能够拮抗胰岛淀粉样多肽(IAPP)诱导的β细胞损伤和葡萄糖耐量受损的新的化合物的制作方法

本发明主要涉及特异性地结合于人胰岛淀粉样多肽(hIAPP)(也称为胰淀素)的分子，特别是用于拮抗作为通常与2型糖尿病(T2D)相关的症状的胰岛淀粉样多肽(IAPP)诱导的β细胞损伤和葡萄糖耐量受损的人抗体以及它们的片段、衍生物和变体。

背景技术：

蛋白质积累、修饰和聚集是许多代谢疾病的病理方面，这些疾病包括公知的诸如亨廷顿氏症、阿尔茨海默症(AD)和帕金森氏症(PD)的神经退行性疾病(Taylor等人，Science 296(2005)，1991-1995)。病理蛋白质聚集也涉及代谢性疾病，诸如2型糖尿病(T2D)和伴随临床胰岛移植到患有1型糖尿病(T1D)的个体中的胰岛排斥反应。蛋白质的错误折叠和聚集导致淀粉样沉积的发展并且在这些疾病中似乎是与细胞毒性直接相关的。胰岛淀粉样多肽(IAPP或胰淀素)，一种与由在胰腺内的β细胞共分泌胰岛素的生理性肽，其在T2D患者的胰岛(也称为郎格罕氏岛)内形成纤维状聚集体，并建议在疾病的发展中起作用(Westermark等人(2011),Physiol.Rev.91(3):795-826)。此外，如前所述，当在患有1型糖尿病(T1D)的患者中移植分离的岛时，在胰岛中发现IAPP聚集体。

人类IAPP(hIAPP)是一种肽激素，其由37个氨基酸构成，具有位于半胱氨酸残基2和7之间的二硫键以及酰胺化的C-末端。胰岛由65％至80％的β细胞组成，其产生并分泌对血糖水平和细胞代谢必不可少的胰岛素和IAPP。IAPP由前激素原preproIAPP合成，一种在胰腺β细胞中产生的89个氨基酸前体。

PreproIAPP在翻译成胰岛淀粉样多肽(一种67个氨基酸肽)后迅速裂解，其经历额外的蛋白水解和翻译后修饰从而产生hIAPP。hIAPP的表达与胰岛素共同调节，因为增加的胰岛素产生导致增加的hIAPP水平。hIAPP由胰腺β细胞释放到血液循环中，并协同胰岛素通过胃排空和饱腹感控制参与血糖调节。

在2型糖尿病(T2D)中，遗传因素和环境因素导致胰岛素抗性的发展，其伴随在β细胞团块以及胰岛素和胰淀素(hIAPP)分泌的代偿性增加以维持正常的血糖水平。所得的高浓度的胰淀素有利于毒性人胰岛淀粉样多肽(hIAPP)寡聚物的形成和hIAPP原纤维的沉积，其在超过90％的2型糖尿病患者中发现。hIAPP的沉积与产生胰岛素的β细胞的减少有关，并且还被提出在移植到具有1型糖尿病的个体内的胰岛中对β细胞的损失发挥作用。

2型糖尿病是糖尿病的最常见形式，占所有病例的约90％。这种疾病影响了全世界超过2亿人，其导致每年超过一百万人死于糖尿病。在瑞士有超过300,000个患者被感染。由于人口增长、衰老、城市化以及糖尿病和缺乏体力活动的日益盛行，糖尿病的流行在发达国家和发展中国家正在急剧增加。预测全球的2型糖尿病市场为250亿美元，到2016年达到350亿美元，其中在2009年和2016之间具有6.4％的复合年增长率。目前的治疗包括通过提高胰岛素敏感性或者刺激胰腺释放胰岛素而以不同的途径作用来降低血糖水平的饮食管理和药物干预。然而，没有可用的治疗方法可以抵消hIAPP的聚集以及胰腺β细胞的损失。用于2型糖尿病的新的治疗策略包括胰高血糖素肽-1(GLP-1)的类似物和二肽基肽酶4(DPP 4)的抑制剂，使内源性GLP-1失活的酶。这些策略基于GLP-1的强效促胰岛素作用和其对提高β细胞增殖的作用。

更近的和有前途的策略涉及消炎药或针对IL-1β途径的抗体的开发(Donath等人.(2008),Nat.Clin.Pract.Endocrinol.Metab.4(5):240-241；Ehes等人.(2009),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106(33):13998-14003；Owyang等人.(2010)，Endocrinology 151(6):2515-2527；Dinarello等人.(2010),Curr.Opin.Endocrinol.Diabetes Obes.17(4):314-321；Boni-Schnetzler等人.(2011),J.Clin.Endocrinol.Metab.93(10):4065-4074；Boni-Schnetzler等人.(2012),Br.J.Clin.Pharmacol.；Cavelti-Weder等人.(2012),Diabetes Care)。重要的是注意到，最近的研究表明，hIAPP特异性诱导炎性体-IL-1β系统，其导致先天免疫系统的激活(Masters等人.(2010),Nat.Immunol.11(10):897-904；Mandrup-Poulsen等人.(2010),Nat.Immunol.11(10):881-883)，因此支持针对hIAPP聚集的治疗策略。

迄今为止，诸如在国际申请WO03/092619所教导的靶向hIAPP和/或proIAPP的主动和被动免疫治疗方法是基于并要求hIAPP原纤维和胰岛淀粉样蛋白的清除。然而，到目前为止，还没有提供免疫治疗可以成功地使用的实验证据。与此相反，体内研究表明，虽然疫苗能够诱导不阻止hIAPP转基因小鼠内的hIAPP诱导的β细胞凋亡的抗毒素IAPP寡聚抗体；参见Lin等人,Diabetes 56(2007),1324–1332。

总结上述内容，急需解决hIAPP诱导的诸如β细胞损伤、葡萄糖耐量受损、体重增加异常等的病症的新的治疗药剂和策略。

技术实现要素：

本发明主要涉及用于保护β细胞免受hIAPP诱导的细胞损伤和/或胰岛淀粉样毒性作用的人胰岛淀粉样多肽(hIAPP)结合分子；和/或在需要其的受试者体内恢复hIAPP诱导的葡萄糖耐量受损，优选地其中该hIAPP结合分子选择性地结合人类糖尿病受试者的胰腺组织中的聚集的hIAPP。

本发明特别是基于令人惊讶的发现，即诸如抗IAPP抗体的hIAPP结合分子对体外形成的IAPP聚集体和对从糖尿病患者获得的胰腺组织中的体内IAPP聚集体的结合水平对于体内活性是无预测性的，并因此对治疗效用也是无预测性的。因此，基于体外测试的候选化合物的预选由于这些化合物体外较差的表现可在第一时间挑出(sort out)生物活性剂。因此，由于动物试验是费力和耗时的，因此生物化学的和基于细胞的体外测试是筛选药物候选物的第一选择。对于糖尿病的转基因的IAPP动物模型，这是特别正确的，因为例如迄今可用的小鼠模型并不自发地发展糖尿病或者直到6至10个月龄仅仅自发地发展具有高血糖症和葡萄糖耐量受损的糖尿病。此外，在自发地发展糖尿病的或仅有12至24个月龄的小鼠体内通常仅观察到极少的淀粉样蛋白沉积。

得益于本发明，提供了一种新的IAPP转基因动物模型(参见实施例)，作为候选化合物的可靠的筛选系统是有用的，使得测试能够在合理的时间内是可行的，并因而分别适合工业和制药的规模。特别是，本发明的动物模型自发地发展糖尿病，其特征在于葡萄糖耐量受损和高血糖症已经分别存在于1个月龄和2个月龄(图4)，并且胞外淀粉样蛋白沉积物出现在2个月龄，并且在4个月龄观察到了丰富的淀粉样变性和相关联的β细胞损失。因此，由于本发明的转基因动物体内的病理的发展(包括在患有糖尿病的人类受试者中观察到的临床相关的医学指征)的相对短的时间，因此该新的动物模型特别适合抗糖尿病药剂的筛选和验证。当然，尽管本发明的动物模型特别适合于测试IAPP结合分子，但是其他的候选化合物也可以被测试，例如作用于该IAPP/胰岛素靶向的通路的下游或上游的和/或能够拮抗或改善由动物体内的IAPP的异源表达所诱导的医学指征的药剂。

正如实施例中所证明的，按照本发明，选择性地结合人类糖尿病受试者的胰腺组织中的聚集的hIAPP的hIAPP结合分子(图2和图3)可以被证明对于保护β细胞免受hIAPP诱导的细胞损伤和胰岛淀粉样毒性作用(图7)、恢复hIAPP诱导的葡萄糖耐量受损(图8)、增加胰岛素分泌(图7)、降低空腹血糖(图8)和使体重增加正常化(图8)是有效的。因此，本发明的hIAPP结合分子在患有或可能发展2型糖尿病(T2D)和/或高血压(通常与一种或多种上述的医学指征相关的)的受试者的治疗是特别有用的。

在这种情况下，按照本发明进行的实验的初步结果表明，β细胞保护是独立于胰岛淀粉样沉积物的去除而实现的。因此，本发明的hIAPP结合分子的IAPP拮抗作用可能确实不是由于IAPP原纤维的清除和/或IAPP原纤维形成的预防，而其在现有技术中被认为对于IAPP特异性抗糖尿病药剂是必要的。这些观察与对艾塞那肽-4(艾塞那肽；被批准为用于治疗2型糖尿病的药物)报道的那些观察相比较，在于艾塞那肽-4增加了胰岛淀粉样蛋白沉积但抵消了在人胰岛淀粉样多肽转基因小鼠胰岛中因此而造成的β细胞毒性；参见Aston-Mourney等人，Diabetologia 54(2011),1756-1765)。因此，在本发明的一个实施方式中，由hIAPP结合分子介导的β细胞保护是与受试者体内的胰岛淀粉样变性不相关的。

