一种悬浮培养发菜糖蛋白的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体的说是一种悬浮培养发菜糖蛋白的制备方法。
【背景技术】
[0002]发菜(Ab1S1c /7<3职77//0/.??)，又名发状念珠藻，是一种能够在干旱地区良好生长的具有很高食用价值和药用价值的陆生海藻。发菜主要生长于石灰土壤或干旱草地等表面，在我国主要分布在西北部的干旱、半干旱荒漠草原地区。
[0003]发菜的营养价值很高，尤其是蛋白质的含量较高，每千克发菜中含蛋白质200?234.1克，还含有钙、铁等多种矿质元素及20多种微量元素。食用发菜对佝偻病、高血压、产后血亏等病症有治疗作用，还有通便利尿，清热解毒，愈合伤口等功效，并可使人体血脂及胆固醇含量降低。
[0004]糖蛋白是一类由糖类同多肽或蛋白质以共价键连接而成的结合蛋白。具有增强免疫调节功能，抑制肿瘤作用，降血脂、降血糖、抗氧化、防疲劳、延缓人体器官的老化速度，以及具有免疫作用、分子、细胞识别等功能。研宄表明，发菜中的活性糖蛋白具有很好的医疗保健功效，具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、提高免疫力等活性。目前，野生发菜资源匮乏，在一定条件下限制了发菜营养成分的获取。因此，研宄一种操作简单、提取率高的从发菜中提取发菜糖蛋白的方法实为必要。
【发明内容】
[0005]本发明的目的为:提供一种简单、快速、提取率高的从人工悬浮培养的发菜中提取发菜糖蛋白的方法，来提高发菜的利用价值。
[0006]本发明为解决上述技术问题，所采用的技术方案是:一种悬浮培养发菜糖蛋白的制备方法，制备步骤为:
步骤一、在无菌条件下，取活化后的发菜细胞种，置于液体培养基中进行培养18~22天，然后，将得到的发菜培养液以4000r/min的转速进行离心分离8~12min，收集离心分离后得到的上层发菜细胞，转置于培养瓶内的新鲜液体培养基中，将培养瓶放置在温度为25°C的恒温生化培养箱中，控制箱内光照强度为4000Lux，培养28~32天；
步骤二、将步骤一的培养物采用滤纸进行过滤，取滤液，得到去除藻体的培养液；步骤三、按体积比为9:1的比例，取步骤二得到的培养液和NaCl摩尔浓度为0-0.25mol/L的浸提液置于锥形瓶中，充分摇匀混合后，转置于超声波震荡器内进行超声处理15~25min，然后，将得到的混合液置于温度为30~80°C的水浴锅内进行加热l~6h，之后，对混合液进行过滤，所得滤液即为发菜糖蛋白混合溶液；
步骤四、将步骤三得到的发菜糖蛋白混合溶液置于旋转蒸发器中进行减压蒸发浓缩，控制减压浓缩时的温度为45~55°C，直至溶液体积为原体积的1/4，即得到糖蛋白样品液；按体积比为1:4的比例，取糖蛋白样品液和Sevage试剂，充分震荡混合后得到下层含有凝胶沉淀的混合溶液，除去混合溶液中上下两层交界处的变性蛋白，之后，在4°C条件下静置10~20h，取混合溶液中的上层液，备用；
步骤五:分5次向步骤四得到的上层液中加入无水乙醇，使每次加入后混合溶液中乙醇的质量浓度分别为50%、60%、70%、80%和90%，且每次无水乙醇加入后均需将混合溶液置于4°C条件下静置沉淀10~15h，收集每次静置后得到的下层沉淀物，合并后备用；
