MND启动子嵌合抗原受体的制作方法

本申请基于35 U.S.C.§119(e)要求于2014年4月25日提交的美国临时申请第61/984,561号的权益，将其通过引用整体并入本文。

关于序列表的声明

与本申请相关的序列表以文本格式提供，代替纸拷贝，并且在此通过引用并入说明书。含有序列表的文本文件的名称是BLBD_027_01WO_ST25.txt。文本文件是27KB，创建于2015年4月24日，并且经EFS-Web以电子方式与说明书文件同时提交。

背景

技术领域

本发明涉及用于治疗癌症或肿瘤的改善的组合物和方法。更具体地，本发明涉及包含嵌合抗原受体(CAR)的改善的载体，用所述载体进行遗传修饰以表达这些CAR的免疫效应细胞，以及利用这些组合物有效治疗多种癌症或肿瘤。

相关领域的描述

癌症是遍及全世界的重要健康问题。基于来自2008-2010的比例，今天出生的男性和女性中的40.76％将在其一生中的某一时间被诊断患有某种形式的癌症。20.37％的男性将在其50岁生日至70岁生日患上癌症，对于女性，相比而言比例为15.30％。在2010年1月1日，在美国有大约13,027,914名活着的男性和女性有癌症史--6,078,974名男性和6,948,940名女性。据估计，在2013年，在美国有1,660,290名男性和女性(854,790名男性和805,500女性)将被诊断患有癌症，并且有580,350名男性和女性将死于所有部位的癌症。Howlader等，2013。

尽管在癌症的检测、预防和治疗中已经取得了进步，但是普遍成功的治疗策略尚未实现。对不同形式的癌症治疗的应答是混合的。由于毒副作用，治疗癌症的常规方法(包括化疗和放疗)具有有限的实用性。用治疗性抗体进行的免疫疗法也提供了有限的成功，部分原因是不良的药代动力学特性、抗体被血清蛋白酶快速清除和肾小球的滤过、以及有限渗入肿瘤部位和肿瘤细胞上靶抗原的表达水平。由于CAR T细胞在体内的不良扩增、输注之后细胞的快速消失、以及令人失望的临床活性，试图使用表达嵌合抗原受体(CAR)的遗传修饰的细胞，也具有有限的成功。

因此，本领域对用于治疗癌症的在临床上更有效的组合物和方法仍有需求。

简要概述

本发明大体提供用于产生治疗性T细胞的改善的载体组合物。

在不同的实施方案中，提供包含与嵌合抗原受体(CAR)可操作地连接的启动子的多核苷酸，所述启动子是骨髓增生性肉瘤病毒增强子负调控区缺失的dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子。

在具体实施方案中，CAR包含胞外结构域、跨膜结构域、一个或多个胞内共刺激信号转导结构域以及CD3ζ初级信号转导结构域，所述胞外结构域与选自下述的抗原结合：α叶酸受体、5T4、αvβ6整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM以及VEGFR2；所述跨膜结构域来源于选自下述的多肽：CD8α，CD4、CD28、CD45、PD1和CD152；所述一个或多个胞内共刺激信号转导结构域选自：CD28、CD54(ICAM)、CD134(OX40)、CD137(41BB)、CD152(CTLA4)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)和CD278(ICOS)。

在一些实施方案中，胞外结构域包含与抗原结合的抗体或者抗原结合片段。

在具体实施方案中，与κ轻链多肽结合的抗体或抗原结合片段选自：骆驼Ig、Ig NAR、Fab片段、Fab’片段、F(ab)’2片段、F(ab)’3片段、Fv、单链Fv抗体(“scFv”)、双-scFv、(scFv)2、微型抗体、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)、二硫键稳定性Fv蛋白(“dsFv”)以及单域抗体(sdAb、纳米抗体)。

在另外实施方案中，与κ轻链多肽结合的抗体或抗原结合片段为scFv。

在某些实施方案中，抗体为人抗体、鼠抗体或人源化抗体。

在具体实施方案中，跨膜结构域来源于CD8α。

在具体实施方案中，一个或多个共刺激信号转导结构域选自：CD28、CD134和CD137。

在一些实施方案中，CAR包含选自CD28、CD134和CD137的两个或者更多个共刺激信号转导结构域。

在一些实施方案中，一个或者多个共刺激信号转导结构域为CD28。

在具体实施方案中，一个或多个共刺激信号转导结构域为CD134。

在某些实施方案中，一个或多个共刺激信号转导结构域为CD137。

在具体实施方案中，CAR还包含铰链区多肽。

在其它实施方案中，铰链区多肽包含PD1、CD152或CD8α的铰链区。

在其它实施方案中，铰链区多肽包含PD1的铰链区。

在其它实施方案中，铰链区多肽包含CD152的铰链区。

在其它实施方案中，铰链区多肽包含CD8α的铰链区。

在一些实施方案中，CAR还包含间隔区。

在另外实施方案中，间隔区多肽包含IgG1的CH2和CH3区域。

在某些实施方案中，CAR还包含信号肽。

在具体实施方案中，信号肽包含IgG1重链信号多肽、CD8α信号多肽或者人GM-CSF受体α信号肽。

在一些实施方案中，多核苷酸编码如SEQ ID NO：2至3中任一项所述的CAR。

在不同的实施方案中，提供载体，所述载体包含编码如在任一前述实施方案中或者任一本文别处考虑的实施方案所考虑的CAR的多核苷酸。

在其它实施方案中，载体为表达载体。

在另外实施方案中，载体为病毒载体。

在具体实施方案中，载体为逆转录病毒载体。

在具体实施方案中，载体为慢病毒载体。

在另外实施方案中，慢病毒载体选自基本上由下述病毒组成的组：人类免疫缺陷病毒(HIV)；维斯纳-梅迪病毒(VMV)(visna-maedi virus(VMV)virus)；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猴免疫缺陷病毒(SIV)。

在某些实施方案中，CAR还包含左端(5’)逆转录病毒LTR、Psi(Ψ)包装信号、中央多嘌呤段(central polypurine tract)/DNA瓣(DNA Flap)(cPPT/FLAP)、逆转录病毒输出元件；与权利要求1至19中任一项所述的CAR可操作地连接的MND启动子；以及右端(3’)逆转录病毒LTR。

在另外实施方案中，CAR还包含异源聚腺苷酸化序列。

在另外实施方案中，聚腺苷酸化序列为牛生长激素聚腺苷酸化序列或者兔β-球蛋白聚腺苷酸化信号序列。

在具体实施方案中，CAR还包含乙型肝炎病毒转录后调控元件(HPRE)或者土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。

在一些实施方案中，5’LTR的启动子被异源启动子替换。

在某些实施方案中，异源启动子为巨细胞病毒(CMV)启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子或者猿猴病毒40(SV40)启动子。

在其它实施方案中，5’LTR或3’LTR为慢病毒LTR。

在另外实施方案中，3’LTR包含一种或多种修饰。

在具体实施方案中，3’LTR包含一个或多个缺失。

在某些实施方案中，3’LTR为自灭活的(SIN)LTR。

在具体实施方案中，编码CAR的多核苷酸包含优化的Kozak序列。

在不同的实施方案中，提供免疫效应细胞，所述免疫效应细胞包含如在任一前述实施方案或任一本文别处所述的实施方案中所述的载体。

在一些实施方案中，免疫效应细胞为T淋巴细胞。

在不同的实施方案中，提供组合物，所述组合物包含如在任一前述实施方案或者任一本文别处所考虑的实施方案中所考虑的免疫效应细胞以及生理学可接受的赋形剂。

在不同的实施方案中，提供产生免疫效应细胞的方法，所述方法包括将本文所考虑的载体引入免疫效应细胞，通过使所述细胞与结合CD3的抗体和结合CD28的抗体接触来刺激所述细胞并诱导所述细胞增殖；从而产生免疫效应细胞。

在其它实施方案中，在引入载体之前，刺激并诱导免疫效应细胞增殖。

在具体实施方案中，免疫效应细胞包括T淋巴细胞。

在不同的实施方案中，提供制备包含本文所考虑的多核苷酸的免疫效应细胞的方法，所述方法包括从来自对象的骨髓、脐带血或动员外周血分离CD34+细胞，以及将本文所考虑的载体引入所分离的CD34+细胞。

在另外实施方案中，在引入权利要求20至36中任一项所述的载体之前，用选自FLT3配体、TPO、SCF、IL-3和IL-6的一种或多种细胞因子预刺激CD34+细胞。

在不同的实施方案中，提供治疗有此需要的对象中的癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的本文所考虑的组合物。

在某些实施方案中，癌症选自：维尔姆斯瘤(Wilms'tumor)、尤文肉瘤(Ewing sarcoma)、神经内分泌肿瘤、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤、黑素瘤、皮肤癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、肺癌、胆管癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、头颈癌、甲状腺髓样癌、卵巢癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤以及膀胱癌。

在具体实施方案中，癌症为胰腺癌，并且胞外结合结构域与PSCA或MUC1的表位结合。

在其它实施方案中，癌症为膀胱癌，并且胞外结合结构域与PSCA或MUC1的表位结合。

在具体实施方案中，癌症为多形性胶质母细胞瘤，并且胞外结合结构域与EPHA2、EGFRvIII或CSPG4的表位结合。

在具体实施方案中，癌症为肺癌，并且胞外结合结构域与PSCA或GD2的表位结合。

在某些实施方案中，癌症为乳腺癌，并且胞外结合结构域与CSPG4或HER2的表位结合。

在一些实施方案中，癌症为黑素瘤，并且胞外结合结构域与CSPG4或GD2的表位结合。

在不同的实施方案中，提供治疗有此需要的对象中的血液恶性肿瘤的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的本文所考虑的组合物。

在其它实施方案中，血液恶性肿瘤为选自多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)或非霍奇金淋巴瘤(NHL)的B细胞恶性肿瘤。

在具体实施方案中，MM选自：明显多发性骨髓瘤(overt multiple myeloma)、冒烟型多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、非分泌型骨髓瘤、IgD骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、孤立性骨浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤。

在某些实施方案中，NHL选自：伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤以及套细胞淋巴瘤。

附图的几个视图的简要描述

图1显示了pMND-CD19 CAR构建体(A)和pMND-κLC CAR构建体(B)的结构。

图2显示了pMND-CD19 CAR的载体图谱。

图3显示了pMND-κLC CAR的载体图谱。

图4显示了整合的pMND-κLC CAR慢病毒颗粒的载体拷贝数(VCN)。在转导之后9天，通过q-PCR测定VCN。每个圆表示与对应的未修饰的(正方形)T细胞培养物平行进行的单个培养克隆。显示的数据来自由6个供体组成的12个单个培养物。通过线和误差棒来表示平均值和标准偏差。

图5显示了转导有pMND-κLC CAR的T细胞中κLC的表达。在转导之后6至9天，通过流式细胞术测定T细胞上的CAR的表达。每个圆表示与对应的未修饰的(正方形)T细胞培养物平行进行的单个培养克隆。显示的数据来自由6个供体组成的12个单个培养物。通过线和误差棒来表示平均值和标准偏差。

图6显示了在转导有pMND-CD19 CAR或pEF1α-CD19 CAR慢病毒载体的T细胞中可比较的CD19 CAR转导和表达。这些载体被用于转导匹配的原代人T细胞的平行培养物。在转导之后6天，通过流式细胞术测定CAR在T细胞上的表达。在转导之后9天，通过q-PCR测定整合的慢病毒颗粒的载体拷贝数。

图7显示了pMND-κLC CAR修饰的T细胞的肿瘤特异性反应性。将修饰的T细胞与κ+Daudi细胞或κ-HDLM-2细胞共培养24小时。通过ELISA分析肿瘤特异性IFN-γ的释放。显示的数据来自4个供体的5种单一T细胞培养物。

图8显示了在pMND-κLC CAR修饰的T细胞的过继性转移之后，建立的Daudi肿瘤的消退。将修饰的T细胞用于治疗具有建立的Daudi肿瘤的小鼠。通过体内成像，来监测与未治疗的对照动物相比，治疗之后的肿瘤负荷。数据代表两次独立的实验。

图9显示了利用表达CAR的T细胞进行的抗原特异性肿瘤清除。(A).表达抗BCMA的CAR T细胞杀死了用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的表达BCMA的肿瘤细胞；通过FACS测量荧光。(B).将表达抗BCMA的CAR T细胞与K562细胞和被遗传修饰以表达BCMA的K562细胞共培养，在24小时之后收集上清液，并经ELISA分析IFN-γ的释放。(n＝3)。

序列标识符的简述

SEQ ID NO:1描述了骨髓增生性肉瘤病毒增强子负调控区缺失的dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:2描述了MND启动子抗CD19 CAR构建体的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:3描述了MND启动子抗κ链CAR构建体的多核苷酸序列。

详述

A.概述

本发明大体涉及用于治疗癌症的改善的组合物和方法，所述癌症包括但不限于肝脏、胰腺、肺、乳腺、膀胱、脑、骨、甲状腺、肾、皮肤以及造血系统的肿瘤或癌症。具体而言，本发明涉及用载体进行遗传修饰的免疫效应细胞的过继性细胞疗法，所述载体包含与编码嵌合抗原受体的多核苷酸可操作地连接的启动子，所述启动子是骨髓增生性肉瘤病毒增强子负调控区缺失的dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子。

遗传学方法提供了增强对癌细胞进行免疫识别和清除的可能手段。一种有希望的策略是从遗传学角度设计免疫效应细胞，以表达使细胞毒性重定向至肿瘤细胞的嵌合抗原受体。然而，既有的治疗肿瘤或癌症的过继性细胞免疫疗法在治疗性细胞中缺乏持续的CAR充分表达水平。因此，此类疗法在临床上不令人满意，因而本领域仍需要对抑制体液免疫的B细胞恶性肿瘤更有效的疗法。

本文公开的改善的组合物和过继性细胞疗法的方法提供这样的遗传修饰的免疫效应细胞：其可以容易地扩增，在体内显示出长期持续性，并提供CAR多肽的持续且充分表达。不希望受任何具体理论的束缚，本发明部分考虑这样的惊人发现：MND启动子引导CAR多肽在静止的、活化的以及扩增的T细胞中的持续表达，并且此种表达足以有效地使本文考虑的基因工程化的免疫效应细胞重定向，以引发针对肿瘤或癌细胞的细胞毒活性。

在一个实施方案中，多核苷酸包含与编码CAR的多核苷酸可操作地连接的MND启动子，所述CAR包含与靶抗原结合的胞外结构域、跨膜结构域以及一个或多个胞内信号转导结构域。

在一个实施方案中，用包含与本文考虑的CAR可操作地连接的MND启动子的载体对T细胞进行遗传修饰。表达CAR的T细胞在本文被称为CAR T细胞或CAR修饰的T细胞。

