一种表皮葡萄球菌特异基因的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及一种表皮葡萄球菌的特异基因的新用途，具体是将表其应用于建立表皮葡萄球菌检测技术方法中。

背景技术：

表皮葡萄球菌是存在于皮肤表面的条件致病菌，其引起败血症，慢性前列腺炎的趋势以日俱增。表皮葡萄球菌的耐药现象非常严重，临床上治疗表皮葡萄球菌所致疾病较为棘手，因此，快速检测出表皮葡萄球菌就显得尤为重要。

目前临床应用的表皮葡萄球菌的检测方法有常规涂片镜检法、培养法、免疫学测定、仪器自动分析鉴定系统等，但是这些方法都存在一定的缺陷，如常规涂片镜检是最基本的细菌学检查方法，但是敏感性低，特异性差；培养法是目前临床上发现传染源的主要途径和手段，但其非常耗时，不能实现快速的目的；免疫学测定方法对培养基的含盐量有很高的要求，若含盐量比较高，那么蛋白的合成会受到抑制，而出现假阴性；近年来，仪器自动化分析鉴定系统不断面市，但这些鉴定系统大多数应用面较窄，费用昂贵。

本发明利用生物信息学寻找出表皮葡萄球菌特异基因，并针对其设计引物，建立了表皮葡萄球菌的检测方法，实现了简便、快速、准确的检测出表皮葡萄球菌的目的。

技术实现要素：

本发明目的在于通过生物信息学手段获取可用于鉴定表皮葡萄球菌的基因，该基因为Amino acid transporter LysE（Genbank登陆号为3240523），其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，该基因为表皮葡萄球菌特有。

本发明针对该特异基因设计特异引物，例如：设计表皮葡萄球菌检测用引物，序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，扩增靶基因的特异碱基序列，该引物扩增序列如SEQ ID NO：4所示；所述靶基因为金黄色葡萄球菌Amino acid transporter LysE基因，Genbank登陆号为3240523，所述引物与所述靶基因的408位至560位的核苷酸序列或其互补链互补；利用该检测引物组可以特异性的检测表皮葡萄球菌。

本发明表皮葡萄球菌特异基因在制备检测表皮葡萄球菌的产品中的应用，该表皮葡萄球菌特异基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，该产品含有至少一对特异扩增该特异基因的引物序列。

本发明用上述引物通过聚合酶链式反应检测标本中是否存在Amino acid transporter LysE基因，进而确定标本中是否存在表皮葡萄球菌。

本发明的有益效果在于:

通过本地Blast比对和分析，获得表皮葡萄球菌的特异基因，针对特异基因设计特异引物，该引物可以快速、简便、准确的检测表皮葡萄球菌。

附图说明

图1为本发明PCR条件优化结果示意图，图中在每个温度下，Mg²⁺浓度(从左至右）分别为0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mM；

图2为本发明特异性检测图，图中M为2000bp marker，1至3为三株表皮葡萄球菌，4、 肺炎克雷伯菌，5、弗劳地氏枸橼酸杆菌，6、伤寒杆菌，7、琼氏不动杆菌，8、大肠杆菌，9、粪肠球菌，10、溶血葡萄球菌，11、金黄色葡萄球菌，12、摩氏摩根菌；

图3为本发明中灵敏度检测图，图中M为2000bp marker，0至9分别为10⁰个/μL至10⁹个/μL，C为阴性对照。

具体实施方式

下面通过实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法。

实施例1：特异性靶基因筛选及引物设计

本地BLAST分析

从NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/）中下载的表皮葡萄球菌全基因组序列，对本地的核酸数据库进行本地BLAST检索，获取得到表皮葡萄球菌各序列片段与数据库比对结果。

BLAST重确认

使用在线BLAST功能，使用2种策略确认其菌种特异性和表皮葡萄球菌鉴定可用性。一种策略为BLAST时排除表皮葡萄球菌，结果显示无任何相似序列者为表皮葡萄球菌特异基因；第二种策略为BLAST时选择在表皮葡萄球菌内进行检索，结果返回大量相似序列者是不同表皮葡萄球菌菌株共有序列。结合两种策略，最终得出Amino acid transporter LysE符合两种策略标准。

