本发明属于多肽药物制备领域，具体涉及一种卡贝缩宫素的制备方法。
背景技术：
卡贝缩宫素(Carbetocin)是一种合成的具有激动剂性质的长效催产素九肽类似物。硬膜外或腰麻下剖腹产术后可以立即单剂量静脉给药，以预防子宫张力不足和产后出血。
卡贝缩宫素的临床和药理特性与天然产生的催产素类似。像催产素一样，卡贝缩宫素与子宫平滑肌的催产素受体结合，引起子宫的节律性收缩，在原有的收缩基础上，增加其频率和增加子宫张力。在非妊娠状态下，子宫的催产素受体含量很低，在妊娠期间增加，分娩时达高峰。因此卡贝缩宫素对非妊娠的子宫没有作用，但是对妊娠的子宫和刚生产的子宫具有有效的子宫收缩作用。
研究表明，当硬膜外或腰麻下剖腹产术后立即单剂量静脉给予卡贝缩宫素100ug，在预防子宫张力不足和减少产后出血方面，卡贝缩宫素明显优于安慰剂。在产后的早期给予卡贝缩宫素也可以促进子宫的复旧。
卡贝缩宫素具有以下结构：
用氨基酸缩写表示为：
卡贝缩宫素及其类似物的制备方法早期主要是液相合成工艺，操作复杂，不利于工业生产、应用价值不高；目前在国外卡贝缩宫素申报的专利合成方面的也不多，其中包括一家西班牙公司的ES2115543，是固液相结合的合成方法，主要方法是：然后用常规固相多肽合成，采用HOBt/DIC体系得到 4-chlorobutyl-Tyr(OMe)-Ile-Gln-Asn-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-PAL-Nle-pMBHA,然后用TFA/1-Dodecanethiol/H2O＝8:1:1裂解2小时(注：1-Dodecanethiol十二硫醇)，得到线形肽4-chlorobutyl-Tyr(OMe)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly－NH2，线性肽用1：1的乙腈和水作溶剂，用1M NaOH调pH＝9,环化得到卡贝缩宫素。它所用的碱还包括LiOH，NaHCO3，DIEA，DMAP。
捷克专利CS：8605461，先用固相多肽合成方法合成肽树脂再裂解得到Z-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH2,再氢化得到Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2再与4-Bromobutyric acid反应，得到Ile-Gln-Asn-Cys(C3H6COOH)-Pro-Leu-Gly-NH2再跟X-Tyr(OMe)-OH反应，脱保护，环化得到卡贝缩宫素。
在这些专利描述的方法中，都以液相方法进行环合，国内专利用液相环合的还有杭州和锦的专利(申请号：201010560715.4)，上海苏豪逸明制药的专利(申请号：201110001400.0)以及苏州天马的专利(申请号201510001735.0)，这种方法需要反应原料在极稀溶液中反应，且副反应较多，在规模化生产中需大量溶剂，随即产生大量废液。本发明利用固相假稀释原理，开发了固相高效环合方法，反应时间缩短至2～3小时，反应废液降为液相反应的1/10以下。并且能有效减少副反应，提高粗肽纯度，进而提高收率。
国内专利中有多篇也使用固相方法环化，根据先成硫醚键还是先成酰胺键可分为两类：第一类是先将溴代丁酸通过酰胺偶联与肽链的酪氨酸氨基偶联，再用碱(如DIPEA、NMM、LiCl、DMAP)作用下消除溴化氢形成硫醚键而关环。采用该方法的专利有深圳翰宇药业的专利(申请号200910106889.0)和杭州湃肽的专利(申请号201410461695.3)；另一类是先将羧基保护的丁酸连接到半胱氨酸的巯基上，偶联完所有残基后脱除丁酸羧基保护基，再通过酰胺偶联与肽链上的酪氨酸氨基偶联环合，采用该方法的专利有深圳健元药业的专利(申请号201010544419.5)，成都圣诺科技的专利(申请号201110151928.6)，无锡凯利的专利(申请号201210255959.0)，成都天台山药业的专利(申请号201410331088.5)。前一类采用溴代丁酸为原料，由于溴比较活泼，在偶联中副反应比较多，致使杂质较多，收率不高；后一类方法由于要先保护羧基，增加了原料的成本和脱羧基保护引起的副反应，杂质情况并没有比前一类方法改善，反而增加了成本和操作的复杂性
技术实现要素：
本发明的目的是提供了一种高收率、低成本、反应条件温和、环境污染小、有利于实现产业化的卡贝缩宫素的固相合成工艺。
本发明一个方面涉及一种卡贝缩宫素的全固相制备方法，其包括如下步骤：
1)以固相合成树脂为载体，通过连接受保护的氨基酸，脱除氨基保护基，再 连接受保护的氨基酸的方法依次连接氨基和侧链经过保护的甘氨酸(Gly)、亮氨酸、脯氨酸(Pro)、半胱氨酸(Cys)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、异亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)，得到末端氨基经过保护的线性八肽片段树脂；
2)脱除末端氨基保护后，连接4-氯丁酸，得到全保护九肽片段树脂；
3)脱除半胱氨酸巯基保护基，得到裸露巯基的九肽片段树脂；
4)在DBU作用下，末端氯基团与半胱氨酸侧链巯基偶联成环，得到卡贝缩宫素肽树脂；
5)裂解卡贝缩宫素肽树脂，得到卡贝缩宫素。
进一步地，其中所述氨基经过保护的甘氨酸选自Fmoc-Gly-OH；所述氨基经过保护的亮氨酸选自Fmoc-Leu-OH；所述氨基和侧链经过保护的脯氨酸选自Fmoc-Pro-OH；所述氨基和侧链经过保护的半胱氨酸选自Fmoc-Cys(Mmt)-OH；所述氨基和侧链经过保护的天冬酰胺选自Fmoc-Asn(Trt)-OH；所述氨基和侧链经过保护的谷氨酰胺选自Fmoc-Gln(Trt)-OH；所述氨基和侧链经过保护的异亮氨酸选自Fmoc-Ile-OH；所述氨基和侧链经过保护的酪氨酸选自Fmoc-Tyr(Me)-OH。
进一步地，步骤1)中所述的固相合成方法是Fmoc固相多肽合成方法，选用的偶联剂为DIPCDI+A或者DIPEA+A+B，其中A选自HOBt或HOAt，B选自PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU中的一种或多种；优选地，偶联剂中各成分的比例以摩尔比例计为DIPCDI:A＝1.1～1.5:1.0～1.4，DIPEA:A:B＝1.8～2.2:1.0～1.4:0.95～1.05；更优选为DIPCDI:A＝1.3:1.2，DIPEA:A:B＝2.0:1.2:1.0