在按照本发明进行的进一步的实验中，可以显示出本发明的hIAPP结合分子，即受试者抗体的NI-203.26C11能够在其发展的早期阶段中结合聚集的结构；参见实施例5。特别是，受试者抗体NI-203.26C11结合至仅仅显示出纤维特性的初始结构，即组装成不溶性的纤维但不具有纤维形态而可以用本发明的hIAPP结合分子来检测的蛋白质；参见图9。因此，在一个实施方式中，本发明的hIAPP结合分子分别能够并用于纤维IAPP结构的早期检测。在优选的实施方式中，该IAPP结合分子检测到了当hIAPP第一次装配发生时的hIAPP聚集体。

鉴于受试者抗体结合早期纤维结构的性质，在一个实施方式中，本发明的hIAPP结合分子被用于治疗、保护和/或改善hIAPP诱导的细胞损伤、胰岛淀粉样毒性作用和/或恢复在纤维发展的早期中hIAPP诱导的葡萄糖耐量受损。因此，根据本发明的该hIAPP结合分子优选地选择性地结合人类糖尿病受试者的胰腺组织中的早期纤维状聚集的hIAPP。

葡萄糖耐量受损，餐后阶段的特征在于血糖水平的快速和大量的增加，而空腹血糖在参考范围内。这种异常的高葡萄糖(血糖)水平是高血糖症的特征(一种糖尿病的标志性符号)。正如实施例6和实施例7中所证明的以及图8和图10中所显示的，对IAPP转基因动物施用该受试者抗hIAPP抗体使血糖水平正常化，并因此在高血糖症的预防或治疗中可能是有用的。因此，在本发明的一个实施方式中，该hIAPP结合分子用于使血糖水平正常化。此外，也正如实施例6中所证明的和图8中所显示的，该受试者抗hIAPP抗体的施用导致了动物模型中与hIAPP相关的体重增加的正常化。因此，在一个实施方式中，该hIAPP结合分子用于使通常与hIAPP相关的体重增加正常化。

理论上，分别选择性地结合人类糖尿病受试者的胰腺组织中的聚集的hIAPP的任何hIAPP结合和相互作用的分子可以按照本发明使用。按照本发明，术语hIAPP结合分子也意指包括该分子的任何前体和单独的成分。例如，如果所指的hIAPP结合分子是肽、多肽或蛋白质(诸如抗体、IAPP衍生物或肽抑制剂)，则各术语也包括编码这样的分子的多核苷酸、载体、特别是包含该分子的编码序列的表达载体以及包含该多核苷酸或载体的宿主细胞。可以如图2和图3中所示的并按照实施例1来测定候选化合物的糖尿病的胰腺组织特异性hIAPP结合，并且该候选化合物的验证可以如实施例1和实施例3中所示例的利用本发明的新的动物模型来进行。然而，在小有机分子的情况下，测定它们与胰腺组织上/胰腺组织内的hIAPP的相互作用可能是麻烦的。相反，本领域技术人员可依赖于本领域中公知的生物化学结合测试和亲和标记技术；参见，例如，Lomenick等人，在ACS Chem.Biol.(2011),34–46发表的Identification of direct protein targets of small molecules(小分子的直接蛋白靶点的鉴定)和Jiang等人，在eLife 2013；2:e00857(在线公开的)发表的Structure-based discovery of fiber-binding compounds that reduce the cytotoxicity of amyloid beta(降低了淀粉样蛋白β的细胞毒性的纤维结合化合物的基于结构的发现)。然后阳性采样数(hits)可以直接将该化合物应用于用于验证的本发明的动物模型。

如在本发明的上下文中所使用的“结合分子”主要涉及抗体以及其片段，但也可以指选择性地和剂量依赖性地识别诊断患有2型糖尿病(T2D)的患者胰腺组织中的病理性hIAPP聚集体并显示出在实施例中所说明的NI-203.26C11抗体的功能性质的其他非抗体分子，包括但不限于激素、受体、配体、主要组织相容性复合体(MHC)分子、分子伴侣(诸如热休克蛋白(HSP))以及细胞-细胞粘附分子(诸如钙粘着蛋白、整合素、C-型凝集素和免疫球蛋白(Ig)超家族的成员)，以及特别是设计的锚定重复序列蛋白(DARPin)，其是能提供超越用于靶向结合的抗体的优势的有希望的一类非免疫球蛋白的蛋白质；参见综述，例如Stumpp和Amstutz,Curr.Opin.Drug Discov.Devel.10(2007),153-159和本文所引用的参考文献。因此，仅为了清楚并且不限制本发明的范围，相对于抗体和代表用于诊断试剂的开发的优选结合分子的抗体样分子对大部分下面的实施方式进行了讨论。本发明的抗体或其抗原结合片段、免疫特异性片段、变体、或衍生物包括，但不限于，多克隆、单克隆、多特异性、人类、人源化、灵长类化、鼠源化或嵌合抗体、重组全抗体(完整抗体)(免疫球蛋白)、特别是单克隆重组全抗体(免疫球蛋白)、单链抗体、表位结合片段(例如，Fab、Fab'和F(ab')₂)、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、由Fab表达文库产生的片段以及抗独特型(抗-Id)抗体(包括，例如，针对本文中公开的抗体的抗-Id抗体)、嵌合抗体、CDR移植抗体、二价抗体构建体、合成抗体、交叉克隆抗体、全人抗体、人源化抗体、异种的或嵌合的人-鼠抗体、纳米抗体、双价抗体(双抗体)等。scFv分子在本领域中是已知的并且描述在例如美国专利5,892,019中。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，类(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。

在本发明的优选的实施方式中，该hIAPP结合分子是免疫活性的，因为它适于组织化学染色，由此可容易地识别对从患者获得的含有IAPP聚集体的胰腺组织的结合。因此，在本发明的特别优选的实施方式中，该hIAPP结合分子是抗hIAPP抗体或其hIAPP结合片段。最优选地，该抗体是人源化抗体。通过如国际申请WO2008/081008中详细描述的神经免疫的RTM^TM技术可以在体外识别和表征、克隆和重组产生本发明的hIAPP结合分子。此外或可替换地，对于hIAPP结合分子的存在和亲和力的筛选方法可以包括敏感组织淀粉样斑块免疫反应(TAPIR)测定的步骤(诸如在国际申请WO2004/095031中描述的，该申请的公开内容通过引入并入本文)，此处类似于胰岛上的淀粉样蛋白沉积物来进行的。

优选地，根据本发明使用的人抗hIAPP抗体已经从健康人类受试者的群体或从肥胖患者的群体及其他具有很大可能发展T2D的患者群体中分离，其在抗体分离时没有显示出T2D的标记，但显示出淀粉样蛋白沉积并表现出IAPP特异性免疫应答。如此人源化的抗体也可被称为“人自身抗体”，以便强调那些抗体起初确实由该受试者表达并且不是例如借助于人免疫球蛋白表达噬菌体文库所产生的体外筛选的构建体或者在该人类免疫球蛋白库(谱系，repertoire)的转基因动物表达部分中产生的异种抗体，迄今为止这代表了用于试图提供人样抗体的最常见方法。另一方面，本发明的人源化抗体可表示合成的、重组的和/或生物技术的，以便将其与人血清抗体自身区分开来，其可通过蛋白质A或亲和柱进行纯化。

在本发明的优选的实施方式中，该hIAPP结合分子来源于在申请人共同待审的国际申请WO2014/041069(该申请的公开内容通过引用并入本文)中所公开的人源化单克隆抗hIAPP抗体，特别是关于该抗hIAPP抗体、其CDR和可变区的氨基酸序列，该抗hIAPP抗体的重组生产以及描述用于测试该抗hIAPP抗体和等价抗体的免疫的和生物的活性的测试的实施例。此外，除非另有说明，否则如本文所用的诸如“IAPP”和“CDR”的术语以如国际申请WO2014/041069中所提供的给出，如上文。

如所附实施例中所示的，用人源化抗hIAPP抗体NI-203.26C11来说明本发明。抗体的结合特异性主要是通过包含可变重链区和可变轻链区的其结合域来测定的，并特别是通过包含在其中的一个或多个互补决定区(CDR)来测定的。正如本领域中所公知的，在构架区中和/或在CDR中的突变可能基本上不影响结合特异性，而是甚至可以提高亲和力。例如，本领域技术人员知晓，结合亲和力可通过制造CDR内或与如Kabat所定义的与CDR部分重叠的高变环(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196(1987),901-917)内的氨基酸取代来提高；参见，例如Riechmann等人，Nature 332(1988),323-327。因此，本发明还涉及抗体，其中该原始抗体的一个或多个CDR包含一个或多个，优选不超过两个氨基酸取代。

