一种产纤维素木醋杆菌菌体浓度的在线评价方法与流程

本发明属于生物发酵领域，特别涉及一种产纤维素木醋杆菌菌体浓度的在线评价方法。

背景技术：

细胞纤维素(Bacterial Cellulose，BC)是一类细菌合成的惰性高分子化合物材料。与天然纤维素结构相似，都是由葡萄糖以β-1，4-糖苷键连接而成。而细菌纤维素又具有独特的物理结构和性质，如具有优异的生物亲和性、生物相容性、生物适应性和良好的生物可降解性，是世界是公认的性能优异的新型生物学材料。目前BC已经在食品、医药、化工、造纸、美容和滤膜等方面取得成功的应用。目前能够产生BC的细菌主要有Acetobacter、Rhizobium、Agrobacterium和Sarcina等，其中产量最高、应用最广的为木醋杆菌(Acetobacter xylinus)。

在发酵工业中，菌体浓度是最重要的工艺参数，培养基的利用情况、菌体代谢活性、产物利率和培养周期等，均与菌体浓度密切相关，因此在发酵过程中对菌体浓度进行监控显得尤为重要。然而，木醋杆菌在培养过程中，会被自身生成的纤维素丝包裹起来，发酵液中易形成絮状菌团，所以其菌体浓度的评价一直以来是个难题。

目前常用的菌体浓度评价方法有两大类：

1)传统离线检测方法，如分光光度法和干湿重法，前者的检测原理是通过测定细菌在特定波长处或一定波长范围内光的吸光度或发光强度，对菌体进行定量分析，但由于木醋杆菌培养基有较深的颜色及产生的纤维素丝会干扰光的吸收，造成检测结果往往有很大的偏差；后者是对培养液离心收集菌体，而后称量菌体的湿重或者干重，但由于木醋杆菌培养产生的纤维素丝也会随着菌体离心下来，且占有比较大的比例，因此检测结果也不准确。另一种常用离线检测方法为平板菌落计数法，检测结果比较准确，但该方法操作费时费力，一般需要3～4天才能得到结果，有很大的时间滞后性。另外，以上这些方法均需要隔一段时间取一次样，取样过程要打开生物反应器极易带进杂菌而造成染菌。

2)在线检测方法，如在线光学浊度法，但木醋杆菌的培养基颜色、不溶颗粒和大量气泡会干扰光的传播，虽然没有了取样的麻烦，检测结果也能时时在线更新，但检测结果偏差太大，因而无法应用于木醋杆菌菌体浓度评价。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种产纤维素木醋杆菌菌体浓度的在线评价方法。该方法建立了菌体浓度与电容率之间的关系模型，在发酵液中加入气体分布器有效减少了发酵液中的纤维素菌团之间相互缠绕成团，插入两根工作电极，在两根工作电极产生的交互电场影响下，溶液中的离子向电极迁移，有完整等离子细胞壁的活细胞被极化，形成很小的电容。细胞浓度越高，等离子细胞壁越多，电容 越大。不同于常规的光学仪器，该系统只针对活菌体，对于死菌体或者是培养液中的任何不溶颗粒都不敏感，因此检测的结果准确可靠。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种产纤维素木醋杆菌菌体浓度的在线评价方法，包括如下步骤：

(1)菌株活化：取冻干保存的木醋杆菌涂布到平板固体培养基上，28-32℃培养4-8天生成单菌落，挑选上述培养好的单菌落，用接种环均匀涂在斜面固体培养基上，于28-32℃的恒温培养箱中培养2-4天。

(2)摇瓶培养：用无菌小铲取一小块上述培养好的斜面薄膜，接入摇瓶液体培养基中，28-32℃培养4-6h。

(3)种子罐培养：将气体分布器置于种子罐中，并将在线电容检测装置的两根工作电极从种子罐侧向插入，然后装入液体培养基，经高温蒸汽灭菌后，将步骤(2)培养好的摇瓶种子液全部接入种子罐开始培养，培养温度28-32℃，培养压力为20-50Kpa，空气流量为3-10L/min。

