本发明属于生物化工领域，更具体地，本发明涉及一种酶法合成阿糖腺苷的方法。
背景技术：
：阿糖腺苷(adenosinearabinoside，简称araa)是一种天然抗病毒化合物，具有广谱的抗病毒活性，临床上已广泛应用于治疗巨细胞病毒、乙型肝炎病毒和疱疹病毒引起的疾病。现有技术中，阿糖腺苷的合成方法包括化学法合成和生物转化法合成。化学法工艺复杂，反应条件苛刻，原料成本高，使用重金属试剂，污染环境。生物转化法的基本原理是阿糖尿苷和磷酸根离子在尿苷磷酸化酶(ec2.4.2.3)的作用下生成阿糖1-磷酸和相应碱基；阿糖1-磷酸和腺嘌呤在嘌呤核苷磷酸化酶(ec2.4.2.1)的作用下生成阿糖腺苷和磷酸根离子。生物转化方法具有反应条件温和，反应步骤简单，不使用有毒有害试剂，不污染环境的等优点。20世纪90年代起国内已开始尝试利用生物转化合成阿糖腺苷。华东理工大学冯万祥、周兴明用大肠杆菌b23生物转化合成阿糖腺苷，其得率对应腺嘌呤的转化率34％，对应阿糖尿苷的转化率12％[工业微生物，1994，24(4):11-14]；郭勇莉等人通过优化产气肠杆菌的发酵培养基配方并用胞苷或胞苷酸来诱导菌体的尿苷磷酸化酶表达，希望提高转化率[生物技术，2006， 16(1):32-35][中国医药工业杂志，2010，41(6):255-258]，其反应得率对应腺嘌呤的转化率75％，对应阿糖尿苷的转化率为25％。魏晓琨、丁庆豹等人通过对产气肠杆菌atcc13048诱变使其嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶的活力提高[中国专利申请号200710043257.5]，其反应得率对应腺嘌呤的转化率90％，对应阿糖尿苷的转化率为30％。以上工作中均采用两种酶混合使用并一步合成目标物的方法，虽然解决了化学合成所带来的污染问题，但这种方法存在逆反应—即当反应一端的物质达到一定浓度后会向反方向进行，从而导致不等摩尔的底物用量，即上述反应中，腺嘌呤的摩尔浓度是阿糖尿苷的3倍；底物消耗大；目标物转化率低的缺点，无法从根本上取代化学合成。因此，本领域需要进一步地优化阿糖腺苷的合成方法，以期进一步地合理的底物用量配比，提高阿糖腺苷转化率，提高产量。技术实现要素：本发明旨在解决上述问题，提供了一种酶法合成阿糖腺苷的方法。在本发明的第一方面，提供一种制备阿糖腺苷的方法，所述方法包括：(1)在含磷酸根离子的水溶液中，使阿糖尿苷与尿苷磷酸化酶(较佳地为ec2.4.2.3)反应，获得含阿糖1-磷酸和尿嘧啶的溶液1；(2)处理(1)获得的含阿糖1-磷酸和尿嘧啶的溶液，去除其中的尿苷磷酸化酶和磷酸根离子，获得含阿糖1-磷酸和尿嘧啶的溶液2；(3)在(2)获得的含阿糖1-磷酸和尿嘧啶的溶液2中，加入腺嘌呤和嘌呤核苷磷酸化酶(较佳地为ec2.4.2.1)，反应，获得阿糖腺苷产物。在一个优选例中，步骤(1)中，阿糖尿苷完全消耗后进行步骤(2)。在另一优选例中，步骤(3)之前，还包括稀释步骤(2)获得的含阿糖1-磷酸和尿嘧啶的溶液2的步骤。在另一优选例中，步骤(2)中，通过加入金属离子结合磷酸根，形成溶解度低的磷酸盐沉淀去除磷酸根离子包括；较佳地，通过过滤、超滤或离心的方法过滤去除沉淀。在另一优选例中，所述的金属离子包括但不限于：钙离子，镁离子，钡 离子，银离子；较佳地，所述的金属离子包括但不限于下列盐在溶液中形成的金属离子：氯化钙，氯化镁，溴化镁，氯化钡；更佳地为氯化钙，氯化镁。在另一优选例中，金属离子的终浓度是5-1000mm；较佳为100-1000mm，最佳为300-800mm。在另一优选例中，步骤(2)中，通过超滤的方法去除其中的尿苷磷酸化酶。