因此，在一个实施方式中，本发明的上述hIAPP结合分子中的任意一种在其结合结构域中包含：

(a)在图1中所描绘的重链(VH)和/或轻链可变(VL)区氨基酸序列(SEQ ID NO：1、3和5)的至少一个互补决定区(CDR)；

(b)如在图1中所描绘的VH和/或VL区的氨基酸序列；

(c)至少一个CDR，其由从(a)的氨基酸序列中的任意一个的局部改变所得到的氨基酸序列组成；和/或

(d)重链和/轻链可变区，其包含从(b)的氨基酸序列中的任意一个的局部改变所得到的氨基酸序列。

抗体NI-203.26C11是在上述国际申请WO2014/041069中所公开的抗IAPP抗体之一。在其中所描述的人重组抗体的IAPP结合表位的肽扫描分析显示了在人IAPP内的序列包括作为由抗体NI-203.26C11所识别的独特的线性表位的aa2-CNTATCA-8(SEQ ID NO：7)。关于抗体NI-203.26C11的表位精细定位的最新的实验数据表明，NI-203.26C11在N-末端结合hIAPP，具有对于2位、3位、4位和7位氨基酸的关键作用。特别是，2位和7位氨基酸的存在似乎对于结合是必要的，这是因为例如2位氨基酸的缺失或突变基本上破坏了IAPP对抗体NI-203.26C11的结合。因此，为了测定与抗体NI-203.26C11等价的抗IAPP抗体，除了普通的竞争测试，可使用抗原结合测试，特别是用于测定给定的抗IAPP抗体是否主要显示了结合特异性的ELISA，即具有所述必需氨基酸位置的2-CNTATCA-8(SEQ ID NO：7)。

优选地，本发明的hIAPP结合分子包含在它的一个或两个免疫球蛋白链中的如图1所阐述的可变区的两个或所有三个CDR。

在本发明的优选的实施方式中，诸如抗hIAPP抗体的hIAPP结合分子是由包含、基本由或由具有如表1中所描述的抗hIAPP抗体的V_H或V_L区的多核苷酸序列的核酸组成的多核苷酸编码的。在这方面，本领域的技术人员将容易理解的是，编码至少轻链和/或重链的可变区的多核苷酸可编码两个或仅一个免疫球蛋白链的可变结构域。因此在一个实施方式中，该多核苷酸包含、基本上由、或由具有如表1中所描述的抗IAPP抗体的V_H和V_L区的多核苷酸序列的核酸组成。

表1：抗hIAPP抗体的V_H和V_L区的核苷酸序列

可替换地，根据本发明使用的hIAPP结合分子与具有如图1中所描述的VH和VL区的抗体竞争结合于胰腺组织中的hIAPP聚集体。那些hIAPP结合分子可能是抗体，例如鼠的、人源化的、异种的、嵌合的人-鼠或优选地是人源化抗体，特别是用于治疗应用。然而，对于诊断用途和研究，一般而言，鼠抗体也是合适的。抗体的抗原结合片段可以是，例如，单链Fv片段(scFv)、F(ab')片段、F(ab)片段和F(ab')₂片段。对于某些应用，仅需要该抗体的可变区，其可以通过用合适的试剂处理该抗体而获得，以便产生Fab'、Fab或F(ab”)₂部分。这样的片段对用于，例如，涉及将免疫球蛋白的免疫特异性部分偶联至检测试剂(诸如放射性同位素)的免疫诊断规程(过程)是足够的。

该示例性IAPP结合分子，即抗hIAPP抗体也可表现出不识别患有阿尔茨海默症的人脑中的病理性Aβ沉积物。因此，在一个实施方式中，本发明的hIAPP结合分子并不识别患有阿尔茨海默症的人脑中的病理性Aβ沉积物。

在本发明的一个实施方式中，该hIAPP结合分子包含与hIAPP结合结构域(例如VH和/或VL区)和/或与至少一个CDR异源的多肽序列。异源多肽序列包含但不限于不同特异性的结合结构域、肽连接物、肽标签、N-末端和C-末端肽部分、Fc结构域等等，无论是单独或者组合。当然，此外或可替换地，本发明的IAPP结合分子可能包含诸如聚乙二醇的非肽部分，其可通过化学的或生物化学的手段和方法在体外加入。

根据本发明使用的hIAPP结合分子或其相应的一个或多个免疫球蛋白链可以使用本领域中已知的常规技术来进一步修饰，例如，通过使用氨基酸的一个或多个缺失、一个或多个插入、一个或多个取代、一个或多个添加和/或一个或多个重组和/或本领域已知的任何一种或多种其他修饰，无论是单独或者组合。用于在位于免疫球蛋白链的氨基酸序列之下的DNA序列中引入这样的修饰的方法对于本领域技术人员来说是公知的；参见，例如，Sambrook，Molecular Cloning A Laboratory Manual(分子克隆实验手册)，Cold Spring Harbor实验室(1989)N.Y和Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates and Wiley Interscience(格林出版协会和威利跨学科)，纽约(1994)。本发明的抗体的修饰包括在一个或多个组成氨基酸上的化学和/或酶衍生，包括侧链修饰，主链修饰以及包括乙酰化、羟基化、甲基化、酰胺化和碳水化合物或脂质部分的附着或移除、辅因子等的N-末端和C-末端修饰。同样地，本发明包括嵌合蛋白质的产生，所述嵌合蛋白质包含所描述的抗体或其某些片段，其在氨基末端融合至异源分子，如在羧基末端的免疫刺激配体；对于相应的技术细节，参见，例如国际申请WO 00/30680。

在优选的实施方式中，本发明的hIAPP结合分子包含与该结合结构域(例如VH和/或VL区)和/或与至少一个CDR异源的恒定结构域或其部分，优选地其中恒定结构域是人恒定结构域。优选地，该恒定结构域是IgG型的，优选地是IgG1类或同种型的；参见，例如Kipriyanov和Le Gall，Molecular Biotechnology 26(2004),39-60；Chan和Carter,Nature Reviews Immunology 10(2010),301-316；Vincent和Zurini,Biotechnol J.7(2012),1444-1450。

因此，本发明涉及如上文所描述的和定义的任何hIAPP结合分子，其具有使得该分子在保护β细胞免受hIAPP诱导的细胞损伤和/或胰岛淀粉样毒性作用；和/或在需要其的受试者体内恢复hIAPP诱导的葡萄糖耐量受损中是有用的功能的和生物的特征。

在本发明的另一实施方式中，根据本发明使用的hIAPP结合分子被可检测地标记或以其他方式连接至官能部分。标记试剂可被直接地或间接地偶联至本发明的hIAPP结合分子。间接偶联的一个实例是使用间隔基部分。此外，本发明的hIAPP结合分子可包含另外的结构域，所述结构域由共价键或非共价键连接。该连接可以基于根据本领域中公知的和如上所述的方法的基因融合，或者可以通过例如如在诸如国际申请WO 94/04686中所描述的化学交联而进行。存在于包含本发明的hIAPP结合分子的融合蛋白的额外结构域可以优选地通过弾性连接臂(有利地通过多肽连接臂)连接，其中所述多肽连接臂包含多个亲水性肽键合的、具有跨越所述额外结构域的C-末端和本发明的hIAPP结合分子的N-末端之间(或反之亦然)的距离的足够长的氨基酸。该治疗或诊断活性剂可以通过各种方法偶联至本发明的hIAPP结合分子。这包括，例如，包含通过诸如肽连接的共价方法偶联至治疗或诊断活性剂的本发明的抗hIAPP抗体的可变区的单链融合蛋白。另外的实例包括至少包含共价地或非共价地偶联至额外的分子(包括在以下非限制性说明性列表中的那些)的抗原结合片段的分子。Traunecker,Int.J.Cancer Surp.SuDP 7(1992),51-52，描述了双特异性试剂janusin，其中用于CD3的Fv区被偶联至可溶性CD4或其他配体(诸如OVCA和IL-7)。类似地，本发明的抗体的可变区可以构建为Fv分子并偶联至可替换的配体(诸如在所引用文章中所说明的那些)。Higgins,J.Infect.Dis.166(1992),198-202，描述了由OKT3组成的杂合共轭物抗体，该OKT3交联到用于GP120的V3区内的特定序列的抗体。这种杂合共轭物抗体也可以至少使用包含在本发明方法的抗hIAPP抗体中的可变区来构建。特异性抗体的其他实例包括Fanger,Cancer Treat.Res.68(1993),181-194和Fanger,Crit.Rev.Immunol.12(1992),101-124所描述的那些。作为包括常规抗体的免疫毒素的轭合物已经在本领域中被广泛地描述。该毒素可以通过常规偶联技术偶联至该抗体，或者含蛋白质毒素部分的免疫毒素可以如融合蛋白一样被生产。本发明的抗体可以以相应的方式被使用以获得这样的免疫毒素。这类免疫毒素的例证是由Byers,Seminars Cell.Biol.2(1991),59-70和由Fanger,Immunol.Today 12(1991),51-54所描述的那些。

上文所描述的融合蛋白还可以包含用于蛋白酶的可切割的连接臂或可切割的位点。反过来，这些间隔基部分可以是不可溶或可溶的(Diener等人,Science 231(1986),148)，并且可以被筛选以使得药物在靶点部位从抗hIAPP抗体释放。用于免疫治疗的可以偶联至本发明的抗体的治疗剂的实例是药物、放射性同位素、凝集素和毒素。可以轭合到本发明的抗体和抗原的药物包括被经典地称为药物(诸如丝裂霉素C、柔红霉素和长春碱)的化合物。在使用本发明的放射性同位素轭合的抗体或抗原(例如，免疫治疗)时，某些同位素可能比其他同位素更优选，取决于诸如白细胞分布以及稳定性和放射的这样的因素。取决于自身免疫应答，相比其他放射体，某些放射体可能是优选的。一般而言，在免疫治疗中，α粒子和β粒子放射性同位素是优选的。优选的放射体是短程、高能的放射体，诸如²¹²Bi。出于治疗目的的可结合于本发明的抗体或抗原的放射性同位素的实例是¹²⁵I、¹³¹I、⁹⁰Y、⁶⁷Cu、²¹²Bi、²¹²At、²¹¹Pb、⁴⁷Sc、¹⁰⁹Pd和¹⁸⁸Re。最优选地，该放射性标记是⁶⁴Cu。可以偶联至本发明的抗体或抗原的其他治疗剂，以及体外和体内治疗方案是公知的，或可以容易地被本领域普通技术人员确定。当合适时，本领域的技术人员可使用编码本发明的hIAPP结合分子的多核苷酸，而非蛋白质的材料本身。