(4)检测：在步骤(3)种子罐中进行培养的同时，开启在线电容检测装置，并将检测频率设置为300～2000Hz，实时在线监测的电容率的变化。

(5)终点：根据电容率变化与菌体浓度相关联的关系模型，绘制菌体浓度趋势图确定发酵培养的终点。

一些实施例中，本发明所述的步骤(1)的固体培养基组成为：葡萄糖2％-3％，多聚蛋白胨0.5％-1％，柠檬酸0.1％-0.2％，七水硫酸镁0.03％-0.05％，硫酸铵0.5％-1％，磷酸二氢钾0.3％-0.5％，乙酸钠0.1％-0.2％，琼脂粉2％-2.5％。

一些实施例中，本发明所述步骤(2)和步骤(3)的液体培养基组成为：果糖1％-4％，玉米浆0.5％-2％，柠檬酸0.2％-0.5％，十二水磷酸氢二纳0.2％-0.5％，七水硫酸镁0.03％-0.05％，磷酸氢二铵0.4％-1％。

一些实施例中，本发明所述步骤(2)和步骤(3)的液体培养基组成为：葡萄糖2％-3％，酵母粉0.5％-1％，柠檬酸0.115％-0.2％，十二水磷酸氢二纳0.34％-0.5％，大豆蛋白胨0.5％-1％，磷酸氢二铵0.1％-0.2％。

一些实施例中，本发明所述步骤(2)和步骤(3)的液体培养基组成为：葡萄糖2-3％，玉米浆干粉0.5％-1.5，柠檬酸0.1％-0.3％，十二水磷酸氢二纳0.1％-0.3％，七水硫酸镁0.02％-0.04％，磷酸氢二铵0.2％-0.6％。

一些实施例中，本发明所述步骤(3)的气体分布器，优选的为环管式多孔气体分布器。气体分布器的加入有效减少了发酵液中的纤维素菌团之间相互缠绕成团。

一些实施例中，本发明步骤(3)所述的种子罐的体积为15L-100L。

一些实施例中，本发明步骤(3)所述的装入液体培养基的体积为种子罐体积的60％-70％。

一些实施例中，本发明步骤(3)和步骤(4)所述的在线电容检测装置，包括工作电极、传感器、转换器、频率控制元件及显示器。

一些实施例中，本发明步骤(3)和步骤(4)所述的在线电容检测装置，其中的工作电极，优选的为铂电极探头。

一些实施例中，本发明步骤(3)和步骤(4)所述的在线电容检测装置，其中的显示器显示的参数是电容率，单位为pF/cm。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

1)根据木醋杆菌的菌体特征寻找到一个最佳检测频率范围，建立了菌体浓度与电容率之间的关系模型，实时显示菌体浓度及活性状态，有利于加深对发酵培养过程的理解，准确掌控发酵培养的周期；

2)操作简便；无需取样，减少染菌风险，且检测结果准确、稳定、及时；

3)根据在线菌体浓度数据的指导意义，调整相关培养工艺，较大幅度提高木醋杆菌菌体浓度，并缩短培养周期；

4)根据在线的菌体浓度调整培养工艺实现了细菌纤维素生产的逐级放大，此培养工艺在细菌纤维素生产小试、中试和工业化生产过程中均得到很好应用；

5)通过调整培养基配方和改善气体分布器类型，在一定程度上减少了菌体培养过程中产生的纤维素丝缠绕成团的现象，使得纤维素能够均匀悬浮分布，这样大大加强了菌体浓度检测的准确性。

附图说明

图1，实施例1培养过程中平板菌落计数与电容率的变化趋势图；

图2，实施例1培养过程中平板菌落计数与电容率的相关性；

图3，实施例2培养过程中平板菌落计数与电容率的变化趋势图；

图4，实施例2培养过程中平板菌落计数与电容率的相关性；

图5，实施例3培养过程中平板菌落计数与电容率的变化趋势图；

图6，实施例3培养过程中平板菌落计数与电容率的相关性。

具体实施方式

下面以具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明不受下述实施例的限定。

实施例1

(1)菌株活化

固体培养基的配制：葡萄糖2％-3％，多聚蛋白胨0.5％-1％，柠檬酸0.1％-0.2％，七水硫酸镁0.03％-0.05％，硫酸铵0.5％-1％，磷酸二氢钾0.3％-0.5％，乙酸钠0.1％-0.2％，琼脂粉2％-2.5％。

