本发明涉及2-[3-(甲酰-Gly)-4-(氧乙酰-Arg-Gly-Asp-AA)]-苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉，涉及它们的制备方法，涉及它们清除自由基的活性，涉及它们的抗血栓活性，涉及它们的溶血栓活性以及涉及它们治疗缺血性中风的作用，因而本发明涉及它们在制备自由基清除药物，抗血栓药物，溶血栓药物以及缺血性中风药物中的应用。
背景技术：
缺血性中风是一类较常见且危害严重的脑血管疾病，特点是发病率高、病死率高、致残率高和复发率高。目前临床治疗缺血性中风面临没有有效药物的现实，尤其中风面4h以上的患者非死即残。发明对中风面4h以上的患者有效的药物是临床的重要需求。发明人曾经公开式II的咪唑啉化合物在中风面24h的大鼠缺血性中风模型上，显示优秀疗效。即连续静脉注射6天式II的咪唑啉化合物，每天1次，首次剂量为5μmol/kg，后5次的剂量为2μmol/kg具有优秀疗效。式中aa1和aa2可为同时存在，aa1存在但aa2不存在，或同时不存在；当aa1和aa2同时存在时，aa1为R(Arg)，且aa2为G(Gly)，A(Ala)或Q(Gln)；当aa1存在但aa2不存在时，aa1为R(Arg)；aa3可为S(Ser)，V(Val)或F(Phe)。由于式II的咪唑啉化合物的2-位是4-氧乙酰-Lys。而该Lys的侧链氨基和主链羧基分别与RGD抗血栓四肽及ARPAK溶栓肽相连接，所以结构比较复杂需要简化。
发明人在经过3年实验研究，发现咪唑啉化合物的2-位由(3-甲酰-Gly)-4-(氧乙酰Arg-Gly-Asp-AA)-苯基取代可以获得结构简单和疗效好的双重意想不到的技术效果。按照这个发现，发明人提出了本发明。
技术实现要素：
本发明的第一个内容是提供式I的2-[3-(甲酰-Gly)-4-(氧乙酰-Arg-Gly-Asp-AA)]-苯基 -4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉(式中AA为Ser，Val，Phe残基)。
本发明的第二个内容是提供式I的2-[3-(甲酰-Gly)-4-(氧乙酰-Arg-Gly-Asp-AA)]-苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉(式中AA为Ser，Val，Phe残基)的合成方法，该方法包括：
(1)2-硝基丙烷在碱性条件下与Br2及乙醇反应，生成2，3-二硝基-2，3-二甲基丁烷；
(2)2，3-二硝基-2，3-二甲基丁烷在乙醇的水溶液中被锌粉还原成2，3-二甲基-2，3-二羟胺基丁烷；
(3)2，3-二甲基-2，3-二羟胺基丁烷与5-甲酰水杨酸缩合，得到4，4，5，5-四甲基-2-(4-羟基苯甲酸)-咪唑-1，3-二醇；
(4)4，4，5，5-四甲基-2-(4-羟基苯甲酸)-咪唑-1，3-二醇用二氧化铅氧化成2-(4-羟基-3羧基)苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉；
(5)2-(4-羟基-3羧基)苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉与HCl·Gly-OtBu偶合得到2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-羟基]苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉；
(6)2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-羟基]苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉在NaH催化下用BrCH2COOC2H5对酚羟基烷基化，得到2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-(氧乙酸乙酯)]苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉；
(7)2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-(氧乙酸乙酯)]苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉在碱性条件下水解生成2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-(氧乙酸)]苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉；
(8)按标准方法制备HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl和HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl；
(9)制备2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-(氧乙酰-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl)]苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧基咪唑啉，2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-(氧乙酰-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl)]苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉和2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-(氧乙酰-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl)]苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉。
(10)制备2-[3-(甲酰-Gly)-4-(氧乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser)]苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉，2-[3-(甲酰-Gly)-4-(氧乙酰-Arg-Gly-Asp-Val)]苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉和 2-[3-(甲酰-Gly)-4-(氧乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe)]苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉。
