本发明涉及微藻中天然活性物质的提取，具体涉及一种发状念珠藻胞外多糖的分离纯化方法，属于生物制备技术领域。
背景技术：
发状念珠藻，俗称发菜，隶属蓝藻门，念珠藻科，念珠藻属，是一种具有独特功能的可食用蓝藻，主要分布在分布于我国西北部干旱及半干旱地区。发菜生长过程中分泌一种胶状物质到胞外，以保护其细胞免受干旱和紫外线伤害，其主要成分为多糖。研究发现，发菜多糖是一种非硫酸化酸性多糖，由葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖四种中性单糖和葡萄糖醛酸组成。发菜多糖能阻断病毒对寄主细胞的吸附，阻止病毒在寄主细胞内的复制，对单纯疱疹病毒、流感病毒、人巨细胞病毒等多种具封套的病毒均具有抗病毒作用。另外，发菜多糖还具有清除自由基活性，抑制癌细胞生长，增强机体免疫调节能力等多种功能。
自2000年起，我国政府颁布规定，严禁发菜的采集和贸易。而液体悬浮培养不但可以有效提高发状念珠藻生长速率和胞外多糖产量，而且保护了野生发菜的资源和生态，因而逐渐引起人们的关注。苏振宏等人分别从发状念珠藻原植体和悬浮培养的发状念珠藻悬浮培养体系中分离纯化胞外聚合物，并初步检测胞外聚合物体外抗肝癌活性，结果表明二者对人肝癌细胞Hep生长均有抑制作用。于海峰等 人的《发状念珠藻胞外多糖的纯化与性质分析》文献报道液体悬浮培养发状念珠藻，从中提取的胞外多糖与野生发状念珠藻多糖在理化性质、单糖组成和热分解行为等方面具有高度相似性，展现出液体悬浮培养发状念珠藻胞外多糖可以代替野生发状念珠藻多糖的可贵前景。
目前液态深层发酵法生产发菜胞外多糖的粗制方法主要采用离心去除藻细胞，再对脱藻培养液进行减压蒸馏浓缩，再经乙醇沉淀后低温干燥。纯化方法包括Sevage法、透析膜法、超滤、离子交换柱层析、凝胶过滤层析一种或多种方法相结合，以去除蛋白质、色素和盐类等杂质。专利CN1220999A公开了一种适用于常见丝状蓝藻胞外多糖的提取分离方法，采用先离心去除藻细胞、再对脱藻培养液进行减压蒸馏浓缩的方法获得，然后依次经脱色、除蛋白和醇沉等步骤进行纯化。但该方法在处理大体积培养液时耗时长、效率低、成本高，不利于胞外多糖的规模化分离制备。专利CN101372668A公开了一种具有抗氧化活性的发菜细胞及发菜提取物的制备方法，将发菜细胞培养上清液超滤浓缩，采用截留分子量为10000的中空纤维膜超滤装置，对经预处理的上清液脱水浓缩并去除小分子物质。得到的浓缩液用3～5倍体积95％乙醇沉淀，3～5℃静置20～30h，离心得到沉淀即为发菜胞外多糖。该方法虽便捷，但制得的发菜多糖粗品纯度低。天津科技大学陈雪峰等人将培养液浓缩，乙醇沉淀，低温干燥制得发菜念珠藻胞外粗多糖，再采用Sevag法去除多糖中的蛋白质，利用DEAE-52纤维素柱和SephadexG-100凝胶柱层析法从中分离得到了一种酸性多糖。缺点是提取过程只适于实验室小型规模，不易大规模 操作。
技术实现要素：
本发明方法在处理大体积培养液时耗时短、效率高、成本低，有利于胞外多糖的规模化分离制备，并易于工业化放大，产品含量高，有较大的工业化应用价值。
本发明的方法包括以下步骤：
1、发状念珠藻细胞经液体发酵培养后，发酵液经陶瓷膜过滤除菌。所用陶瓷膜的孔径为500-1000nm，过滤温度≤35℃，过滤压力0.03～0.07MPa。
2、除菌后清液中加入一定量的活性炭和硅藻土处理脱色，所用活性炭为一种粉状竹炭，用量为0.5～2％(质量/体积)；硅藻土目数为100～200目，用量为0.1～0.5％(质量/体积)。处理温度为40℃，保温时间为0.5h。
3、板框过滤除去活性炭和硅藻土，所用滤布的孔径目数为200～500目，清液经大孔吸附树脂进一步脱色除杂；所用大孔吸附树脂为一种苯乙烯骨架的芳香族大孔吸附树脂SD 300、LS 840、LS 850、LS 860中的任意一种。
4、收集吸附后清液经超滤膜浓缩，在浓缩液中加入无水乙醇沉淀制得粗多糖；所用超滤膜截留分子量为10～50KD，操作压力0.3～0.6MPa，温度控制在35℃以下，加入乙醇的终浓度为60～80％。