在一个实施方式中，本文公开的hIAPP结合分子为(a)可检测地标记的，优选地其中该可检测的标记物选自由酶、放射性同位素、荧光团、核磁和重金属组成的组；或(b)附着至药物。

对于药物用途，根据本发明的hIAPP结合分子被配制在药物组合物中；可选地还包含药学上可接受的载体。优选地，该hIAPP结合分子被设计为皮下(s.c.)、肌内(i.m.)或静脉内(i.v.)给药；和/或以每周、每两周或每月为基础给药。在一个实施方式中，该hIAPP结合分子被设计为在胰腺组织中的胰岛淀粉样蛋白纤维、原纤维和/或淀粉样斑的发作之前或之后给药。正如实施例2和图4所能显示的，葡萄糖耐量受损处于2型糖尿病的转基因小鼠模型(hIAPP转基因小鼠)体内的胰岛淀粉样蛋白的沉积之前。因此，患有葡萄糖耐量受损和/或相比健康受试者显示出IAPP的异常表达的受试者可能已经在胰岛中无IAPP淀粉样斑或纤维形成时被治疗，因而防止了糖尿病的更多有害的医学指征的发作。

在本发明的hIAPP结合分子的一个实施方式中，该药物组合物还包含能够防止或减少IAPP淀粉样蛋白形成的药剂(试剂)，优选地其中所述药剂选自由黄酮(黄酮类化合物)、IAPP类似物、二甲双胍(甲福明)和噻唑烷二酮(诸如罗格列酮)组成的组；参见，例如，Cao和Raleigh,Biochemistry 51(2012),2670–2683；Noor等人,Protein Sci.21(2012),373-382；Yan等人,PNAS 103(2006),2046–2051以及Hull等人,Diabetes 54(2005),2235-2244。可替换地，本发明的hIAPP结合分子可以被设计为共同给药(即伴随地之前、联合中或这样的试剂的给药之后)至受试者。例如，糖尿病患者可能已接受了使用抗糖尿病药物的治疗，然而这证明是不成功的和/或不足以分别治愈所有的医学指征和症状。在这种情况下，现有的治疗可根据本发明用该hIAPP结合分子的给药来补充。在疾病的发展过程中，联合治疗是特别优选的。在本申请的背景下，两种或多种化合物的“共同施用”被定义为在24小时内对患者施用两种或更多种的化合物，包括两种药物(每种含有该化合物之一)的单独给药以及同时给药，无论两种化合物是否结合在一种制剂中或者它们在两个分开的制剂中。两种化合物的“协同效应”是根据统计分析的效果，这比来自于这两个单独化合物的效果总和的相加的效果更大。

根据本发明使用的给定的hIAPP结合分子是否可能是治疗有效的，可以通过使用本发明和在所附实施例中公开的动物模型来测定。优选地，当在转基因hIAPP小鼠模型中以约10mg/kg的剂量和/或在转基因hIAPP大鼠模型中以约3mg/kg的剂量给药相关的抗hIAPP IgG抗体时，该抗hIAPP结合分子是有效的。因此，在使用诸如单链抗体的hIAPP结合片段或使用有机小分子的情况下，该剂量可相对于抗体的分子量进行调整。

典型的剂量可以例如在0.001到1000μg的范围内(或在该范围内具有核酸表达或抑制表达)；然而，也可以设想低于或高于该示例性范围的剂量，特别是考虑到前述因素。一般地，剂量的范围可以例如从约0.0001至100mg/kg宿主体重，更通常为从0.01至5mg/kg(例如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内，优选地为至少1mg/kg。在上述范围内的中间剂量也旨在本发明的范围之内。受试者可以每天、隔日、每周或根据经验分析所确定的任何其他时间安排来给予这样的剂量。示例性的治疗需要长时间(例如，至少六个月)地给药多种剂量。另外的示例性治疗方案需要每两周给药一次或每月给药一次或每3至6个月给药一次。示例性的剂量方案包括连续数天1-10mg/kg或15mg/kg、隔日30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中，具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体同时给药，在这种情况下所给药的每种抗体的剂量落入所示的范围内。进程可以通过定期性评估来监测。用于肠胃外给药的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)以及可注射有机酯(诸如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或不挥发性油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏葡萄糖的电解质补充剂)等等。防腐剂和其他添加剂也可存在，诸如，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

术语“受试者”和“患者“在本文中可互换使用，并且是指需要治疗代谢疾病的个体。优选地，该受试者是哺乳动物，特别优选地是人类。

“处理(治疗)”、“治疗”等在本文中用于主要表示获得所需的药理学和/或生理学效果。在完全地或部分地预防疾病或其症状方面，该效果可能是预防性的和/或在部分地或完全地治愈疾病和/或源于疾病的不良反应方面该效果可能是治疗性的。如本文所使用的，术语“处理(治疗)”或“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防范性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)不期望的生理变化或病症，诸如代谢性病的发展或扩散。有益的或期望的临床结果包括，但不限于，症状的减轻，疾病程度的减弱，疾病的稳定(即，不恶化)状态，疾病进展的延迟或减慢，疾病状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”也可以指与如果不接受治疗的预期存活相比延长的存活。需要治疗的那些包括已经患有该病症或障碍的那些以及易患该病症或障碍的那些或者其中该病症或障碍的表现形式被防止的那些。

为了用作药物组合物，根据本发明的hIAPP结合分子，可选地与其他活性剂结合，可以与一种或多种惰性常规载体和/或稀释剂混合在一起。药学上可接受的载体和给药途径可以获自本领域技术人员已知的相应文献。本发明的药物组合物可以根据本领域中公知的方法来配制；例如参见Remington:费城科学大学的The Science and Practice of Pharmacy(药学科学与实践)(2000),ISBN 0-683-306472,Robinson等人的Vaccine Protocol(疫苗协议)，第二版,Humana Press,Totowa,New Jersey,USA,2003；Banga,Therapeutic Peptides and Proteins(治疗性多肽和蛋白质)：Formulation,Processing,and Delivery Systems(制剂、加工和递送系统)，Taylor和Francis，第二版(2006),ISBN:0-8493-1630-8。合适的药物载体的实例在本领域中是熟知的，并且包括磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂、诸如油/水乳剂、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。包括这样的载体的组合物可以通过公知的传统方法来配制。这些药物组合物可以以合适的剂量给予受试者。合适的组合物的给药可以通过不同的方式来实现。实例包括通过口服、鼻内、直肠、局部、腹膜内、静脉内、肌内、皮下、真皮下、经皮、鞘内、颅内方法给予含有药学上可接受载体的组合物。用于口服给药的药物组合物，例如单域抗体分子(例如，“纳米抗体^TM(nanobodies^TM)”)等也设想在本发明中。这样的口服制剂可以是片剂、胶囊、粉末、液体或半固体形式。片剂可以包含固体载体，诸如明胶或佐剂。关于适合于各种类型的给药的制剂的进一步指导可以在Remington's Pharmaceutical Sciences,Mace Publishing Company,Philadelphia,PA,17th ed.(1985)和相应的更新中找到。对于用于药物递送的方法的简要回顾，参见Langer,Science 249(1990),1527-1533。在一个实施方式中，本发明的hIAPP结合分子和组合物以每日一次、每次隔日、每周三次、每周两次或每周一次(优选地低于每日一次)给予人类患者。

如上面提到的，在另一方面，本发明涉及一种转基因非人类动物用于测定测试化合物是否能够防止β细胞免受hIAPP诱导的细胞损伤和/或胰岛淀粉样毒性作用；和/或恢复hIAPP诱导的葡萄糖耐量受损；其中该动物的特征在于能够表达包括编码人胰岛淀粉样多肽(hIAPP)的DNA序列的至少一种转基因，以及

(i)在大约1个月龄和2个月龄时，分别自发地发展以葡萄糖耐量受损和/或高血糖症为特征的糖尿病；和/或

(ii)在大约2个月龄时出现细胞外淀粉样蛋白沉积物和/或在大约4个月龄时出现广泛的淀粉样病变相关的β细胞损失；参见实施例4和图4。

优选地，该测试化合物为如上文所定义的hIAPP结合分子。

正如在实施中所描述的，该编码hIAPP的DNA序列优选地可操作地连接至大鼠胰岛素II启动子。此外，本发明的转基因动物优选是半合子的(半合的，hemizygous)；参见，例如，Cho等人，Curr Protoc Cell Biol.(2009),章:单元-19.11；Haruyama等人,Curr Protoc Cell Biol.(2009),章:单元-19.11。