取冻干保存的木醋杆菌涂布到平板固体培养基上，28℃培养4天生成单菌落。挑选上述培养好的单菌落，用接种环均匀涂在斜面固体培养基上，于28℃的恒温培养箱中培养4天。

(2)摇瓶培养

液体培养基的配制：葡萄糖2％-3％，酵母粉0.5％-1％，柠檬酸0.115％-0.2％，十二水磷酸氢二纳0.34％-0.5％，大豆蛋白胨0.5％-1％，磷酸氢二铵0.1％-0.2％。

用无菌小铲取上述培养好的斜面薄膜，接入摇瓶液体培养基中，28℃培养5h。

(3)种子罐培养

液体培养基的配制：葡萄糖2％-3％，酵母粉0.5％-1％，柠檬酸0.115％-0.2％，十二水磷酸氢二纳0.34％-0.5％，大豆蛋白胨0.5％-1％，磷酸氢二铵0.1％-0.2％。

将环管式多孔气体分布器置于15L种子罐中，并将在线电容检测装置的两根工作电极从种子罐侧向插入，然后装入10L液体培养基，经高温蒸汽灭菌后，最后将步骤(2)培养好的摇瓶种子液全部接入种子罐开始培养，培养温度28℃，培养压力为30Kpa，空气流量为6L/min；

(4)检测：在步骤(3)种子罐中进行培养的同时，开启在线电容检测装置，并将检测频率设置为300～1300Hz，实时在线监测的电容率的变化，如图1所示；

(5)终点：培养24h结束。

(6)结果分析：

1)由于图2可以看出在线电容检测系统的电容率与平板菌落计数之间有良好的线性相关性，其中，相关系数r＝0.992，表明电容率可间接代表平板菌落计数，并且二者之间的关系模型为：平板菌落计数＝1.567*电容率+0.049。

2)15L规模培养时，由平板菌落计数法计数显示(每4h取样)，在20h达到最大菌体浓度1.8±0.2(10⁶个/mL)，而本申请的在线电容检测系统的电容率结果显示在18h时电容率为1.1pF/cm，菌体浓度已经达到最大值。表明平板菌落计数法由于受到取样频率的限制，很容易漏掉关键的“拐点”，而在线电容检测法却能实时显示过程变化，可将15L小试的培养周期成功的缩短为18h，节约了成本。

实施例2

(1)菌株活化

固体培养基的配制：葡萄糖2％-3％，多聚蛋白胨0.5％-1％，柠檬酸0.1％-0.2％，七水硫酸镁0.03％-0.05％，硫酸铵0.5％-1％，磷酸二氢钾0.3％-0.5％，乙酸钠0.1％-0.2％，琼脂粉2％-2.5％。

取冻干保存的木醋杆菌涂布到平板固体培养基上，30℃培养6天生成单菌落。挑选上述培养好的单菌落，用接种环均匀涂在斜面固体培养基上，于30℃的恒温培养箱中培养3天。

(2)摇瓶培养

液体培养基的配制：果糖1％-4％，玉米浆0.5％-2％，柠檬酸0.2％-0.5％，十二水磷酸氢二纳0.2％-0.5％，七水硫酸镁0.03％-0.05％，磷酸氢二铵0.4％-1％。

用无菌小铲取上述培养好的斜面薄膜，接入摇瓶液体培养基中，30℃培养6h。

(3)种子罐培养

液体培养基的配制：果糖1％-4％，玉米浆0.5％-2％，柠檬酸0.2％-0.5％，十二水磷酸氢二纳0.2％-0.5％，七水硫酸镁0.03％-0.05％，磷酸氢二铵0.4％-1％。

将环管式多孔气体分布器置于50L种子罐中，并将在线电容检测装置的两根工作电极从种子罐侧向插入，然后装入30L液体培养基，经高温蒸汽灭菌后，最后将步骤(2)培养好的摇瓶种子液全部接入种子罐开始培养，培养温度30℃，培养压力为20Kpa，空气流量为3L/min；