在不同的实施方案中，向患有癌症或肿瘤的患者施用本文考虑的遗传修饰的CAR T细胞。

除非相反地明确规定，本发明的实践将采用本领域技术内的的常规方法：化学方法、生物化学方法、有机化学方法、分子生物学方法、微生物学方法、重组DNA技术方法、遗传学方法、免疫学方法和细胞生物学方法，出于示例的目的，下文描述其中的一些。此类技术在文献中有充分地解释。参见，例如，Sambrook,等人，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第3版,2001)；Sambrook,等人，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第2版,1989)；Maniatis等人，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(1982)；Ausubel等人，《最新分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)(John Wiley and Sons,于2008年7月更新)；Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience；Glover,DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I&II(IRL Press,Oxford,1985)；Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992)；《转录和翻译》(Transcription and Translation)(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1984)；Perbal,《分子生物学实用指南》(A Practical Guide to Molecular Cloning)(1984)；Harlow and Lane,《抗体》(Antibodies),(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)；《最新免疫性实验指南》(Current Protocols in Immunology)Q.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach and W.Strober,eds.,1991)；Annual Review of Immunology；以及期刊专著如免疫性进展(Advances in Immunology)。

将本文引用的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用整体并入。

B.定义

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试中，但是在本文描述组合物、方法和材料的优选实施方案。出于本发明的目的，在下文定义了以下术语。

冠词“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”在本文用来指“一个/一种(one)”或者“一个/一种(one)”至“多个/多种(more than one)”(即，至“至少一个/至少一种(at least one)”)所述冠词的语法上目标。举例来说，“元素”意指一种元素或多种元素。

本文使用的术语“约”或“大约”指针对参照的量、水平、值、数、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度改变多达30％、25％、20％、25％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的量、水平、值、数、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度。在具体实施方案中，当在数值之前时，术语“约”或“大约”表示加或减15％、10％、5％或1％范围的值。

在整个说明书中，除非另有要求，单词“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为隐含包括指定的步骤或元素或者步骤或元素的组，但不排除任何其它步骤或元素或者步骤或元素的组。“由...组成”意指包括且限于短语“由...组成”之后的任何内容。因此，短语“由...组成”表示列出的元素是必需或强制的，以及不可以存在其它元素。“基本上由...组成”意指包括短语之后列出的任何元素，且限于不干扰本公开详细说明的所列元素的活性或作用或者不促进本公开详细说明的所列元素的活性或作用的其它元素。因此，短语“基本上由...组成”表示所列元素是必需的或强制的，但是其它元素不是任选的，且可以存在或不可以存在，取决于它们是否影响所列元素的活性或作用。

在整个说明书中，提及“一个实施方案”、“实施方案”、“具体实施方案”、“相关实施方案”、“某一实施方案”、“另外实施方案”或“其它实施方案”或者它们的组合，意为关于实施方案所描述的具体特征、结构或特性包含于本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个发明书不同位置出现的前述短语不一定均指同一实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，可将具体特征、结构或特性以任何合适的方式组合。

C.嵌合抗原受体

在不同的实施方案中，本发明提供基因工程化的免疫效应细胞，其包含设计以表达使细胞毒性重定向至肿瘤细胞的嵌合抗原受体的载体。这些基因工程化的受体在本文被称为嵌合抗原受体(CARs)。CAR是这样的分子：将基于对靶抗原(例如肿瘤抗原)特异性的抗体与T细胞受体活化胞内结构域组合，以产生显示出特异性的抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白。本文使用的术语“嵌合的”描述了由不同蛋白的部分组成或者由来自不同来源的DNA组成。

本文考虑的载体包含MND启动子和编码CAR的多核苷酸。本文考虑的CAR包含与特异性的靶抗原结合的胞外结构域(也被称为结合结构域或者抗原特异性结合结构域)、跨膜结构域和胞内信号转导结构域。CAR的抗原结合结构域与其在靶细胞表面上的靶抗原的结合导致CAR的聚集，并向包含CAR的细胞递送活化刺激。CAR的主要特性是其使免疫效应细胞的特异性重定向的能力，从而引发增殖、细胞因子的产生、吞噬作用或者能够以不依赖主要组织相容性复合物(MHC)的方式介导表达靶抗原的细胞死亡的分子的产生，利用单克隆抗体、可溶性配体或细胞特异性共受体的细胞特异性靶向能力。

在具体实施方案中，CAR包含胞外结合结构域、一个或多个铰链结构域或间隔结构域、跨膜结构域、一个或多个胞内共刺激信号转导结构域以及来自CD3ζ或FcRγ的初级信号转导结构域，所述胞外结构域包括但不限于特异性地结合选自下述的靶抗原的抗体或其抗原结合片段、束缚配体或者共受体的胞外结构域：α叶酸受体、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM以及VEGFR2；所述跨膜结构域包括但不限于来自CD8α、CD4、CD45、PD1和CD152的跨膜结构域；所述一个或多个胞内共刺激信号转导结构域包括但不限于来自下述的胞内共刺激信号转导结构域：CD28、CD54(ICAM)、CD134(OX40)、CD137(41BB)、CD152(CTLA4)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)和CD278(ICOS)。

1.结合结构域

在具体实施方案中，本文考虑的CAR包含与在肿瘤细胞上表达的靶多肽(例如靶抗原)特异性结合的胞外结合结构域。本文使用的术语“结合结构域”、“胞外结构域”、“胞外结合结构域”、“抗原特异性结合结构域”和“胞外抗原特异性结合结构域”可互换使用，并且提供具有与目标靶抗原特异性结合的能力的CAR。结合结构域可以包括具有特异性识别并结合生物分子(例如细胞表面受体或肿瘤蛋白、脂质、多糖或者其它细胞表面靶分子或者它们的组分)的能力的任何蛋白、多肽、寡肽或肽。结合结构域包括用于目标生物分子的任何天然存在的、合成的、半合成的或者重组产生的结合伴侣。

本文使用的术语“特异性结合亲和力(specific binding affinity)”或者“特异性结合(specifically binds)”或者“特异性结合(specifically bound)”或者“特异性结合(specific binding)”或者“特异性靶向(specifically targets)”描述一种分子以比背景结合更大的结合亲和力结合另一分子。如果结合结构域(或包含结合结构域的CAR或者包含结合结构域的融合蛋白)与靶分子以例如高于或者等于约10⁵M^-1的亲和力或Ka(即具体结合反应的平衡缔合常数，单位为1/M)结合或联合，则其“特异性结合”靶分子。在某些实施方案中，结合结构域(或其融合蛋白)以高于或等于约10⁶M^-1、10⁷M^-1、10⁸M^-1、10⁹M^-1、10¹⁰M^-1、10¹¹M^-1、10¹²M^-1或者10¹³M^-1的Ka结合靶标。“高亲和力”结合结构域(或其单链融合蛋白)指具有至少10⁷M^-1，至少10⁸M^-1，至少10⁹M^-1，至少10¹⁰M^-1，至少10¹¹M^-1，至少10¹²M^-1，至少10¹³M^-1或者更高K_a的那些结合结构域。

可选地，可将亲和力定义为具体结合相互作用的平衡解离常数(K_d)，其中单位为M(例如，10^-5M至10^-13M，或者更低)。可以利用常规技术容易地测定本公开所述的结合结构域多肽与CAR蛋白的亲和力，例如通过竞争性ELISA(酶联免疫吸附分析)或者通过结合联合或者利用标记配体的置换分析，或者利用表面等离子体共振装置(如可获自Biacore,Inc.,Piscataway,NJ的Biacore T100)或光学生物传感器技术(如可分别获自Corning和Perkin Elmer的EPIC系统或EnSpire)(也参见，例如Scatchard等(1949)Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660；和美国专利申请第5,283,173号、第5,468,614号或等同物)。

在一个实施方案中，特异性结合的亲和力高于背景结合约2倍，高于背景结合约5倍，高于背景结合倍约10倍，高于背景结合约20倍，高于背景结合约50倍，高于背景结合约100倍，或者高于背景结合约1000倍或者更高。

在具体实施方案中，CAR的胞外结合结构域包含抗体或其抗原结合片段。“抗体”指为这样的结合物质，其为至少包含特异性识别并结合抗原表位的轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽，所述抗原如包含抗原决定簇(如免疫细胞所识别的那些抗原决定簇)的肽、脂质、多糖或核酸。

“抗原(Ag)”指能够在动物中刺激产生抗体或T细胞应答的化合物、组合物或物质，包括向动物注射或者被动物吸收的组合物(如包含肿瘤特异性蛋白的组合物)。抗原与特异性体液免疫或者细胞免疫的产物反应，包括由异源抗原(如所公开的抗原)所诱导的那些产物。“靶抗原”或者“靶标抗原或目标(target antigen or interest)”是与设计的本文考虑的CAR的结合结构域结合的抗原。在具体实施方案中，靶抗原是结合结构域特异性结合的肽、脂质、多糖或核酸的表位。在优选实施方案中，抗原是下述的表位：α叶酸受体、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或者VEGFR2多肽。

“表位”或“抗原决定簇”指与结合物质结合的抗原区域。表位可以由邻接的氨基酸形成或者通过蛋白的三级折叠由并列的非邻接氨基酸形成。由邻接的氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时通常保留，而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常丧失。在单一空间构象中，表位通常包括至少3个氨基酸，以及更通常包括至少5个、约9个或者约8-10个氨基酸。

抗体包括其抗原结合片段，如骆驼Ig、Ig NAR、Fab片段、Fab’片段、F(ab)’2片段、F(ab)’3片段、Fv、单链Fv蛋白(“scFv”)、双scFv、(scFv)₂、微型抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、二硫键稳定性Fv蛋白(“dsFv”)和单域抗体(sdAb，纳米抗体)以及负责抗原结合的全长抗体的一部分。该术语还包括基因工程化的形式，如嵌合抗体(例如，人源化的鼠抗体)、异源缀合抗体(如双特异性抗体)及其抗原结合片段。也参见Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)；Kuby,J.,Immunology,3rd Ed.,W.H.Freeman&Co.,New York,1997。

本领域技术人员将会理解以及如本文别处所述，完整的抗体包含两条重链和两条轻链。各重链由可变区以及第一恒定区、第二恒定区和第三恒定区组成，而各轻链由可变区和恒定区组成。哺乳动物的重链被分为α、δ、ε、γ和μ，以及哺乳动物的轻链被分为λ或κ。包含α、δ、ε、γ和μ重链的免疫球蛋白被分为免疫球蛋白(Ig)A、IgD、IgE、IgG和IgM。完整的抗体形成“Y”形。Y的茎部由结合在一起的两条重链的第二和第三恒定区(以及对于IgE和IgM，第四恒定区)组成，并在铰链处形成二硫键(链间)。重链γ、α和δ具有由三个串联(排成一列)Ig结构域组成的恒定区以及用于增加灵活性的铰链区；重链μ和ε具有由四个免疫球蛋白结构域组成的恒定区。第二和第三恒定区分别被称为“CH2结构域”和“CH3结构域”。Y的各臂均包含与单一轻链的可变区和恒定区结合的单一重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。

轻链和重链可变区含有被三个高变区间隔的“框架”区，也被叫做“互补决定区”或“CDR”。CDR可以通过常规的方法来限定或鉴定，如通过根据Kabat等人(Wu,TT and Kabat,E.A.,J Exp Med.132(2):211-50,(1970)；Borden,P.and Kabat E.A.,PNAS,84:2440-2443(1987)；(参见,Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services,1991,将其通过引用在此并入)所述的序列，或者通过根据Chothia等人(Choithia,C.and Lesk,A.M.,J Mol.Biol.,196(4):901-917(1987),Choithia,C.等,Nature,342:877-883(1989))所述的结构。

不同的轻链或重链的框架区的序列在物种(如人)内相对保守。抗体的框架区，其为组成的轻链或重链的组合框架区，用于在三维空间中定位和对齐CDR。CDR主要负责与抗原的表位结合。各链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-末端开始顺序编号，并且通常还通过特定CDR所位于的链进行鉴定。因此，位于抗体重链的可变结构域上的CDR被称作CDRH1、CDRH2和CDRH3，而位于抗体轻链的可变结构域的CDR被称作CDRL1、CDRL2和CDRL3。具有不同特异性的抗体(即，对于不同的抗原具有不同的组合位点)具有不同的CDR。尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接涉及抗原的结合。CDR内的这些位置叫做特异性决定残基(SDR)。

提及“V_H”或“VH”指免疫球蛋白重链的可变区，包括抗体、Fv、scFv、dsFv、Fab或如本文所公开的其它抗体片段的可变区。提及“V_L”或“VL”指免疫球蛋白轻链的可变区，其包括抗体、Fv、scFv、dsFv、Fab或如本文所公开的其它抗体片段的可变区。

“单克隆抗体”是由B淋巴细胞的单一克隆所产生的抗体或者由转染有单一抗体的轻链或重链基因的细胞所产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法产生，例如通过从骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合体制备杂交的形成抗体的细胞。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。

“嵌合抗体”具有来自一种物种(如人)的框架残基和来自另外物种(如小鼠)的CDR(其通常赋予结合抗原)。在具体的优选实施方案中，本文所考虑的CAR包含抗原特异性结合结构域，所述抗原特异性结合结构域为嵌合抗体或其抗原结合片段。

在某些优选实施方案中，抗体是与在肿瘤细胞上的表面蛋白特异性结合的人源化抗体(如人源化单克隆抗体)。“人源化”抗体是包括人框架区和来自非人(例如小鼠、大鼠或合成物)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白被称为“供体”，以及提供框架的人免疫球蛋白被称为“接受体”。在一个实施方案中，在人源化的免疫球蛋白中，所有的CDR均来自供体的免疫球蛋白。不需要存在恒定区，但是如果存在，其必须与人免疫球蛋白的恒定区基本上相同，即至少约85-90％相同，如约95％或者更多的相同。因此，可能除了CDR，人源化免疫球蛋白的所有部分均与天然的人免疫球蛋白序列的相应部分基本上相同。人源化的抗体或者其它单克隆抗体可以具有对于抗原结合或者其它的免疫球蛋白功能基本上无影响的其它保守氨基酸置换。可以通过基因工程的手段构建人源化抗体(参见例如，美国专利第5,585,089号)。

在具体实施方案中，CAR的胞外结合结构域包括抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合片段包括但不限于骆驼Ig(骆驼科抗体(VHH))、Ig NAR、Fab片段、Fab’片段、F(ab)’2片段、F(ab)’3片段、Fv、单链Fv抗体(“scFv”)、双scFv、(scFv)2、微型抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、二硫键稳定性Fv蛋白(“dsFv”)以及单域抗体(sdAb，纳米抗体)。

本文使用的“骆驼Ig”或“骆驼科VHH”指重链抗体已知的最小抗原结合单元(Koch-Nolte等，FASEB J.,21:3490-3498(2007))。“重链抗体”或“骆驼科抗体”指含有两个VH结构域且不含轻链的抗体(Riechmann L等，J.Immunol.Methods 231:25–38(1999)；WO94/04678；WO94/25591；美国专利第6,005,079号)。

“免疫球蛋白新抗原受体”的“IgNAR”指由一个可变的新抗原受体(VNAR)结构域和5个恒定的新抗原受体(CNAR)结构域的同源二聚体组成的来自鲨鱼免疫库的抗体类型。IgNAR代表一些基于已知的免疫球蛋白的最小蛋白支架，并且高度稳定，且具有高效结合的特性。固有的稳定性可以归因于(i)在下面的Ig支架，与存在于鼠抗体中的常规抗体的VH和VL结构域相比，其存在大量带电荷的且亲水表面暴露的残基；和(ii)互补决定区(CDR)环中的稳定结构特征，包括环间二硫桥和环内氢键形式。