本发明的第三个内容是评价式I的2-[3-(甲酰-Gly)-4-(氧乙酰-Arg-Gly-Asp-AA)]-苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉(式中AA为Ser，Val，Phe残基)清除自由基的活性，抗血栓活性，溶血栓活性以及治疗缺血性中风的活性。
附图说明
图1 2-[3-(甲酰-Gly)-4-(氧乙酰-Arg-Gly-Asp-AA)]-苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉(式中AA为Ser，Val，Phe残基)的合成路线i)Br2，6N NaOH；ii)Zn，NH4Cl，50％乙醇；iii)5-甲酰水杨酸，CH3OH；iv)PbO2，CH3OH；v)DCC/HOBt，HCl·Ala-OtBu；vi)Br2CO2C2H5，NaH，THF；Vii)2N NaOH，CH3OH；viii)DCC/HOBt，Arg(NO2)Gly-Asp(OBzl)-AA-OBz；ix)TFA/TFMSA.化合物1中AA＝Val残基，化合物2中AA＝Ser残基，化合物3中AA＝Phe残基。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1制备2，3-二甲基-2，3-二硝基丁烷
冰浴和搅拌下往69.0g(0.78mol，70mL)2-硝基丙烷中依次加130mL 6N NaOH溶液，20mL(0.38mol，缓慢滴加，1小时内滴加完)Br2和240mL乙醇。反应化合物90℃回流3小时，期间出现片状沉淀。将反应液趁热倒入800mL冰水中，滤得49.0g(73％)标题化合物，为无色片状结晶。ESI-MS(m/e)：177[M+H]+。
实施例2制备2，3-二甲基-2，3-二羟胺基丁烷
将7.00g(40mmol)2，3-二甲基-2，3-二硝基丁烷与4.00g NH4Cl溶解于80mL 50％的乙醇水[]\溶液中，冰浴下搅拌，3小时之内分批加入16.00g锌粉。锌粉加完后，反应混合物室温搅拌3h，抽滤，滤饼用50％的乙醇水溶液反复洗。合并滤液与洗涤液，用浓盐酸调pH为2，减压浓缩得泥浆状物。将泥浆状物用少量50％的乙醇水溶液溶解，加适量碳酸钾，拌匀之后装入索式提取器，用二氯甲烷作提取剂，60℃提取6h，提取液减压浓缩，残留物用石油醚研磨得到2.07g(35％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：149[M+H]+。
实施例3制备2-(3-羧基-4-羟基苯基)-1，3-二羟基-4，4，5，5-四甲基咪唑
室温下将1.48g(10mmol)2，3-二甲基-2，3-二羟胺基丁烷用少量甲醇溶解，加入2.0g(12mmol)3-羧基-4-羟基苯甲醛，反应12小时，过滤得到2.07g(70％)标题化合物，为无 色粉末。ESI-MS(m/e)：298[M+H]+。
实施例4制备2-(3-羧基-4-羟基苯基)-1，3-二氧-4，4，5，5-四甲基基咪唑啉
将1.00g(3.38mmol)2-(3-羧基-4-羟基苯基)-1，3-二羟基-4，4，5，5-四甲基咪唑用100mL甲醇溶解之后，用1N NaOH调节pH至7，加入6.77g PbO2。TLC显示反应结束之后，滤除去PbO2，滤液用1N HCl调节pH至7，减压浓缩。残留物用少量丙酮溶解，过滤除盐，得到693mg(70％)标题化合物，为蓝色粉末。ESI-MS(m/e)：292[M-H]-。
实施例5制备2-[3-(甲酰-Ala-OtBu)-4-羟基苯基]-1，3-二氧-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
将300mg(1mmol)2-(3-羧基-4-羟基苯基)-1，3-二氧-4，4，5，5-四甲基基咪唑啉溶于20mL无水THF中，冰浴下加入135mg(1mmol)HOBt和268mg(1.2mmol)DCC，活化30min之后加入174mg(1.2mmol)HCl·Ala-OtBu，反应液用NMM调pH至9，室温搅拌8h。结束反应，滤除DCU，减压浓缩，残留物用柱层析(氯仿/甲醇，10/1)纯化，得到204mg(68％)标题化合物，为蓝色粉末。ESI-MS(m/e)：421[M+H]+。
实施例6制备2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-(氧乙酸乙酯)-苯基]-1，3-二氧-4，4，5，5-四甲基咪唑啉
将406mg(1mmol)2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-羟基苯基]-1，3-二氧-4，4，5，5-四甲基咪唑啉溶于20mL无水THF。往溶液中加72mg(3mmol)NaH和0.5mL(3mmol)BrCH2CO2C2H5，60℃反应5h，TLC检测反应显示原料点消失。减压过滤，滤液减压浓缩，残留物经干柱柱层析纯化(氯仿/甲醇，10/1)，得到410mg(83％)标题化合物，为蓝色粉末。ESI-MS(m/e)：493[M+H]+。
实施例7制备2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-(氧乙酸)-苯基]-1，3-二氧-4，4，5，5-四甲基咪唑啉(NN)
将492mg(1mmol)2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-(氧基乙酸乙酯)-苯基]-1，3-二氧-4，4，5，5-四甲基咪唑啉溶于30mL甲醇，冰浴下用2N NaOH调反应液pH至12，反应2h，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失。将反应液减浓缩，加入2mL饱和NaCl溶液，用1N HCl调pH至3。混合溶液用乙酸乙酯萃取3次，合并的乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥12h，过滤，滤液减压浓缩得420mg(90％)标题化合物，为蓝色粉末。EI-MS(m/z)：463[M-H]-。
实施例8制备Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl
将957mg(3.0mmol)Boc-Arg(NO2)溶于20mL无水THF中，冰浴下加入405mg(3.0mmol)HOBt和742mg(3.6mmol)DCC，活化30min之后加545mg(3.3mmol)HCl·Gly-OBzl。反应液用N-甲基吗啉调pH至9，室温反应8h，TLC(氯仿/甲醇，10/1) 显示原料点消失。滤除DCU，滤液减压浓缩，残留物用150mL乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用50mL饱和NaHCO3洗3次，50mL饱和NaCl溶液洗3次，50mL饱和KHSO4洗3次，50mL饱和NaCl溶液洗3次，50mL饱和NaHCO3洗3次，50mL饱和NaCl溶液洗3次。乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥12h，过滤，滤液减压浓缩，得1.12g(90％)标题化合物，为无色油状液体。ESI-MS(m/z)：466[M+H]+。
