醇按5:1的比例混合而成)，除去糖蛋白样品中的游离蛋白，脱蛋白一次，4°C静置10h，弃下层游离蛋白层；
步骤②:收集步骤①中的上层糖蛋白溶液，分5次向其中加入无水乙醇，分别在乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%时于4°C沉淀10h，并收集着5个乙醇浓度下得到的下层沉淀；步骤③:将步骤②中收集的沉淀用丙酮、乙醚各洗涤2次，然后用蒸馏水复溶至8mL，再用3500Da透析袋透析68h脱盐，冷冻干燥，就得到了发菜糖蛋白的粗纯品；
步骤五、发菜糖蛋白的精纯化
取步骤四得到的发菜糖蛋白粗纯品按质量体积比0.2g:5mL的比例溶解在去离子水中，过0.45 μ m滤膜后取样品液，将样品液上DEAE-52纤维素阴离子交换柱进行分离纯化，上样后分别用0.05mol/L、0.lmol/L和0.5mol/L的似!10)3进行阶段性洗脱，每个浓度洗脱120min，在280nm处采用紫外吸收法检测糖蛋白的出峰位置，分别收集含有糖蛋白组分的第一吸收峰、第二吸收峰和第四吸收峰，冷冻干燥，得到不同分子量的发菜糖蛋白精纯品。
[0016] 实施例2
一种悬浮培养发菜糖蛋白的制备方法，包括以下步骤:
步骤一、悬浮培养发菜
无菌条件下从发菜固体培养基上挑取发菜细胞于BG-1l液体培养基中进行培养，每20d为一个周期；在最初培养20d后，将得到的发菜培养液以4000r/min转速离心分离lOmin，然后收集细胞悬浮于新鲜无菌的BG-1l培养基中，于生化培养箱中在25°C和40001x光照强度条件下进行扩大培养30天；
步骤二、过滤去藻体
将发菜培养液经滤纸过滤，藻体留在滤纸上，得到去除藻体的培养液；
步骤三、发菜糖蛋白的提取
步骤A、将步骤二得到的培养液与浓度为0.08mol/L的Nacl浸提液按9:1的比例混合于锥形瓶中摇匀；
步骤B、将步骤A中锥形瓶的混合液在超声功率为500W的条件下，进行超声波辅助提取20min ； 步骤C、再将步骤B中的混合液置于水浴锅中，在温度为75°C下浸提4.27h ;
步骤D、最后用滤纸过滤步骤C浸提后的溶液，得到的上清液即为发菜糖蛋白混合溶液；
步骤四、发菜糖蛋白的粗纯化
步骤①:将步骤三得到的发菜糖蛋白溶液在温度为50°C，压强为IMpa的条件下减压浓缩至原体积的四分之一，得到糖蛋白样品液，按体积比为1:4的比例，用Sevage法将糖蛋白样品液与Sevage试剂(Sevage试剂由氯仿与正丁醇按5:1的比例混合而成)混合，除去糖蛋白样品中的游离蛋白，脱蛋白一次，4°C静置15 h过夜，弃下层游离蛋白层；
步骤②:收集步骤①中的上层糖蛋白溶液，分5次向其中加入无水乙醇，且分别在乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%时于4°C沉淀12h，并收集5个乙醇浓度下得到的下层沉淀；步骤③:将步骤②中收集的沉淀用丙酮、乙醚各洗涤2次，然后用蒸馏水复溶至12mL，再用3500Da透析袋透析72h脱盐，冷冻干燥，就得到了发菜糖蛋白的粗纯品；
步骤五、发菜糖蛋白的精纯化
取步骤四得到的发菜糖蛋白粗纯品按质量体积比0.2g:5mL的比例溶解在去离子水中，过0.45 μ m滤膜后取样品液，将样品液上DEAE-52纤维素阴离子交换柱进行分离纯化，上样后分别用0.05mol/L、0.lmol/L和0.5mol/L的似!10)3进行阶段性洗脱，每个浓度洗脱120min，在280nm处采用紫外吸收法检测糖蛋白的出峰位置，分别收集含有糖蛋白组分的第一吸收峰、第二吸收峰和第四吸收峰，冷冻干燥，得到不同分子量的发菜糖蛋白精纯品。