步骤六:将步骤五收集到的沉淀物分别采用丙酮和乙醚各洗涤2~3次，然后，按照每克沉淀物加入l~3mL蒸馏水的比例进行复溶，之后，采用透析袋对复溶后的溶液进行透析脱盐处理68~76h，然后，对处理后的溶液进行冷冻干燥，得到发菜糖蛋白粗品；
步骤七、按照0.2g:5mL的比例，将步骤六得到的发菜糖蛋白粗品溶解于去离子水中，然后用孔径为0.45 μ m的膜对溶液进行过滤，之后，将得到的滤液上样于DEAE-52纤维素阴离子交换柱进行分离纯化，并依次用摩尔浓度为0.05 mol/L、0.lmol/L和0.5mol/L的NaHCCV^液对交换柱进行阶段性洗脱，每次洗脱的时间为120min，之后，采用紫外吸收法在波长为280nm处对发菜糖蛋白溶液的出峰位置进行检测，并分别收集其第一吸收峰、第二吸收峰和第四吸收峰的发菜糖蛋白溶液，之后，对收集到的发菜糖蛋白溶液分别进行冷冻干燥，即得到不同分子量的发菜糖蛋白纯品。
[0007]所述步骤一中的液体培养基为BG-1I培养基。
[0008]所述步骤三中的浸提液为摩尔浓度为0.08mol/L的NaCl溶液。
[0009]所述步骤三中超声波震荡器的功率为500W。
[0010]所述步骤四中所用的透析袋为3500Da透析袋。
[0011]本发明的有益效果是:
1、本发明提供了一种操作简便、提取率高的悬浮培养发菜糖蛋白的制备方法，采用悬浮培养发菜细胞，结合超声振荡、水浴加热等辅助浸提方式制得发菜糖蛋白混合溶液，再进行减压蒸发、Sevage法脱蛋白、膜过滤、交换柱分离纯化洗脱等步骤高效、快速的制得了发菜糖蛋白纯品。提取出来的糖蛋白品质好、药用价值高，具有很好的医疗保健功效，有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、提高免疫力等活性。并且此糖蛋白涉及细胞的定向归巢、糖蛋白毒素及激素作用机制，可使药物选择性地集中到病灶，提高药效，而不影响正常组织的生长和免疫系统的功能，降低不良反应，具有极高的医用价值。
[0012]2、本发明提供了一种悬浮培养发菜糖蛋白的制备方法，Sevage法脱蛋白一次，并长时间静置能够有效去除游离蛋白质，避免了脱蛋白次数过多导致的糖蛋白损失；超滤选用3500Da的滤膜，在脱盐的同时，也可以去除其他低聚肽和氨基酸等物质；用NaHCCV^液洗脱可置换出被纤维素上阳离子基团吸附的带负电荷的糖蛋白，且分别用0.05mol/L、
0.lmol/L和0.5mol/L的NaHCO3S液进行阶段性洗脱，随着洗脱溶液浓度的升高，HCO 3_浓度及溶液的PH都升高，这对洗脱糖蛋白更快捷、有利。
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明:
在发菜糖蛋白的提取过程中:首先用制备的BG-1l培养基悬浮培养发菜，过滤去藻体，然后配置0~0.25mol/L的Nacl浸提液，与去除藻体的培养液按照1:9的比例混合于锥形瓶中，摇匀后首先进行超声波辅助提取20min，再置于水浴锅中于30°C~80°C下热水浸提l~6h，最后滤纸过滤，上清液即为糖蛋白混合溶液；随后采取Sevage法和乙醇分级沉淀法，用有机溶剂洗涤，透析干燥得到粗纯品；对于粗纯品过滤膜，上DEAE-52纤维素阴离子交换柱进行分离纯化，用NaHCO3溶液进行洗脱，在280nm处采用紫外吸收法检测糖蛋白的出峰位置，冷冻干燥，得到不同分子量的发菜糖蛋白纯品。
[0014]所述悬浮培养发菜糖蛋白的制备方法，包括以下步骤:
步骤一、悬浮培养发菜