木瓜蛋白酶消化抗体产生被称为“Fab”片段的两个相同的抗原结合片段和剩余的“Fc”片段，各“Fab”片段均含有单价抗原结合位点，“Fc”片段的名字反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab’)2片段，所述片段含有两个抗原结合位点，并且仍能够交联抗原。

“Fv”是含有完整的抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由紧密非共价联合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接，以使轻链和重链能够以与双链Fv种类中的结构类似的“二聚”结构联合。在该构型中，各可变结构域的三个超变区(HVR)相互作用，以限定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。共同地，六个HVR给予对抗体的抗原结合特异性。然而，甚至单一可变结构域(或者仅包含对抗原具有特异性的三个HVR的Fv的一半)也具有识别并结合抗原的能力，尽管具有低于整个结合位点的亲和力。

Fab片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域，并且还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于，在重链CH1结构域的羧基末端添加了几个残基，所述残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH在本文是Fab’的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离的硫醇基。F(ab’)2抗体片段最初产生为Fab’片段对，所述Fab’片段对在其间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联体也是已知的。

术语“双链抗体(diabody)”指具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述片段在同一多肽链中(VH-VL)包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不能在同一链上的两个结构域之间配对的接头，强迫所述结构域与另一链上的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点。双链抗体可以是二价或双特异性的。双链抗体更充分描述于例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)；以及Hollinger等,PNAS USA 90:6444-6448(1993)。三链抗体和四链抗体也描述于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)。

“单结构域抗体”或“sdAb”或“纳米抗体”指由抗体重链的可变区(VH结构域)或抗体轻链的可变区(VL结构域)组成的抗体片段(Holt,L.,等,Trends in Biotechnology,21(11):484-490)。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链上且处于任一方向(例如，VL-VH或VH-VL)。通常，scFv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，所述接头使scFv形成用于抗原结合的期望结构。对于scFv的综述，参见，例如，Pluckthün,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,(Springer-Verlag,New York,1994),pp.269-315。

在优选实施方案中，本文考虑的CAR包含抗原特异性结合结构域，所述抗原特异性结合结构域为scFv并且可以是鼠scFv、人scFv或者人源化的scFv。可由对期望靶点具有特异性的杂交瘤的V区基因克隆单链抗体。此类杂交瘤的产生已经是常规的。可用于克隆可变区重链(V_H)和可变区轻链(V_L)的技术描述于，例如Orlandi等，PNAS,1989；86:3833-3837中。在具体实施方案中，抗原特异性结合结构域为scFv，其与κ或λ轻链多肽结合。在某一实施方案中，scFv与下述结合：α叶酸受体、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或者VEGFR2多肽。

示例性的人源化抗原特异性结合结构域是包含至少一个人框架区域的对肿瘤抗原具有特异性的免疫球蛋白可变区。“人框架区”指人免疫球蛋白可变区的野生型(即天然存在的)框架区、区域中少于约50％(例如，优选少于约45％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％)的氨基酸缺失或被置换的人免疫球蛋白可变区的改变的框架区(例如，用非人免疫球蛋白框架区域相应位点处的一个或多个氨基酸残基)，或者区中少于约50％(例如，少于45％、40％、30％、25％、20％、15％、10％或5％)的氨基酸缺失或被置换(例如，在暴露的残基的位点处和/或用人免疫球蛋白框架区相应位点处的一个或多个氨基酸残基)的非人免疫球蛋白可变区的改变的框架区，以在一方面降低免疫原性。

在某些实施方案中，人框架区为人免疫球蛋白可变区的野生型框架区。在某些其它实施方案中，人框架区是在1个、2个、3个、4个或5个位点处具有氨基酸缺失或被置换的人免疫球蛋白可变区的改变的框架区。在其它实施方案中，人框架区是在1个、2个、3个、4个或5个位点处具有氨基酸缺失或被置换的非人免疫球蛋白可变区的改变的框架区。

在具体实施方案中，抗原特异性结合结构域包含选自下述的至少1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种或8种人框架区(FR)：人轻链FR1、人重链FR1、人轻链FR2、人重链FR2、人轻链FR3、人重链FR3、人轻链FR4和人重链FR4。

可以存在于抗原特异性结合结构域中的人FR还包括本文所提供的示例性FR的变体，其中所述示例性FR的一个或多个氨基酸被置换或缺失。

在某些实施方案中，人源化的抗原特异性结合结构域包含(a)含有人轻链FR1、人轻链FR2、人轻链FR3和人轻链FR4的人源化轻链可变区，以及(b)含有人重链FR1、人重链FR2、人重链FR3和人重链FR4的人源化重链可变区。

本文提供的抗原特异性结合结构域还包含1个、2个、3个、4个、5个或6个CDR。此类CDR可以是选自轻链的CDRL1、CDRL2和CDRL3以及重链的CDRH1、CDRH2和CDRH3的非人CDR或改变的非人CDR。在某些实施方案中，抗原特异性结合结构域包含(a)含有轻链CDRL1、轻链CDRL2和轻链CDRL3的轻链可变区，以及(b)含有重链CDRH1、重链CDRH2和重链CDRH3的重链可变区。

2.接头

在某些实施方案中，本文所考虑的CAR可以在各个结构域之间，例如，在V_H和V_L结构域之间包含接头残基，添加所述接头残基为了所述分子的适当空间和构象。本文所考虑的CAR可以包含1、2、3、4或5个或者更多个接头。在具体实施方案中，接头的长度是约1至约25个氨基酸、约5至约20个氨基酸、或约10至约20个氨基酸、或者任意介入中间长度的氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个氨基酸。

接头的示例性实例包括甘氨酸聚合物(G)_n；甘氨酸-丝氨酸聚合物(G_1-5S_1-5)_n，其中n是至少为1、2、3、4或5的整数；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；以及本领域已知的其它柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物相对非结构化，并且因此可以作为融合蛋白(如本文所描述的CAR)的结构域之间的中性系链(neutral tether)。甘氨酸甚至比丙氨酸显著更大程度地接近phi-psi空间，并且受到的限制比具有更长侧链的残基更少(参见Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142(1992))。普通技术人员将理解，在具体实施方案中，CAR的设计可以包括全部或部分柔性的接头，使得接头可以包含柔性接头以及赋予较小柔性结构的一个或多个部分以提供期望的CAR结构。

其它示例性接头包括但不限于下述氨基酸序列：GGG；DGGGS(SEQ ID NO：4)；TGEKP(SEQ ID NO：5)(参见，例如，Liu等,PNAS 5525-5530(1997))；GGRR(SEQ ID NO：6)(Pomerantz等,1995,同以上)；(GGGGS)_n，其中n＝1、2、3、4或5(SEQ ID NO：7)(Kim等,PNAS 93,1156-1160(1996)；EGKSSGSGSESKVD(SEQ ID NO：8)(Chaudhary等,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1066-1070)；KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO：9)(Bird等,1988,Science 242:423-426)，GGRRGGGS(SEQ ID NO：10)；LRQRDGERP(SEQ ID NO：11)；LRQKDGGGSERP(SEQ ID NO：12)；LRQKd(GGGS)₂ERP(SEQ ID NO：13)。可选地，使用能够模拟DNA-结合位点和它们自身肽的计算机程序(Desjarlais&Berg,PNAS 90:2256-2260(1993),PNAS 91:11099-11103(1994))或者通过噬菌体展示方法可以设计柔性接头。

在具体实施方案中，CAR包含还含有可变区连接序列的scFV。“可变区连接序列”是这样的氨基酸序列：其将重链可变区与轻链可变区连接，并且提供与两个子结合结构域的相互作用兼容的间隔功能，使所得到的多肽与包含相同轻链或重链可变区的抗体一样维持对靶分子的特异性结合亲和性。在一个实施方案中，可变区连接序列的长度是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个氨基酸。在具体实施方案中，可变区连接序列包含甘氨酸-丝氨酸聚合物(G_1-5S_1-5)_n，其中n是至少为1、2、3、4或5的整数。在另外的实施方案中，可变区连接序列包含(G₄S)₃氨基酸接头。

3.间隔结构域

在具体实施方案中，CAR的结合结构域之后是一个或多个“间隔结构域”，所述“间隔结构域”指这样的区域：所述区域使抗原结合结构域远离效应细胞的表面，使能够进行适当的细胞/细胞接触、抗原结合和活化(Patel等,GeneTherapy,1999；6:412-419)。铰链结构域可以源自天然、合成、半合成或重组来源。在某些实施方案中，间隔结构域是免疫球蛋白的一部分，包括但不限于，一个或多个重链恒定区，例如，CH2和CH3。间隔结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。

在一个实施方案中，间隔结构域包括IgG1的CH2和CH3。

4.铰链结构域

通常，CAR的结合结构域之后是一个或多个“铰链结构域”，其在使抗原结合结构域定位远离效应细胞表面使能够进行适当的细胞/细胞接触、抗原结合和活化方面发挥作用。CAR通常在结合结构域和跨膜结构域(TM)之间包含一个或多个铰链结构域。铰链结构域可以源自天然、合成、半合成或重组来源。铰链结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。

“改变的铰链区”指(a)高至30％的氨基酸改变(例如，高至25％、20％、15％、10％或5％的氨基酸置换或缺失)的天然存在的铰链区，(b)高至30％的氨基酸改变(例如，高至25％、20％、15％、10％或5％的氨基酸置换或缺失)的长度为至少10个氨基酸(例如，至少12、13、14或15个氨基酸)的天然存在的铰链区的一部分，或者(c)包含核心铰链区的天然存在的铰链区的一部分(其长度可以是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸，或者至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)。在某些实施方案中，天然存在的免疫球蛋白铰链区中的一个或多个半胱氨酸残基可被一个或多个其它氨基酸残基置换(例如，一个或多个丝氨酸残基)。可选地或此外，改变的免疫球蛋白铰链区可以是野生型免疫球蛋白铰链区的脯氨酸残基被其它氨基酸残基(例如，丝氨酸残基)置换。

适合用于本文所述的CAR的其它示例性的铰链结构域包括来源于1型膜蛋白(如CD8α、CD4、CD28和CD7)的胞外区的铰链区，其可以是来自这些分子的野生型铰链区或者可以是改变的铰链区。在另一实施方案中，铰链结构域包括CD8α铰链区。

5.跨膜(TM)结构域

“跨膜结构域”是CAR的部分，其使胞外结合部分和胞内信号转导结构域融合，并且使CAR锚定至免疫效应细胞的质膜上。TM结构域可以源自天然、合成、半合成或重组来源。TM结构域可以源自(即，至少包括以下的跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD9、CD 16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、PD-1和CD154。在具体实施方案中，TM结构域是合成的，并且主要包含疏水残基，如亮氨酸和缬氨酸。

在一个实施方案中，本文所考虑的CAR包含源自CD8α的TM结构域。在另外的实施方案中，本文所考虑的CAR包含源自CD8α的TM结构域和优选长度优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的短的寡肽或多肽接头，所述接头连接CAR的TM结构域和胞内信号转导结构域。甘氨酸-丝氨酸接头提供特别合适的接头。

6.胞内信号转导结构域

在具体实施方案中，本文所考虑的CAR包含胞内信号转导结构域。“胞内信号转导结构域”指这样的CAR部分，其参与将CAR与靶抗原有效结合的信息转化入免疫效应细胞的内部以引发效应细胞的功能，例如，活化、细胞因子的产生、增殖和细胞毒性活性，所述效应细胞的功能包括将细胞毒性因子释放至结合CAR的靶细胞，或者随着抗原与胞外CAR结构域的结合引发的其它细胞应答。

术语“效应功能”指细胞的特化功能。T细胞的效应功能，例如，可以是细胞溶解活性或补救或者包括细胞因子的分泌在内的活性。因此，术语“胞内信号转导结构域”指转化效应功能信号并引导细胞进行特化功能的蛋白部分。虽然通常可以采用整个胞内信号转导结构域，但是在一些情况下，使用整个结构域不是必须的。就使用胞内信号转导结构域的截短部分而言，此类截短部分可以用于代替整个结构域，只要其能转化效应功能信号。术语胞内信号转导结构域意指包括足以转化效应功能信号的胞内信号转导结构域的任何截短部分。

已知，通过单独TCR产生的信号不足以完全活化T细胞，并且还需要次级信号或共刺激信号。因此，T细胞活化可以说成是由两种不同类型的胞内信号转导结构域介导：初级信号转导结构域和共刺激信号转导结构域，所述初级信号转导结构域通过TCR(例如，TCR/CD3复合物)起始抗原依赖性初级活化，所述共刺激信号转导结构域以抗原非依赖性方式起作用以提供次级信号或共刺激信号。在优选实施方案中，本文所考虑的CAR包含这样的胞内信号转导结构域：所述胞内信号转导结构域包含一个或多个“共刺激信号转导结构域”和“初级信号转导结构域”。

初级信号转导结构域以刺激的方式或抑制的方式调控TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级信号转导结构域可以包含被称为免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM的信号传导基序。

在本发明中具体使用的含有ITAM的初级信号转导结构域的示例性实例包括源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在具体的优选实施方案中，CAR包含CD3ζ初级信号转导结构域和一个或多个共刺激信号转导结构域。胞内的初级信号转导结构域和共刺激信号转导结构域可以以任意串联顺序连接至跨膜结构域的羧基末端。

本文考虑的CAR包含一个或多个共刺激信号转导结构域，以增强表达CAR受体的T细胞的功效和扩增。本文使用的术语“共刺激信号转导结构域”或“共刺激结构域”指共刺激分子的胞内信号转导结构域。共刺激分子是在与抗原结合时，为淋巴细胞的有效活化和功能提供所需的第二信号的除抗原受体或Fc受体之外的细胞表面分子。此类共刺激分子的示例性实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、CD30、CD40、PD-1、ICOS(CD278)、CTLA4、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT和NKD2C以及CD83。在一个实施方案中，CAR包含选自CD28、CD137和CD134的一个或多个共刺激信号转导结构域以及CD3ζ初级信号转导结构域。

在另一实施方案中，CAR包含CD28和CD137共刺激信号转导结构域以及CD3ζ初级信号转导结构域。

而在另一实施方案中，CAR包含CD28和CD134共刺激信号转导结构域以及CD3ζ初级信号转导结构域。

在一个实施方案中，CAR包含CD137和CD134共刺激信号转导结构域以及CD3ζ初级信号转导结构域。

在一个实施方案中，CAR包含CD137共刺激信号转导结构域以及CD3ζ初级信号转导结构域。

在一个实施方案中，CAR包含CD134共刺激信号转导结构域以及CD3ζ初级信号转导结构域。

在一个实施方案中，CAR包含CD28共刺激信号转导结构域以及CD3ζ初级信号转导结构域。

在具体实施方案中，本文考虑的CAR包含与肿瘤细胞上表达的下述物质特异性结合的抗体或其抗原结合片段：α叶酸受体、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或者VEGFR2多肽。

在一个实施方案中，CAR包含scFv、跨膜结构域和一个或多个胞内共刺激信号转导结构域以及CD3ζ初级信号转导结构域，所述scFv与下述结合：α叶酸受体、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或VEGFR2多肽；所述跨膜结构域来源于选自CD8α，CD4、CD45、PD1和CD152的多肽；所述一个或多个胞内共刺激信号转导结构域选自CD28、CD54、CD134、CD137、CD152、CD273、CD274和CD278。