引物设计

针对表皮葡萄球菌Amino acid transporter LysE基因，设计特异引物。表皮葡萄球菌特异引物通过在线设计特异性寡核苷酸引物工具Primer-BLAST设计完成。设计步骤和注意事项参照Primer-BLAST使用说明书进行。

实施例2：检测方法的建立

DNA的提取

用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的细菌基因组DNA小量提取试剂盒进行抽提回收，步骤如下：

(1)取细菌培养液5mL，12,000rpm离心1分钟，尽量吸净上清；

(2)向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL细胞悬浮液，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀，37℃温浴30分钟。每隔10分钟颠倒混匀数次。12,000rpm离心2分钟，尽量吸净上清；

(3)向菌体沉淀中加入225μL缓冲液A，振荡至菌体彻底悬浮；

(4)向管中加入6μL RNaseA溶液，振荡15秒，室温放置5分钟；

(5)向管中加入10μL蛋白酶K溶液，颠倒混匀；

(6)加入25μL裂解缓冲液S，颠倒混匀；

(7)加入250μL缓冲液B，振荡10秒，70℃放置10分钟，12,000rpm离心1分钟，取上清放入一新管中，弃去沉淀；

(8)加入250μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，瞬时离心以去除管盖内壁的水珠；

(9)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；

(10)向吸附柱中加入500μL缓冲液C，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；

(11)向吸附柱中加入700μL漂洗液W₂，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱放入收集管中；

(12)向吸附柱中加入500μL漂洗液W₂，12,000rpm离30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。然后12,000rpm离心2分钟。将吸附柱置于一个新的1.5mL离心管中，室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

(13)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

PCR条件优化

一、对退火温度和Mg²⁺同时进行优化。退火温度为6个梯度，49、51、53、55、57、59℃。Mg²⁺浓度为5个梯度，0.8、1.6、2.4、3.2和4.0mM。所述通过聚合酶链式反应检测表皮葡萄球菌条件优化扩增体系为25μL。具体反应体系为：TaqDNA聚合酶0.125μL, 10×聚合酶缓冲液2.5μL, dNTP 2μL，Mg²⁺分别为0.8、1.6、2.4、3.2和4.0mM，模板1μL，上下游引物各1μL，加ddH₂O补足25μL。

二、在PCR仪中按以下程序扩增：

(1)预变性

95℃ 5分钟

(2) 30个循环：

95℃ 30 秒钟

49、51、53、55、57、59℃ 30秒钟

72℃ 20秒钟

(3)后扩增

72℃ 1分钟

最终确立Mg²⁺为1.6mM，退火温度为57℃条件为检测的最优化条件，结果如图1所示。

特异性检测

一、收集表皮葡萄球菌临床分离株3株，非表皮葡萄球菌9株。将这些菌株用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的细菌基因组DNA小量提取试剂盒提取基因组，步骤如下：

(1)取细菌培养液5mL，12,000rpm离心1分钟，尽量吸净上清；

(2)向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL细胞悬浮液，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀，37℃温浴30分钟。每隔10分钟颠倒混匀数次。12,000rpm离心2分钟，尽量吸净上清；

(3)向菌体沉淀中加入225μL缓冲液A，振荡至菌体彻底悬浮；

(4)向管中加入6μL RNaseA溶液，振荡15秒，室温放置5分钟；

(5)向管中加入10μL蛋白酶K溶液，颠倒混匀；

(6)加入25μL裂解缓冲液S，颠倒混匀；

(7)加入250μL缓冲液B，振荡10秒，70℃放置10分钟，12,000rpm离心1分钟，取上清放入一新管中，弃去沉淀；

(8)加入250μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，瞬时离心以去除管盖内壁的水珠；

(9)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；

(10)向吸附柱中加入500μL缓冲液C，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；

(11)向吸附柱中加入700μL漂洗液W₂，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱放入收集管中；