[0017] 实施例3
一种悬浮培养发菜糖蛋白的制备方法，包括以下步骤:
步骤一、悬浮培养发菜
无菌条件下从发菜固体培养基上挑取发菜细胞于BG-1l液体培养基中进行培养32d后，将得到的发菜培养液以4000r/min转速离心分离12min，然后收集细胞悬浮于新鲜无菌的BG-1l培养基中，于生化培养箱中在25°C和40001x光照强度条件下进行扩大培养32天；步骤二、过滤去藻体
将发菜培养液经滤纸过滤，藻体留在滤纸上，得到去除藻体的培养液；
步骤三、发菜糖蛋白的提取
步骤A、将步骤二得到的培养液与浓度为0.25mol/L的Nacl浸提液按9:1的比例混合于锥形瓶中摇匀；
步骤B、将步骤A中锥形瓶的混合液在超声功率为500W的条件下，进行超声波辅助提取25min ；
步骤C、再将步骤B中的混合液置于水浴锅中，在温度为80°C下浸提Ih ;
步骤D、最后用滤纸过滤步骤C浸提后的溶液，得到的上清液即为发菜糖蛋白混合溶液；
步骤四、发菜糖蛋白的粗纯化
步骤①:将步骤三得到的发菜糖蛋白溶液在温度为55°C，压强为IMpa的条件下减压浓缩至原体积的四分之一，得到糖蛋白样品液，按体积比为1:4的比例，用Sevage法将糖蛋白样品液与Sevage试剂(Sevage试剂由氯仿与正丁醇按5:1的比例混合而成)混合，除去糖蛋白样品中的游离蛋白，脱蛋白一次，4°C静置20h过夜，弃下层游离蛋白层； 步骤②:收集步骤①中的上层糖蛋白溶液，分5次向其中加入无水乙醇，且分别在乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%时于4°C沉淀15h，并收集5个乙醇浓度下得到的下层沉淀；步骤③:将步骤②中收集的沉淀用丙酮、乙醚各洗涤2次，然后用蒸馏水复溶至10mL，再用3500Da透析袋透析72h脱盐，冷冻干燥，就得到了发菜糖蛋白的粗纯品；
步骤五、发菜糖蛋白的精纯化
取步骤四得到的发菜糖蛋白粗纯品按质量体积比0.2g:5mL的比例溶解在去离子水中，过0.45 μ m滤膜后取样品液，将样品液上DEAE-52纤维素阴离子交换柱进行分离纯化，上样后分别用0.05mol/L、0.lmol/L和0.5mol/L的似!10)3进行阶段性洗脱，每个浓度洗脱120min，在280nm处采用紫外吸收法检测糖蛋白的出峰位置，分别收集含有糖蛋白组分的第一吸收峰、第二吸收峰和第四吸收峰，冷冻干燥，得到不同分子量的发菜糖蛋白精纯品。
【主权项】
1.一种悬浮培养发菜糖蛋白的制备方法，其特征在于，制备步骤为: 步骤一、在无菌条件下，取活化后的发菜细胞种，置于液体培养基中进行培养18~22天，然后，将得到的发菜培养液以4000r/min的转速进行离心分离8~12min，收集离心分离后得到的上层发菜细胞，转置于培养瓶内的新鲜液体培养基中，将培养瓶放置在温度为25°C的恒温生化培养箱中，控制箱内光照强度为4000Lux，培养28~32天； 步骤二、将步骤一的培养物采用滤纸进行过滤，取滤液，得到去除藻体的培养液；步骤三、按体积比为9:1的比例，取步骤二得到的培养液和NaCl摩尔浓度为0-0.25mol/L的浸提液置于锥形瓶中，充分摇匀混合后，转置于超声波震荡器内进行超声处理15~25min，然后，将得到的混合液置于温度为30~80°C的水浴锅内进行加热l~6h，之后，对混合液进行过滤，所得滤液即为发菜糖蛋白混合溶液； 