化的曲线,可以计算抑制剂和酶的解离常数(Kd)及kinact的最大值。2、试验结果化合物15在含20％甘油的pH7的25℃磷酸钠缓冲溶液中，不可逆地抑制人体乙二醛酶I的活性。经计算，本发明化合物的抑制常数Kd如下表3所示表3.本发明化合物的乙二醛酶I抑制活性化合物编号乙二醛酶I抑制活性Kda(nM)15120a数值为二次不同实验的平均值。以上试验表明，本发明的化合物在含20％甘油的pH＝7的25℃磷酸钠缓冲溶液中，不可逆地抑制人体乙二醛酶I的活性，证明本发明的化合物为乙二醛酶I不可逆抑制剂。试验例2本发明化合物的体外肿瘤细胞增殖抑制试验1、试验方法首先，用ATP法测定本发明乙二醛酶I不可逆抑制剂化合物的细胞毒性。将前列腺癌NCI-H660细胞调整合适的细胞密度，以每孔140μL细胞悬液接种96孔板，每种细胞的接种密度为：2000-6000个。将上述细胞培养板在培养箱中放置24小时使其完全附着在孔壁上，采用三倍稀释法使乙二醛酶I 抑制剂在孔中的最终浓度达到：100μM、33.3μM、11.1μM、3.70μM、1.23μM、0.41μM、0.14μM、0.046μM、0.015μM。每个浓度加入三复孔。37℃培养箱中孵育72小时后，每孔加入75μLCellTiterGlo裂解液，然后再振板机上混匀2分钟，诱导细胞溶解，将96孔板在室温中避光放置10分钟，使其发光信号稳定，将每孔100μL的混合液转移至新的96孔白板，使用EnVision读取luminescence信号。使用Excel计算每个药物浓度对细胞增殖的抑制率，然后使用Excel的插件XLFit软件进行拟合做出抑制曲线图并计算相应参数。2、试验结果试验结果表明，所测得的IC50范围均在0.01μM-3000μM之间，其中，本发明化合物15DE对NCI-H660细胞的IC50为6.2μM，此时阳性对照CHG二乙酯化合物的IC50为90.5μM，证明本发明化合物具有肿瘤细胞生长抑制作用。试验例3本发明化合物的体内前列腺癌皮下异种移植增殖抑制试验本试验例以化合物15DE作为乙二醛酶I抑制剂进行试验，评估其在C57BL/6(Es-1c)裸鼠皮下移植人源前列腺癌NCI-H660细胞的生长抑制效果。1、试验方法首先，静脉注射最大耐受剂量药物测定其血浆药代动力学特性，组织分布试验可以同时完成，包括测定在肝、肾、胰腺、心、肺、肿瘤细胞与骨髓等中抑制剂的浓度与代谢产物。给药方式一般采用静脉注射的方式，除非生物利用度试验结果显示其他给药方式(如腹腔注射)也可以达到良好的吸收效果。药代动力学结果显示，在肿瘤细胞中抑制剂的浓度可以达到满意的浓度时，抑制剂的抑制试验开始进行。即使肿瘤的体积保持在％T/C50％或以下的药物剂量组。2、试验指标试验指标是考察肿瘤生长是否可以被抑制、延缓或治愈。每周两次或隔天用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。乙二醛酶I抑制剂的抑瘤疗效(TGI)用T-C(天)和T/C(％)评价。T-C(天)反映肿瘤生长延迟指标，T表示用药组肿瘤达到预先设定体积(如1,000mm3)所用的平均天数，C表示对照组肿瘤达到相同体积所用的平均天数。T/C(％)的百分比值反映肿瘤生长抑制率，T和C分别表示给药组和对照组的瘤重(瘤体积)。T/C％≤42％，认为此药有效；T/C％≤10％，认为此药极有效。3、数据分析T检验用于两组间比较。三组或多组间比较用one-wayANOVA。如果F值有显著性差异，应在ANOVA分析之后再进行多重比较。two-wayANOVA用于分析联合给药组潜在的协同作用。用SPSS17.0进行所有数据分析。p<0.05认为有显著性差异。4、试验结果乙二醛酶I抑制剂的给药剂量为0.1mg/Kg-100mg/Kg之间，mAH二乙酯化合物在5mg/Kg的情况下，每日给药一次，连续给药两个星期后，检测肿瘤的体积。