(4)检测：在步骤(3)种子罐中进行培养的同时，开启在线电容检测装置，并将检测频率设置为500～1500Hz，实时在线监测的电容率的变化，如图3所示；

(5)终点：培养24h结束。

(6)结果分析：

1)由于图4可以看出在线电容检测系统的电容率与平板菌落计数之间有良好的线性相关性，其中，相关系数r＝0.999，表明电容率可间接代表平板菌落计数，并且二者之间的关系模型为：平板菌落计数＝1.553*电容率-0.050。

2)50L规模培养时，由平板菌落计数法计数显示(每4h取样)，在24h达到最大菌体浓度3.0±0.2(106个/mL)，而本申请的在线电容检测系统的电容率结果显示在20h的电容率为2.0pF/cm，菌体浓度已经达到最大值。表明平板菌落计数法由于受到取样频率的限制，很容易漏掉关键的“拐点”，而在线电容法却能实时显示过程变化。由此，可将50L中试的培养周期成功的缩短为20h，节约了成本。

实施例3

(1)菌株活化

固体培养基的配制：葡萄糖2％-3％，多聚蛋白胨0.5％-1％，柠檬酸0.1％-0.2％，七水硫酸镁0.03％-0.05％，硫酸铵0.5％-1％，磷酸二氢钾0.3％-0.5％，乙酸钠0.1％-0.2％，琼脂粉2％-2.5％。

取冻干保存的木醋杆菌涂布到平板固体培养基上，32℃培养8天生成单菌落。挑选上述培养好的单菌落，用接种环均匀涂在斜面固体培养基上，于32℃的恒温培养箱中培养2天。

(2)摇瓶培养

液体培养基的配制：葡萄糖2-3％，玉米浆干粉0.5％-1.5，柠檬酸0.1％-0.3％，十二水磷酸氢二纳0.1％-0.3％，七水硫酸镁0.02％-0.04％，磷酸氢二铵0.2％-0.6％。

用无菌小铲取上述培养好的斜面薄膜，接入摇瓶液体培养基中，32℃培养4h。

(3)种子罐培养

液体培养基的配制：葡萄糖2-3％，玉米浆干粉0.5％-1.5，柠檬酸0.1％-0.3％，十二水磷酸氢二纳0.1％-0.3％，七水硫酸镁0.02％-0.04％，磷酸氢二铵0.2％-0.6％。

将环管式多孔气体分布器置于100L种子罐中，并将在线电容检测装置的两根工作电极从种子罐侧向插入，然后装入60L液体培养基，经高温蒸汽灭菌后，最后将步骤(2)培养好的摇瓶种子液全部接入种 子罐开始培养，培养温度32℃，培养压力为50Kpa，空气流量为10L/min；

将环管式多孔气体分布器置于100L体积种子罐中，并将在线电容检测系统的铂电极探头从种子罐侧向插入。然后装入60L液体培养基，经高温蒸汽灭菌后，连接好在线活细胞检测系统并将检测频率设置为1000～2000Hz。最后将步骤(2)培养好的摇瓶种子液全部接入种子罐开始培养，培养温度32℃，培养压力为50Kpa，空气流量为10L/min，培养至24h后结束。

(4)检测：在步骤(3)种子罐中进行培养的同时，开启在线电容检测装置，并将检测频率设置为1000～2000Hz，实时在线监测的电容率的变化，如图5所示；

(5)终点：培养24h结束。

(6)结果分析：

1)由于图6可以看出在线电容检测系统的电容率与平板菌落计数之间有良好的线性相关性，其中，相关系数r＝0.996，表明电容率可间接代表平板菌落计数，并且二者之间的关系模型为：平板菌落计数＝1.662*电容率-0.183。

2)100L规模培养时，由平板菌落计数法计数显示(每4h取样)，在20h达到最大菌体浓度7.5±0.2(106个/mL)，而本申请的在线电容检测系统的电容率结果显示在17h的电容率为4.3pF/cm，菌体浓度已经达到最大值。表明平板菌落计数法由于受到取样频率的限制，很容易漏掉关键的“拐点”，而在线电容法却能实时显示过程变化。由此，可将100L工业生产的培养周期成功的缩短为17h，节约了成本。