步骤四、将步骤三得到的发菜糖蛋白混合溶液置于旋转蒸发器中进行减压蒸发浓缩，控制减压浓缩时的温度为45~55°C，直至溶液体积为原体积的1/4，即得到糖蛋白样品液；按体积比为1:4的比例，取糖蛋白样品液和Sevage试剂，充分震荡混合后得到下层含有凝胶沉淀的混合溶液，除去混合溶液中上下两层交界处的变性蛋白，之后，在4°C条件下静置10~20h，取混合溶液中的上层液，备用； 步骤五:分5次向步骤四得到的上层液中加入无水乙醇，使每次加入后混合溶液中乙醇的质量浓度分别为50%、60%、70%、80%和90%，且每次无水乙醇加入后均需将混合溶液置于4°C条件下静置沉淀10~15h，收集每次静置后得到的下层沉淀物，合并后备用； 步骤六:将步骤五收集到的沉淀物分别采用丙酮和乙醚各洗涤2~3次，然后，按照每克沉淀物加入l~3mL蒸馏水的比例进行复溶，之后，采用透析袋对复溶后的溶液进行透析脱盐处理68~76h，然后，对处理后的溶液进行冷冻干燥，得到发菜糖蛋白粗品； 步骤七、按照0.2g:5mL的比例，将步骤六得到的发菜糖蛋白粗品溶解于去离子水中，然后用孔径为0.45 μ m的膜对溶液进行过滤，之后，将得到的滤液上样于DEAE-52纤维素阴离子交换柱进行分离纯化，并依次用摩尔浓度为0.05 mol/L、0.lmol/L和0.5mol/L的NaHCCV^液对交换柱进行阶段性洗脱，每次洗脱的时间为120min，之后，采用紫外吸收法在波长为280nm处对发菜糖蛋白溶液的出峰位置进行检测，并分别收集其第一吸收峰、第二吸收峰和第四吸收峰的发菜糖蛋白溶液，之后，对收集到的发菜糖蛋白溶液分别进行冷冻干燥，即得到不同分子量的发菜糖蛋白纯品。
2.根据权利要求1所述的一种悬浮培养发菜糖蛋白的制备方法，其特征在于:所述步骤一中的液体培养基为BG-1l培养基。
3.根据权利要求1所述的一种悬浮培养发菜糖蛋白的制备方法，其特征在于:所述步骤三中的浸提液为摩尔浓度为0.08mol/L的NaCl溶液。
4.根据权利要求1所述的一种悬浮培养发菜糖蛋白的制备方法，其特征在于:所述步骤三中超声波震荡器的功率为500W。
5.根据权利要求1所述的一种悬浮培养发菜糖蛋白的制备方法，其特征在于:所述步骤四中所用的透析袋为3500Da透析袋。
【专利摘要】一种悬浮培养发菜糖蛋白的制备方法，包括挑取发菜细胞种进行悬浮培养发菜的步骤；过滤去藻体的步骤；进行发菜糖蛋白提取的步骤；发菜糖蛋白的粗纯化步骤以及发菜糖蛋白的精纯化步骤。本发明的悬浮培养发菜糖蛋白的制备方法操作简便、提取率高，提取出来的糖蛋白品质好、药用价值高，具有很好的医疗保健功效，有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、提高免疫力等活性。并且此糖蛋白涉及细胞的定向归巢、糖蛋白毒素及激素作用机制，可使药物选择性地集中到病灶，提高药效，而不影响正常组织的生长和免疫系统的功能，降低不良反应，具有极高的医用价值。
【IPC分类】C07K1-36, C07K1-30, C07K1-34, C07K14-415
【公开号】CN104592372
【申请号】CN201510025002
【发明人】郭金英, 胡娟娟
【申请人】河南科技大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月19日