在另一实施方案中，CAR包含scFv、铰链结构域、跨膜结构域和一个或多个胞内共刺激信号转导结构域以及CD3ζ初级信号转导结构域，所述scFv与下述结合：α叶酸受体、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或者VEGFR2多肽；所述铰链结构域选自：IgG1铰链/CH2/CH3和CD8α以及CD8α；所述跨膜结构域来源于选自CD8α；CD4、CD45、PD1和CD152的多肽；所述一个或多个胞内共刺激信号转导结构域选自CD28、CD134和CD137。

而在另一实施方案中，CAR包含还含有接头的scFv、铰链结构域、跨膜结构域、一个或多个胞内共刺激信号转导结构域以及CD3ζ初级信号转导结构域，所述scFv与下述结合：α叶酸受体、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或者VEGFR2多肽；所述铰链结构域选自：IgG1铰链/CH2/CH3和CD8α以及CD8α；所述跨膜结构域包含来源于选自CD8α，CD4、CD45、PD1和CD152的多肽的TM结构域以及短的寡肽或多肽接头，所述接头优选地长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，其连接TM结构域和CAR的胞内信号转导结构域；所述一个或多个胞内共刺激信号转导结构域选自CD28、CD134和CD137。

在具体实施方案中，CAR包含scFv、含有PD1或CD152铰链多肽的铰链结构域、含有约3个氨基酸的多肽接头的PD1或CD152跨膜结构域、CD137胞内共刺激信号转导结构域以及CD3ζ初级信号转导结构域，所述scFv与下述结合：α叶酸受体、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包含ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或者VEGFR2多肽。

在具体实施方案中，CAR包含scFv、含有PD1或CD152铰链多肽的铰链结构域、含有约3个氨基酸的多肽接头的PD1或CD152跨膜结构域、CD134胞内共刺激信号转导结构域以及CD3ζ初级信号转导结构域，所述scFv与下述结合：α叶酸受体、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包含ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或者VEGFR2多肽。

在具体实施方案中，CAR包含scFv、含有PD1或CD152铰链多肽的铰链结构域、含有约3个氨基酸的多肽接头的PD1或CD152跨膜结构域、CD28胞内共刺激信号转导结构域以及CD3ζ初级信号转导结构域，所述scFv与下述结合：α叶酸受体、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或者VEGFR2多肽。

在具体实施方案中，CAR包含scFv、含有IgG1铰链/CH2/CH3多肽和CD8α多肽的铰链结构域、含有约3个氨基酸的多肽接头的CD8α跨膜结构域、CD137胞内共刺激信号转导结构域以及CD3ζ初级信号转导结构域，所述scFv与下述结合：α叶酸受体、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或者VEGFR2多肽。

在具体实施方案中，CAR包含scFv、含有CD8α多肽的铰链结构域、含有约3个氨基酸的多肽接头的CD8α跨膜结构域、CD134胞内共刺激信号转导结构域以及CD3ζ初级信号转导结构域，所述scFv与下述结合：α叶酸受体、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或者VEGFR2多肽。

在具体实施方案中，CAR包含scFv、含有CD8α多肽的铰链结构域、含有约3个氨基酸的多肽接头的CD8α跨膜结构域、CD28胞内共刺激信号转导结构域以及CD3ζ初级信号转导结构域，所述scFv与下述结合：α叶酸受体、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或者VEGFR2多肽。

此外，与非修饰的T细胞或者用其它载体修饰的T细胞相比，本文考虑的载体的设计能够改善T细胞的扩增、长期持续性和细胞毒特性以及整个细胞生命中CAR的持续表达。

D.多肽

本发明部分考虑CAR多肽及其片段，包含所述多肽或其片段的细胞和组合物以及表达多肽的载体。在优选实施方案中，提供包含一个或多个CAR的多肽，所述CAR由如SEQ ID NO：2和3中所述的多核苷酸序列编码。

除非作出相反规定，“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白”可互换使用，并且根据常规含义，即作为氨基酸序列。多肽不限于具体的长度，例如它们可以包括全长的蛋白序列或者全长蛋白的片段，并且可以包含多肽的翻译后修饰物(例如糖基化物、乙酰化物、磷酸化物等)以及天然存在的和非天然存在的本领域已知的其它修饰物。在不同的实施方案中，本文考虑的CAR多肽在蛋白的N端包含信号(或者前导)序列，其共翻译或者翻译后引导蛋白转移。可用于本文公开的CAR的合适的信号序列(信号肽)的示例性实例包括但不限于IgG1重链信号多肽、CD8α信号多肽或者人GM-CSF受体α信号肽。可以利用任何众所周知的重组和/或合成技术来制备多肽。具体地，本文考虑的多肽包含本公开的CAR或者具有本文公开的CAR的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或置换的序列。

本文使用的“分离的肽”或“分离的多肽”等指从细胞环境以及从与细胞的其它组分的联合物体外分离和/或纯化肽或多肽分子，即其不与体内物质明显联合。类似地，“分离的细胞”指获自体内组织或器官且基本不含细胞外基质的细胞。

多肽包括“多肽变体”。多肽变体与天然存在的多肽的不同可在于一个或多个置换、缺失、添加和/或插入。此类变体可以是天然存在的，或者可以是合成产生的，例如通过对以上多肽序列中的一种或多种进行修饰产生的。例如，在具体实施方案中，通过向CAR多肽的结合结构域、铰链、TM结构域、共刺激信号转导结构域或者初级信号转导结构域引入一个或多个置换、缺失、添加和/或插入而提高CAR的结合亲和力和/或其它生物学特性是可取的。优选地，本发明的多肽包括与其具有至少约65％、70％、75％、85％、90％、95％、98％或者99％的氨基酸同一性的多肽。

多肽包括“多肽片段”。多肽片段指可以是单体或多聚体的多肽，其包括氨基端缺失、羧基端缺失和/或内部缺失或置换的天然存在的或重组产生的多肽。在某些实施方案中，多肽片段可以包含至少5个至约500个氨基酸长度的氨基酸链。将会理解，在某些实施方案中，片段长度为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400或者450个氨基酸。特别有用的多肽片段包含功能结构域，所述功能结构域包括抗体的抗原结合结构域或者片段。在抗κ或者抗λ轻链抗体的情况下，有用的片段包括但不限于：CDR区、重链或轻链的CDR3区；重链或轻链的可变区；包含两个CDR的抗体链或可变区的一部分等。

也可将多肽框内融合或者缀合至接头或者其它序列，便于合成、纯化或鉴定多肽(例如聚His)，或者增强多肽与固体支持物的结合。

如上所述，可以以各种方式改变本发明的多肽，包括氨基酸置换、缺失、截断和插入。用于此类操作的方法在本领域通常是已知的。例如，可以通过DNA中的突变来制备参照多肽的氨基酸序列变体。用于进行诱变和核苷酸序列改变的方法在本领域众所周知。参见，例如Kunkel(1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82:488-492)，Kunkel等(1987,Methods in Enzymol,154:367-382)，美国专利第4,873,192号，Watson,J.D.等(Molecular Biology of the Gene,Fourth Edition,Benjamin/Cummings,Menlo Park,Calif.,1987)以及在其中引用的参考文献。关于不影响目标蛋白的生物学活性的合适的氨基酸置换的指导可见于Dayhoff等(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的模型。

在某些实施方案中，变体将包含保守性置换。“保守性置换”是这样的置换：其中氨基酸被具有类似特性的另一氨基酸置换，以使肽化学领域的技术人员预期多肽的二级结构和亲水性质基本上未改变。可对本发明的多核苷酸和多肽的结构做出修饰，并仍获得编码具有期望特性的变体或衍生多肽的功能性分子。当期望改变多肽的氨基酸序列以产生等同的甚至是改善的本发明的变体多肽时，本领域技术人员例如可以例如根据表1改变编码DNA序列的密码子中的一个或多个。

表1-氨基酸密码子

利用本领域众所周知的计算机程序(如DNASTAR^TM软件)，可以指导确定哪些氨基酸残基可被置换、插入或缺失而不消除生物学活性。优选地，本文公开的蛋白变体中的氨基酸变化是保守的氨基酸变化，即相似带电荷的氨基酸或不带电荷的氨基酸的置换。保守的氨基酸变化涉及在侧链上的相关的氨基酸家族之一的置换。天然存在的氨基酸通常分为四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电荷的氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被共同分类为芳香族氨基酸。在肽或蛋白中，合适的氨基酸的保守性置换对于本领域技术人员而言是已知的，并且通常可以进行置换而不改变产生的分子的生物学活性。本领域技术人员认识到，一般而言，在多肽的非必要区域的单一氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见，例如Watson等，Molecular Biology of the Gene,4th Edition,1987,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,p.224)。示例性的保守性置换描述于美国临时专利申请第61/241,647号中，将其公开内容通过引用并入本文。

在作出此类变化时，可以考虑氨基酸的亲水指数。本领域普遍理解氨基酸的亲水指数在赋予蛋白的相互作用生物学功能中的重要性(Kyte和Doolittle,1982，通过引用并入本文)。基于各氨基酸的疏水性和电荷特性指定其亲水指数(Kyte和Doolittle,1982)。这些数值为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(–0.4)；苏氨酸(–0.7)；丝氨酸(–0.8)；色氨酸(–0.9)；酪氨酸(–1.3)；脯氨酸(–1.6)；组氨酸(–3.2)；谷氨酸(–3.5)；谷氨酰胺(–3.5)；天冬氨酸(–3.5)；天冬酰胺(–3.5)；赖氨酸(–3.9)以及精氨酸(–4.5)。

本领域已知，某些氨基酸可以被具有类似亲水指数或得分的其它氨基酸置换，并仍获得具有类似生物学活性的蛋白，即仍获得生物学功能等同的蛋白。在作出此类变化时，优选置换亲水指数在±2内的氨基酸，特别优选置换±1内的氨基酸，以及甚至更特别优选置换±0.5内的氨基酸。本领域还理解，可以基于亲水性有效地作出相似氨基酸的置换。

如美国专利第4,554,101号所详细描述的，为氨基酸残基指定下述亲水性数值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(–0.4)；脯氨酸(–0.5±1)；丙氨酸(–0.5)；组氨酸(–0.5)；半胱氨酸(–1.0)；甲硫氨酸(–1.3)；缬氨酸(–1.5)；亮氨酸(–1.8)；异亮氨酸(–1.8)；酪氨酸(–2.3)；苯丙氨酸(–2.5)；色氨酸(–3.4)。据理解，氨基酸可被置换为具有类似亲水性数值的另一氨基酸，并仍获得生物学等同的蛋白，特别是免疫学等同的蛋白。在此类变化中，优选置换亲水性数值在±2内的氨基酸，特别优选置换在±1内的氨基酸，以及甚至更特别优选置换在±0.5内的氨基酸。

如以上所述，氨基酸的置换可以基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。

多肽变体还包括糖基化形式、具有其它分子的聚集缀合物，以及具有不相关化学部分(例如，聚乙二醇化分子)的共价缀合物。如本领域所知，通过将官能团与存在于氨基酸链的基团或位于N-末端或C-末端残基的基团连接，可以制备共价变体。变体还包括等位变体、物种变体和突变蛋白(mutein)。不影响蛋白功能活性的区域的截短或缺失也是变体。

在一个实施方案中，当想得到两种或更多种多肽的表达时，编码它们的多核苷酸序列可以被如本文别处所讨论的IRES序列隔开。在另外的实施方案中，两种或更多种多肽可以表达为包含一个或多个自我切割自我切割多肽序列的融合蛋白。

本发明的多肽包括融合多肽。在优选实施方案中，提供融合多肽和编码融合多肽的多核苷酸，例如CAR。融合多肽和融合蛋白指具有至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种或更多种多肽区段的多肽。融合多肽通常是C-末端连接至N-末端，但是它们也可以是C-末端连接至C-末端、N-末端连接至N-末端、或者N-末端连接至C-末端。融合蛋白的多肽可以是任意顺序或指定的顺序。融合多肽或融合蛋白还可以包括保守修饰的变体、多态变体、等位基因、突变体、子序列以及种间同系物，只要保留融合多肽的期望转录活性。可以通过化学合成方法或通过在两个部分之间化学键合产生融合多肽，或者通常可以使用其它标准技术来制备融合多肽。将包含融合多肽的结合DNA序列与如本文别处所讨论的合适的转录或翻译控制元件可操作地连接。

在一个实施方案中，融合伴侣包含以比天然重组蛋白更高产率的方式帮助表达蛋白的序列(表达增强子)。可以选择其它融合伴侣以便增加蛋白的溶解性或者使蛋白能够被靶向至期望的胞内区室或者促进融合蛋白通过细胞膜的转运。

融合多肽还可以在本文所描述的各多肽结构域之间包含多肽切割信号。此外，多肽位点可以进入任何接头肽序列。示例性的多肽切割信号包括多肽切割识别位点，如蛋白酶切割位点、核酸酶切割位点(例如，罕见限制性酶识别位点、自我切割我切割核酶识别位点)和自我切割病毒寡肽(参见deFelipe and Ryan,2004.Traffic,5(8)；616-26)。

合适的蛋白酶切割位点和自我切割肽是对技术人员来说是已知的(参见，例如，Ryan等,1997.J.Gener.Virol.78,699-722；Scymczak等(2004)Nature Biotech.5,589-594)。示例性蛋白酶切割位点包括但不限于以下的切割位点：马铃薯Y病毒NIa蛋白酶(例如、烟草蚀纹病毒蛋白酶)、马铃薯Y病毒HC蛋白酶、马铃薯Y病毒P1(P35)蛋白酶、byovirus NIa蛋白酶、byovirus RNA-2-编码蛋白酶、口蹄疫病毒L蛋白酶、肠病毒2A蛋白酶、鼻病毒2A蛋白酶、小核糖核酸病毒(picorna)3C蛋白酶、豇豆花叶病毒24K蛋白酶、线虫传多面体病毒24K蛋白酶、RTSV(水稻东格鲁球状病毒)3C-样蛋白酶、PYVF(欧防风黄点病毒)3C-样蛋白酶、肝素、凝血酶因子Xa和肠激酶。由于其高切割严格性，在一个实施方案中优选TEV(烟草蚀纹病毒)蛋白酶切割位点，例如，EXXYXQ(G/S)(SEQ ID NO：14)，例如，ENLYFQG(SEQ ID NO：15)和ENLYFQS(SEQ ID NO：16)，其中X代表任何氨基酸(在Q和G或Q和S之间发生TEV切割)。