(12)向吸附柱中加入500μL漂洗液W₂，12,000rpm离30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中，然后12,000rpm离心2分钟。将吸附柱置于一个新的1.5mL离心管中，室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

(13)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

二、PCR反应体系

把每个菌株的基因组分别用作模板进行聚合酶链式反应。反应体系为25μL，Taq 0.125μL、10×聚合酶缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、Mg²⁺1.6μL、模板1μL、上下游引物各1μL、加ddH₂O补足25μL。

三、在PCR仪中按以下程序扩增：

(1)预变性

95℃ 5分钟

(2)30个循环：

95℃ 30秒钟

57℃ 30秒钟

72℃ 20秒钟

(3)后扩增

72℃ 1分钟

在Mg²⁺为1.6mM，退火温度为57℃的条件下，该检测方法可以特异性的检测出表皮葡萄球菌，而不受其他菌种影响，如图2所示。

灵敏度检测

一、阳性质粒载体构建

1、以表皮葡萄球菌基因组为模板，用上述特异引物进行PCR扩增，反应体系为100μL，Taq 0.5μL、10×聚合酶缓冲液10μL、dNTP 8μL、Mg²⁺ 6.4μL、模板4μL、上下游引物各4μL、加ddH₂O补足100μL。

2、在PCR仪中按以下程序扩增：

(1)预变性

95℃ 5分钟

(2)30个循环：

95℃ 30 秒钟

57℃ 30秒钟

72℃ 20秒钟

(3)后扩增

72℃ 1分钟；

3、循环结束后，将PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，并用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行抽提回收，步骤如下：

(1)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量；

(2) 向胶块中加入2倍体积溶胶液，55℃水浴10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；

(3) 将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；

(4) 向吸附柱中加入700μL漂洗液W₂，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；

(5)向吸附柱中加入50μL漂洗液W₂，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；

(6)将吸附柱放入收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干；

(7)将吸附柱放入一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μL的洗脱缓冲液TE，室温放置2分钟。12,000rpm离心2分钟，收集DNA溶液。

4、大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备

(1)挑取单个DH5α菌落，接种于3mL不含氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50mL LB培养基中，37℃振荡2小时。当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物；

(2)将细菌转移到一个50mL预冷的无菌聚丙烯管中，冰上放置10分钟，使培养物冷却；

(3)于4℃下4100rpm离心10分钟，吸出培养液，并将管倒置l分钟以使残留的培养基流尽；

(4)每50mL初始培养液且30mL预冷的0.1mol/L CaCl₂-MgCl₂溶(80mmol/L MgCl₂，20mmol/L CaCl₂)重悬细胞沉淀；

(5)于4℃下4100rpm离心10分钟，吸出上清液，并将管倒置l 分钟以使残留的液体流尽；

(6)每50mL初始培养物用2mL预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液重悬细胞沉淀，分装后备用。

5、连接及连接产物的转化

(1)在微量离心管中加入1μL Takara pMD19-T simple载体、4μL Amino acid transporter LysE基因PCR产物及5μL的连接酶缓冲混合物；

(2)16℃反应3 小时；

(3)全量（10μL）加入至100μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟；

(4)42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟；

(5)加入37℃温浴过的LB培养基890μL，37℃缓慢振荡培养60分钟；

(6)取200μL涂布于含有氨苄青霉素的LB培养基上，37℃培养16h以形成单菌落。

6、Amino acid transporter LysE基因PCR产物筛选及鉴定

挑取上述单菌落于含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃缓慢振荡培养4h，进行PCR扩增。扩增引物及扩增条件同前述最优反应条件，将经PCR确证的阳性克隆进行质粒提取后，以美国Applied Biosystems3730A全自动核苷酸序列测定仪进行核苷酸序列的测定；测序引物为BcaBESTTM Sequencing Primer ML3-47（5’ CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’），目的片段测序结果自5’端至3’端序列为:

gccttgaatc tcggtctgct gaataataat ttaatatatt gaaagatgaa tacacaaaat

aaaaaccata agcatataac tacaacaact gaaaaagcaa ataacgcaac ttcagatttc

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7、阳性质粒提取

(1)取5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，12,000rpm离心1分钟，尽量吸除上清；

