表达人肠道病毒71型衣壳蛋白的重组腺病毒、由其制备的疫苗和应用的制作方法

本发明涉及重组腺病毒，尤其涉及表达人肠道病毒71型衣壳蛋白的重组腺病毒，本发明还涉及由所述重组腺病毒在制备预防或治疗手足口病的疫苗中的应用，属于重组腺病毒的构建及应用领域。

背景技术：

肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)是引起人手足口病(Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD)的主要病原。该病多发于5岁以下儿童，患儿除发生手、足、口腔等部位的疱疹外，临床上还表现为疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎和脊髓灰质炎样麻痹，病症严重者可引起死亡。目前还无有效的措施阻止EV71疾病的流行，在疫情爆发时唯一控制EV71流行的方法就是公共卫生监督和隔离。

目前国内外EV71疫苗的研究主要集中在全病毒灭活疫苗。虽然灭活疫苗能够诱导高水平的中和抗体，可是制备灭活疫苗的种毒是活病毒，在生产过程中存在散毒的风险。因此，开发更加安全有效的新型疫苗是未来的发展方向。

腺病毒(Adenovirus，Ad)载体在多种哺乳动物细胞上能够高效地进行基因转导和蛋白表达，使其在疫苗开发及基因治疗的研究中广受青睐。最常用的腺病毒载体是缺损腺病毒5型，它是一种复制缺陷性型病毒，因缺失了复制所必须的E1和E3基因，导致其在体内不能复制，这就保证了该病毒作为疫苗载体的安全性，也因此排除了针对载体免疫应答的干扰，保证了载体疫苗在重复使用时的有效性。

缺损腺病毒5型载体具有较好的诱导特异性细胞介导免疫应答的能力；使用重组腺病毒疫苗时，不用佐剂即可以达到良好的免疫效果；同时， 腺病毒在感染细胞内不发生整合，这就排除了致癌和致突变的危险；Ad4和Ad7活载体疫苗已在美国批准使用30年，缺损型Ad5应用于基因治疗也有30年历史，至今在人类肿瘤细胞中尚未发现有腺病毒基因的整合。目前，已用腺病毒载体表达了多种病原体(包括细菌、病毒等病原微生物)的基因。动物试验表明，腺病毒载体疫苗由于能够同时诱导坚强的体液免疫和细胞介导免疫应答反应，所以用相应病原体攻击时的免疫保护效果均比较理想。

P1是EV71病毒的结构蛋白，在非结构蛋白3CD的作用下可裂解为衣壳蛋白VP0、VP1和VP3，并且能自动组装成病毒空衣壳。空衣壳在形态结构上与天然的病毒颗粒相似，具有很强的免疫原性和生物学活性，但不具有感染性，因此不存在散毒的风险。

有研究者尝试开发以腺病毒为载体表达EV71病毒衣壳蛋白的新型疫苗，但是由于构建策略不合理以及获得的重组腺病毒不稳定等因素，致使EV71病毒衣壳蛋白表达量极低而无应用前景(戈小琴等，中国生物制品学杂志，2010)。因此，构建稳定、高效表达EV71病毒衣壳蛋白的重组腺病毒，对于研制防治人手足口病的新型疫苗具有非常重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供两组含有EV71病毒衣壳蛋白P1基因和3CD基因的EV71亚基因组；

本发明的目的之二是提供两株稳定、高效表达人肠道病毒71型衣壳蛋白的重组腺病毒，该重组腺病毒能稳定、高效的表达EV71病毒的衣壳蛋白且遗传稳定，能够将其应用于制备预防或治疗人手足口病的疫苗。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来现实的：

本发明分别以碱性蛋白酶裂解位点和口蹄疫病毒2A基因相连接的融合基因、具有高翻译起始效率的口蹄疫病毒IRES元件为Linker，分别构 建了两组含有人肠道病毒71型(EV71)病毒结构蛋白前体P1基因和病毒蛋白酶3CD基因的亚基因组，即：P1-F2A-3CD和P1-IRES-3CD，两组亚基因组的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