本发明的说明书和实施例公开并涵盖了这些和其他实施方式。使用例如电子设备，根据本发明待应用的关于材料、方法、用途和化合物中的任何一种的进一步文献可从公共图书馆和数据库中检索到。例如，可以利用公共数据库“Medline”，其是由国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)和/或国家医学图书馆(National Library of Medicine)在国立卫生研究院(National Institutes of Health)主办的。另外的数据库和网址(诸如欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute)(EBI)的那些，其是欧洲分子生物学实验室(European Molecular Biology Laboratory)(EMBL)的一部分)对本领域技术人员来说是已知的，并且也可以利用因特网搜索引擎获得。在Berks,TIBTECH 12(1994),352-364中给出了对追溯查询和当前意识有用的生物技术中的专利信息的综述和专利信息的相关资源的调查。

几个文件通篇引用在本说明书中。所有引用的文献(包括如在本申请中通篇引用的参考文献、授权的专利、公开的专利申请和制造商的说明书、指南等)的内容在此明确地通过引用并入本文中；然而，没有承认所引用的任何文献确实是关于本发明的现有技术。

可以通过参考以下具体实施例例和附图来获得更完整的理解，本文中提供这些实施例仅用于说明的目的，而并非旨在限制本发明的范围。

附图说明

图1：可变区的氨基酸和核苷酸序列，即人IAPP抗体的NI-203.26C11的重链和κ轻链。框架区(FR)和互补决定区(CDR)用带下划线的CDR显示。重链连接区(JH)和轻链连接区(JK)也被显示。由于克隆策略，在重链和轻链的N-末端的氨基酸序列可能潜在地包含在FR1中的引物诱导的改变，然而其基本上不影响抗体的生物活性。为了提供一致的人类抗体，原始克隆的核苷酸和氨基酸序列根据数据库中的有关人种系(生殖细胞系，germ line)可变区序列进行对准和调整；例如，参见由蛋白质工程MRC中心(MRC Centre for Protein Engineering)(Cambridge,UK)主办的Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)。当N-末端氨基酸被认为可能是由于PCR引物偏离一致的种系序列，并且因而被引物诱导的突变校正(PIMC)替换时，人类抗体的氨基酸序列被显示。

图2：NI-203.26C11抗体选择性地并且剂量依赖性地识别在诊断患有2型糖尿病(T2D)的患者的胰腺中的病理性hIAPP聚集体。在T2D患者而非健康对照的胰岛中的胰岛淀粉样蛋白的硫黄素S(ThioS，左图，绿色)染色。NI-203.26C11抗体显示了在负载有胰岛淀粉样蛋白的T2D胰岛(受试者1和2)中而非在缺乏胰岛淀粉样蛋白的健康对照胰岛(受试者3和4)中的染色。用3nM、10nM、30nM(强染色)和1nM(弱染色)的重组小鼠嵌合抗体NI-203.26C11(NI-203.26C11-ch；棕色)来检测在淀粉样蛋白阳性T2D胰岛上的hIAPP聚集体。NI-203.26C11抗体不识别健康对照胰腺上的生理性hIAPP。仅抗IAPP抗体(1:100；抗IAPP)和驴抗小鼠二抗(抗小鼠二级)分别被用作阳性对照和阴性对照。进行复染(对比染色，counterstaining)以使细胞核可视化(淡蓝色i.o.，这里淡染色)。比例尺：100μm。

图3：NI-203.26C11抗体选择性地识别T2D患者体内的病理性hIAPP聚集体。NI-203.26C11抗体在T2D胰岛中显示出染色，但不识别缺乏病理性hIAPP聚集体的健康对照胰岛上的生理性IAPP。用重组小鼠嵌合抗体NI-203.26C11(NI-203.26C11-ch；蓝色；100nM；顶部图)来检测在T2D胰岛上的hIAPP聚集体。hIAPP聚集体的NI-203.26C11染色被限制为失去了β细胞的胰岛区域(没有与红色染色的胰岛素合并)。用抗胰岛素抗体(1:3，红色)来检测胰岛β细胞上的胰岛素。抗IAPP抗体(1:100；抗IAPP；底部图)识别在T2D和健康对照胰岛β细胞上的生理性hIAPP，正如用胰岛素染色(与红色染色的胰岛素合并)共定位所显示的。比例尺：50μm。

图4：葡萄糖耐量受损处于在2型糖尿病的转基因小鼠模型(hIAPP转基因小鼠)中的胰岛淀粉样蛋白的沉积之前。(A)在hIAPP转基因小鼠体内，胰岛淀粉样蛋白在14周龄而非4周龄是可见的。野生型小鼠丧失了胰岛淀粉样蛋白。因胰岛淀粉样蛋白(0.1％的ThioS)、胰岛素(抗胰岛素抗体；1:3；红色)和胰高血糖素(抗胰高血糖素抗体；1:2500；蓝色)而被染色的hIAPP转基因的和野生型小鼠的胰岛的代表性图像。(B)4周龄的和14周龄的转基因小鼠的葡萄糖耐量受损。在4周龄(顶部图)和14周龄(底部图)时对hIAPP转基因的和野生型小鼠进行口服葡萄糖耐量试验(oGTT)期间的血糖水平。在4周龄(tg，n＝13；wt，n＝9)和14周龄((tg，n＝27；wt，n＝31)时，在口服葡萄糖后，在hIAPP转基因小鼠体内的血糖水平与野生型小鼠相比更高。空腹血糖水平在4周的组之间是相似的，但在14周龄时在hIAPP转基因小鼠体内增加。与wt组相比，**p<0.01和***p<0.001。比例尺：50μm。

图5：NI-203.26C11抗体选择性地结合hIAPP转基因小鼠体内的hIAPP聚集体。NI-203.26C11在4周龄和16周龄的hIAPP转基因小鼠的胰岛上显示出染色(蓝色染色；左图)，其中在年龄匹配的野生型小鼠上没有染色(无蓝色染色；右图)。用重组人抗体NI-203.26C11(NI-203.26C1；蓝色；100nM)来检测转基因胰岛上的hIAPP聚集体。用抗胰岛素抗体(1:3；红色)来检测胰岛β细胞上的胰岛素。比例尺：50μm。

图6：在单次给药后，NI-203.26C11抗体在hIAPP转基因小鼠内靶向聚集的hIAPP。重组人NI-203.26C11或同种型对照(对照IgG)抗体以10mg/kg(i.p.(腹腔注射))给予16周龄的hIAPP转基因的和野生型小鼠，并且在给药2天后使用抗人二抗来评价抗体结合。重组人NI-203.26C11(这里棕色染色)靶向显示了ThioS阳性的淀粉样蛋白(这里绿色染色)的转基因胰岛，而非ThioS阴性的野生型胰岛。对照IgG没有观察到染色。进行复染以使细胞核可视化(淡蓝色i.o.，这里淡染色)。

图7：NI-203.26C11抗体防止了在hIAPP转基因小鼠体内的β细胞的损失。(A)用抗胰岛素抗体染色来可视化β细胞的小鼠胰岛的代表性图像(红色i.o.，这里强染色)。(B)在hIAPP转基因小鼠体内用重组小鼠嵌合NI-203.26C11抗体每周一次治疗(tg NI-203.26C11-ch，n＝23；10mg/kg i.p.(腹腔注射)12周)增加了胰腺的胰岛素(以胰腺面积％和胰岛面积％表示的胰岛素阳性面积；顶部左侧图和顶部中间图)、胰岛面积(平均胰岛面积；顶部右图)和胰岛素分泌(血浆胰岛素水平，底部左图)，与接受PBS的hIAPP转基因小鼠相比((tg PBS，n＝28)。在NI-203.26C11-ch治疗后，胰岛密度和胰腺质量没有改变(分别为底部中间图和底部右侧图)。与tg PBS组相比，*p<0.05和**p<0.01。比例尺：50μm。

图8：在hIAPP转基因小鼠体内NI-203.26C11抗体降低了空腹血糖，提高了葡萄糖耐量并使体重增加正常化。将重组小鼠嵌合NI-203.26C11抗体每周一次给予hIAPP转基因小鼠(tg NI-203.26C11-ch，n＝24；10mg/kg i.p.(腹腔注射))。使用PBS作为载体(tg PBS，n＝27)。(A)与PBS组相比，NI-203.26C11抗体显著降低了8周和12周治疗后的hIAPP转基因小鼠体内的空腹血糖。在过夜禁食后测定了血糖水平。(B)与PBS组相比，NI-203.26C11抗体显著提高了hIAPP转基因小鼠体内的葡萄糖耐量。在治疗10周后在hIAPP转基因小鼠中进行口服葡萄糖耐量试验(oGTT)期间的血糖水平。(C)与注射PBS(wt PBS，n＝31)的野生型小鼠相比，增加的体重(％)在超过12周治疗的NI-203.26C11治疗的hIAPP转基因小鼠体内正常化。与野生型小鼠相比，在PBS治疗下的hIAPP转基因小鼠显示了受损的体重增加。tg NI-203.26C11-ch与tg PBS相比：*p<0.05和**p<0.01；tg PBS与wt PBS相比：#p<0.05和###p<0.001；tg NI-203.26C11-ch与wt PBS相比：§p<0.05。