在具体实施方案中，自我切割肽包括获自以下的那些多肽序列：马铃薯Y病毒和心病毒2A肽、FMDV(口蹄疫疾病病毒)、马鼻病毒A、明脉扁刺蛾β四体病毒和猪捷申病毒。

在某些实施方案中，自我切割多肽位点包含2A或2A-样的位点、序列或结构域(Donnelly等,2001.J.Gen.Virol.82:1027-1041)。

表2：示例性的2A位点包括下述序列：

在优选实施方案中，本文考虑的多肽包含CAR多肽。

E.多核苷酸

在具体实施方案中，提供包含MND启动子和编码一种或多种CAR的多核苷酸的多核苷酸。在优选实施方案中，提供包含与编码如SEQ ID NO：2和3中所述的一种或多种CAR的多核苷酸可操作地连接的MND启动子的多核苷酸。本文使用的术语“多核苷酸”或“核酸”指信使RNA(mRNA)、RNA、基因组RNA(gRNA)、正链RNA(RNA(+))、负链RNA(RNA(-))、基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)或重组DNA。多核苷酸包括单链和双链多核苷酸。优选地，本发明的多核苷酸包括与本文所描述的任何参照序列(参见，例如，序列表)具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸或变体，通常，其中所述变体维持参照序列的至少一种生物学活性。在不同的示例性实施方案中，本发明部分考虑了包含多核苷酸的表达载体、病毒载体、转移质粒和组合物，以及包含所述包含多核苷酸的表达载体、病毒载体、转移质粒和组合物的细胞。

在具体实施方案中，通过本发明提供的多核苷酸编码本发明多肽的至少约5、10、25、50、100、150、200、250、300、350、400、500、1000、1250、1500、1750或2000个或更多个连续氨基酸残基，以及所有中间长度的连续氨基酸残基。将容易理解的是，本背景中的“中间长度”意指引用值之间的任意长度，如6、7、8、9等；101、102、103等；151、152、153等；201、202、203等。

本文使用的术语“多核苷酸变体”和“变体”等，指与参照多核苷酸序列呈现基本上序列同一性的多核苷酸或者指在其后所定义的严格条件下与参照序列杂合的多核苷酸。这些术语包括这样的多核苷酸：其中与参照多核苷酸相比，添加了或缺失了一个或多个核苷酸，或者用不同的核苷酸替代了一个或多个核苷酸。在这点上，本领域众所周知的是，可以对参照多核苷酸进行某些改变，包括突变、添加、缺失和置换，使改变的多核苷酸保留参照多核苷酸的生物学功能或活性。

本文使用的叙述“序列同一性”或者例如包含“与…50％相同的序列”指在比较窗口中以逐个核苷酸或逐个氨基酸的方式序列相同的程度。因此，可以通过以下步骤计算“序列同一性的百分比”：对比较窗口中的两个最佳对齐的序列进行比较，测定两个序列中存在的相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数，匹配的位置数除以比较窗口中的总位置数(即，窗口大小)，并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。包括与本文所描述的任何参照序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸和多肽，通常其中多肽变体维持参照多肽的至少一种生物学活性。

用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参照序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”以及“基本相同”。“参照序列”的长度为至少12个但经常为15至18个以及通常至少25个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基。因为两个多核苷酸可以各自包含(1)两个多核苷酸之间类似的序列(即，只有完整多核苷酸序列的一部分)和(2)两个多核苷酸之间不同的序列，所以通常通过比较“比较窗口”中的两个多核苷酸的序列进行两个(更多个)多核苷酸之间的序列比较，以鉴定和比较序列相似性的局部区域。“比较窗口”指至少6个连续位置，通常约50至约100个，更通常约100至约150个连续位置的概念上的区段，其中在将两个序列最佳对齐后，将序列与相同连续位置数的参照序列比较。为了两个序列的最佳比对，比较窗口可以包含与参照序列(其不包含添加或缺失)相比约20％或更少的添加或缺失(即，空位)。通过计算机化实施的算法(威斯康星遗传学软件包版本7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Drive Madison,WI,USA)或通过检验以及通过所选择的各种方法中的任一种所产生的最佳比对(即，在比较窗口中产生最高百分比同源性)，可以进行对齐比较窗口的序列的最佳比对。还可以参考如例如由Altschul等,1997,Nucl.Acids Res.25:3389所公开的BLAST程序家族。序列分析的详细讨论可以见于Ausubel等人编著的《最新分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)(John Wiley&Sons Inc,1994-1998,第15章)的第19.3单元。

本文所使用的“分离的多核苷酸”指已从在天然存在状态下位于其侧翼的序列纯化的多核苷酸，例如，已从通常与DNA片段邻近的序列中移出的DNA片段。“分离的多核苷酸”也指互补DNA(cDNA)、重组DNA或者在自然中不存在且通过人为处理制备的其它多核苷酸。

描述多核苷酸的方向的术语包括：5’(通常为具有游离的磷酸基团的多核苷酸的末端)和3’(通常为具有游离的羟基(OH)的多核苷酸的末端)。可以以5’至3’的方向或者以3’至5’的方向对多核苷酸序列进行注释。对于DNA和mRNA，5’至3’的链被指定为“正义链”、“正链”或“编码链”，因为其序列与前信使RNA(premRNA)的序列相同[除了在RNA中为尿嘧啶(U)而在DNA中为胸腺嘧啶(T)]。对于DNA和mRNA，互补的3’至5’链是被RNA聚合酶转录的链，其被指定为“模板链”、“反义链”、“负链”或“非编码链”。本文使用的术语“反向”指以3’至5’方向书写的5’至3’序列，或者以5’至3’方向书写的3’至5’序列。

术语“互补”和“互补性”指通过碱基配对规则关联的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，DNA序列5’A G T C A T G 3’的互补链是3’T C A G T A C5’。后一序列通常被写作5’端在左且3’端在右的反向互补序列5’C A T G A C T 3’。与序列的反向互补序列相同的序列被称为回文序列。互补性可以是“部分的”，其中根据碱基配对规则仅一些核酸’碱基匹配。或者，在核酸之间可以具有“完全(complete)”或“全部(total)”互补性。

此外，本领域技术人员将会理解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码如本文所述的多肽或其变体片段的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因(native gene)的核苷酸序列具有最小的同源性。尽管如此，本发明特别考虑，由于密码子选择的差异而改变的多核苷酸，例如对于人和/或灵长类密码子选择而最佳化的多核苷酸。此外，也可以使用包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因。等位基因是由于一个或多个突变如核苷酸的缺失、添加和/或置换而改变的内源基因。

本文使用的术语“核酸盒(nucleic acid cassette)”指可以表达RNA，并且随后表达蛋白的在载体内的遗传序列。核酸盒包含启动子和目的基因，例如CAR。核酸盒在载体内定位且顺序取向，以使盒内的核酸可以转录为RNA，并且当必要时，翻译为蛋白或多肽，在转化的细胞中经受活性所需的合适的翻译后修饰，以及通过靶向至合适的细胞内区室或者分泌至细胞外区室而被易位至对于生物学活性而言合适的区室。优选地，盒具有适于准备插入载体中的3’和5’端，例如所述盒在各端具有限制性内切酶位点。在本发明的优选实施方案中，核酸盒包含MND启动子和本文考虑的嵌合抗原受体的序列。可将所述盒移出并作为单一单元插入质粒或病毒载体中。

在具体实施方案中，多核苷酸包含至少一种目标多核苷酸。本文使用的术语“目标多核苷酸”指编码多肽(即目标多肽)的、被插入表达载体中期望表达的多核苷酸。载体可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种目标多核苷酸。在某些实施方案中，目标多核苷酸编码在疾病或病症的治疗或预防中提供治疗效果的多肽。目标多核苷酸以及由其编码的多肽包括编码野生型多肽的多核苷酸，以及其功能性变体和片段。在具体实施方案中，功能性变体与相应的野生型参照多核苷酸或多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％或者至少99％的同一性。在某些实施方案中，功能性变体或片段具有相应的野生型多肽的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或者至少90％的生物学活性。

在一个实施方案中，目标多核苷酸不编码多肽，但是作为转录miRNA、siRNA或shRNA、核酶或者其它抑制性RNA的模板。在各种其它实施方案中，多核苷酸包含编码CAR的目标多核苷酸和一种或多种其它目标多核苷酸，所述其它目标多核苷酸包括但不限于抑制性核酸序列，所述抑制性核酸序列包括但不限于：siRNA、miRNA、shRNA和核酶。

本文使用的术语“siRNA”或“短干扰RNA”指在动物中介导序列特异的转录后基因沉默、翻译抑制、转录抑制或者表观RNAi的过程的多核苷酸序列(Zamore等，2000,Cell,101,25-33；Fire等，1998,Nature,391,806；Hamilton等，1999,Science,286,950-951；Lin等，1999,Nature,402,128-129；Sharp,1999,Genes&Dev.,13,139-141；以及Strauss,1999,Science,286,886)。在某些实施方案中，siRNA包含含有相同的核苷数的第一链和第二链；然而，第一链和第二链是偏移的，以使第一链和第二链上的两个末端核苷与互补链上的残基不配对。在某些情况下，不配对的两个核苷是胸苷残基。siRNA应当包含与靶基因足够同源的区域，并且核苷酸应当足够长，以使siRNA或其片段可以介导靶基因的下调。因此，siRNA包含与靶RNA至少部分互补的区域。siRNA与靶标之间的不需要存在完全互补性，但是一致性必须足以使siRNA或其切割产物能够指导序列特异性沉默，例如通过靶RNA的RNAi切割。在反义链中，与靶标链的互补性或同源程度是最关键的。尽管经常期望完全互补性，特别是在反义链中，但是一些实施方案包含与靶RNA的一个或多个错配，优选10、8、6、5、4、3、2个或者更少的错配。错配在末端区域是最可接受的，并且如果存在，优选存在于例如在5’和/或3’末端的6、5、4或3个核苷酸内的末端区域中。有义链仅需要与反义链足够互补，以维持分子的整体双链特征。

此外，siRNA可被修饰或者包含核苷类似物。siRNA的单链区域可被修饰或者包含核苷类似物，例如未配对区域或者发卡结构区域(例如连接两个互补区域的区域)可以具有修饰或者核苷类似物。使siRNA的一个或多个3’末端或5’末端例如针对核酸外切酶稳定的修饰，或者利于反义siRNA物质进入RISC的修饰也是有益的。修饰可以包括C3(或C6、C7、C12)氨基接头、硫醇接头、羧基接头、非核苷酸间隔(C3、C6、C9、C12、无碱基(abasic)、三甘醇、六甘醇)、特殊的生物素试剂或荧光素试剂，所述试剂以亚磷酰胺的形式存在并具有另一DMT保护的羟基，以允许在RNA合成期间多次偶联。siRNA各链的长度可以等于或者少于30、25、24、23、22、21或20个核苷酸。链的长度优选为至少19个核苷酸。例如，各链的长度可以是21至25个核苷酸。优选的siRNA具有17、18、19、29、21、22、23、24或25个核苷酸对的双链区域以及一个或多个2-3个核苷酸的突出端，优选一个或两个2-3个核苷酸的3’突出端。

本文使用的术语“miRNA”或“微RNA”指20-22个核苷酸的小的非编码RNA，通常由被称为前miRNA的～70个核苷酸折返(foldback)RNA前体结构切割而来。miRNA以取决于miRNA与靶标之间的互补性程度的两种方式之一负调控其靶标。首先，与编码蛋白的mRNA序列完全或几乎完全互补结合的miRNA诱导RNA介导的干扰(RNAi)通路。通过与其mRNA靶标的3’非翻译区(UTR)内的不完全互补位点结合而发挥其调控作用的miRNA，通过RISC复合体在翻译水平明显地抑制靶基因的转录后表达，所述RISC复合体与用于RNAi通路中的复合体类似或者可能完全相同。与翻译控制一致，利用该机制的miRNA降低了其靶基因的蛋白水平，但是这些基因的mRNA水平仅受到很小影响。miRNA包括可以特异性地靶向任何mRNA序列的天然存在的miRNA以及人工设计的miRNA。例如，在一个实施方案中，技术人员可以设计表达为人miRNA(例如miR-30或miR-21)初级转录本的短发卡RNA构建体。该设计向发卡构建体添加了Drosha处理位点，并且已经显示极大地增加了敲低效率(Pusch等，2004)。发卡茎部由22-nt的dsRNA(例如反义链与其期望的靶标具有完全互补性)和来自人miR的15-19-nt环组成。当与不含微RNA的常规shRNA相比时，在发卡的任一侧或者两侧添加miR环和miR30侧翼序列导致所表达的发卡的Drosha和Dicer处理高于10倍的增加。增加的Drosha和Dicer处理转化为更多的siRNA/miRNA产生和所表达发卡的更高效能。

本文使用的术语“shRNA”或“短发卡RNA”指由自身互补的RNA单链形成的双链结构。优选将含有与靶基因的编码序列或非编码序列的一部分相同的核苷酸序列的shRNA构建体用于抑制。还发现，相对于靶序列具有插入、缺失和单位点突变的RNA序列对于抑制是有效的。抑制性RNA与靶基因的一部分之间具有高于90％的序列同一性，或者甚至100％的序列同一性是优选的。在某些优选实施方案中，shRNA的双链形成部分的长度为至少20、21或22个核苷酸，例如与通过Dicer依赖的切割产生的RNA产物大小一致。在某些实施方案中，shRNA构建体的长度为至少25、50、100、200、300或400个碱基。在某些实施方案中，shRNA构建体的长度为400-800个碱基。shRNA构建体的环序列和环尺寸高度可变。

本文使用的术语“核酶”指能够对靶mRNA进行位点特异地切割的具有催化活性的RNA分子。已经描述了一些亚型，例如锤头状核酶和发卡状核酶。可以通过在非催化碱基处用脱氧核糖核苷酸置换核糖核苷酸来增强核酶的催化活性和稳定性。尽管在位点特异的识别序列处切割mRNA的核酶可用于破坏特定的mRNA，但是优选使用锤头状核酶。锤头状核酶在由与靶mRNA形成互补碱基对的侧翼区域所指示的位置处切割mRNA。唯一的要求是靶mRNA具有下述双碱基序列：5’-UG-3’。锤头状核酶的构建和产生在本领域众所周知。

如本文别处所描述的，递送包含siRNA、miRNA、shRNA或核酶的目标多核苷酸的优选方法包括一种或多种调控序列，如例如强组成型pol III启动子(例如人U6snRNA启动子、小鼠U6snRNA启动子、人和小鼠H1RNA启动子以及人tRNA-val启动子)或者强组成型pol II启动子。

本发明的多核苷酸(不考虑编码序列本身的长度)可以与如本文别处所公开的或如本领域已知的其它DNA序列组合，如启动子和/或增强子、非翻译区(UTR)、Kozak序列、聚腺苷酸化信号、另外的限制性酶位点、多克隆位点、内部核糖体进入位点(IRES)、重组酶识别位点(例如LoxP、FRT和Att位点)、终止密码子、转录终止信号以及编码自我切割多肽、附加表位的多核苷酸，使得它们的总长度可以大大改变。因此考虑，可以采用几乎任意长度的多核苷酸片段，其中总长度优选受制备的容易性和在预期的重组DNA方案中的用途的限制。

使用本领域已知且可用的各种很好建立的技术中的任一种可以制备、操作和/或表达多核苷酸。为了表达期望的多肽，可以将编码多肽的核苷酸序列插入适当的载体。载体的实例是质粒、独立自主复制的序列和转座元件。另外的示例性载体包括不限于，质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体(如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC))、细菌噬菌体(如λ噬菌体或M13噬菌体)、以及动物病毒。用作载体的动物病毒类的实例包括不限于，逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳多空病毒(例如，SV40)。表达载体的实例是用于在哺乳动物细胞中表达的pClneo载体(Promega)；用于在哺乳动物细胞中进行慢病毒介导的基因转移和表达的pLenti4/V5-DEST^TM、pLenti6/V5-DEST^TM和pLenti6.2/V5-GW/lacZ(Invitrogen)。在具体实施方案中，可以将本文所公开的嵌合蛋白的编码序列连接进此类表达载体用于在哺乳动物细胞中表达嵌合蛋白。