5、粗多糖经水溶解后过阴离子离子交换树脂纯化，所用阴离子交换树脂为DEAE-陶瓷/琼脂糖凝胶、Q-陶瓷/琼脂糖凝胶、DEAE 52中的 任意一种。上柱流速为0.5～1.0BV，经0.5～2.0mol/L NaCl溶液解吸后，洗脱流速为0.5～2BV，解吸液进行真空低温浓缩，温度为40～～50℃，真空度为-0.08～-0.09MPa。
6、浓缩液加入无水乙醇使乙醇的终浓度为70～90％，再次进行沉淀，经苯酚-硫酸法检测，制得含量大于85％的发菜胞外多糖。
综上所述，本发明的优点在于：
1、针对发酵液的除菌操作，使用工业化更易于放大的陶瓷膜过滤代替离心、抽滤或压滤操作，提高了除菌效率，也降低了操作成本。
2、在进行大孔吸附树脂处理前，预先进行活性炭和硅藻土的脱色、脱蛋白处理，提高了大孔吸附树脂的吸附量，增加了树脂的使用效率，也在一定程度上减少了树脂的用量，降低了生产成本。
3、对于多糖浓度较低的大孔吸附树脂吸附液，使用超滤膜浓缩代替高能耗、高损失率的蒸汽浓缩，降低了多糖的损失，缩短了处理时间，进一步降低了处理成本。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明提供的方法进一步说明，但并不因此而限制本发明，还应包括：在不偏离本发明范围条件下，对公开的方案进行本领域技术人员显而易见各种改变。
实施例1
1、发状念珠藻细胞经液体发酵培养后，发酵液经陶瓷膜过滤除菌。所用陶瓷膜的孔径为500nm，过滤温度≤35℃，过滤压力0.07MPa。
2、除菌后清液中加入活性炭和硅藻土处理脱色，处理温度为40℃，保温时间为0.5h。所用活性炭为一种粉状竹炭，用量为0.5％(质量/体积)；硅藻土目数为100目，用量为0.1％(质量/体积)。
3、板框过滤除去活性炭和硅藻土，所用滤布的孔径目数为500目，清液经一种苯乙烯骨架的芳香族大孔吸附树脂SD 300进一步脱色除杂，上样流速为0.5BV，使用3-5％氢氧化钠溶液，2BV流速再生。
4、收集吸附后清液使用截留分子量为50KD超滤膜浓缩，操作压力0.3MPa，温度控制在35℃以下；在浓缩液中加入无水乙醇沉淀制得粗多糖，加入乙醇的终浓度为80％。
5、粗多糖经水溶解为浓度1g/L后过DEAE-陶瓷/琼脂糖凝胶阴离子离子交换树脂纯化。上柱流速为0.5BV，经0.5mol/L NaCl溶液解吸后，洗脱流速为1.0BV，解吸液进行真空低温浓缩，温度为40～50℃，真空度为-0.08～-0.09MPa。
6、在浓缩液中加入无水乙醇使乙醇的终浓度为80％，再次进行沉淀，经苯酚-硫酸法检测，制得含量89.5％的发菜胞外多糖。
实施例2
1、发状念珠藻细胞经液体发酵培养后，发酵液经陶瓷膜过滤除菌。所用陶瓷膜的孔径为500nm，过滤温度≤35℃，过滤压力0.06MPa。
2、除菌后清液中加入活性炭和硅藻土处理脱色，处理温度为40℃，保温时间为0.5h。所用活性炭为一种粉状竹炭，用量为1.0％(质量/体积)；硅藻土目数为200目，用量为0.3％(质量/体积)。
3、板框过滤除去活性炭和硅藻土，所用滤布的孔径目数为500目，清液经一种苯乙烯骨架的芳香族大孔吸附树脂LS 840进一步脱色除杂；上样流速为0.75BV，使用3-5％氢氧化钠溶液，2BV流速再生。
4、收集吸附后清液使用截留分子量为10KD超滤膜浓缩，在浓缩液中加入无水乙醇沉淀制得粗多糖；超滤操作压力0.4MPa，温度控制在35℃以下，加入乙醇的终浓度为80％。
5、粗多糖经水溶解为浓度1.5g/L后过Q-陶瓷/琼脂糖凝胶阴离子离子交换树脂纯化。上柱流速为0.5BV，经1.0mol/L NaCl溶液解吸后，洗脱流速为1.0BV，解吸液进行真空低温浓缩，温度为40～50℃，真空度为-0.08～-0.09MPa。
6、浓缩液加入无水乙醇使乙醇的终浓度为90％，再次进行沉淀，经苯酚-硫酸法检测，制得含量90.2％的发菜胞外多糖。