较佳地，所述的超滤为低温超滤。在另一优选例中，在2～20℃(较佳地为4～15℃，如6、8、10、12、14℃)的温度下进行超滤。在另一优选例中，所述的磷酸根离子包括但不限于下列盐配成的水溶液所产生的磷酸根离子：磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，磷酸钠，磷酸钾，磷酸氢铵，磷酸二氢铵。在另一优选例中，所述的含磷酸根离子的水溶液的ph6.0-9.0；较佳地为ph6.0-8.0。在另一优选例中，步骤(1)中，磷酸根离子的水溶液中，磷酸根的浓度5-1000mm；较佳为100-1000mm，最佳为300-600mm。在另一优选例中，阿糖尿苷的浓度为10-1000mm；较佳为10-500mm，最佳为30-200mm。在另一优选例中，步骤(1)中，所述的尿苷磷酸化酶是纯酶或由微生物表达的尿苷磷酸化酶；较佳地，所述的尿苷磷酸化酶在反应体系中的浓度20-1000u/ml；更佳地为20-500u/ml；如50、100、200、300u/ml。在另一优选例中，步骤(3)中，所述的嘌呤核苷磷酸化酶是纯酶或由微生物表达的嘌呤核苷磷酸化酶；较佳地，所述的嘌呤核苷磷酸化酶在体系中的浓度20-1000u/ml；更佳地为100-700u/ml；如150、200、300、500u/ml。在另一优选例中，步骤(3)中，腺嘌呤的浓度2-400mm；较佳为5-200mm，最佳为10-70mm；如10、20、50、70mm。在另一优选例中，步骤(1)或步骤(3)中，反应温度为30℃～80℃；较佳地为40-65℃；更佳地为45-60℃。在另一优选例中，步骤(1)中，混合液在55±1℃下振摇反应8±1小时；步骤(3)中，混合液在50±1℃下振摇反应4±1小时。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。具体实施方式本发明人致力于优化阿糖腺苷的合成方法，经过深入的研究，首次意外地发现，含阿糖尿苷和磷酸根离子的水溶液中单独加入含尿苷磷酸化酶的菌体，在阿糖尿苷完全消耗后去除尿苷磷酸化酶和磷酸根离子，使阿糖-1-磷酸稳定，之后再加入腺嘌呤和嘌呤核苷磷酸化酶反应，获得阿糖腺苷，该方法可显著地促进底物的反应完全以及提高产物阿糖腺苷的转化率。本发明旨在突破酶反应生产阿糖腺苷的方法中产生的腺嘌呤和目标物之间的平衡，充分利用尿苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的不同作用使反应往一个方向进行，消除逆反应的发生。从而使底物被充分消耗且产物的转化率达到较高水平。基于以上宗旨，本发明提供了一种新的阿糖腺苷酶法合成的方法，所述方法见反应式(i)和反应式(ii)，包括步骤：(1)在磷酸根离子的水溶液中加入阿糖尿苷和尿苷磷酸化酶，进行如反应式(i)的反应；式(i)中：ara-u表示阿糖尿苷；ec2.4.2.3表示尿苷磷酸化酶；p表示磷酸根离子；uracil表示尿嘧啶；ara-1-p表示阿糖-1-磷酸；(2)在阿糖尿苷完全消耗后，去除尿苷磷酸化酶和磷酸根离子，使阿糖-1-磷酸稳定；(3)在(2)获得的含阿糖1-磷酸和尿嘧啶的溶液2中，加入腺嘌呤和嘌呤核苷磷酸化酶，进行如式(ii)的反应，获得阿糖腺苷产物；式(ii)中：adenine表示腺嘌呤；ec2.4.2.1表示嘌呤核苷磷酸化酶；ara-a表示阿糖腺苷；p表示磷酸根离子。步骤(2)中，可以采用多种方法去除磷酸根离子，本领域中各种可在溶液中去除磷酸根离子的方法皆可被应用于本发明中。作为本发明的优选方式，采用加入金属离子的方法，使得金属离子结合磷酸根，形成溶解度低的磷酸化盐而发生沉淀。