实施例9制备Boc-Arg(NO2)-Gly
将1.12g(2.4mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl溶于100mL甲醇，冰浴下用2N NaOH调pH至12，反应6h后，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失。将反应液减压浓缩除去甲醇，水相用1N HCl调pH至2，用乙酸乙酯萃取3遍，合并的乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥12h，过滤，滤液减压浓缩得1.0g(90％)标题化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/z)：376[M-H]-。
实施例10制备Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl
采用实施例8的方法从808mg(2.5mmol)Boc-Asp(OBzl)和558mg(2.3mmol)HCl·Val-OBzl得1.12g(96％)标题化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/z)：512[M+H]+。
实施例11制备HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl
将1.28g(2.5mmol)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl与15mL 4N氯化氢/乙酸乙酯溶液冰浴下搅拌3h，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失。反应液减压浓缩，残留物用无水乙醚析晶，得到的目标化合物化合物直接用于下步反应。ESI-MS(m/z)：412[M+H]+。
实施例12制备Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(Obzl)-Val-OBzl的
采用实施例8的方法从1.0g(2.7mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly和0.87g(2.8mmol)HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl得1.8g(86％)标题化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/z)：770[M+H]+。
实施例13制备HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(Obzl)-Val-OBzl
采用实施例11的方法，从1.8g(2.5mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得到的标题化合物直接用于下步反应。ESI-MS(m/z)：670[M+H]+。
实施例14制备Boc-Asp(OBzl)-Ser-OBz
采用实施例8的方法从808mg(2.5mmol)Boc-Asp(OBzl)和546mg(2.8mmol)HCl·Ser-OBzl得1.1g(88％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/z)：501[M+H]+。
实施例15制备HCl·Asp(OBzl)-Ser-OBzl
采用实施例11的方法，从1.1g(2.2mmol)Boc-Asp(OBzl)-Ser-OBzl得到的标题化合物直接用于下步反应。ESI-MS(m/z)：401[M+H]+。
实施例16制备Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp-Ser-OBzl
采用实施例8的方法从1.0g(2.7mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly和1.4g(2.8mmol)HCl·Asp(OBzl)-Ser-OBzl得1.4g(70％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/z)：759[M+H]+。
实施例17制备HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp-Ser-OBzl
采用实施例11的方法，从1.4g(1.84mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp-Ser-OBzl得到的标题化合物直接用于下步反应。ESI-MS(m/z)：659[M+H]+。
实施例18制备Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
采用实施例8的方法从808mg(2.5mmol)Boc-Asp(OBzl)和714mg(2.8mmol)HCl·Phe-OBzl得1.32g(92％)标题化合物，为色粉末。ESI-MS(m/z)：574[M+H]+。
实施例19HCl·Asp(OBzl)-Phe-OBzl的制备
将1.32g(2.3mmol)Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl溶于少量的干燥乙酸乙酯中，冰浴条件下加入约100mL 4N HCl/EA，冰浴下搅拌反应3h，原料点消失后，减压抽干反应液，残留物用无水乙醚析晶，得到目标标题所示化合物，用于下步反应。ESI-MS(m/z)：474[M+H]+。
实施例20制备Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp-Phe-OBzl
采用实施例8的方法从1.0g(2.7mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly和1.32g(2.8mmol)HCl·Asp(OBzl)-Phe-OBzl得到1.7g(75％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/z)：818[M+H]+。
实施例21制备HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp-Phe-OBzl