图9：NI-203.26C11主要识别早期纤维状hIAPP聚集体种类。(A)具有对于hIAPP(■)的经典S形聚集曲线的硫黄素-T(Thio-T)聚集测试，而对于啮齿动物IAPP(□；rIAPP)没有聚集。(B)在所显示的时间点从Thio-T实验获取的样品(1:3稀释系列)的Dotblot分析显示出抗IAPP抗体与所收集的所有hIAPP样品以及在20分钟后获取的rIAPP的非选择性结合。相反，NI-203.26C11显示出对在hIAPP聚集(5')的生长阶段所获得的hIAPP制备物的选择性结合，同时降低了与在稍晚的时间点(10'、20')所取得的hIAPP样品的结合。重要的是，NI-203.26C11保持了对非聚集的hIAPP部分(0')的免疫阴性并且与rIAPP不反应。在过滤器阻滞分析(FRA)中，在所评估的所有时间点，该抗IAPP抗体识别了SDS抗性纤维状hIAPP种类，但未见NI-203.26C11针对这些hIAPP种类的反应性。(C)从Thio-T聚集测试获取的样品的透射电子显微镜(TEM)分析显示出不同的形态谱图。对于在聚集前(0')取得的hIAPP和在后期(20')取得的rIAPP都没有检测到较大的纤维状聚集体。中间体hIAPP种类显示出无定形非纤维状以及纤维状的特性(5')，而在边界(10')或平衡相(20')内获取的样品主要显示出纤维状形态。

图10：NI-203.26C11抗体使2型糖尿病的转基因大鼠模型(hIAPP转基因大鼠)内的葡萄糖耐量正常化。重组大鼠嵌合NI-203.26C11抗体每周一次给予hIAPP转基因大鼠(tg NI-203.26C11-r，n＝9；3mg/kg i.p.(腹腔注射))和野生型大鼠(wt NI-203.26C11-r，n＝4；3mg/kg i.p.(腹膜内腔注射))。在hIAPP转基因大鼠(tg PBS，n＝10)和野生型大鼠(wt PBS，n＝5)中，PBS被用作载体。(A)治疗前在3月龄的hIAPP转基因大鼠和野生型大鼠体内的口服葡萄糖耐量试验(oGTT)显示出相等的血糖水平。(B)与tg PBS和wt PBS大鼠相比，NI-203.26C11-R抗体使在治疗8周后进行的oGTT期间hIAPP转基因大鼠体内的血糖水平正常化。NI-203.26C11-r抗体不影响野生型大鼠(wt NI-203.26C11-r)体内的血糖水平。tg NI-203.26C11-r与tg PBS比较：**p<0.01。

具体实施方式

方法

抗体

通过对来源于临床选择的老年人类受试者群的人类记忆B细胞库的完全补体的高通量分析来识别靶向聚集种类的人类IAPP(hIAPP)的人源化抗体。来源于hIAPP反应性记忆B细胞的抗体cDNA被表达用于结合特性的测定。为了避免中和针对人IgG的小鼠和大鼠抗人抗体应答，通过蛋白质工程产生了由人类可变结构域和小鼠或大鼠恒定区组成的嵌合抗体。hIAPP反应性IgG克隆在CHO中被重组产生，用于体外表征以及在转基因小鼠和大鼠的体内验证研究。蛋白表达被扩大到20升波浪反应器，以便允许以100mg的规模产生抗体。通过亲和层析将抗体纯化为无内毒素的。

小鼠

从杰克逊实验室(巴尔港(Bar Harbor)，缅因州(ME))获得小鼠。通过饲养hIAPP转基因FVB/N(FVB/N-Tg(Ins2-IAPP)RHFSoel/J)雄性小鼠和DBA/2J野生型雌性小鼠，生成了具有由大鼠胰岛素II启动子驱动的hIAPP的胰岛β细胞表达的半合子转基因雄性小鼠(F1)以及具有FVB/NxDBA/2J背景的野生型雄性小鼠(F1)。通过使用针对该hIAPP转基因的寡核苷酸引物的基因组DNA的PCR来测定转基因状态。

该小鼠表现出代谢表型的早期发作，即该小鼠自发地发展了以已分别在1个月龄和2个月龄出现的葡萄糖耐量受损和高血糖症为特征的糖尿病。与本文所描述的小鼠模型相比较，先前描述的小鼠模型没有自发地发展糖尿病，并且直到6个月龄至10个月龄自发地发展了具有高血糖症和葡萄糖耐量受损的糖尿病，参见例如Couce等人.Diabetes 45(1996),1094-1101)；Soeller等人，Diabetes 47(1998),743-750；Hull等人，Diabetes 52(2)(2003),372-379；Hull等人，Am J Physiol Endocrinol Metab 289(2005),703-709；Butler等人，Diabetes 52(2003),2304-2314；Hoppener等人，Diabetologia 42(4)(1999),427-434；以及Janson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(14)(1996),7283-7288。此外，与先前描述的小鼠模型(其中在自发地发展糖尿病的小鼠体内观察到最少量的淀粉样蛋白沉积)相比，本发明的小鼠模型显示了在2个月龄时细胞外淀粉样蛋白沉积物的出现以及在4个月龄时观察到的广泛的淀粉样变性，伴随相关的β细胞损失，也显示了在12个月龄时的细胞外淀粉样蛋白沉积(淀粉样蛋白严重性＝1％至5％，以及淀粉样蛋白患病率＝40％至60％)，伴随相关的β细胞损失，并且显示了在16至19个月龄时的细胞外淀粉样蛋白沉积(淀粉样蛋白患病率＝25％至85％)，伴随相关的β细胞损失；参见，例如Hull等人，Diabetes 52(2)(2003),372-379；Hull等人，Am J Physiol Endocrinol Metab 289(2005),703-709；Hoppener等人，Diabetologia 42(4)(1999),427-434。

相对于先前的模型，该小鼠模型的新特征(参见综述：Matveyenko等人(2006)，ILAR J.47(3)：225-233)包括：

1)不同的遗传背景：

-我们的小鼠模型：FVB/NxDBA/2J背景下的半合子hIAPP转基因体。

-先前描述的小鼠模型：FVB/N(Couce等人(1996),Diabetes 45:1094-1101)、FVB/N/A^vy/A(Soeller等人，(1998),Diabetes 47:743-750)、C57BL/6J(Hull等人，(2005),Am J Physiol Endocrinol Metab 289:703-709)、DBA/2J(Hull等人，(2005),Am J Physiol Endocrinol Metab 289:703-709)、C57BL/6JxDBA/2J(Hull等人，(2003),Diabetes 52(2):372-379；Hull等人，(2005),Am J Physiol Endocrinol Metab 289:703-709)、C57BL/6J/A^vy/A(Butler等人，(2003),Diabetes 52:2304-2314)以及ob/ob(Hoppener等人，(1999),Diabetologia 42(4):427-434)背景下的半合子hIAPP转基因体。FVB/N背景下的纯合hIAPP转基因体(Janson等人，(1996),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(14):7283-7288)。

2)早期发作代谢表型：

-我们的小鼠模型：小鼠，分别自发地发展以在1个月龄和2个月龄已经出现的葡萄糖耐量受损和高血糖症为特征的糖尿病。

-先前描述的小鼠模型：

○小鼠没有自发地发展糖尿病：FVB/N(Couce等人，(1996),Diabetes 45:1094-1101)、C57BL/6J(Hull等人，(2005),Am J Physiol Endocrinol Metab 289:703-709)以及DBA/2J(Hull等人，(2005),Am J Physiol Endocrinol Metab 289:703-709)背景下的半合子hIAPP转基因体。

○直至6至10个月龄，小鼠自发地发展具有高血糖症和葡萄糖耐量受损的糖尿病：FVB/N/A^vy/A(Soeller等人(1998),Diabetes 47:743-750)、C57BL/6J/A^vy/A(Butler等人(2003),Diabetes 52:2304-2314)、C57BL/6JxDBA/2J(Hull等人(2003),Diabetes 52(2):372-379；Hull等人(2005),Am J Physiol Endocrinol Metab 289:703-709)以及ob/ob(Hoppener等人(1999),Diabetologia 42(4):427-434)背景下的半合子hIAPP转基因体。

3)早期发作和更加突出的胰岛病理：

-我们的小鼠模型：在2个月龄时细胞外淀粉样蛋白沉积物的出现以及在4个月龄时观察到的广泛的淀粉样变性，伴随相关的β细胞损失。

-先前描述的小鼠模型：在自发地发展糖尿病的小鼠体内观察到的极小的淀粉样蛋白沉积。在C57BL/6JxDBA/2J(Hull等人(2003),Diabetes 52(2):372-379；Hull等人(2005),Am J Physiol Endocrinol Metab 289:703-709)背景下的半合子hIAPP转基因体在12个月龄时显示了细胞外淀粉样蛋白沉积(淀粉样蛋白严重性＝1％至5％，以及淀粉样蛋白患病率＝40％至60％)，伴随相关的β细胞损失。在ob/ob(Hoppener等人(1999),Diabetologia 42(4):427-434)背景下的半合子hIAPP转基因体在16至19个月龄时显示了细胞外淀粉样蛋白沉积(淀粉样蛋白患病率＝25％至85％)，伴随相关的β细胞损失。

将小鼠保持在12小时清淡的(易消化的)方案中并给予由7％的脂肪和18％的蛋白质(按总热量[千卡]的百分比)组成的正常饲料(KLIBA NAFAG)。所有小鼠已经自由摄入食物和水。

大鼠

具有由大鼠胰岛素II启动子驱动的hIAPP的胰岛β细胞表达的半合子转基因大鼠(Matveyenko等人，Diabetes(2009)，1604-1615；Butler等人，Diabetes(2004)，1509-1516)和野生型斯普拉-道来氏(Sprague-Dawley)雄性大鼠是从查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)(德国)获得的。将大鼠保持在12小时清淡的方案中并给予正常饲料。所有大鼠已经自由摄入食物和水。