无菌条件下从发菜固体培养基上挑取发菜细胞于BG-1l液体培养基中进行培养，每20d为一个周期；在最初培养20d后，4000r/min离心lOmin，然后收集细胞悬浮于新鲜无菌的BG-1l培养基中，于生化培养箱中在25°C和40001x光照强度条件下进行扩大培养；步骤二、过滤去藻体
将发菜培养液经滤纸过滤，藻体留在滤纸上，得到去除藻体的培养液；
步骤三、发菜糖蛋白的提取
步骤A、将步骤二得到的培养液与Nacl浓度为0.08mol/L的浸提液按9:1的比例混合于锥形瓶中摇匀；
步骤B、将步骤A中锥形瓶的混合液在超声功率为500W的条件下，进行超声波辅助提取20min ；
步骤C、再将步骤B中的混合液置于水浴锅中，在温度为72~77°C下浸提4.27h ;
步骤D、最后用滤纸过滤步骤C浸提后的溶液，得到的上清液即为发菜糖蛋白混合溶液；
步骤四、发菜糖蛋白的粗纯化
步骤①:将步骤三得到的发菜糖蛋白溶液减压浓缩至原体积的四分之一，得到糖蛋白样品液，用Sevage法将糖蛋白样品液与Sevage试剂(Sevage试剂由氯仿与正丁醇按5:1的比例混合而成)比例为1:4除去糖蛋白样品中的游离蛋白，脱蛋白一次，4°C静置过夜，弃下层游离蛋白层；
步骤②:收集步骤①中的上层糖蛋白溶液，依次加入无水乙醇，分别在乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%时于4°C沉淀12h，最后收集各乙醇浓度下得到的沉淀；
步骤③:将步骤②中收集的沉淀用丙酮、乙醚各洗涤2次，然后用蒸馏水复溶至8~12mL，再用3500Da透析袋透析72h脱盐，冷冻干燥，就得到了发菜糖蛋白的粗纯品；步骤五、发菜糖蛋白的精纯化
取步骤四得到的发菜糖蛋白粗纯品按质量体积比0.2g:5mL的比例溶解在去离子水中，过0.45 μ m滤膜后取样品液，将样品液上DEAE-52纤维素阴离子交换柱进行分离纯化，上样后分别用0.05,0.1,0.511101/11^!10)3进行阶段性洗脱，每个浓度洗脱120min，在280nm处采用紫外吸收法检测糖蛋白的出峰位置，分别收集含有糖蛋白组分的第一吸收峰、第二吸收峰和第四吸收峰，冷冻干燥，得到不同分子量的发菜糖蛋白精纯品。
[0015]实施例1
一种悬浮培养发菜糖蛋白的制备方法，包括以下步骤:
步骤一、悬浮培养发菜
无菌条件下从发菜固体培养基上挑取发菜细胞于BG-1l液体培养基中进行培养18d后，将得到的发菜培养液以4000r/min转速离心分离8min，然后收集细胞悬浮于新鲜无菌的BG-1l培养基中，于生化培养箱中在25°C和40001x光照强度条件下进行扩大培养28天； 步骤二、过滤去藻体
将发菜培养液经滤纸过滤，藻体留在滤纸上，得到去除藻体的培养液；
步骤三、发菜糖蛋白的提取
步骤A、将步骤二得到的培养液与浓度为0.05mol/L的Nacl的浸提液按9:1的比例混合于锥形瓶中摇匀；
步骤B、将步骤A中锥形瓶的混合液在超声功率为500W的条件下，进行超声波辅助提取15min ；
步骤C、再将步骤B中的混合液置于水浴锅中，在温度为30°C下浸提6h ;
步骤D、最后用滤纸过滤步骤C浸提后的溶液，得到的上清液即为发菜糖蛋白混合溶液；
步骤四、发菜糖蛋白的粗纯化
步骤①:将步骤三得到的发菜糖蛋白溶液在温度为45°C，压强为IMpa的条件下减压浓缩至原体积的四分之一，得到糖蛋白样品液，按体积比为1:4的比例，取糖蛋白样品液和Sevage试剂(Sevage试剂由氯仿与正丁