采用实施例11的方法，从1.7g(1.22mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp-Phe-OBzl得到的标题化合物直接用于下步反应。ESI-MS(m/z)：718[M+H]+。
实施例22制备2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-(氧乙酰-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl)-苯基]-4，4，5，5-四甲基1，3-二氧咪唑啉
采用实施例8的方法从464mg(1mmol)2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-(氧乙酸)-苯基]-1，3-二氧-4，4，5，5-四甲基咪唑啉和910mg(1.3mmol)HCl·Arg(NO2)Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得到500mg(45％)标题化合物，为蓝色粉末。ESI-MS(m/z)：1117[M+H]+。
实施例23制备2-[3-(甲酰-Gly)-4-(氧乙酰-Arg-Gly-Asp-Val)]苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉(1)
冰浴下将110mg(0.1mmol)2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-(氧乙酰-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl)]苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉与1mL TFA及0.3mL TFMSA混合，搅拌15min，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失。反应混合物用无水乙醚稀释，静置，倾倒 上清液，残留物再用无水乙醚稀释，静置，倾倒上清液。该操作重复5次。减压浓缩至干，残留物用蒸馏水溶解，用25％氨水调pH＝7，用Sephadex G10除盐，C18柱纯化，冻干，得30mg(40％)标题化合物，为蓝色粉末，ESI-MS(m/z)：836[M+H]+。
实施例24制备2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-(氧乙酰-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl)]苯基-4，4，5，5-四甲基1，3-二氧咪唑啉
采用实施例8的方法从464mg(1mmol)2-[3-(甲酰-Ala-OtBu)-4-(氧乙酰-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl)]苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉和903.5mg(1.3mmol)HCl·Arg(NO2)Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl得到400mg(36％)标题化合物，为蓝色粉末。ESI-MS(m/z)：1107[M+H]+。
实施例25制备2-[3-(甲酰-Gly)-4-(氧乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser)]苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉(2)
采用实施例23的方法从100mg(0.1mmol)2-[3-(甲酰-Ala-OtBu)-4-(氧乙酰-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl)]苯基-4，4，5，5-四甲基1，3-二氧咪唑啉得20mg(27％)标题化合物，为蓝色粉末，ESI-MS(m/z)：824[M+H]+。
实施例26制备2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-(氧乙酰-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl)]苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉
采用实施例8的方法从464mg(1mmol)2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-(氧乙酸)-]苯基-4，4，5，5-四甲基1，3-二氧咪唑啉和975mg(1.3mmol)HCl·Arg(NO2)Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl得到525mg(45％)标题化合物，为蓝色粉末。ESI-MS(m/z)：1165[M+H]+。
实施例27制备2-[3-(甲酰-Gly)-4-(氧乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe)]苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉(3)
采用实施例23的方法从110mg(0.1mmol)2-[3-(甲酰-Ala-OtBu)-4-(氧乙酰-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl)]苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉得25mg(33％)标题化合物，为蓝色粉末，ESI-MS(m/z)：884[M+H]+。
实验例1评价化合物1-3清除NO自由基的活性
在JES300 JEOL顺磁共振仪上测定5.0μL 7.3mg N-甲基-葡萄糖胺二硫代甲酸与1mL超纯水的溶液+5.0μL3.5mg FeSO4·7H2O与1mL超纯水的溶液+5.0μL2.5mg亚硝基乙酰青霉胺与1mL超纯水的溶液产生的NO·的信号高度作为NO·的空白对照。
在JES300 JEOL顺磁共振仪上测定2.5μL 2.78g FeSO4·7H2O与1mL超纯水的溶液+2.5μL 11.32mg N-氧-二甲基吡啶与1mL超纯水的溶液+5μL H2O2产生的·OH的信号高度作 为·OH的空白对照。
清除率％＝(空白对照OH·或NO·信号峰高度-加入0.1mM化合物1-3或0.1mM NN后OH·或NO·信号峰高度)/空白OH·或NO·信号峰高度×100％。结果列入表1。数据表明，在0.1mM浓度下，化合物1-3与NN都能有效地清除OH·和NO·自由基。
表1 0.1mM化合物1-3清除OH·和NO·的％率(Mean±SD％)
n＝4；a)与NN比p＞0.05.