存在于表达载体中的“控制元件”或“调控序列”是载体的那些非翻译区-复制起点、选择盒、启动子、增强子、翻译起始信号(Shine Dalgarno序列或Kozak序列)内含子、聚腺苷酸化序列、5’和3’非翻译区-其与宿主细胞的蛋白相互作用以进行转录和翻译。此类元件的强度和特异性可以改变。根据所利用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的合适的转录和翻译元件，包括普遍存在的启动子和可诱导的启动子。

在具体实施方案中，用于实行本发明的载体(包括但不限于表达载体和病毒载体)将包含外源控制序列、内源控制序列或异源控制序列，如启动子和/或增强子。“内源”控制序列是与基因组中的指定基因天然连接的序列。“外源”控制序列是通过遗传操作的方法(即，分子生物学技术)与基因并列放置使所述基因的转录被连接的增强子/启动子引导的序列。“异源”控制序列是来自与待遗传操作的细胞不同物种的外源序列。

本文使用的术语“启动子”指RNA聚合酶所结合至的多核苷酸(DNA或RNA)的识别位点。RNA聚合酶起始并转录与启动子可操作地连接的多核苷酸。在具体实施方案中，在哺乳动物细胞中起作用的启动子包含位于起始转录位点上游大约25至30个碱基的富AT区和/或存在于转录开始上游70至80个碱基的另外序列，CNCAAT区，其中N可以是任意核苷酸。

术语“增强子”指这样的DNA区段：其含有能够提供增强的转录且在某些情况下可以以独立于其相对另外控制序列的方向而起作用的序列。增强子可以与启动子和/或其它增强子元件合作地或叠加性地起作用。术语“启动子/增强子”指含有能够提供启动子和增强子二者功能的序列的DNA区段。

术语“可操作地连接”指并列，其中所描述的组分处于允许它们以它们预期方式起作用的关系中。在一个实施方案中，所述术语指核酸表达控制序列(如启动子和/或增强子)和第二多核苷酸序列(例如，目的多核苷酸)之间的功能性连接，其中表达控制序列引导对应于第二序列的核酸的转录。

本文使用的术语“组成性表达控制序列”指连续地或连续不断地允许可操作地连接的序列的转录的启动子、增强子或启动子/增强子。组成性表达控制序列可以分别是允许在广泛的多种细胞和组织类型中表达的“普遍存在的”启动子、增强子或启动子/增强子，或者允许在受限制的多种细胞和组织类型中表达的“细胞特异性”、“细胞类型特异性”、“细胞谱系特异性”或“组织特异性”的启动子、增强子或启动子/增强子。

适合用于本发明的具体实施方案中的示例性的普遍存在的表达控制序列包括但不限于，巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、病毒猿猴病毒40(SV40)(例如、早期或晚期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR、单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子、来自牛痘病毒的H5、P7.5和P11启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、早期生长反应因子1(EGR1)、铁蛋白H(FerH)、铁蛋白L(FerL)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)、热激70kDa蛋白5(HSPA5)、热激蛋白90kDaβ成员1(HSP90B1)、热激蛋白70kDa(HSP70)、β-驱动蛋白(β-KIN)、人ROSA26基因座(Irions等,Nature Biotechnology 25,1477-1482(2007))、泛素C启动子(UBC)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子、β-肌动蛋白启动子和骨髓及骨髓外肉瘤病毒增强子、负控制区缺失的dl587rev引物-结合位点取代的(MND)启动子(Challita等,J Virol.69(2):748-55(1995))。

在具体实施方案中，可以期望由在T细胞中提供稳定且长期表达的启动子表达包含CAR的多核苷酸，并且以足够的水平表达，从而使T细胞重定向至表达靶抗原的细胞。在优选实施方案中，启动子是MND启动子。

在一个实施方案中，本发明的载体包含MND启动子，所述MND启动子包含增强、降低或稳定MND启动子活性的一个或多个核苷酸插入、缺失、取代或修饰。

本文使用的“条件性表达”可以指任何类型的条件性表达，其包括但不限于，可诱导的表达；可阻遏的表达；在具有特定生理学、生物学或疾病状态等的细胞或组织中的表达。该定义并非意图排除细胞类型或组织的特异性表达。本发明的某些实施方案提供条件性表达目的多核苷酸，例如，通过使细胞、组织、有机体等经历这样的处理或条件来控制表达，所述处理或条件引起多核苷酸表达或者引起由目的多核苷酸编码的多核苷酸的表达的增加或减少。

诱导性启动子/系统的示例性实例包括但不限于，类固醇诱导性启动子(如用于编码糖皮质激素或雌激素受体的基因的启动子(可通过用对应的激素处理诱导))、金属硫蛋白启动子(可通过用各种重金属处理诱导)、MX-1启动子(可通过干扰素诱导)、“GeneSwitch”米非司酮调控性系统(Sirin等,2003,Gene,323:67)、cumate诱导性基因开关(WO 2002/088346)、四环素依赖性调控系统等。

还可以通过使用位点特异性DNA重组酶实现条件性表达。根据本发明的某些实施方案，载体包含至少一个(通常两个)用于通过位点特异性重组酶介导的重组位点。本文使用的术语“重组酶”或“位点特异性重组酶”包括涉及重组反应的切除的或整合的蛋白、酶、辅因子或相关蛋白，所述重组反应涉及一个或多个(例如，2个，3个、4个、5个、7个、10个、12个、15个、20个、30个、50个等)重组位点，所述术语可以是野生型蛋白(参见Landy,Current Opinion in Biotechnology 3:699-707(1993))，或者其突变体、衍生物(例如，含有重组蛋白序列或其片段的融合蛋白)、片段和变体。适合用于本发明具体实施方案中的重组酶的示例性实例包括但不限于：Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、ΦC31、Cin、Tn3解离酶、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gin、SpCCE1和ParA。

载体可以包含多种位点特异性重组酶中的任一种的一个或多个重组位点。应当理解，位点特异性重组酶的靶位点是除载体(例如逆转录病毒载体或慢病毒载体)整合所需的位点之外的任何位点。本文使用的术语“重组序列”、“重组位点”或者“位点特异性重组位点”指重组酶识别并结合的特定核酸序列。

例如，Cre重组酶的一个重组位点是loxP，其为34个碱基对的序列，其包含两个13个碱基对的反向重复序列(作为重组酶的结合位点)，侧翼接有8个碱基对的核心序列(参见Sauer,B.,Current Opinion in Biotechnology 5:521-527(1994)的图1)。其它示例性loxP位点包括但不限于：lox511(Hoess等，1996；Bethke和Sauer,1997)、lox5171(Lee and Saito,1998)、lox2272(Lee和Saito,1998)、m2(Langer等，2002)、lox71(Albert等，1995)和lox66(Albert等，1995)。

FLP重组酶的合适的识别位点包括但不限于：FRT(McLeod等，1996)，F₁、F₂、F₃(Schlake和Bode,1994)，F₄、F₅(Schlake和Bode,1994)、FRT(LE)(Senecoff等，1988)，FRT(RE)(Senecoff等，1988)。

识别序列的其它实例为attB、attP、attL和attR序列，它们由重组酶酶λ整合酶(例如phi-c31)识别。SSR仅介导异型位点(heterotypic site)attB(长度为34bp)与attP(长度为39bp)之间的重组(Groth等，2000)。分别以细菌和噬菌体基因组上的噬菌体整合酶的附着位点命名的attB和attP，均含有可能被同源二聚体结合的不完全反向重复序列(Groth等，2000)。产生位点attL和attR针对其它介导的重组呈有效惰性(Belteki等，2003)，这使得反应不可逆。对于催化插入，已经发现，携带attB的DNA插入基因组attP位点比attP位点插入基因组attB位点更容易(Thyagarajan等，2001；Belteki等，2003)。因此，典型的策略是通过同源重组将携带attP的“对接位点”放入限定的基因座，然后其与插入的携带attB的进入序列配对。

本文使用的“内部核糖体进入位点”或“IRES”指这样的元件：其促进内部核糖体直接进入顺反子(蛋白编码区域)的起始密码子如ATG，从而导致不依赖帽的基因的翻译。参见，例如Jackson等，1990.Trends Biochem Sci 15(12):477-83)以及Jackson和Kaminski.1995.RNA 1(10):985-1000。在具体实施方案中，本发明考虑的载体包含编码一种或多种多肽的一个或多个目标多核苷酸。在具体实施方案中，为了实现多种多肽各自的有效翻译，多核苷酸序列可以被一个或多个IRES序列或者编码自身切割多肽的多核苷酸序列间隔。

本文使用的术语“Kozak序列”指极大地促进mRNA与核糖体的小亚基初步结合并增加翻译的短核苷酸序列。共有的Kozak序列为(GCC)RCCATGG(SEQ ID NO:27)，其中R是嘌呤(A或G)(Kozak,1986.Cell.44(2):283-92，以及Kozak,1987.Nucleic Acids Res.15(20):8125-48)。在具体实施方案中，本发明考虑的载体包含含有共有的Kozak序列并编码期望的多肽(例如CAR)的多核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，多核苷酸或包含所述多核苷酸的细胞利用自杀基因(包括可诱导的自杀基因)来降低直接的毒性和/或不受控制的增殖的风险。在具体方面，自杀基因对于含有所述多核苷酸或者细胞的宿主不具有免疫原性。可以使用的自杀基因的某些实例为半胱天冬酶-9或半胱天冬酶-8或者胞嘧啶脱氨酶。可以使用特定的二聚化化学诱导物(CID)来激活半胱天冬酶-9。

在某些实施方案中，载体包含引起本发明的免疫效应细胞(例如T细胞)对在体内的阴性选择敏感的基因区段。“阴性选择”意为由于个体体内条件的改变，输注的细胞可被除去。阴性选择表型可以由插入赋予对施用的物质(例如化合物)敏感的基因而导致。阴性选择基因在本领域是已知的，并且包括尤其是以下基因：赋予更昔洛韦(ganciclovir)敏感性的I型单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler等，Cell 11:223,1977)；细胞次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因，细胞腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)基因以及细菌胞嘧啶脱氨酶(Mullen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:33(1992))。

在一些实施方案中，遗传修饰的免疫效应细胞(如T细胞)包含多核苷酸，所述核苷酸还包含使能够在体外选择阴性选择表型细胞的阳性标志物。阳性选择标志物可以是这样的基因：当被引入宿主细胞时，其表达允许对携带所述基因的细胞进行阳性选择的显性表型。该类基因在本领域是已知的，并且包括尤其是赋予对潮霉素B的抗性的潮霉素-B磷酸转移酶基因(hph)、编码对抗生素G418的抗性的来自Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶基因(neo或aph)、二氢叶酸还原酶(DHFR)基因、腺苷脱氨酶基因(ADA)以及多重耐药(MDR)基因。

优选地，阳性选择标志物和阴性选择元件相连，以使阴性选择元件的丧失也必定伴随着阳性选择标志物的丧失。甚至更优选地，将阳性选择标志物和阴性选择标志物融合，以使一种的丧失强制性地导致另一种的丧失。作为表达产物产生赋予以上所述的期望的阳性和阴性选择特征的多肽的融合多核苷酸的实例是潮霉素磷酸转移酶胸苷激酶融合基因(HyTK)。该基因的表达产生赋予潮霉素B抗性用于在体内进行阳性选择，以及赋予更昔洛韦敏感性用于在体内进行阴性选择的多肽。参见Lupton S.D.等，Mol.and Cell.Biology 1 1:3374-3378,1991。此外，在优选实施方案中，编码嵌合受体的本发明的多核苷酸位于逆转录病毒载体中，所述逆转录病毒载体包含融合基因，特别是赋予潮霉素B抗性用于在体外进行阳性选择以及赋予更昔洛韦敏感性用于在体内进行阴性选择的的那些融合基因，例如以上Lupton,S.D.等(1991)中所述的HyTK逆转录病毒载体。也参见S.D.Lupton的PCT US91/08442和PCT/US94/05601的出版物，其描述了使用来源于将显性阳性选择标志物与阴性选择标志物融合的双功能选择融合基因。

优选的阳性选择标志物来源于选自hph、nco和gpt的基因，以及优选的阴性选择标志物来源于选自胞嘧啶脱氨酶、HSV-I TK、VZV TK、HPRT、APRT和gpt的基因。特别优选的标志物是双功能选择融合基因，其中阳性选择标志物来源于hph或neo，以及阴性选择标志物来源于胞嘧啶脱氨酶或者TK基因或者选择标志物。

F.病毒载体

在具体实施方案中，用编码CAR的逆转录病毒载体(例如慢病毒载体)转导细胞(例如T细胞)。例如，载体包含MND启动子，并编码CAR，所述CAR将抗体的抗原特异性结合结构域与胞内信号转导结构域组合，所述抗体的抗原特异性结合结构域与以下结合：α叶酸受体、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或VEGFR2多肽，所述胞内信号转导结构域是CD3ζ、CD28、4-1BB、Ox40或其任意组合。因此，这些转导的T细胞能够引发稳定、长期且持续的CAR介导的T细胞应答。

逆转录病毒是用于基因递送的常用工具(Miller,2000,Nature.357:455-460)。在具体实施方案中，将逆转录病毒用于向细胞递送编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸。本文使用的术语“逆转录病毒”指这样的RNA病毒：其将其基因组RNA反转录为线性双链DNA拷贝，以及随后将其基因组DNA共价整合进宿主基因组。一旦病毒被整合进宿主基因组，其被称为“原病毒”。原病毒作为RNA聚合酶II的模板，并引导编码产生新病毒颗粒所需的结构蛋白和酶的RNA分子的表达。

适于用于具体实施方案的示例性逆转录病毒包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗云德鼠白血病病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳氏肉瘤病毒(RSV))以及慢病毒。

本文使用的术语“慢病毒”指复合逆转录病毒群(或属)。示例性的慢病毒包括但不限于：HIV(人免疫缺陷病毒；包括1型HIV和2型HIV)；维斯纳-梅迪病毒(VMV)；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一个实施方案中，优选基于HIV的载体骨架(即HIV顺式作用序列元件)。在具体实施方案中，将慢病毒用于向细胞递送多核苷酸，所述多核苷酸包含MND启动子并编码CAR。

可将逆转录病毒载体，以及尤其是慢病毒载体用于实践本发明的具体实施方案。因此，本文使用的术语“逆转录病毒”或“逆转录病毒载体”分别意为包括“慢病毒”和“慢病毒载体”。

术语“载体”在本文用来指能够转移或转运另外核酸分子的核酸分子。转移的核酸通常与载体的核酸分子连接，例如被插入载体的核酸分子。载体可以包含引导在细胞中自主复制的序列，或者可以包含足以允许整合进宿主细胞DNA的序列。有用的载体包括，例如，质粒(例如，DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘粒、细菌人工染色体和病毒载体。有用的病毒载体包括，例如，复制缺陷型逆转录病毒和慢病毒。