口蹄疫病毒(FMDV)的2A蛋白和IRES元件常用于构建多个基因共表达的linker。但是，口蹄疫病毒的2A蛋白作为linker时，往往会与其前面的蛋白形成一个融合蛋白，2A的残留可能会影响该蛋白的折叠，进而影响蛋白的活性及空衣壳的组装。本发明通过大量的实验发现：在VP1蛋白和2A蛋白之间引入碱性蛋白酶裂解位点(Furin cleavage site)，蛋白翻译后细胞内的碱性蛋白酶可将linker 2A蛋白剪切掉，成功解决了2A蛋白残留对EV71VP1蛋白折叠以及空衣壳组装带来的影响。

IRES元件的起始蛋白合成效率受其来源以及序列差异的影响较大。不同种属病毒来源的IRES元件，其翻译起始效率差异非常大；即便是同一种属病毒，不同毒株来源的IERS翻译起始效率也不尽相同。另外，即使是同一IRES在不同的表达系统中起始蛋白的合成效率也存在较大的差异，即IRES的使用需要与表达系统相匹配。本发明通过大量的筛选实验最终发现，只有选用FMDV O/YS/CHA/05病毒株的IRES作为连接人肠道病毒71型(EV71)病毒结构蛋白前体P1基因和病毒蛋白酶3CD基因的linker，才能在腺病毒表达系统中实现起始3CD基因的高效表达。

本发明还公开了含有所述亚基因组P1-F2A-3CD或亚基因组P1-IRES-3CD的表达载体以及含有所述表达载体的宿主细胞；其中，所述的表达载体优选为腺病毒表达载体。

本发明将EV71亚基因组P1-F2A-3CD和P1-IRES-3CD插入到腺病毒穿梭载体中并与人缺损型腺病毒5型基因组进行同源重组，经大量的噬斑筛选和鉴定，最终筛选获得了两株能够高效、稳定表达EV71衣壳蛋白的重组腺病毒Ad5-A和Ad5-B：

本发明经多轮噬斑筛选获得了4株能够快速、稳定致HEK-293细胞 病变的重组腺病毒，分别为Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B和Ad5-B17。这4株重组腺病毒对HEK-293细胞致细胞病变效应与野生型腺病毒Ad5-WT相似。将上述4株重组腺病毒在HEK-293细胞上连续传10代，细胞均在60h左右完全病变。4株重组腺病毒的增殖滴度略低于野生型腺病毒Ad5-WT，但生长曲线动态相似。

本发明进一步将重组腺病毒Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B和Ad5-B17在HEK-293细胞上传代，对传至第3和第10代的病毒用特异性引物扩增EV71VP1基因。结果表明，第3代的4株重组腺病毒经PCR扩增VP1基因丰度相似；然而，第10代重组腺病毒Ad5-A13、Ad5-B17的VP1基因丰度明显低于Ad5-A、Ad5-B。推测Ad5-A13、Ad5-B17在传代过程中目的基因可能发生了丢失，而Ad5-A、Ad5-B具有良好的遗传稳定性。

Western blot结果表明，本发明获得的重组腺病毒(Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B和Ad5-B17)在感染的HEK-293细胞中能够表达EV71病毒完整的P1和3CD蛋白，同时3CD对P1进行了正确切割。另外，第3代和第10代重组腺病毒Ad5-A、Ad5-B与MAb 22A12反应条带的眼观显示密度相似，而第10代重组腺病毒Ad5-A13、Ad5-B17较其第3代与MAb 22A12反应条带的眼观显示密度明显减弱，Western blot结果与PCR检测结果相一致。上述结果表明，重组腺病毒Ad5-A以及Ad5-B能够稳定、高效表达EV71病毒衣壳蛋白。本发明通过大量的噬斑筛选，最终筛选获得复制能力好、遗传稳定而且蛋白表达量高的两株重组腺病毒Ad5-A和Ad5-B，这也是后期鼠体免疫效果好的重要原因。

本发明将筛选获得的重组腺病毒Ad5-A提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.10889；分类命名为：人腺病毒5型。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2015年6月16日；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明将筛选获得的重组腺病毒Ad5-B提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.10890；分类命名为：人腺病毒5型。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2015年6月16日；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