进一步地，其中，步骤1)中所述的固相载体为Rink Amide树脂Rink Amide-AM树脂或Rink Amide-MBHA树脂，优选地，树脂替代度为0.2-0.9mmol/g，更优选0.4～0.6mmol/g。
进一步地，步骤3)的脱除试剂为三氟乙酸和三异丙基硅烷的二氯甲烷溶液，三氟乙酸浓度为2～5％，三异丙基硅烷浓度为3～8％。
进一步地，步骤4)所述溶剂优选为DMF或N-甲基吡咯烷酮，反应时间为2-3小时。
进一步地，步骤5)采用的裂解试剂为TFA：TIS：H2O＝85～95:2～8:2～8(V:V)。
进一步地，步骤5)获得产物后，还包括纯化步骤，优选所述纯化步骤选自重结晶、反相高压液相方法。
具体实施方式
实施例1：卡贝缩宫素肽树脂的制备
称取替代度为0.557mmol/g的Rink Amide树脂52.8g(29.4mmol)，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤6次。称取26.2g(88.2mmol)Fmoc-Gly-OH和13.1g(97.0mmol)HOBT用DMF溶解，加入15.2mL(106mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。
反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取31.2g(88.2mmol)Fmoc-Leu-OH和13.1g(97.0mmol)HOBT用DMF溶解，冰水浴下加入15.2mL(105.8mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。
反应结束，按以上同样方法依次偶联Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Cys(Mmt)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Ile-OH和Fmoc-Tyr(OMe)-OH。
反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，茚三酮检测树脂有颜色。称取36.0g(294mmol)4- 氯丁酸用DCM溶解，冰水浴下加入23.3ml(162mmol)DIPCDI和19.0g DIPEA(147mmol)活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2.5小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应0.5小时)。
脱除Mmt保护基：用DCM洗涤树脂6次,将DCM：TFA：TIS＝90:3:7的脱保护液加入固相反应柱中，氮气鼓气反应10分钟后，抽掉，再加入脱保护液氮气反应10分钟，抽掉，再重复两次脱保护反应。
固相环化：脱Mmt保护反应结束后，用DCM洗涤3次，DMF洗涤3次。称取22.4g(147mmol)DBU用适量DMF溶解加入固相反应柱中，室温反应2小时后，以DTNB检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应0.5小时，直至树脂无色)。
反应结束，抽干反应液，DMF洗涤树脂3次，抽干液体。甲醇收缩树脂3次，肽树脂真空干燥得到78.5g卡贝缩宫素肽树脂，树脂增重22.7g,理论增重22.0g，增重率103.2％。
实施例2：卡贝缩宫素精肽的制备
将实施例1得到的卡贝缩宫素肽树脂78.5克加入到2000ml三口瓶中，氮气保护。加入预先配制好的TFA：TIS：H2O＝90:5:5(V:V)785ml，室温反应2小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入7850ml冰乙醚\中沉淀、离心，乙醚洗涤2次，减压干燥得到粗肽28.7克，HPLC纯度87.23％。经过高压液相制备纯化，冻干得到卡贝缩宫素精肽19.7g，纯度99.42％，最大单杂0.15％。理论产量29.04g，总收率67.8％。
实施例3：采用溴丁酸为原料的对比例
按照实施例1的方法，将4-氯丁酸改为4-溴丁酸进行固相偶联后，得到BrCH2CH2CH2CO-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Mmt)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide树脂，然后脱除Mmt保护基。固相环化步骤采用DIPEA，室温环化3小时，以DTNB检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应0.5小时，直至树脂无色)。反应结束，抽干反应液，DMF洗涤树脂3次，抽干液体。甲醇收缩树脂3次，肽树脂真空干燥。采用实施例3的方法裂解得到粗肽，粗肽纯度60.4％，明显低于实施例1。
实施例4：先偶联硫醚的对比例
先采用固相偶联制备Fmoc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Mmt)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide树脂，然后脱除Mmt保护基，脱除Mmt保护基后，称取溴丁酸和DIPEA溶于DMF后加 入反应柱中。反应0.5h后以DTNB检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应0.5小时，直至树脂无色)。DMF洗涤树脂3次后，加入DBLK脱保护5min+7min。DCM洗涤3次，1％TFA/DCM溶液洗涤3次，DMF洗涤3次，得到H-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(CH2CH2CH2COOH)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide树脂。
环化：向上述树脂中加入TBTU和DIPEA的DMF溶液，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应完毕，抽干反应液，DMF洗涤树脂3次，抽干液体。甲醇收缩树脂3次，肽树脂真空干燥。采用实施例4的方法裂解得到粗肽，粗肽纯度53.3％，
明显低于实施例1。