一种α‑酮基丁酸的发酵生产工艺的制作方法

文档序号:11809374阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种α-酮基丁酸的发酵生产工艺,其特征在于:对大肠杆菌E.coliTHRD(保藏号CGMCC No.11074)苏氨酸脱水酶编码基因ilvA进行定点突变、解除L-异亮氨酸对ilvA的反馈抑制的基础上过表达ilvA;敲除了乙酰羟基酸合成酶III的大亚基编码基因ilvI;利用温度控制诱导的方式,采用发酵法生产α-酮基丁酸,其中,最佳诱导时机和最合适的升温诱导模式为:35-37℃培养菌体,生长到OD600为20-25时,0.5h内升温至40-42℃。

2.根据权利要求1所述的α-酮基丁酸的发酵生产工艺,其特征在于:利用温控诱导方式制备α-酮基丁酸,具体步骤如下:

Ⅰ、摇瓶发酵积累α-酮基丁酸

<1>活化斜面培养:将产生α-酮基丁酸的基因工程菌划线接于1支新鲜AmpR抗性斜面,37℃培养16h左右;

<2>摇瓶种子培养:从新鲜活化斜面上挑取1环菌体接于30mL的种子培养基中,200r/min,35-37℃恒温振荡培养,种子培养期间根据指示剂苯酚红颜色变化,用25%(W/V)氨水调节pH≈6.7-7.0;

<3>摇瓶发酵培养:保证溶氧充足情况下,500mL挡板三角瓶装液量30mL,9层纱布封口;待种子液培养至OD600值约为8-10时,种龄为10-12h,按8-10%接种量接入发酵培养基中,200r/min,32-35℃恒温振荡培养;待发酵4-6h,菌体OD600值约为10-15时,将发酵温度从32-35℃直接提高到40-42℃开始升温诱导,直至24h发酵结束,发酵期间补加25%(W/V)的氨水维持发酵液pH≈6.7-7.0;

上述步骤(3)所得α-酮基丁酸的产量可达到9.4-12.5g/L;

Ⅱ、7.5L发酵罐发酵积累α-酮基丁酸

<1>活化斜面培养:将产生α-酮基丁酸的基因工程菌划线接于4支新鲜AmpR抗性斜面,37℃培养16h左右;

<2>7.5L罐种子培养:吸取适量灭菌的去离子水于4支新鲜的活化斜面,刮下所有菌体后将菌悬液接入装有2L种子培养基的5L发酵罐;种子培养温度为35-37℃,通气量变化范围为2-5L/min,搅拌转速变化范围为100-500r/min,期间通过流加25%(W/V)的氨水控制pH≈6.7-7.0;

<3>7.5L罐发酵培养:种子液培养至OD600=10-15时,种龄约为7h,将500mL左右种子液转移到含有3.5L新鲜无菌发酵培养基的7.5L发酵罐中,总装液量为4L,接种量为8-10%;32-35℃开始进行发酵培养;待种子液OD600值为20-25时,在0.5-1.0h内将发酵温度从32-35℃提高到40-42℃开始升温诱导,直至28h发酵结束,发酵过程中通过自动流加25%(W/V)氨水控制pH≈6.7-7.0,溶氧控制在30-50%,通气量变化范围为2-8L/min,搅拌转速变化范围为200-900r/min;当发酵培养基中葡萄糖耗完后,将80%(W/V)葡萄糖溶液按1-1.5mL/min的脉冲速度流加至培养基中以维持发酵液中残糖浓度控制在0-1g/L;

上述步骤(3)所得α-酮基丁酸的产量可达到16.5-22.8g/L。

3.根据权利要求2所述的α-酮基丁酸的发酵生产工艺,其特征在于:所述产生α-酮基丁酸的基因工程菌是以苏氨酸生产菌株E.coli THRD(保藏号CGMCC No.11074)为出发菌株,利用热诱导型表达载体PBV220、PBV221或PBV222过表达定点突变的苏氨酸脱水酶编码基因ilvA并敲除乙酰羟基酸合成酶III的大亚基编码基因ilvI。

4.根据权利要求1或3所述的α-酮基丁酸的发酵生产工艺,其特征在于:所述定点突变的苏氨酸脱水酶编码基因ilvA的核苷酸序列为序列表<400>2所示序列;所述编码基因ilvA原始(未突变)核苷酸序列为序列表<400>1所示序列;所述编码基因ilvI的核苷酸序列为序列表<400>3所示序列。

5.根据权利要求3所述的α-酮基丁酸的发酵生产工艺,其特征在于:所述产生α-酮基丁酸的基因工程菌是由下述方法构建得到的,具体步骤为:

一、基因ilvI的敲除

<1>采用PCR技术以大肠杆菌E.coli THRD(保藏号CGMCC No.11074)基因组为模板,根据E.col iMG1655中ilvI(GeneID:948793)基因的5’和3’端500bp序列设计同源臂引物,扩增获取ilvI基因的上下游同源臂;

<2>采用PCR技术以pKD3质粒为模板,设计引物,扩增氯霉素抗性基因片段;

<3>以<1>、<2>获得的扩增片段为模板通过重叠PCR获得ilvI基因的敲除片段,所述敲除片段由乙酰羟基酸合成酶III大亚基编码基因ilvI的上、下游同源臂基因片段以及氯霉素抗性基因片段组成;

<4>将上述基因敲除片段电转入含pKD46质粒的大肠杆菌E.coliTHRD感受态细胞中获得阳性转化子,消除掉阳性菌中的氯霉素抗性基因后即可获得ilvI基因敲除菌;

二、ilvA基因的定点突变和过表达

<1>采用PCR技术以大肠杆菌E.coli THRD(保藏号CGMCC No.11074)基因组为模板,根据E.col i MG1655中ilvA基因的5’端到突变处设计引物ilvA-1、ilvA-2,突变得到3’端设计引物ilvA-3、ilvA-4,扩增获取ilvA基因突变处前后的两段片段A1和A2;

<2>通过引物ilvA-2和ilvA-3完全反向互补,扩增片段重叠后将碱基序列GCTGCTGCGCTTCCT突变为GTCTGCTGCGCTTCGC,即以<1>中获得的两条扩增片段为模板通过重叠PCR获得突变后的ilvA基因;

<3>将点突变后的ilvA基因及温控表达载体PBV220分别用pst I和BamHI进行双酶切后连接,连接产物转化至上述ilvI基因敲除菌中,菌落PCR鉴定后获得的阳性转化子即为本发明所述的产生α-酮基丁酸的基因工程菌;

另外,步骤二<3>所述将点突变后的ilvA基因及温控表达载体PBV220分别用pst I和BamHI进行双酶切后连接,该步骤中的PBV220同样可用于PBV221-ilvA或PBV222-ilvA,即所述PBV221-ilvA和PBV222-ilvA构建方法相同。

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