由于长片段的外源基因的插入，导致重组腺病毒不稳定，这是很多研究者构建的重组腺病毒不稳定和蛋白量表达低的重要原因。有研究者尝试开发以腺病毒为载体表达EV71病毒衣壳蛋白的疫苗，但是由于构建策略不合理以及获得的重组腺病毒不稳定等因素，致使EV71病毒衣壳蛋白表达量极低而无应用前景(戈小琴等，中国生物制品学杂志，2010)。本发明克服了上述技术困难，创造性地使用融合了碱性蛋白酶裂解位点的口蹄疫病毒2A基因和具有高翻译起始效率的口蹄疫病毒IRES元件作为Linker构建的EV71亚基因组，所获得的两株重组腺病毒能够高效、稳定的表达EV71病毒衣壳蛋白，且在鼠体内的免疫效果好。

对重组腺病毒Ad5-A、Ad5-B免疫鼠血清样品中的EV71特异性IgG抗体动态水平的评价结果表明，重组腺病毒Ad5-A、Ad5-B免疫组的EV71特异性IgG抗体在二次免疫后迅速升高，并在二免后两周达到高峰，随后开始缓慢下降。Ad5-A和Ad5-B免疫组的特异性IgG抗体水平略低于灭活EV71全病毒抗原免疫组，但无显著差异。

重组腺病毒Ad5-A、Ad5-B接种小鼠后诱导的针对EV71中和抗体水平及其动态变化检测结果表明，重组腺病毒Ad5-A、Ad5-B免疫组在一次免疫后，中和抗体水平逐渐上升，在二免后两周达到高峰，Ad5-A和Ad5-B的中和抗体滴度最高可达1：256，EV71灭活病毒对照组的中和抗体滴度最高为1：512。随后中和抗体滴度逐渐下降，在第12周时重组腺病毒Ad5-A、Ad5-B以及EV71灭活病毒组的中和抗体滴度下降到相近的水平。

由于本发明构建的重组腺病毒表达的EV71空衣壳基因来源于C4亚型的毒株EV71/Fuyang.Anhui.CHN/1708/1。为了确定该重组腺病毒在小鼠体内能否诱导EV71病毒的广谱型中和抗体，本发明用EV71不同基因型和基因亚型毒株与免疫鼠血清进行交叉中和试验。结果表明，二免后2周的鼠血清对EV71的B5、B4、C5、C4以及C2亚型病毒均能中和，且中和滴度均略高于1:128水平。上述结果表明，本发明构建的两株表达EV71衣壳蛋白的重组腺病毒在小鼠体内均能诱导产生高水平的广谱中和抗体。

重组腺病毒免疫鼠的细胞因子检测结果显示，Ad5-A，Ad5-B免疫组小鼠单核淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2和IL-4的水平均显著高于灭活EV71病毒抗原免疫组，表明重组腺病毒诱导抗EV71特异性细胞免疫应答的能力较灭活EV71病毒抗原具有显著的优势。

根据上述小鼠免疫接种实验结果，本发明构建获得的两株表达EV71衣壳蛋白的重组腺病毒可作为防控儿童手足口病的候选疫苗株，能够应用于制备预防或治疗由EV71引起的人手足口病疫苗。

因此，本发明进一步公开了一种预防或治疗由EV71引起的人手足口病的疫苗组合物，包括：免疫上有效量的所述人缺损型腺病毒5型重组腺病毒和药学上可接受的佐剂。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明使用融合了碱性蛋白酶裂解位点的口蹄疫病毒2A基因和具有高翻译起始效率的口蹄疫病毒IRES元件作为Linker构建EV71亚基因组；在腺病毒5型表达系统中，以这两种linker构建的EV71亚基因组均能正确表达EV71病毒的衣壳蛋白。经大量的噬斑筛选和传代，本发明最终筛选获得了两株高效表达EV71病毒衣壳蛋白的重组腺病毒，其在感染的细胞中能够表达EV71病毒完整的P1和3CD蛋白，同时3CD对P1进行了正确切割；在小鼠体内能够诱导高水平的广谱中和抗体，其诱导抗EV71特异性细胞免疫应答的能力较灭活EV71病毒抗原具有显著的优势，能够 作为预防或治疗由EV71引起的人手足口病的候选疫苗株，具有良好的应用前景。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“核苷酸”或“多核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。