检测结果表明，T/C(％)为6.0％。本试验例中用15DE在5mg/Kg的情况下进行实验，检测结果显示T/C(％)为7.6％。以上结果表明，本发明的化合物确有体内肿瘤抑制效果，可作为抗肿瘤药物应用。试验例4本发明化合物的药代动力学雌性C57BL/6(Es-1c)裸鼠单剂量静脉受试乙二醛酶I抑制剂后，用液相色谱串联质谱法定量测定其在主要组织中的浓度及血药浓度，考察受试药物在雌性C57BL/6(Es-1c)裸鼠体内血液与主要组织中的分布差异。1、试验方法雌性C57BL/6(Es-1c)裸鼠，体重18-25g，6-8周龄，另外，3只雌性C57BL/6(Es-1c)裸鼠用于采集空白样品，配制分析所需的标准曲线。静脉注射乙二醛酶I抑制剂给药剂量为1mg/kg，给药体积均为5mL/kg。静脉注射给药溶媒:DMSO:SolutolHS15:Saline＝5:5:90,v/v/v。建立LC-MS/MS方法，用内标法定量测定受试药物血药浓度及组织浓度，线性范围1-1000ng/mL，定量下限范围一般为1ng/mL。雌性C57BL/6(Es-1c)裸鼠经静脉注射乙二醛酶I抑制剂给药后在0.25,2,8和24hr单次从小鼠尾静脉采集全血约20μL，用K2EDTA抗凝，按照体积比加入3倍的重蒸水得到稀释后的血样，保存于-70℃中直至分析。同时采集心，肝，脾，肺，肾，胃，小肠，胰腺等组织样品，用生理盐水洗净，滤纸吸干后称重并记录，然后保存于-70℃中直至分析。将称重过的脏器组织解冻后，心，肝，脾，肺，肾，胃，小肠，胰腺加入3倍PBS缓冲盐用Beadbeater匀浆；骨髓样品采集时采用0.3mL的PBS缓冲盐冲洗，然后12000转离心5分钟，移去0.25mL上清液，剩余的细胞样品加入150mlPBS缓冲盐匀浆。2、数据分析采用WinNonlin(版本6.2)软件，按非房室模型计算药动学参数(CL,Vss,t1/2,AUC,MRTINF等)。3、试验结果本试验例以化合物15DE作为乙二醛酶I抑制剂进行试验，检测结果显示t1/2是70分钟。试验例5本发明化合物对假膜组织细胞介导的骨溶解的抑制作用1、试验方法采用酶消化法从假膜组织中分离细胞，应用免疫磁珠法将细胞分离成CD14+和CD14-。将CD14+细胞分为2组，其中A组培养液中加入M-CSF(30ng/mL)+RANKL(50ng/mL)，B组培养液中加入M-CSF(30ng/mL)+RANKL(50ng/mL)+乙二醛酶I抑制剂(不同浓度的乙二醛酶I抑制剂，其最终浓度达到：100μM、50μM、30μM、15μM、10μM、5μM、1μM、0.5μM，于培养开始时加入)。细胞分别接种于玻璃盖玻片(培养10天)及皮质骨磨片(培养14天)上，培养结束后检测骨吸收陷窝的形成，以骨吸收陷窝面积为指标比较本发明乙二醛酶I抑制剂的骨吸收抑制活性(IC50)。2、试验结果CD14+细胞(A组)在皮质骨磨片上形成骨吸收陷窝(面积为10.10％±1.38％)；于培养开始时加入乙二醛酶I抑制剂(B组)，根据骨吸收陷窝的面积减少，测算出乙二醛酶I抑制剂的骨吸收抑制活性(IC50)。所测得的IC50范围均在0.1μM-500μM之间，其中，本发明化合物15DE的IC50为8.5μM，此时阳性对照CHG二乙酯化合物的IC50为68.5μM。证明本发明的化合物对假膜组织细胞介导的骨溶解的抑制作用，即具有骨吸收抑制活性，可应用于骨质疏松症的治疗。综上所述，本发明的化合物可以作为乙二醛酶Ⅰ不可逆抑制剂，对恶性肿瘤具有良好的治疗作用，该类抑制剂的制备方法简便，成本低廉，具有良好的应用前景。本发明抑制剂可以应用于治疗前列腺癌、肺癌、白血病、膀胱癌等各种肿瘤以及骨质疏松症等疾病的治疗。当前第1页1 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