金属离子和磷酸根离子结合形成磷酸盐沉淀，沉淀可通过离心或超滤的方式去除。所述的金属离子包括但不限于：钙离子，镁离子，钡离子，银离子；较佳地，所述的金属离子包括但不限于下列盐在溶液中形成的金属离子：氯化钙，氯化镁，溴化镁，氯化钡；更佳地为氯化钙，氯化镁。步骤(2)中，可以采用多种方法去除尿苷磷酸化酶。作为本发明的优选方式，采用低温超滤的方法。本发明人发现，低温超滤有利于使阿糖-1-磷酸稳定，更好地应用于后续的反应，获得更高的转化率。此外，通过多种生物学方法可以使得细胞及其表达的酶失活(例如调节温度至细胞或酶活性受影响的温度，调节ph值至细胞或酶活性受影响的ph值，一些重金属也能使酶失活)，这些方法也可被包含在本发明的方法中，只要它们不影响本发明的方法的后 续步骤。作为本发明的优选方式，超滤过程的溶液温度控制2℃～20℃；较佳为2℃～15℃，最佳为6℃～12℃。本发明中，所述的尿苷磷酸化酶可以是纯酶，或可以是由菌体表达的酶。其可以是以游离状态存在于反应体系中的，也可以是固定化的酶。只要具有较好的酶活性，各种存在形式的尿苷磷酸化酶均可应用于本发明中。作为本发明的优选方式，所述的酶是由菌体表达的酶。本发明中，所述的磷酸根离子可以是下列盐配成的水溶液所产生的：磷酸二氢钠，磷酸钠，磷酸氢铵，磷酸二氢铵等，所述的磷酸盐配成的水溶液具有较为稳定的ph值，作为本发明的优选方式，所述的磷酸盐水溶液ph6.0-9.0；较佳地为ph6.0-8.0。本发明人还优化了反应体系中各原料的浓度，以提高反应的效率。作为本发明的优选方式，阿糖尿苷的浓度为10-1000mm；较佳为10-500mm，最佳为30-200mm。作为本发明的优选方式，磷酸根离子的水溶液中，磷酸根的浓度5-1000mm；较佳为100-1000mm，最佳为300-600mm。作为本发明的优选方式，尿苷磷酸化酶在体系中的浓度20-1000u/ml；较佳为20-500u/ml，如50、100、200、300u/ml。最佳为50-200u/ml。作为本发明的优选方式，去除磷酸根离子所加入的金属离子最终浓度是5-1000mm；较佳为100-1000mm，最佳为300-800mm。作为本发明的优选方式，腺嘌呤的浓度2-400mm；较佳为5-200mm，最佳为10-70mm。作为本发明的优选方式，嘌呤核苷磷酸化酶在体系中的浓度20-1000u/ml；较佳为100-700u/ml，最佳为200-400u/ml。作为本发明的优选方式，在尿苷磷酸化酶反应中的温度30℃～80℃；较佳为40℃～70℃，最佳为50℃～60℃。作为本发明的优选方式，在嘌呤核苷磷酸化酶反应中的温度30℃～80℃；较佳为40℃～70℃，最佳为50℃～60℃。本发明的式i中产生的阿糖-1-磷酸含量测定方法使用高效液相测定(elsd)，通过定量标准曲线和实测峰面积计算具体含量。本发明的式ii中生成的阿糖腺苷含量测定方法使用高效液相测定(uv)，通过定量标准曲线和实测峰面积计算具体含量。除非另外说明，本发明中所提到的阿糖腺苷转化率指，通过高效液相(uv)标准定量方法测得反应液中阿糖腺苷的摩尔量，然后除以投入的阿糖尿苷的摩尔量。应理解，可应用于测定物质含量的其它测定设备及测定方法也可被应用于本发明中。本发明提到的上述特征，或实例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形成并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。本发明的主要优点在于：(a)本发明提供的两步酶合成方法成本低，所需设备均是生物品生产中常用设备。