本发明涉及Thr-Val-Gly-Cys-Ser，涉及它的制备方法、涉及它的镇痛活性，涉及它的抗肿瘤活性，涉及它的溶血栓活性，因而本发明涉及它在制备镇痛药物，抗肿瘤药物和溶血栓药物的应用。本发明属于生物医药领域。
背景技术：
发明抗肿瘤、抗血栓、溶血栓、抗凝血和镇痛作用寡肽是发明人长期关注的领域。虽然发明人发明公开过一系列具有这些活性的寡肽，但是集这些活性为一体的寡肽一直没有得到。经过近10年的序列设计和近5年的实验研究，发明人发现Thr-Val-Gly-Cys-Ser是集镇痛作用，抗肿瘤作用和溶血栓作用为一体的寡肽。
技术实现要素：
本发明的第一个内容是提供Thr-Val-Gly-Cys-Ser：
本发明的第二个内容是提供Thr-Val-Gly-Cys-Ser的合成方法，该方法包括：
(1)在DCC、HOBt的催化下按照标准方法制备Boc-Val-Gly-OBzl；
(2)在DCC、HOBt的催化下，合成Boc-Cys(Bzl)-Ser-OBzl；
(3)Boc-Cys(Bzl)-Ser-OBzl在在浓度为4N的氯化氢-乙酸乙酯溶液中，0℃脱Boc，转化成Cys(Bzl)-Ser-OBzl；
(4)Boc-Val-Gly-OBzl在在浓度为4N的氯化氢-乙酸乙酯溶液中，0℃脱Boc，转化成Boc-Val-Gly；
(5)在DCC、HOBt的催化下，制备Boc-Thr-Val-Gly-OBzl；
(6)Boc-Thr-Val-Gly-OBzl在H2Pd/C中转化成Boc-Thr-Val-Gly；
(7)在DCC、HOBt的催化下，合成Boc-Thr-Val-Gly-Cys(Bzl)-Ser-OBzl；
(8)Boc-Arg(NO2)-Leu-Val-Cys(Bzl)-Val-OBzl在TFA和TFSMA中，0℃中转化成Thr-Val-Gly-Cys-Ser。
本发明的第三个内容是评价Thr-Val-Gly-Cys-Ser的镇痛作用。
本发明的第四个内容是评价Thr-Val-Gly-Cys-Ser的抗肿瘤作用。
本发明的第五个内容是评价Thr-Val-Gly-Cys-Ser的溶血栓作用。
附图说明
图1.Thr-Val-Gly-Cys-Ser的合成路线.i)二环己基碳二亚胺(DCC)，1-羟基苯并三唑(HOBt)，N-甲基吗啉(NMM)，四氢呋喃(THF)；ii)浓度为4N的氯化氢-乙酸乙酯溶液，0℃；iii)H2，Pd/C；iv)TFA，TFMSA，0℃。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1制备Boc-Val-Gly-OBzl的制备
冰浴下2.17g(10mmol)Boc-Val溶解于少量无水THF中，加入1.36g(10mmol)HOBt，加入2.47g(12mmol)DCC与少量无水THF的溶液，活化30分钟，加入1.65g(10mmol)Gly-OBzl，用NMM调节pH＝9，反应结束后过滤除去二环己基脲(DCU)。滤液减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解，再次过滤DCU，滤液用NaHCO3饱和溶液洗3遍，用NaCl饱和溶液洗3遍，5％的KHSO4溶液洗3遍，NaCl饱和溶液洗3遍，5％的NaHCO3溶液萃洗3遍，NaCl饱和溶液萃洗3遍，乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥12小时，滤除Na2SO4，滤液减压浓缩，得到3.33g(91.5％)标题化合物，为黄色粉末。ESI+-MS(m/e)：365[M+H]+。
实施例2制备Boc-Cys(Bzl)-Ser-OBzl
按照实施例1的方法从3.11g(10mmol)Boc-Cys(Bzl)和1.95g(10mmol)Ser-OBzl得到4.02g(82％)标题化合物，为无色油状物。
实施例3制备Cys(Bzl)-Ser-OBzl
冰浴下将4.88g(10mmol)Boc-Cys(Bzl)-Ser-OBzl用尽少量干燥过的乙酸乙酯溶解，搅拌10min，加入50mL氯化氢-乙酸乙酯溶液(4N)反应4h，原料点消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物加40mL干燥过的乙酸乙酯溶解，得到的溶液减压浓缩至干。残留物按该操作重复3次。残留物加无水乙醚，用塑料铲研磨，减压浓缩除去乙醚。残留物按该操作重复3次。得到3.7g(96％)标题化合物，为无色粉末。