实验例2评价化合物1-3的抗血栓活性
将雄性SD大鼠(200±20g)，随机分组，每组10只，饲养1天，停止喂食过夜。灌胃给予化合物1-3的生理盐水溶液(剂量为100nmol/kg)或阿司匹林的生理盐水溶液(剂量为167μmol/kg)或生理盐水(剂量为10ml/kg)30min之后，大鼠用20％乌来糖的生理盐水溶液麻醉，之后手术。分离大鼠的右颈动脉和左颈静脉，将准确称重的丝线置于旁路插管，管的一端插入左静脉，另一端管插入右侧动脉并注射0.2mL肝素钠抗凝。使得血流从右侧动脉流经旁路插管进入左侧静脉，15min之后取出附有血栓的丝线称量，计算血液循环前后丝线的重量，得到的血栓重以均值±SD mg表示并代表抗血栓活性，作t检验。数据列入表2。结果表明口服100nmol/kg化合物1-3能有效地抑制血栓形成。其中100nmol/kg化合物1和2抑制血栓形成的活性与167μmol/kg阿司匹林相当，说明它的活性比阿司匹林强1670倍。与发明人公开的化合物的抗血栓活性相比，化合物1-3的活性强。说明结构简化之后，技术效果明显。
表2 100nmol/kg化合物1-3的抗血栓活性
n＝10；a)与生理盐水比p＜0.01，与阿司匹林比p＞0.05；b)与生理盐水比p＜0.01。
实验例3评价化合物1-3的溶血栓活性
SD大鼠(雄性，200±20g)按1200mg/kg-1的剂量腹腔注射乌拉坦生理盐水溶液进行麻醉。麻醉大鼠后将其仰卧位固定，分离其右颈总动脉，近心端处夹住动脉夹，将近心端及远心端分别穿入手术线，远心端的手术线结扎，远心端插管，将动脉夹松开，取出约1mL动脉血，置于1mL离心管中。往垂直固定的橡胶管(长15mm，内径2.5mm，外径5.0mm，管底用胶塞密封，para膜封紧)内注入0.1ml大鼠动脉血，随后在管内迅速插入一支不锈钢材质的血栓的固定螺栓(血栓固定螺旋用直径为0.2mm的不锈钢丝绕成，螺旋部分长10mm，内含15个螺圈，螺圈的直径为1.0mm，托柄与螺旋相连，长约7.0mm，呈问号型)。血液凝固45min后，从玻璃管中小心取出被血栓包裹的血栓固定螺旋，精确称其重量。
旁路插管由三部分构成，中间段为长60.0mm，内径3.5mm的聚乙烯胶管；两端均为长100.0mm，内径1.0mm，外径2.0mm的相同的聚乙烯管，该管一端拉成尖管，长约10.0mm(用于插入大鼠颈动脉及静脉)，外径为1.0mm，其另一端的外部套一段长为7.0mm，外径为3.5mm的聚乙烯管(用于插入中段的聚乙烯胶管内)，3段管的内壁均需要硅烷化(1％的硅油乙醚溶液)。将血栓包裹的血栓固定螺旋置于中段聚乙烯胶管内，胶管的另外两端分别与两根聚乙烯的加粗端相套，保证在循环的过程中不会漏血。用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50IU/kg)，排除气泡，备用。
分离大鼠的左颈外静脉，近心端和远心端分别穿入手术线，结扎远心端的血管，在暴露的左颈外静脉上剪一小口，将上述制备好的旁路管道尖管由小口插入左颈外静脉开口处，同时远离旁路管中段(含精确称量的血栓固定螺旋)内血栓固定螺旋。用注射器通过另一端的尖管注入准确量的肝素钠的生理盐水溶液(50IU/kg)，此时注射器不要撤离聚乙烯管，用动脉夹夹住注射器与聚乙烯管之间的软管。在右颈总动脉的近心端用动脉夹止血，结扎远心端，在离动脉夹不远处将右颈总动脉剪一小口，从聚乙烯管的尖部拔出注射器，将聚乙烯管的尖部插入动脉斜口的近心端。旁路管道的两端均用4号手术缝线将动静脉固定。