如对本领域技术人员明显的是，术语“病毒载体”广泛地用来指包括病毒来源核酸元件的核酸分子(例如，转移质粒)或者指介导核酸转移的病毒颗粒，所述病毒来源核酸元件通常促进核酸分子的转移或整合进细胞基因组。病毒颗粒通常包含各种病毒组分并且有时还包含除核酸之外的宿主细胞组分。

术语病毒载体可以指能够将核酸转移进细胞的病毒或病毒颗粒或者指转移的核酸本身。病毒载体和转移质粒含有主要源自病毒的结构和/或功能遗传元件。术语“逆转录病毒载体”指含有主要源自逆转录病毒的结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。术语“慢病毒载体”指含有主要源自慢病毒的结构和功能遗传元件或者其部分(包括LTR)的病毒载体或质粒。术语“杂合载体”指含有逆转录病毒(例如，慢病毒)序列和非慢病毒的病毒序列二者的载体、LTR或其它核酸。在一个实施方案中，杂合载体指包含用于逆转录、复制、整合和/或包装的逆转录病毒(例如，慢病毒)序列的载体或转移质粒。

在具体实施方案中，术语“慢病毒载体”、“慢病毒表达载体”可以用来指慢病毒转移质粒和/或感染性慢病毒颗粒。当在本文提及诸如克隆位点、启动子、调控元件、异源核酸等的元件时，应理解，这些元件的序列以RNA形式存在于本发明的慢病毒颗粒中，以及以DNA形式存在于本发明的DNA质粒中。

原病毒的每一端是叫做“长末端重复序列”或“LTR”的结构。术语“长末端重复序列(LTR)”指位于逆转录病毒DNA端的碱基对结构域，在它们的天然序列背景中，所述碱基对结构域是直接的重复序列并且含有U3、R和U5区。LTR通常为逆转录病毒基因的表达(例如，基因转录物的促进、起始和聚腺苷酸化)以及病毒复制提供基本功能。LTR含有众多调控信号，包括转录控制元件、聚腺苷酸化信号以及用于病毒基因组的复制和整合所需的序列。将病毒LTR分为叫做U3、R和U5的三个区域。U3区含有增强子和启动子元件。U5区是引物结合位点和R区之间的序列，并且含有聚腺苷酸化序列。R(重复)区的侧翼是U3和U5区。LTR由U3、R和U5区构成，并且出现在病毒基因组的5’端和3’端。靠近5’LTR的是用于基因组反转录所需的序列(tRNA引物结合位点)以及用于病毒RNA有效包装为颗粒所需的序列(Psi位点)。

本文使用的术语“包装信号”或“包装序列”指位于逆转录病毒基因组内的序列，其是病毒RNA插入病毒衣壳或颗粒所必需的，参见例如，Clever等,1995.J.of Virology,Vol.69,No.4；pp.2101–2109。数种逆转录病毒载体利用病毒基因组衣壳化所需的最小包装信号(也被称作psi[Ψ]序列)。因此，本文使用的术语“包装序列”、“包装信号”、“psi”和符号“Ψ”被用来提及病毒颗粒形成期间逆转录病毒RNA链衣壳化所需的非编码序列。

在不同实施方案中，载体包含修饰的5’LTR和/或3’LTR。LTR的任一者或二者可以包含一种或多种修饰，包括但不限于，一处或多处缺失、插入或置换。通常对3'LTR进行修饰以通过使成为病毒复制缺陷型来改善慢病毒或逆转录病毒系统的安全性。本文使用的术语“复制缺陷型”指不能够完全有效复制以致于不能产生感染性病毒颗粒(例如，复制缺陷型慢病毒子代)的病毒。术语“复制型(replication-competent)”指能够复制，以致于病毒的病毒复制能够产生感染性病毒颗粒(例如，复制型慢病毒子代)的野生型病毒或突变病毒。

“自我失活”(SIN)载体指复制缺陷型载体，例如，逆转录病毒或慢病毒载体，其中已对被称作U3区的右端(3’)LTR增强子-启动子区进行了修饰(例如，通过缺失或置换)以阻止第一轮病毒复制之外的病毒转录。这是因为，在病毒复制期间右端(3’)LTR U3区用作左端(5’)LTR U3区的模板，并且因此，在无U3增强子-启动子的情况下不能形成病毒转录物。在本发明的其它实施方案中，对3’LTR进行修饰使得U5区被例如理想的聚(A)序列替换。应当注意到，对LTR的修饰，如对3’LTR、5’LTR或者3’LTR和5’LTR二者的修饰，也包括在本发明中。

通过用异源启动子替换5’LTR的U3区以驱使病毒颗粒产生期间病毒基因组的转录来增强另外的安全性。可以使用的异源启动子的实例包括，例如，病毒猿猴病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)、巨细胞病毒(CMV)(例如，立即早期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)和单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子。典型的启动子能够以Tat独立型方式驱使高的转录水平。该替换减少了产生复制型病毒的重组可能性，因为在病毒产生系统中不存在完整的U3序列。在某些实施方案中，异源启动子在控制病毒基因组转录的方式方面具有另外的优势。例如，异源启动子可以是可诱导的，使得只有当诱导因子存在时，才发生病毒基因组的全部或部分转录。诱导因子包括但不限于，一种或多种化合物或者培养宿主细胞的生理条件，如温度或pH。

在一些实施方案中，病毒载体包含TAR元件。术语“TAR”指位于慢病毒(例如，HIV)LTR的R区的“反式激活反应”遗传元件。该元件与慢病毒反式激活因子(tat)遗传元件相互作用以增强病毒复制。然而，该元件不是其中5’LTR的U3区被异源启动子替换的实施方案中必需的。

“R区”指逆转录病毒LTR内的区域，其开始于加帽基团起点处(即，转录的起点)并结束于PolyA序列段(tract)的起点之前。R区也被定义为侧翼有U3和U5区。在反转录期间，R区在允许初生DNA从基因组的一端转移至另一端中发挥作用。

本文使用的术语“FLAP元件”指这样的核酸，所述核酸的序列包括逆转录病毒(例如，HIV-1或HIV-2)的中央聚嘌呤序列段和中央终止序列(cPPT和CTS)。合适的FLAP元件描述于美国专利第6,682,907号和Zennou等,2000,Cell,101:173。在HIV-1反转录期间，正链DNA在中央聚嘌呤序列段(cPPT)处的中央起始和在中央终止序列(CTS)处的中央终止导致形成三链DNA结构：HIV-1中央DNA瓣。虽然不希望被任何理论束缚，DNA瓣可以作为慢病毒基因组核输入的顺式作用决定子和/或可以增加病毒的滴度。在具体实施方案中，逆转录病毒或慢病毒载体骨架在载体中的目的异源基因的上游或下游包含一个或多个FLAP元件。例如，在具体实施方案中，转移质粒包含FLAP元件。在一个实施方案中，本发明的载体包含分离自HIV-1的FLAP元件。

在一个实施方案中，逆转录病毒或慢病毒转移载体包含一个或多个输出元件。术语“输出元件”指顺式作用转录后调控元件，其调控RNA转录物从核向细胞胞质的转运。RNA输出元件的实例包括但不限于，人免疫缺陷病毒(HIV)rev应答元件(RRE)(参见例如，Cullen等,1991.J.Virol.65:1053；和Cullen等,1991.Cell 58:423)和乙型肝炎病毒转录后调控元件(HPRE)。通常，RNA输出元件被置于基因的3'UTR内，并且可以作为一个或多个拷贝插入。

在具体实施方案中，通过将转录后调控元件、高效的聚腺苷酸化位点、以及任选地转录终止信号引入载体来增加病毒载体中异源序列的表达。各种转录后调控元件可以增加异源核酸在蛋白处的表达，例如，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE；Zufferey等,1999,J.Virol.,73:2886)；存在于乙型肝炎病毒中的转录后调控元件(HPRE)(Huang等,Mol.Cell.Biol.,5:3864)等等(Liu等,1995,Genes Dev.,9:1766)。在具体实施方案中，本发明的载体包含诸如WPRE或HPRE的转录后调控元件。

在具体实施方案中，本发明的载体缺乏或者不包含诸如WPRE或HPRE的转录后调控元件，因为在某些情况下，这些元件增加细胞转化的风险和/或不会大幅度或显著地增加mRNA转录物的数量或者增加mRNA的稳定性。因此，在一些实施方案中，本发明的载体缺乏或者不包含作为添加的安全度量的WPRE或HPRE。

引导异源核酸转录本高效终止和聚腺苷酸化的元件增加异源基因的表达。转录终止信号通常存在于聚腺苷酸化信号的下游。在具体实施方案中，载体在编码待表达多肽的多核苷酸的3’端包含聚腺苷酸化序列。本文使用的术语“polyA位点”或“polyA序列”表示引导通过RNA聚合酶II产生的初生RNA转录物终止和聚腺苷酸化的DNA序列。通过将polyA尾巴添加至编码序列的3′端，聚腺苷酸化序列可以促进mRNA的稳定性，并且因此有助于翻译效率的提高。重组转录物的高效聚腺苷酸化是所希望的，因为缺乏polyA尾巴的转录物不稳定且被快速降解。可以用于本发明载体中的polyA信号的示例性实例包括理想的polyA序列(例如，AATAAA、ATTAAA、AGTAAA)、牛生长激素polyA序列(BGHpA)、兔β-球蛋白polyA序列(rβgpA)、或本领域已知的另外合适的异源或内源polyA序列。

在某些实施方案中，逆转录病毒或慢病毒载体还包含一个或多个绝缘子元件。绝缘子元件可以有助于保护慢病毒表达的序列(例如治疗性多肽)不受整合位点的影响，这可由存在于基因组DNA中的顺式作用元件介导，并导致转移的序列的表达失调(即位置效应；参见，例如Burgess-Beusse等，2002,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,99:16433；和Zhan等，2001,Hum.Genet.,109:471)。在一些实施方案中，转移载体在3’LTR处包含一个或多个绝缘子元件，以及在原病毒整合进宿主基因组时，通过3’LTR复制，所述原病毒在5’LTR或3’LTR处包含一个或多个绝缘子。用于本发明的合适的绝缘子包括但不限于鸡β-球蛋白绝缘子(参见，Chung等，1993.Cell 74:505；Chung等，1997.PNAS 94:575；以及Bell等，1999.Cell 98:387，通过引用并入本文)。绝缘子元件的实例包括但不限于来自β-球蛋白座位的绝缘子，如鸡HS4。

根据本发明的某些具体实施方案，病毒载体骨架序列中的大部分或者全部来源于慢病毒，例如HIV-1。然而，应当理解，可以使用多种不同来源的逆转录病毒和/或慢病毒序列或者将其进行组合，并且在某些慢病毒序列中可以包含许多置换和改变，而不损害转移载体进行本文所述的功能的能力。此外，各种慢病毒载体在本领域是已知的，参见Naldini等，(1996a,1996b,和1998)；Zufferey等，(1997)；Dull等，998,美国专利第6,013,516号和第5,994,136号，可对其中的许多进行改变以产生本发明的病毒载体或转移质粒。

在不同的实施方案中，本发明的载体包含与编码CAR多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子。载体可以包含一个或多个LTR，其中任一LTR包含一种或多种修饰，如一个或多个核苷酸的置换、添加或缺失。载体还可以包含多种辅助元件之一，以增加转导效率(例如，cPPT/FLAP)、病毒包装(例如，Psi(Ψ)包装信号，RRE)和/或包含增加治疗性基因的表达的其它元件(例如，多聚(A)序列)，并且可以任选地包含WPRE或HPRE。

在具体实施方案中，本发明的转移载体包含左端(5’)逆转录病毒LTR；中央多嘌呤段/DNA瓣(flap)(cPPT/FLAP)；逆转录病毒输出元件；与编码本文考虑的CAR多肽的多核苷酸可操作地连接的MND启动子；和右端(3’)逆转录病毒LTR；以及任选地包含WPRE或HPRE。

在具体实施方案中，本发明的转移载体包含左端(5’)逆转录病毒LTR；逆转录病毒输出元件；与编码本文考虑的CAR多肽的多核苷酸可操作地连接的MND启动子；右端(3’)逆转录病毒LTR；和多聚(A)序列；以及任选地包含WPRE或HPRE。在另一具体实施方案中，本发明提供包含下述的慢病毒载体：左端(5’)LTR；cPPT/FLAP；RRE；与编码本文考虑的CAR多肽的多核苷酸可操作地连接的MND启动子；右端(3’)LTR；和聚腺苷酸化序列；以及任选地包含WPRE或HPRE。

在某一实施方案中，本发明提供包含下述的慢病毒载体：左端(5’)HIV-1LTR；Psi(Ψ)包装信号；cPPT/FLAP；RRE；与编码本文考虑的CAR多肽的多核苷酸可操作地连接的MND启动子；和右端(3’)自灭活(SIN)HIV-1LTR；和兔β-球蛋白聚腺苷酸化序列；以及任选地包含WPRE或HPRE。

在另一实施方案中，本发明提供包含下述的载体：至少一个LTR；中央多嘌呤段/DNA瓣(cPPT/FLAP)；逆转录病毒输出元件；和与编码本文考虑的CAR多肽的多核苷酸可操作地连接的MND启动子；以及任选地包含WPRE或HPRE。

在具体实施方案中，本发明提供包含下述的载体：至少一个LTR；cPPT/FLAP；RRE；与编码本文考虑的CAR多肽的多核苷酸可操作地连接的MND启动子；和聚腺苷酸化序列；以及任选地包含WPRE或HPRE。

在某一实施方案中，本发明提供至少一个SIN HIV-1LTR；Psi(Ψ)包装信号；cPPT/FLAP；RRE；与编码本文考虑的CAR多肽的多核苷酸可操作地连接的MND启动子；和兔β-球蛋白聚腺苷酸化序列；以及任选地包含WPRE或HPRE。

技术人员将会理解，许多其它不同的实施方案可以改变自本发明既有的实施方案。

“宿主细胞”包括用本发明的重组载体或多核苷酸在体内、离体或者在体外转染、感染或者转导的细胞。宿主细胞可以包括包装细胞、生产细胞和用病毒载体感染的细胞。在具体实施方案中，向需要治疗的对象施用用本发明的病毒载体感染的宿主细胞。在某些实施方案中，术语“靶细胞”可与宿主细胞互换使用，并且指期望的细胞类型的转染、感染或者转导的细胞。在优选实施方案中，靶细胞是T细胞。

大规模病毒颗粒的产生通常是达到合理的病毒滴度所必需的。通过将转移载体转染至包含病毒结构基因和/或辅助基因的包装细胞系中而产生病毒颗粒，所述病毒结构基因和/或辅助基因例如gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef基因或者其它逆转录病毒基因。

本文使用的术语“包装载体”指缺乏包装信号，并包含编码一种、两种、三种、四种或者更多种病毒结构基因和/或辅助基因的多核苷酸的表达载体或病毒载体。通常，包装载体被包含于包装细胞中，并经转染、转导或感染而被引入细胞。转染、转导或感染的方法为本领域技术人员所熟知。可经转染、转导或感染将本发明的逆转录病毒/慢病毒转移载体引入包装细胞系，以产生生产细胞或细胞系。可以通过标准方法将本发明的包装载体引入人细胞或细胞系，所述标准方法包括，例如磷酸钙转染、脂质体转染或电穿孔。在一些实施方案中，将包装载体与显性选择标志物基因一同引入细胞，随后在合适的药物存在的情况下进行选择，并分离克隆，所述显性选择标记如新霉素、潮霉素、嘌呤霉素、杀稻瘟菌素(blastocidin)、博来霉素(zeocin)、胸苷激酶、DHFR、Gln合成酶或ADA。可以例如通过IRES或自我切割的病毒肽将选择标志物基因与由包装载体编码的基因物理连接。