术语“表达”意指内源性基因或转基因在细胞中的转录和/或翻译。

可互换使用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”指这样的药物组合物，其包 括在动物中诱导免疫应答的至少一种免疫原性组合物。疫苗或疫苗组合物可以保护动物免受由于感染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增强活性组分的免疫活性的一种或多种另外组分。疫苗或疫苗组合物可以另外包括对于疫苗或疫苗组合物典型的进一步组分，包括例如佐剂或免疫调节剂。疫苗的免疫活性组分可以包括以其原始形式的完全活生物体或在经修饰的活疫苗中作为经减毒的生物体，或在经杀死或灭活的疫苗中通过合适方法灭活的生物体，或包括病毒的一种或多种免疫原性组分的亚单位疫苗，或通过本领域技术人员已知的方法制备的遗传改造、突变或克隆的疫苗。疫苗或疫苗组合物可以包括一种或同时超过一种上述组分。

术语“佐剂”意指包括一种或多种物质的组合物，所述物质增强疫苗组合物的抗原性。佐剂可以充当缓慢释放抗原的组织储存，并且还充当非特异性增强免疫应答的淋巴样系统激活。通常，在不存在佐剂的情况下，用单独抗原的初次疫苗接种将无法引发体液或细胞免疫应答。佐剂包括但不限于完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、矿物质凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质。

附图说明

图1为两种EV71亚基因组拼接示意图；其中，A：P1-F2A-3CD亚基因组；B：P1-IRES-3CD亚基因组；

图2为重组腺病毒Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B和Ad5-B17感染的HEK-293细胞引起的细胞病变；

图3为Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B和Ad5-B17的一步生长曲线；

图4为重组腺病毒Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B和Ad5-B17的PCR鉴定结果；

图5为Western blot检测EV71衣壳蛋白在Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B和Ad5-B17感染细胞中的表达；

图6为重组腺病毒免疫小鼠诱导的EV71特异性IgG抗体；

图7为重组腺病毒免疫鼠血清对不同基因型和基因亚型EV71毒株的中和作用；其中，A：重组腺病毒Ad5-A、Ad5-B接种小鼠后诱导的针对EV71中和抗体水平及其动态变化；B：EV71不同基因型和基因亚型毒株与免疫鼠血清的交叉中和试验结果；

图8为重组腺病毒免疫小鼠的细胞因子水平检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、材料

1.1细胞、载体和毒株

腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV、E.coli BJ5183感受态菌以及HEK-293细胞均购自Stratagene公司。大肠杆菌DH5α感受态细胞、pOK12载体由本发明人实验室保存。含O型FMDV全长cDNA感染性克隆质粒PYS(中国发明专利，授权公告号CN 101838658B)，野生型腺病毒5型(Ad5-WT)，由本发明人实验室保存。EV71各基因亚型毒株JS52-3(C4亚型)、TW-2006-02203(B4亚型)、XMCDC-5535(B5亚型)、TW-2008-02969(C5亚型)、TW-2008-03149(C2亚型)以及灭活的EV71全病毒纯化抗原均由中国食品药品检定研究院病毒室保存。

1.2工具酶与主要试剂

C4亚型EV71VP1单克隆抗体(MAb)22A12由中国疾病预防控制 中心的毕胜利教授馈赠，限制性内切酶Pme I和Pac I购自NEB公司。PrimeSTAR DNA聚合酶和其他限制性内切酶均购自TaKaRa公司。T₄DNA连接酶购自NEB公司。转染试剂采用QIAGEN公司的Effenctene Transfection Reagent转染试剂盒。质粒提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒以及小量胶回收试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司。辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG(HRP-IgG)购自Sigma公司。EV71全病毒抗原包被的ELISA试剂盒，购自北京贝尔生物工程有限公司(北京)。

实施例1表达人肠道病毒71型衣壳蛋白的重组腺病毒的构建

1、实验方法

1.1引物设计与合成

根据GeneBank上已登录的C4亚型EV71/Fuyang.Anhui.CHN/1708/1毒株基因组序列，人工合成EV71P1-F2A-3CD亚基因组，并克隆于pUC57载体上，命名为pUC57-A。用于构建EV71P1-IRES-3CD亚基因组的引物见表1。引物设计使用Oligo 6.0软件，引物及EV71P1-F2A-3CD基因均由上海生物工程有限公司合成。

P1-F2A-3CD亚基因组，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；P1-IRES-3CD亚基因组，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

表1用于构建EV71P1-IRES-3CD亚基因组的引物

1.2重组腺病毒穿梭载体的构建

分别以质粒pUC57-A和pYS为模板，用表1中引物扩增含相应酶切位点的P1、3CD和IRES基因片段，并按图1的设计方案，拼接、克隆于 pOK12载体中，获得的重组质粒命名为pOK-B。