用头皮针将生理盐水(3ml/kg)或尿激酶的生理盐水溶液(剂量为20000IU/kg)或化合物1-3的生理盐水溶液(剂量为100nmol/kg)通过旁路管的中段(含精确称量的血栓固定螺旋)，扎入远离血栓固定螺旋的近静脉端，松开动脉夹，使血流通过旁路管道从动脉流向静脉。将注射器中的溶液缓慢注入血液，通过血液循环，按静脉-心脏-动脉的顺序作用于螺旋的血栓上。血液循环1h之后，从旁路管道中取出固定血栓的螺旋，精确称量。计算每只大鼠旁路管道中固定血栓的螺旋血液循环前后血栓的重量差，以均值±SD mg表示并代表 溶血栓活性，作t检验。数据列入表3。结果表明100nmol/kg化合物1-3能有效地溶解形成的血栓。其中100nmol/kg化合物2和3溶解血栓的活性与20000IU/kg尿激酶相当。说明结构简化之后，技术效果明显。
表3 100nmol/kg化合物1-3的溶血栓活性
n＝10；a)与生理盐水比p＜0.01；b)与生理盐水比p＜0.01，与尿激酶比p＞0.05。
实验例4评价化合物1-3对缺血性中风大鼠的治疗作用
在雄性SD大鼠(体重300±20g)的颈部正中部竖直开约2cm长切口，沿胸锁乳突肌内侧缘分离出右颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉。用无创动脉夹分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉近心端，结扎颈外动脉的远心端，在颈外动脉剪一小口，松开颈总动脉近心端的动脉夹，取10μl血，之后再用无创动脉夹夹闭颈总动脉的近心端。将取得的10μl血放置在1ml EP管中常温放置30分钟使血液凝固，然后转移至-20℃冰箱中放置1小时，使血液凝块结实。大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，剂量为400mg/kg。取出血液凝块，加入1ml生理盐水，用钢铲把血液凝块捣成大小均一的细小血栓块，制备细小血栓的悬液并转移至1ml注射器内。松开颈总动脉近心端的动脉夹，将1ml血栓混悬液缓慢从大鼠颈外动脉向近心端经过颈内动脉注入大鼠的大脑，然后结扎颈外动脉近心端，打开颈内动脉和颈总动脉处得动脉夹，恢复血流。等待苏醒。大鼠苏酮24小时后按Zealonga方法评定神经功能缺损程度。0分表示无任何神经功能缺失体征、1分表示未损伤侧前肢不能伸展、2分表示向未损伤侧行走、3分表示向未损伤侧转圈成追尾状行走、4分表示意识障碍无自主行走、5分表示死亡。按照得分平均分组。各组大鼠经尾静脉每天注射1次化合物1-3，剂量为100nmol/kg。连续注射6天，每天评分。结果列入表4-6。数据表明化合物1连续治疗6天除可维持3只脑缺血24小时的大鼠神经生物学评分为1分外，尤其可将7只脑缺血24小时神经生物学评分为2分和3分的大鼠改善为1分。因为不像已经公开的化合物首次剂量需要5μmol/kg，后5次维持剂量需要2μmol/kg，化合物1-3的6次剂量均为100nmol/kg。这样一来，首次剂量和维持剂量分别降低了50倍和20倍。加上结构简化的 好处，本发明获得了意想不到的技术效果。
表4化合物1连续治疗6天对脑缺血24小时大鼠神经生物学评分的影响
n＝8
表5化合物2连续治疗6天对脑缺血24小时大鼠神经生物学评分的影响
n＝9
表6化合物3连续治疗6天对脑缺血24小时大鼠神经生物学评分的影响
n＝11。