(2)向留有菌体沉淀的离心管中加入250µL溶液1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；

(3)向离心管中加入250μL溶液2，温和地上下翻转6－8次使菌体充分裂解；

(4)向离心管中加入350μL溶液3，立即温和地上下翻转6–8次，充分混匀，即出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10分钟，此时在离心管底部形成沉淀。将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱中，12,000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；

(5)向吸附柱中加入700μL漂洗液W₂，12,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；

(6)向吸附柱中加入500μL漂洗液W₂，12,000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；

(7)将吸附柱放入收集管中， 12,000rpm离心2分钟，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

(8)将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加60µL洗脱缓冲液TE，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟将质粒溶液收集到离心管中。

二、表皮葡萄球菌灵敏度

1、质粒数目换算

用紫外分光光度计测得质粒浓度为：233 ng/μL。

质粒数目换算公式：（注：X为质粒浓度；Y为质粒碱基对数；N_A为阿伏伽德罗常数；2692为载体碱基对数；660为碱基平均分子量）得到Amino acid transporter LysE的浓度为7.47×10¹⁰个/μL。

2、取1μL Amino acid transporter LysE阳性质粒稀释到1.0×10⁹个/μL，取2µL稀释好的阳性质粒进行10倍梯度稀释，稀释成1.0×10⁸至1.0×10⁰ 9个梯度。分别取每个梯度稀释液2μL为模板。反应体系为25µL，Taq 0.125μL、10×聚合酶缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、Mg²⁺1.6μL、模板2μL、上下游引物各1μL，加ddH₂O补足25μL。

3、在PCR仪中按以下程序扩增：

(1) 预变性

95℃ 5分钟

(2) 30个循环：

95℃ 30 秒钟

57℃ 30秒钟

72℃ 20秒钟

(3) 后扩增

72℃ 1分钟；

在Mg²⁺为1.6mM，退火温度为57℃的条件下，该检测方法可以检测到表皮葡萄球菌的最低浓度为1个/μL，如图3所示。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 一种表皮葡萄球菌特异基因的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cccgcagttc ctttctaacg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gccttgaatc tcggtctgct 20

<210> 3

<211> 633

<212> DNA

<213> Staphylococcus epidermidis

<400> 3

atggacggtt taattacatt tatcattatc acattattga ttattatagt acctgggcca 60

gatttcatta ttgtaatgaa aaacactatt aattcaagta aaatgaatgg ttttatggct 120

gcatttggta ttactacggg gcatatttta tactcttcat tagctatttt tggaattata 180

tacatactta cgagtttaca ctttgttttt ttaacaataa aaatattggg tgcttgttat 240

cttatttatc tcggaatcaa aagtattttg agtgcgcaca gttctgttga ttttagtaaa 300

caagctttag ctgatgtcag aaatgtgagt tatatcactt cttttagaca aggtttttta 360

agtacaagtc ttaaccctaa ggctttatta ttttatgtta gtatattccc gcagttcctt 420

tctaacggta atatacatat gaaatctgaa gttgcgttat ttgctttttc agttgttgta 480

gttatatgct tatggttttt attttgtgta ttcatctttc aatatattaa attattattc 540

agcagaccga gattcaaggc tatatttgat tatattgtag ggtttgtttt aattggctta 600

tctattaatt tattattaag taaaagtagc taa 633

<210> 4

<211> 153

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gccttgaatc tcggtctgct gaataataat ttaatatatt gaaagatgaa tacacaaaat 60

aaaaaccata agcatataac tacaacaact gaaaaagcaa ataacgcaac ttcagatttc 120

atatgtatat taccgttaga aaggaactgc ggg 153