经测序验证正确的pOK-B重组质粒与pUC57-A重组质粒，经限制性内切酶Hind III和Not I双酶切后，将两个EV71亚基因组分别定向克隆至pShuttle-CMV载体中，获得的重组穿梭质粒分别命名为pShuttle-A和pShuttle-B。

1.3重组腺病毒质粒的构建

将pShuttle-A和pShuttle-B用限制性内切酶PmeI线性化，电转化至含有腺病毒骨架载体AdEasy-1的BJ5183感受态菌(AdEasy-1-BJ5183)中。经卡那霉素抗性筛选，提取质粒，用Pac I酶切鉴定，选择3个阳性重组腺病毒质粒进行测序，确定正确的命名为pAd5-A和pAd5-B。

1.4转染

阳性质粒pAd5-A和pAd5-B转化DH5α感受态菌，大量增殖重组质粒。用中量质粒提取试剂盒提取腺病毒重组质粒，用Pac I酶切，乙醇沉淀灭菌，超净工作台无菌吹干并以无菌超纯水溶解沉淀，使质粒的终浓度为1～2mg/ml。用QIAGEN公司转染试剂Effectene Transfection Reagent转染HEK-293细胞，具体操作按说明书进行。

将收获的重组腺病毒反复冻融后，离心取上清，接种HEK-293细胞，连续传10代，观察细胞病变情况。

2、实验结果

将含有EV71亚基因组的重组腺病毒质粒pAd5-A和pAd5-B经限制性内切酶PacI线性化后转染HEK-293细胞，转染后7天细胞开始出现病变，细胞变圆、变大、脱落，这表明重组腺病毒已成功拯救。将两种以不同方式构建的重组腺病毒分别经多轮噬斑筛选，获得了4株能够快速、稳定致HEK-293细胞病变的重组腺病毒，分别命名为Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B和Ad5-B17。这4株重组腺病毒对HEK-293细胞致细胞病变效应 与野生型腺病毒Ad5-WT相似，正常对照细胞HEK-293细胞生长良好(图2)。

将重组腺病毒Ad5-A、Ad5-A13和Ad5-B、Ad5-B17在HEK-293细胞上连续传10代，细胞均在60h左右完全病变。

实验例1表达人肠道病毒71型衣壳蛋白的重组腺病毒的鉴定

1、实验方法

1.1重组腺病毒的PCR鉴定

将实施例1获得的重组腺病毒Ad5-A、Ad5-A13和Ad5-B、Ad5-B17接种HEK-293细胞，连续传10代；取第3代和第10代病毒，用DNA抽提试剂盒提取DNA后，使用EV71VP1基因特异性引物(VP1-U:5'GGG GAT AGA GTG GCA GAT GTG AT 3'，VP1-L:5'AAG AGT AGT GAT GGC ATT GCG AC 3')对目的基因VP1进行PCR扩增检测。

1.2Western blot

将感染第3和第10代重组腺病毒的HEK-293细胞进行SDS-PAGE分析，同时分别设立野生型腺病毒(Ad5-WT)感染的HEK-293细胞和HEK-293细胞作为阴性对照，以MAb 22A12(1:1000稀释)为一抗，37℃作用1h，用PBST洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG(1:10,000稀释)，37℃作用1h，洗涤后加入DAB溶液显色。

1.3重组腺病毒增殖比较试验

用10MOI剂量的第10代重组腺病毒(Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B和Ad5-B17)以及Ad5-WT分别接种HEK-293细胞，在接种后12、24、36、48、60和72h收取病毒并进行毒价测定，绘制重组腺病毒与野生型腺病毒的一步生长曲线。

2、实验结果

2.1重组腺病毒的生长特性

为比较重组腺病毒的生长特性，本发明分别绘制了Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B、Ad5-B17的第10代重组腺病毒以及Ad5-WT的一步生长曲线并进行比较(图3)。

实验结果表明，噬斑筛选获得的四株重组腺病毒的增殖滴度虽略低于野生型腺病毒Ad5-WT，但生长曲线动态相似。随着重组腺病毒感染HEK-293细胞时间的延长，病毒滴度逐渐升高，在60h时重组腺病毒的滴度达到峰值，随后开始下降。