ESI-MS(m/e)：390[M+H]+。
实施例4制备Val-Gly-OBzl
按照实施例3的方法从3.64g(10mmol)Boc-Val-Gly-OBzl得到2.46g(93％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：265[M+H]+。
实施例5制备Boc-Thr-Val-Gly-OBzl
按照实施例1的方法从2.19g(10mmol)Boc-Thr和2.64g(10mmol)Val-Gly-OBzl得到3.40g(73％)标题化合物，为无色粉末ESI-MS(m/e)：467[M+H]+。
实施例6制备Boc-Thr-Val-Gly
将4.65g(10mmol)Boc-Thr-Val-Gly-OBzl用甲醇溶解，加入500mg的10％的Pd/C，加三项通气阀，减压抽除茄瓶中的空气，通入H2，反应24h原料点消失。滤除Pd/C，减压浓缩除甲醇得到无色粉末3.65g(97％)。ESI-MS(m/e)：376[M+H]+。
实施例7制备Boc-Thr-Val-Gly-Cys(Bzl)-Ser-OBzl
按照实施例1的方法从3.75g(10mmol)Boc-Thr-Val-Gly和3.88g(10mmol)Cys(Bzl)-Ser-OBzl得到2.35g(31％)标题化合物，为无色果冻状产物。ESI-MS(m/e)：746[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.60(m，lH)，8.23(s，1H)，7.98(m，1H)，7.68(m，1H)，7.56-7.09(m，10H)，6.53(d，J＝8.1Hz，1H)，5.13(m，2H)，4.75(m，1H)，4.65(m，1H)，4.42(m，lH)，4.31(t，1H)，3.93(m，2H)，3.51(m，4H)，3.35(m，1H)，2.70(m，2H)，1.38(s，9H)，1.02(d，J＝5.4Hz，3H)，0.86(m，6H)。
实施例8制备Thr-Val-Gly-Cys-Ser
冰浴下将372mg(0.5mmol)Boc-Tht-Val-Gly-Cys(Bzl)-Ser-OBzl用6mL三氟醋酸溶解，搅拌10min，加入1.5mL三氟甲磺酸反应30min后，反应基本完成，原料点消失。将新开封的乙醚加入茄瓶中，用塑料铲磨洗，倾倒乙醚；重复操作三次。最终达到棕黄色粉末，用三蒸水溶解，用氨水调pH至7，走Sephdex G10，收集冻干样品为白色粉末198mg(产率85.1％)。ESI+-MS(m/e)：467[M+H]+；Mp 160～161℃.(c＝0.090，甲醇).1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.46(m，1H)，8.31(m，1H)，8.29(m，1H)，8.04(m，2H)，7.26(m，3H)，4.56(m，3H)，4.26(m，3H)，3.87(m，3H)，3.87(m，1H)，2.90(m，2H)，1.07(m，3H)，0.90(t，6H)。
实施例9评价Thr-Val-Gly-Cys-Ser的镇痛活性
雄性ICR小鼠(20±2g)装到小鼠固定器中，鼠尾暴露于固定器外，于鼠尾距离尾尖三分之一处标记，作为光感感受器的感应点，照射鼠尾距离尾尖三分之二的位置。测痛仪预热30min，记时，将小鼠鼠尾遮住光感仪。灯闪烁时开始记时，鼠尾离开光感仪时停止记时，测得的时间即为小鼠产生痛感的时间，连续测定3次，每次测量间隔为5min，取平均值。未服药小鼠产生痛感的时间为基础痛感时间。服药引起的小鼠产生痛感时间变化反映了药物的镇痛活性。小鼠，随机分组，每组14只，测定基础痛感时间后，小鼠或口服0.2mL Thr-Val-Gly-Cys-Ser(TVGCS)的生理盐水溶液，剂量为1μmol/kg或口服0.2mL生理盐水或口服阿司匹林的生理盐水溶液，剂量为1200μmol/kg。测量给药后30，60，90，120，150和180min小鼠产生痛感的时间。数据用均值±SD秒表示， 列如表1，用方差分析并进行t检验。