(b)本发明提供的两步酶合成方法使阿糖腺苷的转化率达到90％以上。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅做示范之用。本发明中所涉及的酶活力单位、各原料的浓度单位是本领域技术人员所熟知的。以下实施例所用的菌体是表达尿苷磷酸化酶的重组大肠杆菌(根据biosci.biotech.biochem.,59(10),1987-1990,1995克隆所得)和表达嘌呤磷酸化酶的重组大肠杆菌(根据biosci.biotech.biochem.,59(10),1987-1990,1995 克隆所得)。本发明下述实施例中的高效液相(elsd)条件：仪器：waters2695+waters2420elsd检测器(蒸发光散射)，分析柱：ymc-aq250*4.6mm，流速：0.8ml/min，柱温：5℃。梯度条件：时间(min)0.01m磷酸缓冲液(ph6.0)甲醇0100％0％2100％0％1080％20％1580％20％42100％0％50100％0％标准曲线：y＝3100168.94*x+33400.24(r2＝1.00)，y—峰面积；x—摩尔；检测有效范围：0.0049摩尔～0.0295摩尔；本发明下述实施例中的高效液相(uv)条件：仪器：waters2695+waters996uv检测器，分析柱：ymc-aq150*4.6mm，流速：1.0ml/min，检测波长：260nm；梯度条件：标准曲线：y＝3188562.59*x-27005.28(r2＝1.00)，y—峰面积；x—摩尔；检测有效范围：0.8876毫摩尔～6.1357毫摩尔；实施例1、两步法反应1反应分两步进行，具体如下：反应一：向1000mlph6.8的300mm磷酸钠溶液中加入0.04摩尔的阿糖尿苷使其浓度达到40mm，然后加入1.56g菌体(每克含尿苷磷酸化酶32200u)使尿苷磷酸化酶的浓度达到50u/ml；将此混合液置于摇床内，在55℃下振摇8小时。取出反应液并冷却至10℃，加入无水氯化钙固体34g，并搅拌30分钟，超滤去除析出的尿嘧啶、磷酸钙和其他不溶物，该不溶物包括含尿苷磷酸化酶的菌体，保持超滤溶液5-10℃，收集超滤溶液，完成后用500ml双蒸水洗膜，洗出残留在膜包中的剩余反应液，合并超滤液体和洗膜液体(这两部分液体均含有产物，合并可使得率更高)，共得到1420ml液体。超滤得到液体稀释3倍后经高效液相(elsd)定量分析，阿糖-1-磷酸的峰面积为73185.74，将这个数字代入标准曲线公式中计算得到：在此溶液中含阿糖-1-磷酸0.0385摩尔，除以0.04摩尔的阿糖尿苷后其转化率为96.3％。反应二：反应一得到的溶液中加入1580ml双蒸水稀释，然后加入0.04摩尔的腺嘌呤使其浓度达到13.3mm；加入21.6g菌体(每克含嘌呤核苷磷酸化酶27800u)使嘌呤核苷磷酸化酶的浓度达到200u/ml；将此混合液置于摇床内，在50℃下振摇4小时。反应液稀释10倍后经高效液相(uv)定量分析，阿糖腺苷的峰面积为11961990.05，将这个数字代入标准曲线公式中计算得到：在此溶液中含阿糖 腺苷0.0376摩尔，除以0.04摩尔的阿糖尿苷后其转化率为94％。实施例2、两步法反应2反应分两步进行，具体如下：反应一：向1000mlph6.8的600mm磷酸钠溶液中加入0.2摩尔的阿糖尿苷使其浓度达到200mm，然后加入6.21g菌体(每克含尿苷磷酸化酶32200u)使尿苷磷酸化酶的浓度达到200u/ml；将此混合液置于摇床内，在55℃下振摇8小时。