2.2EV71衣壳蛋白在重组腺病毒中的表达及其稳定性

将重组腺病毒Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B和Ad5-B17在HEK-293细胞上传代，对传至第3代和第10代的病毒，用DNA抽提试剂盒提取重组病毒DNA，用特异性引物扩增EV71VP1基因。结果如图4所示，第3代的4株重组腺病毒经PCR扩增VP1基因丰度相似(图4)，Ad5-WT未扩增出相应条带。然而，第10代重组腺病毒Ad5-A13、Ad5-B17的VP1基因丰度明显低于Ad5-A、Ad5-B。推测Ad5-A13、Ad5-B17在传代过程中目的基因可能发生了丢失。这些实验结果表明，相比重组腺病毒Ad5-A13和Ad5-B17，重组腺病毒Ad5-A、Ad5-B具有良好的遗传稳定性。

对重组腺病毒Ad5-A、Ad5-A13、Ad5-B和Ad5-B17表达EV71衣壳蛋白的能力进行Western blot分析。由于本发明在EV71VP1蛋白与linker2A蛋白之间引入碱性蛋白酶裂解位点，因此linker 2A蛋白能够在细胞内被剪切去除，从而形成完整的VP1蛋白，不影响病毒空衣壳的包装。结果如图5所示，4株重组腺病毒表达的蛋白与MAb 22A12发生特异性免疫反应的条带与EV71VP1的大小相当，野生型腺病毒和正常细胞未出现特异性条带。这些结果表明，本发明获得的重组腺病毒在感染的HEK-293细胞中能够表达EV71病毒完整的P1和3CD蛋白，同时3CD对P1进行了正确切割。另外，第3代和第10代重组腺病毒Ad5-A、Ad5-B与MAb 22A12反应条带的眼观显示密度相似，而第10代重组腺病毒Ad5-A13、Ad5-B17较其第3代与MAb 22A12反应条带的眼观显示密度明显减弱，Western blot结果与PCR检测结果相一致。这些结果表明，相比重组腺病毒Ad5-A13和Ad5-B17，重组腺病毒Ad5-A以及Ad5-B能够更加稳定、高效的表达EV71病毒衣壳蛋白。

本发明将重组腺病毒Ad5-A、Ad5-B分别提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，其微生物保藏编号分别为：CGMCC No.10889、CGMCC No.10890。

实验例2表达人肠道病毒71型衣壳蛋白的重组腺病毒的免疫实验

1、实验方法

1.1重组腺病毒免疫BALB/c鼠

选用6周龄SPF级BALB/c雌鼠140只，购自于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。随机分成4组，每组35只，其中第1组免疫重组腺病毒Ad5-A(微生物保藏编号为：CGMCC No.10889)；第2组免疫重组腺病毒Ad5-B(微生物保藏编号为：CGMCC No.10890)；第3组为阴性对照组，免疫重组腺病毒Ad5-WT；第4组为阳性对照组，免疫灭活的EV71全病毒纯化抗原0.25μg/次/只。重组腺病毒接种剂量为3×10⁷TCID₅₀/ml的病毒液200μl，接种方式为腿部肌肉注射。在第一次免疫后4周以相同剂量加强免疫，分别在一免后0、3、6、9、12周随机抽取5只小鼠，摘取眼球采血。

1.2间接ELISA

采集小鼠免疫血清置于37℃1h，然后4℃过夜。4,000rpm离心10min后分离血清，按1:100稀释用北京贝尔生物工程有限公司的EV71全病毒包被的ELISA试剂盒检测血清样品中的特异性IgG抗体水平，具体操作按试剂盒说明书进行。

1.3微量病毒中和试验

待检血清按1:8比例稀释后，56℃灭活30min；于96孔板中2倍系列稀释，分别与100TCID₅₀的EV71混合，37℃作用2h，每块细胞培养板均设细胞对照、血清对照和病毒对照；加入人横纹肌肉瘤(RD)细胞悬液，100μl/孔，细胞终浓度为2×10⁵个/ml，置CO₂培养箱中35℃培养7d，将能抑制50％细胞病变的最高稀释度判定为血清中和效价。