数据表明，口服生理盐水30，60，90，120，150和180min之后小鼠产生痛感的时间与口服生理盐水之前的基础痛感时间没有显著差异；口服1200μmol/kg阿司匹林60，90，120，150和180min之后小鼠产生痛感的时间显著长于口服阿司匹林之前的基础痛感时间；口服1μmol/kgThr-Val-Gly-Cys-Ser，60，90，120和150min之后小鼠产生痛感的时间显著长于口服Thr-Val-Gly-Cys-Ser之前的基础痛感时间。可见，口服1μmol/kgThr-Val-Gly-Cys-Ser120和150min之后的镇痛活性与口服1200μmol/kg阿司匹林相当。而口服1μmol/kgThr-Val-Gly-Cys-Ser60和90min之后的镇痛活性比口服1200μmol/kg阿司匹林还强。
表1 Thr-Val-Gly-Cys-Ser(TVGCS)的镇痛活性
n＝14；a)与基础痛感时间比p＞0.05；b)与基础痛感时间比p＜0.05；c)与基础痛感时间比p＜0.01。
实施例10评价Thr-Val-Gly-Cys-Ser的抗肿瘤活性
无菌条件下取接种于ICR小鼠7-10天的S180肉瘤，加入适量生理盐水配制成瘤细胞悬液，细胞数为2×107/mL，接种于健康雄性ICR小鼠前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2mL。肿瘤接种24h后，小鼠每日腹腔注射0.2mL Thr-Val-Gly-Cys-Ser的生理盐水溶液，连续给药10天，剂量为1μmol/kg；或小鼠每日腹腔注射0.2mL阿霉素的生理盐水溶液，连续给药10天，剂量为2μmol/kg；或小鼠每日腹腔注射0.2mL生理盐水，连续给药10天。实验进行至第11天，称小鼠体重，乙醚麻醉剖取各组小鼠的肿瘤，称重并以瘤重表示化合物的活性，数据列入表3。结果表明1μmol/kgThr-Val-Gly-Cys-Ser治疗小鼠的瘤重明显小于生理盐水治疗小鼠的瘤重，Thr-Val-Gly-Cys-Ser显示确切的抗肿瘤活性。
表2 Thr-Val-Gly-Cys-Ser对S180荷瘤小鼠瘤重的影响
n＝12；a)与生理盐水比p＜0.01.
实施例11评价Thr-Val-Gly-Cys-Ser的溶栓活性
1)将体重250±雄性SD大鼠用20％乌拉坦溶液进行麻醉(6mL/kg腹腔)。麻醉后的大鼠固定于鼠板上，分离右侧颈总动脉，于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别传入手术线，在远心端插取血管，松开动脉夹取约1mL动脉血。迅速将动脉血注射入垂直的造栓管(长16mm，内径2.5mm，外径5mm，管底用1mL EP管底座)中，(注意不可有气泡)每个造栓管中注入0.1mL大鼠动脉血液，往管内迅速插入血栓固定螺栓(长20mm，)，血液凝固40min，用针灸针取出血栓，称取血栓重量。
2)旁路插管由三部分组成，其中中段为聚乙烯胶管，长60mm，内径3.5mm，两端为相同的聚乙烯管，长100mm，内径1mm，外景2mm，该管的一段拉成尖管，另一端的外部套一段长7mm，外径3.5mm的聚乙烯管。三段管的内壁均为硅烷化。
3)将血栓包裹的血栓固定螺栓置于中段的聚乙烯胶管内，胶管的两端分别与两根聚乙烯的加粗端相套，用注射器通过尖管端注满肝素生理盐水溶液。将充满肝素钠的生理盐水溶液一端插入左侧静脉，另一端用注射器加入准确量的肝素钠抗凝后，拔掉肝素钠的注射器，插入动脉端。用头皮针将生理盐水(3mL/kg)或者尿激酶的生理盐水溶液(20000IU/kg)或Thr-Val-Gly-Cys-Ser的生理盐水溶液(1μmol/kg)通过旁路管的中段，刺入远离血栓固定螺栓的近静脉处，打开动脉夹，使血流通过旁路管道从动脉流入静脉的时刻为循环起始时间，缓慢的将注射器中的液体注入到血液中(约6min)，使生理盐水，尿激酶，Thr-Val-Gly-Cys-Ser通过血液循环，按静脉-心脏-动脉的顺序作用到血栓上。60min后取出附有血栓的螺栓，蘸去浮血，记录重量。以血栓减重代表溶栓活性。数据列入表3。结果表明，Thr-Val-Gly-Cys-Ser治疗大鼠的血栓减重明显大于生理盐水治疗大鼠的血栓减重，Thr-Val-Gly-Cys-Ser显示确切的溶血栓活性。
表3 Thr-Val-Gly-Cys-Ser的溶栓活性
n＝10；a)与生理盐水比p＜0.01。