取出反应液并冷却至10℃，加入1000ml的双蒸水稀释反应液；加入无水氯化钙固体68g，并搅拌30分钟，超滤去除析出的尿嘧啶、磷酸钙和其他不溶物，该不溶物包括含尿苷磷酸化酶的菌体；保持超滤溶液5-10℃，完成后用500ml双蒸水洗膜，洗出残留在膜包中的剩余反应液，合并超滤液体和洗膜液体，共得到2390ml液体。超滤得到液体稀释10倍后经高效液相(elsd)定量分析，阿糖-1-磷酸的峰面积为69992.87，将这个数字代入标准曲线公式中计算得到：在此溶液中含阿糖-1-磷酸0.1855摩尔，除以0.2摩尔的阿糖尿苷后其转化率为92.75％。反应二：反应一得到的溶液中加入610ml双蒸水稀释，然后加入0.2摩尔的腺嘌呤使其浓度达到66.6mm；加入43g菌体(每克含嘌呤核苷磷酸化酶27800u)使嘌呤核苷磷酸化酶的浓度达到398u/ml；将此混合液置于摇床内，在50℃下振摇4小时。反应液稀释50倍后经高效液相(uv)定量分析，阿糖腺苷的峰面积为10902381.78，将这个数字代入标准曲线公式中计算得到：在此溶液中含阿糖腺苷0.1836摩尔，除以0.2摩尔的阿糖尿苷后其转化率为91.8％。实施例3、比较例1采用实施例1相同的方法，不同点主要在于“反应一”中“在55℃下振摇8小时”之后，直接加入腺嘌呤进行反应二，不包括“反应一”中低温超滤和“反应二”中双蒸水稀释的步骤。反应分两步进行，具体如下：反应一：向1000mlph6.8的300mm磷酸钠溶液中加入0.04摩尔的阿糖尿苷使其浓度达到40mm，然后加入1.56g菌体(每克含尿苷磷酸化酶32200u)使尿苷磷酸化酶的浓度达到50u/ml；将此混合液置于摇床内，在55℃下振摇8小时。上述得到的混合液稀释3倍后经高效液相(elsd)定量分析，阿糖-1-磷酸的峰面积为72974.04，将这个数字代入标准曲线公式中计算得到：在此溶液中含阿糖-1-磷酸0.0381摩尔，除以0.04摩尔的阿糖尿苷后其转化率为95.3％。反应二：反应一得到的溶液中加入0.04摩尔的腺嘌呤使其浓度达到40mm；加入21.6g菌体(每克含嘌呤核苷磷酸化酶27800u)使嘌呤核苷磷酸化酶的浓度达到600u/ml；将此混合液置于摇床内，在50℃下振摇4小时。反应液稀释10倍后经高效液相(uv)定量分析，阿糖腺苷的峰面积为8774560.76，将这个数字代入标准曲线公式中计算得到：在此溶液中含阿糖腺苷0.00884摩尔，除以0.04摩尔的阿糖尿苷后其转化率为22.1％。虽然反应一中阿糖-1-磷酸的得率高达95.3％，但是没有去除的磷酸根离子，在反应二中大幅度的抑制了阿糖腺苷的生成，尿苷磷酸化酶的存在，使得产生阿糖尿苷的逆反应通路仍旧存在。实施例4、比较例2向1000mlph6.8的300mm磷酸钠溶液中加入0.04摩尔的阿糖尿苷使其浓度达到40mm，然后加入0.04摩尔的腺嘌呤使其浓度达到40mm，然后加1.56g菌体(每克含尿苷磷酸化酶32200u)使尿苷磷酸化酶的浓度达到50u/ml，加入21.6g菌体(每克含嘌呤核苷磷酸化酶27800u)使嘌呤核苷磷酸化酶的浓度达到600u/ml；将此混合液置于摇床内，在50℃下振摇12小时。反应液稀释10倍后经高效液相(uv)定量分析，阿糖腺苷的峰面积为8624233.32，将这个数字代入标准曲线公式中计算得到：在此溶液中含阿糖腺苷0.0084摩尔，除以0.04摩尔的阿糖尿苷后其转化率为21.3％。一步法反应体系存在底物未利用完之前，反应却已平衡的缺点。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权力要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。当前第1页12