治疗

转基因小鼠从第4周龄开始接受每周一次的重组小鼠嵌合IgG2a抗体的NI-203.26C11-ch的给药(10mg/kg体重；腹腔注射(i.p.))，并持续整个研究期间。载体治疗的转基因小鼠和野生型小鼠以生理盐水(PBS)腹膜内给药。

转基因大鼠和野生型大鼠从第12周龄开始接受每周一次的重组大鼠嵌合IgG2b抗体NI-203.26C11-r的给药(3mg/kg体重；腹腔注射(i.p.))，并持续整个研究期间。载体治疗的转基因大鼠和野生型大鼠以生理盐水(PBS)腹膜内给药。

口服葡萄糖耐量测试、空腹血糖、血浆胰岛素和血浆hIAPP

对于葡萄糖耐量测试，5小时禁食的小鼠和整夜禁食的大鼠以2g/kg的葡萄糖溶液口服地给药。在葡萄糖注射之前和葡萄糖注射后10分钟、30分钟、60分钟、120分钟和240分钟，从小鼠尾静脉收集血液样品。在葡萄糖注射之前和葡萄糖注射后30分钟、60分钟、120分钟和240分钟，在气体麻醉下从舌下静脉收集大鼠血液。使用血糖仪(CONTOUR XT传感器，拜尔)测量血糖。从过夜禁食后所收集的血液样品测量空腹血糖。使用小鼠胰岛素(Mercodia)和人胰岛淀粉样多肽(Millipore)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒来测定非空腹血浆胰岛素和hIAPP水平。

组织学

将小鼠处死，并且解剖胰腺，称重(以计算胰腺的质量)，固定在4％(wt/vol.(重量/体积))的磷酸盐缓冲的多聚甲醛中，包埋于石蜡中并切割3-μm的切片。石蜡包埋的人体组织是从巴塞尔大学医院(UHB，巴塞尔，瑞士)获得的，并切割3-μm的切片。切片用0.1％(wt/vol.)的硫黄素S染色，以使淀粉样蛋白沉积物、多克隆豚鼠抗胰岛素抗体(1:3；FLEX；Dako)、小鼠单克隆抗IAPP抗体(1:100；R 10/99；Abcam)、多克隆兔抗胰高血糖素抗体和重组的NI-203.26C11(人或小鼠嵌合)抗体可视化。接着初级抗体，将切片与TRITC轭合的驴抗豚鼠抗体(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.(免疫研究(欧洲)有限公司)，英国)、Cy5轭合的或生物素化的驴抗小鼠抗体、Cy5轭合的山羊抗兔抗体、Cy5轭合的或生物素化的驴抗人抗体一起孵育。链霉亲和素-生物素-过氧化物酶反应(Vectastain ABC试剂盒，Vector Lab Inc.(载体实验室公司)，伯林格姆，美国)与生物素化的二抗一起使用，并将切片用苏木精复染色以使细胞核可视化。使用Image J软件进行图像分析。为了量化ThioS阳性的淀粉样蛋白面积、胰岛素阳性面积、平均胰岛面积和胰岛密度，将每个胰腺切片(每只动物五个切片)的所有胰岛以20倍的放大率进行了详细地检测。ThioS阳性的淀粉样蛋白面积和胰岛素阳性面积是以对应于超过预设阈值的荧光的面积来计算的。胰岛面积是由手动画出在ThioS途径上可视的胰岛的轮廓而测定的，其中该胰岛的轮廓是清晰可见的。ThioS染色表示为与胰腺面积和胰岛素面积相关。胰岛素染色表示为与胰腺面积和胰岛面积相关。

统计分析

数据表示为平均值±SEM。使用学生t检验来测定组对之间的显著性差异。葡萄糖耐量数据是使用重复测量的ANOVA(以研究和治疗的时间为独立变量)来分析的。所有统计分析使用Prism软件(GraphPad软件公司，圣地亚哥，加州，美国)来进行。p<0.05被认为是显著的。

实施例1：对人体组织内病理性hIAPP的抗体的亲和力和选择性的验证

为了测试该NI-203.26C11抗体是否选择性地和剂量依赖性地识别人体组织内(即在诊断患有2型糖尿病(T2D)的患者(受试者1和2)的胰腺内)的病理性hIAPP聚集体，对于NI-203.26C11抗体结合而检测了显示出当ThioS染色时观察到的在胰岛内的淀粉样蛋白负载的石蜡包埋的诊断患有T2D患者的胰腺切片。作为对照，使用了未被诊断有T2D的患者(受试者3和4)的石蜡包埋的胰腺切片(图2)。

在甲酸预处理后，将切片与以不同浓度(即1nM、3nM、10nM和30nM)的NI-203.26C11-ch抗体一起孵育，或者与小鼠单克隆抗IAPP抗体(1:100；Abcam，剑桥，英国)一起孵育，并且将驴抗小鼠二抗用作对照，随后与生物素化的驴抗人二抗(1:500；Jackson ImmunoResearch，纽马基特，英国)或生物素化的山羊抗小鼠二抗(1:500；Jackson ImmunoResearch，纽马基特，英国)一起孵育。抗体信号用Vectastain ABC-AP试剂盒(Vector Laboratories，美国)扩增，并且用二氨基联苯胺底物(Thermo Fisher Scientific，USA)检测。在抗生物素蛋白/生物素阻断(抗生物素蛋白/生物素阻断试剂盒，Vector Laboratories，美国)之后，胰岛β细胞利用多克隆豚鼠抗胰岛素抗体(1:5；Dako，美国)进行可视化，其与生物素化的驴抗豚鼠二抗(1:500；ImmunoResearch Laboratories，美国)结合，并且抗体信号用Vectastain ABC-AP试剂盒(Vector Laboratories，美国)扩增，并用碱性磷酸酶底物(Vector Laboratories，美国)进行检测。

NI-203.26C11抗体显示了在负载有胰岛淀粉样蛋白的T2D胰岛(受试者1和2)中的剂量依赖的染色，但在缺乏胰岛淀粉样蛋白的健康对照胰岛(受试者3和4)中不显示(图2)。然而，NI-203.26C11抗体不识别在健康对照胰腺上的生理性hIAPP，如图2所示的两个较低行。

此外，NI-203.26C11抗体的选择性是通过免疫荧光染色来测试的(图3)。利用用于胰岛β细胞的NI-203.26C11抗体、小鼠单克隆抗IAPP抗体(1:100；Abcam，剑桥，英国)和驴抗小鼠二抗和多克隆豚鼠抗胰岛素抗体(1:5；Dako，美国)来针对IAPP和胰岛β细胞标记组织切片。用荧光标记的二级抗体进行可视化。

简言之，石蜡包埋的切片用NI-203.26C11或小鼠单克隆抗IAPP抗体(1:100；Abcam公司，剑桥，英国)标记，并随后通过Cy5标记的驴抗小鼠IgG二抗标记。胰岛β细胞，即胰岛素，使用偶联至TRITC-标记的驴抗豚鼠二抗(1:500；Jackson ImmunoResearch实验室，美国)的多克隆豚鼠抗胰岛素抗体(1:5；Dako，美国)来测定与IAPP的共定位。用Tris缓冲甘油(一种pH 9.5的0.1M Tris-HCl与补充有50mg/mL的正丙基棓酸盐的3:7的混合物)来滑动覆盖已染色的样品。

结果，该重组小鼠嵌合抗体NI-203.26C11(NI-203.26C11-ch；蓝色；100nM；图3顶部图)检测到了T2D胰岛上的hIAPP聚集体。特别是，该染色被限于失去了β细胞的胰岛区域(没有与红色染色的胰岛素合并)。然而，在缺乏病理性hIAPP聚集体的健康对照胰岛中，没有染色在生理性IAPP上是可见的。

实施例2：葡萄糖耐量受损处于2型糖尿病的转基因小鼠模型中ThioS阳性材料的沉积之前

为了测试在转基因小鼠模型中的胰岛淀粉样蛋白的沉积，利用免疫荧光染色将胰岛淀粉样蛋白可视化，正如上所描述的在14周龄而非4周龄的hIAPP转基因小鼠内利用已染色的hIAPP转基因和野生型小鼠的胰岛用于胰岛淀粉状蛋白(0.1％ThioS)、胰岛素(抗胰岛素抗体；1:3；红色)和胰高血糖素(抗胰高血糖素抗体；1:2500；蓝色)，参见图4。如图4(A)中所示，与该转基因小鼠相比，野生型小鼠失去了胰岛淀粉样蛋白。

此外，在转基因小鼠体内测定了葡萄糖耐量，参见图4(B)。简言之，以每克体重的2mg将葡萄糖腹腔内给予5小时禁食的动物，然后使用商购的测量装置(Medisafe Reader，Terumo有限公司)每15分钟测定该动物血液中的葡萄糖水平(外周血，血糖浓度)，持续240分钟。利用商购的测量装置的测量是基于比色分析。制备测量芯片，并且将作为催化剂的葡萄糖氧化酶和过氧化物酶以及作为显色剂的4-氨基安替吡啉和N-乙基-N(2-羟基-3-磺丙基)-间-甲苯胺置于该芯片上。当通过毛细管现象所吸收的血液样品(这里为4μl)被置于该芯片上时，于是血液中的葡萄糖被葡萄糖氧化酶氧化。然后，该芯片上的显色剂被此刻产生的过氧化氢和过氧化物酶氧化，这产生了红紫色。通过测量此色调的程度来计算血液中的葡萄糖的量。口服葡萄糖耐量测试是在4周龄(顶部图)和14周龄(底部图)的转基因和野生型小鼠体内进行的，参见图4(B)。该结果表明，与在4周龄(tg,n＝13；wt,n＝9)和14周龄(tg,n＝27；wt,n＝31)的野生型小鼠相比，口服葡萄糖后的血糖水平在hIAPP转基因小鼠体内更高。另外，空腹血糖水平在4周龄的组间是相似的，但在14周龄的hIAPP转基因小鼠体内增加。