1.4细胞因子检测

小鼠在加强免疫后3周，无菌取小鼠的脾脏，制备脾细胞悬液，800g离心30min，分离小鼠脾脏单个核细胞，96孔板按5×10⁶个/ml的细胞密度加入100μl/孔，经EV71VP2-36(0.8g/ml，10μl/孔)刺激60h后，按Platinum ELISA试剂盒(eBioscience,San Diego,CA)说明书分别检测小鼠脾单核淋巴细胞分泌IL-2、IL-4、IFN-γ的水平，实验设培养基对照孔、空白对照孔和刀豆蛋白(ConA)刺激对照孔。

2、实验结果

2.1重组腺病毒免疫小鼠诱导的特异性IgG抗体应答

用全病毒作为包被抗原的商品化EV71IgG抗体ELISA检测试剂盒，对免疫鼠血清样品中的EV71特异性IgG抗体动态水平进行评价(图6)。重组腺病毒Ad5-A、Ad5-B以及灭活EV71全病毒抗原免疫组的EV71特异性IgG抗体，在二次免疫后迅速升高，并在二免后两周(初免后第6周)达到高峰，随后开始缓慢下降。Ad5-A和Ad5-B免疫组的特异性IgG抗体水平略低于灭活EV71全病毒抗原免疫组，但无显著性差异。Ad5-WT免疫组作为阴性对照，无EV71特异性IgG抗体产生。

2.2重组腺病毒在小鼠体内诱导的中和抗体及其对不同基因亚型EV71病毒的交叉中和能力

利用病毒微量中和试验方法跟踪检测重组腺病毒Ad5-A、Ad5-B接种 小鼠后诱导的针对EV71中和抗体水平及其动态变化(图7A)。重组腺病毒Ad5-A、Ad5-B以及EV71灭活病毒免疫组在一次免疫后，中和抗体水平逐渐上升，在二免后两周达到高峰，其中Ad5-A和Ad5-B的中和抗体滴度最高可达1:256，EV71灭活病毒对照组的中和抗体滴度最高为1:512。随后，中和抗体滴度逐渐下降，在第12周时，重组腺病毒Ad5-A、Ad5-B以及EV71灭活病毒组的中和抗体滴度下降到相近的水平。野生型腺病毒对照组未能检出EV71中和抗体。

由于本发明构建的重组腺病毒表达的EV71空衣壳基因来源于C4亚型的毒株EV71/Fuyang.Anhui.CHN/1708/1。为了确定该重组腺病毒在小鼠体内能否诱导EV71病毒的广谱型中和抗体，本发明用EV71不同基因型和基因亚型毒株与免疫鼠血清进行交叉中和试验(图7B)。结果表明，二免后2周的鼠血清对EV71的B5、B4、C5、C4以及C2亚型病毒均能中和，且中和滴度均略高于1:128水平。这些结果表明，本发明构建的两株表达EV71衣壳蛋白的重组腺病毒Ad5-A和Ad5-B在小鼠体内均能诱导产生高水平的广谱中和抗体。

2.3重组腺病毒在小鼠体内诱导EV71特异性细胞介导免疫的评价

目前，EV71疫苗诱导的免疫应答研究多集中于体液免疫方面。可是近年来的研究发现，细胞免疫应答在抗EV71感染过程中尤为重要。辅助性T细胞主要分Th1和Th2两个细胞亚群，Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等细胞因子，主要效应功能是增强吞噬细胞介导的抗感染机制，特别是抗细胞内寄生菌或病毒的感染。Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等细胞因子，主要作用是增强B细胞介导的体液免疫应答。辅助性T细胞分泌细胞因子的水平代表相应T细胞的活化程度以及细胞免疫强度。

重组腺病毒免疫鼠的细胞因子检测结果显示，灭活EV71病毒抗原免疫组小鼠，其脾脏单核淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2和IL-4的水平较低，与野生型腺病毒对照组诱导水平相似(图8)。然而，Ad5-A，Ad5-B免疫 组小鼠，其单核淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2和IL-4的水平均显著高于灭活EV71病毒抗原免疫组(图8)。这些结果表明，本发明构建的两株重组腺病毒Ad5-A和Ad5-B诱导抗EV71特异性细胞免疫应答的能力较灭活EV71病毒抗原具有显著的优势。

根据小鼠免疫接种试验结果，本发明构建的两株重组腺病毒Ad5-A和Ad5-B可作为防控儿童手足口病的候选疫苗株。