实施例3：对hIAPP转基因小鼠体内的hIAPP聚集体的抗体的亲和力和选择性的验证

为了测试该NI-203.26C11抗体针对hIAPP转基因小鼠体内的hIAPP聚集体的亲和力和选择性，利用用于检测转基因胰岛上的hIAPP聚集体的重组人抗体NI-203.26C11(NI-203.26C11；蓝色；100nM)和用于检测胰岛β细胞上的胰岛素的抗胰岛素抗体(1:3；红色)进行免疫荧光和免疫组织化学分析，参见图5。该结果显示在4周龄和16周龄hIAPP转基因小鼠体内的胰岛上的NI-203.26C11染色(蓝色染色；左图，图5)，其中在年龄匹配的野生型小鼠上没有染色(没有蓝色染色；右图，图5)。

此外，将该NI-203.26C11抗体以单次给药(10mg/kg(i.p.))给予16周龄的hIAPP转基因和野生型小鼠，并且其结合是在给药2天后使用抗人二抗来评价的，参见图6。

这表明，该重组人NI-203.26C11(棕色染色，图6)靶向显示ThioS阳性淀粉状蛋白(绿色染色，图6)的转基因胰岛，而非ThioS阴性的野生型胰岛。此外，对照IgG没有观察到染色。

实施例4：本发明的抗体的给药防止了hIAPP转基因小鼠体内的β细胞损失

为了测试该NI-203.26C11对hIAPP转基因小鼠体内的β细胞的效果，在hIAPP转基因小鼠体内用重组小鼠嵌合NI-203.26C11抗体一周一次治疗以后(tg NI-203.26C11-ch,n＝23；10mg/kg腹膜内持续12周)，测量了胰腺胰岛素、胰岛面积和胰岛素分泌；参见图7。

简言之，石蜡包埋的切片用多克隆豚鼠抗胰岛素抗体(1:5；Dako，美国)标记，并随后通过TRITC标记的驴抗豚鼠二抗(1:500；Jackson ImmunoResearch Laboratories，美国)标记。用Tris缓冲甘油(一种pH 9.5的0.1M Tris-HCl与补充有50mg/mL正丙基棓酸盐的3:7的混合物)来滑动覆盖已染色的样品。在方法部分中描述了与胰腺和胰岛面积有关的胰岛素阳性面积、平均胰岛面积和胰岛密度的定量。

该结果表明，与接受PBS的hIAPP转基因小鼠(tg PBS,n＝28)相比，胰腺的胰岛素(以％胰腺面积和％胰岛面积的胰岛素阳性面积；顶部左侧图和顶部中间图)、胰岛面积(平均胰岛面积；顶部右图)和胰岛素分泌(血浆胰岛素水平；底部左图)增加了。在NI-203.26C11-ch治疗后，该胰岛密度和胰腺质量没有改变(分别为底部中间图和底部右图；图7)。

实施例5：本发明的抗体主要识别早期纤维状IAPP

为了测定该抗体NI-203.26C11结合于何种hIAPP聚集体，进行了硫黄素-T(Thio-T)聚集测试。简言之，合成的hIAPP的自发聚集是由通过淀粉样蛋白特异性染料硫代黄素-T(Thio-T)的荧光的增加而监测淀粉样纤维形成来评估的。冻干的合成hIAPP肽(Bachem，瑞士)在纯DMSO中重构，并在Thio-T溶液(在20mM Tris-HCl中的20μM Thio-T，pH 8.5)中混合至20μM的最终肽浓度。在通过0.22μm过滤器(滤膜)(Millipore)过滤后，将聚集溶液立即转移到荧光石英比色杯中，并在搅拌下在室温下每1分钟在489nm处测量荧光发射波长(在456nm激发)的Cary Eclipse荧光分光光度计(Agilent)上记录聚集。该测试显示出了对hIAPP而非对啮齿类IAPP(rIAPP)的经典的S形聚集曲线，如图9A中所示。

此外，利用来自于Thio-T实验的样品进行了DotBlot分析。该DotBlot分析如下进行，将来自聚集测试的hIAPP制备物连续稀释并通过PBS-T(0.1％吐温-20的PBS)预平衡的硝化纤维素膜(孔径0.1μm)过滤。用PBS-T洗涤孔并加入样品。在完整的过滤后洗涤膜三次。随后，将该膜在室温下短时间风干15分钟，在封闭缓冲液(3％BSA，含0.1％吐温-20的PBS)中在室温下孵育1小时，并用小鼠嵌合NI-203.26C11抗体(封闭缓冲液中5μg/ml)在室温下孵育1小时。作为对照抗体，使用了鸡抗IAPP抗体(1:1000；P10997，Agrisera)。在洗涤后，将该膜与HRP轭合的抗小鼠和抗鸡IgG二抗(1:10000稀释；Jackson ImmunoResearch Laboratories)一起在室温下孵育1小时。HRP底物(ECL)的转化是使用ImageQuant LAS 4000检测(GE Healthcare)来进行分析的。如图9B中所示，可以显示出在hIAPP聚集的早期阶段的对hIAPP制备物的选择性结合，而在生长后期阶段观察到了降低的结合。然而，该抗体NI-203.26C11保持了对非聚集hIAPP部分(0')的免疫阴性，并且对rIAPP不反应。

此外，使用来自于聚集测试混合于2％SDS的hIAPP制备物来进行过滤阻滞测试(FRA)。然后将样品通过乙酸纤维素膜过滤，并且用封闭缓冲液(含3％奶、0.1％Tween-20的PBS)在室温下将该膜封闭1小时。SDS抗性的hIAPP集合的检测是如对DotBlot分析所描述的来进行。该FRA表明了在所有的评估时间点的抗IAPP抗体识别了SDS抗性纤维状hIAPP种类，而对于针对这些hIAPP种类的抗体NI-203.26C11没有观察到反应性，参见例如图9B。

通过透射电子显微镜(TEM)分析来评估hIAPP集合的形态。简言之，将样品被吸附在发光放电碳包覆的铜网格上，并且将过量的样品通过滤纸上的印迹除去。将网格用2％(w/v)醋酸铀染色60秒，并且过量的溶液通过用ddH20洗涤除去。风干后，将网格用具有100kV的加速电压的飞利浦CM100透射电子显微镜成像。如图9C中所示，可以用TEM来评估多样形态的谱图。特别是，在表示聚集之前的时间点的时间点0分钟时，没有大的纤维状聚集体。5分钟后，可以观察到无定形非纤维状和纤维状特性。在后续的时间点(即10分钟和20分钟)取得的样品中观察到了纤维状的形态。

实施例6：本发明抗体的给药防止了与糖尿病相关的症状

为了证明NI-203.26C11抗体的给药是否可以改善与糖尿病相关的症状，将该重组小鼠嵌合NI-203.26C11抗体每周一次给药于hIAPP转基因小鼠(tg NI-203.26C11-ch，n＝24；10mg/kg腹腔注射(i.p.))并且如上已经描述的来评估血糖、葡萄糖耐量和体重；参见图8。

治疗8周和12周后，与PBS组相比，该NI-203.26C11抗体显示了hIAPP转基因小鼠体内禁食过夜后所测量的空腹血糖的显著下降。此外，治疗10周后该葡萄糖耐量显著改善。

此外，在用NI-203.26C11治疗的hIAPP转基因小鼠体内可以观察到正常化的体重，即与注射PBS的野生型小鼠(wt PBS，n＝31)相比，超过12周的治疗在NI-203.26C11治疗的体内将增加的体重(％)正常化。特别是，与野生型小鼠相比，PBS治疗的hIAPP转基因小鼠表现出受损的体重增加，参见图8。

因此，作为结果，已经表明，NI-203.26C11抗体在hIAPP转基因小鼠体内降低了空腹血糖、改善了葡萄糖耐量和使体重增加正常化。

实施例7：本发明的抗体使hIAPP转基因大鼠体内的葡萄糖耐量正常化

此外，为了进一步改善转基因小鼠中所显示的结果，评估了NI-203.26C11抗体在2型糖尿病的转基因大鼠(hIAPP转基因大鼠)模型中的作用，参见图10。特别是，将重组大鼠嵌合NI-203.26C11抗体每周一次给予hIAPP转基因大鼠(tg NI-203.26C11-r，n＝9；3mg/kg腹腔注射(i.p.))和野生型大鼠(wt NI-203.26C11-r，n＝4；3mg/kg腹腔注射(i.p.))。

为了测试葡萄糖耐量，治疗前在3月龄的hIAPP转基因大鼠和野生型大鼠体内进行了口服葡萄糖耐量测试(oGTT)，显示出相当的血糖水平。结果，与PBS-治疗的hIAPP转基因大鼠(tg PBS，n＝10)和PBS-治疗的野生型大鼠(wt PBS，n＝5)相比，在治疗8周后进行的oGTT期间该NI-203.26C11-r抗体使hIAPP转基因大鼠体内的血糖水平正常化。此外显示出了，NI-203.26C11-r抗体并不影响野生型大鼠(wt NI-203.26C11-r)体内的血糖水平。