病毒包膜蛋白(env)决定了最终可被由细胞系产生的重组逆转录病毒感染或转化的宿主细胞的范围。在慢病毒(如HIV-1、HIV-2、SIV、FIV和EIV)的情况下，env蛋白包括gp41和gp120。优选地，由本发明的包装细胞表达的病毒env蛋白在去除如之前所述的病毒gag和pol基因的单独载体上编码。

可用于本发明的逆转录病毒来源的env基因的示例性实例包括但不限于：MLV包膜，10A1包膜，BAEV包膜、FeLV-B包膜、RD114包膜、SSAV包膜、埃博拉病毒包膜、仙台病毒包膜、FPV(鸡瘟病毒)包膜和流感病毒包膜。类似地，可以使用编码来自RNA病毒(例如，微小核糖核酸病毒科、杯状病毒科、星状病毒科、披膜病毒科、黄病毒科、冠状病毒科、副粘病毒科、弹状病毒科、丝状病毒科、正粘病毒科、布尼亚病毒科、沙粒病毒科、呼肠孤病毒科、双核糖核酸病毒科、逆转录病毒科的RNA病毒家族)的包膜以及来自DNA病毒(肝病毒科、圆环病毒科、小DNA病毒科、乳头多瘤空泡病毒科、腺病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科(Poxyiridae)以及虹彩病毒科的家族)的包膜的基因。代表性的实例包括：FeLV、VEE、HFVW、WDSV、SFV、狂犬病毒、ALV、BIV、BLV、EBV、CAEV、SNV、ChTLV、STLV、MPMV、SMRV、RAV、FuSV、MH2、AEV、AMV、CT10以及EIAV。

在其它实施方案中，用于将本发明的病毒假型包装(pseudotyping)的包膜蛋白包括但不限于任何下述病毒的包膜蛋白：A型流感病毒(如H1N1、H1N2、H3N2和H5N1(禽流感病毒))、B型流感病毒、C型流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、轮状病毒、诺瓦克病毒组的任何病毒、肠道腺病毒、细小病毒、登革热病毒、猴痘病毒、单股负链病毒、狂犬病毒属(如狂犬病毒、拉各斯蝙蝠病毒、莫科拉病毒、杜文黑基病毒、欧洲蝙蝠病毒1型&2型以及澳大利亚蝙蝠病毒)、暂时热病毒属、水泡病毒属、水泡性口炎病毒(VSV)、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒1型和2型、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Bar)病毒(EBV)、人疱疹病毒(HHV)、人疱疹病毒6型和8型)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、乳头状瘤病毒、鼠γ疱疹病毒、沙粒病毒(如阿根廷出血热病毒、玻利维亚出血热病毒、萨比亚相关出血热病毒(Sabia-associated hemorrhagic fever virus)、委内瑞拉出血热病毒、拉沙热病毒、马丘波病毒)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、布尼亚病毒科(Bunyaviridiae)(如克里米亚-刚果出血热病毒、汉坦病毒、引起肾综合征出血热的病毒、裂谷热病毒)、丝状病毒科(线状病毒)(包括埃博拉出血热病毒和马尔堡出血热病毒)、黄病毒科(包括卡萨诺尔森林病病毒、鄂木斯克出血热病毒、引起蜱传脑炎的病毒)和副粘病毒科(如亨德拉病毒和立百病毒)、重型天花和轻型天花(天花)、甲病毒(如委内瑞拉马脑炎病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒)、SARS相关的冠状病毒(SARS-CoV)、西尼罗病毒、引起任何脑炎的病毒。

在一个实施方案中，本发明提供产生用VSV-G糖蛋白假型包装的重组逆转录病毒(例如慢病毒)的包装细胞。

本文使用的术语“假型(pseudotype)”或“假型包装(pseudotyping)”指病毒包膜蛋白已被具有更优特征的其它病毒的包膜蛋白替换的病毒。例如，可用水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)包膜蛋白对HIV进行假型包装，这允许HIV感染更广范围的细胞，因为HIV包膜蛋白(由env基因编码)通常使病毒靶向至CD4+递呈细胞。在本发明的优选实施方案中，用VSV-G对慢病毒包膜蛋白进行假型包装。在一个实施方案中，本发明提供产生用VSV-G包膜糖蛋白假型包装的重组逆转录病毒(例如慢病毒)的包装细胞。

本文使用的术语“包装细胞系”用于提及这样的细胞系：其不包含包装信号，但是稳定或者瞬时表达病毒颗粒的正确包装所必需的病毒结构蛋白和复制酶(例如gag、pol和env)。可以使用任何合适的细胞系制备本发明的包装细胞。通常，细胞为哺乳动物细胞。在具体实施方案中，用于产生包装细胞系的细胞是人细胞。可以使用的合适的细胞系包括，例如，CHO细胞、BHK细胞、MDCK细胞、C3H 10T1/2细胞、FLY细胞、Psi-2细胞、BOSC 23细胞、PA317细胞、WEHI细胞、COS细胞、BSC 1细胞、BSC 40细胞、BMT 10细胞、VERO细胞、W138细胞、MRC5细胞、A549细胞、HT1080细胞、293细胞、293T细胞、B-50细胞、3T3细胞、NIH3T3细胞、HepG2细胞、Saos-2细胞、Huh7细胞、HeLa细胞、W163细胞、211细胞以及211A细胞。在优选实施方案中，包装细胞为293细胞、293T细胞或者A549细胞。在另一优选实施方案中，细胞为A549细胞。

本文使用的术语“生产细胞系”指能够产生重组逆转录病毒颗粒的细胞系，其包括包装细胞系和包含包装信号的转移载体构建体。可以利用常规的技术产生感染性病毒颗粒和病毒储液。制备病毒储液的方法在本领域是已知的，并且由例如Y.Soneoka等(1995)Nucl.Acids Res.23:628-633和N.R.Landau等(1992)J.Virol.66:5110-5113阐明。可以利用常规的技术，从包装细胞收集感染性病毒颗粒。例如，如本领域所知的，可以通过细胞裂解或者收集细胞培养物的上清液来收集感染性颗粒。任选地，如果需要，可将收集的病毒颗粒进行纯化。合适的纯化技术对于本领域技术人员而言众所周知。

使用逆转录病毒或慢病毒载体通过病毒感染而非转染的方式递送基因或其它多核苷酸序列被称为“转导”。在一个实施方案中，通过感染和原病毒整合将逆转录病毒载体转导进细胞。在某些实施方案中，如果靶细胞(例如T细胞)包含使用病毒或逆转录病毒载体通过感染递送至细胞的基因或其它多核苷酸序列，则其被“转导”。在具体实施方案中，转导的细胞在其细胞基因组中包含通过逆转录病毒或慢病毒载体递送的一种或多种基因或者其它多核苷酸序列。

在具体实施方案中，向对象施用转导有本发明的病毒载体的宿主细胞来治疗和/或预防B细胞恶性肿瘤，所述病毒载体表达一种或多种多肽。可以根据本发明的某些实施方案使用的涉及病毒载体在基因疗法中应用的其它方法可见于，例如Kay,M.A.(1997)Chest 111(6Supp.):138S-142S；Ferry,N.和Heard,J.M.(1998)Hum.Gene Ther.9:1975-81；Shiratory,Y.等(1999)Liver 19:265-74；Oka,K.等(2000)Curr.Opin.Lipidol.11:179-86；Thule,P.M.和Liu,J.M.(2000)Gene Ther.7:1744-52；Yang,N.S.(1992)Crit.Rev.Biotechnol.12:335-56；Alt,M.(1995)J.Hepatol.23:746-58；Brody,S.L.和Crystal,R.G.(1994)Ann.N.Y.Acad.Sci.716:90-101；Strayer,D.S.(1999)Expert Opin.Investig.Drugs 8:2159-2172；Smith-Arica,J.R.and Bartlett,J.S.(2001)Curr.Cardiol.Rep.3:43-49；以及Lee,H.C.等(2000)Nature 408:483-8。

G.遗传修饰的细胞

在具体实施方案中，本发明考虑了被遗传修饰以表达本文所考虑的CAR的细胞，用于在癌症的治疗中使用。本文使用的术语“基因工程化的”或“遗传修饰的”指向细胞中的总遗传物质添加DNA或RNA形式的额外遗传物质。术语“遗传修饰的细胞”、“修饰的细胞”和“重定向的细胞”可互换使用。本文使用的术语“基因疗法”指为了恢复、调整或改变基因的表达，或者出于表达治疗性多肽(例如CAR)的目的，将DNA或RNA形式的额外的遗传物质引入细胞中的总遗传物质。

在具体实施方案中，将包含MND启动子并编码本文考虑的CAR的载体引入免疫效应细胞，并在所述细胞中表达，以将其特异性重定向至目标靶抗原。“免疫效应细胞”是具有一种或多种效应子功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、细胞因子的分泌、ADCC和/或CDC的诱导)的免疫系统的任何细胞。

本发明的免疫效应细胞可以是自体同源的/自体的(autologous/autogeneic)(“自体(self)”)或者非自体的(“非自体(non-self)”，例如同种异体的、同基因的或者异基因的)。

本文使用的“自体”指来自同一对象的细胞。

本文使用的“同种异体”指与比较的细胞在遗传学上不同的同一物种的细胞。

本文使用的“同基因的”指与比较的细胞在遗传学上相同的不同对象的细胞。

本文使用的“异基因的”指与比较的细胞不同物种的细胞。在优选实施方案中，本发明的细胞是同种异体的。

与包含本文考虑的CAR一起使用的示例性的免疫效应细胞包括T淋巴细胞。术语“T细胞”或“T淋巴细胞”是本领域公认的，并且意图包括胸腺细胞、未成熟的T淋巴细胞、成熟的T淋巴细胞、静止的T淋巴细胞或活化的T淋巴细胞。T细胞可以是辅助性T(Th)细胞，例如辅助性T1(Th1)细胞或者辅助性T2(Th2)细胞。T细胞可以是辅助性T细胞(HTL；CD4⁺T细胞)CD4⁺T细胞、细胞毒性T细胞(CTL；CD8⁺T细胞)、CD4⁺CD8⁺T细胞、CD4^-CD8^-T细胞或者T细胞的任何其它亚型。适用于具体实施方案的其它示例性T细胞群体包括初始初始T细胞和记忆T细胞。

本领域技术人员将会理解，可将包含MND启动子并编码CAR的载体引入也可用作免疫效应细胞的其它细胞。具体而言，免疫效应细胞还包括NK细胞、NKT细胞、中性粒细胞和巨噬细胞。免疫效应细胞还包括效应细胞的祖细胞，其中可以在体内或体外将此类祖细胞诱导分化为免疫效应细胞。因此，在具体实施方案中，免疫效应细胞包括免疫效应细胞的祖细胞，如包含在源自脐带血、骨髓或动员外周血的CD34⁺细胞群体内的造血干细胞(HSC)，当在对象中施用时，所述祖细胞分化为成熟的免疫效应细胞，或者其可在体外被诱导分化为成熟的免疫效应细胞。

如本文所使用的，基因工程化以包含含有MND启动子并编码抗原特异性CAR的载体的免疫效应细胞可被称为“抗原特异性重定向的免疫效应细胞”。

本文使用的术语“CD34⁺细胞”指在其细胞表面表达CD34蛋白的细胞。本文使用的“CD34”指通常作为细胞-细胞粘附因子并参与T细胞进入淋巴结的细胞表面糖蛋白(例如唾液粘蛋白)。CD34⁺细胞群体含有造血干细胞(HSC)，当向患者施用时，所述造血干细胞分化并有助于所有造血谱系，包括T细胞、NK细胞、NKT细胞、中性粒细胞以及单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞。

本发明提供制备表达本文考虑的CAR的免疫效应细胞的方法。在一个实施方案中，所述方法包括转染或转导分离自个体的免疫效应细胞，以使免疫效应细胞表达如本文所述的一种或多种CAR。在某些实施方案中，免疫效应细胞分离自个体，并且对其进行遗传修饰而不进行进一步体外操作。然后可将此类细胞直接再施用回所述个体。在其它实施方案中，在对免疫效应细胞进行遗传修饰以表达CAR之前，将其在体外初次活化并刺激，从而增殖。就这一点而言，可在在进行遗传修饰(即转导或转染，以表达本文考虑的CAR)之前和/或之后培养免疫效应细胞。

在具体实施方案中，在对本文所述的免疫效应细胞进行体外操作或者遗传修饰之前，从对象获得细胞来源。在具体实施方案中，CAR修饰的免疫效应细胞包括T细胞。T细胞可获自多种来源，包括但不限于：外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织以及肿瘤。在某些实施方案中，利用技术人员已知的多种技术(如沉积，例如FICOLL^TM分离)从收集自对象的血液单位可以获得T细胞。在一个实施方案中，通过清血法(apheresis)获得来自个体循环血的细胞。清血法的产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以对通过清血法收集的细胞进行洗涤，以移除血浆级分，并将细胞置于合适的缓冲液或介质中用于随后处理。可以用PBS或者用缺乏钙、镁以及大部分二价阳离子(即使不是所有其它二价阳离子)的其它合适的溶液洗涤细胞。如本领域普通技术人员所理解，可以通过本领域技术人员已知的方法，如通过使用半自动流通式离心机，来完成洗涤步骤。例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate等。洗涤之后，可在多种生物相容的缓冲液或者含有或不含缓冲液的其它盐溶液中重悬细胞。在某些实施方案中，可在细胞直接重悬的培养基中移除清血法样品中不想要的组分。

在某些实施方案中，通过裂解红细胞并耗尽单核细胞(例如，通过经PERCOLL^TM梯度离心)，从外周血单核细胞(PBMC)分离T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离表达下述标志物中的一种或多种的特定T细胞亚群：CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA和CD45RO。在一个实施方案中，通过阳性或阴性选择技术进一步分离表达CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA和CD45RO的特定T细胞亚群。例如，可以用针对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体组合来完成通过阴性选择的T细胞群体的富集。本文使用的一种方法是经负磁性免疫粘附(negative magnetic immunoadherence)或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，所述负磁性免疫粘附或流式细胞术利用针对被阴性选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4⁺细胞，单克隆抗体混合物通常包含针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。也可将流式细胞术和细胞分选用于分离本发明使用的目标细胞群。

可以用包含与编码本文考虑的CAR的多核苷酸可操作地连接的MND启动子的载体对PBMC直接进行遗传修饰。在某些实施方案中，在PBMC分离之后，进一步分离T淋巴细胞；以及在某些实施方案中，在进行遗传修饰和/或扩增之前或之后，细胞毒性T淋巴细胞和辅助性T淋巴细胞均可被分选为初始T细胞亚群、记忆T细胞亚群和效应T细胞亚群。

通过使用标准方法可以获得CD8⁺细胞。在一些实施方案中，通过鉴定与那些CD8⁺细胞类型中的每一种相关的细胞表面抗原，将CD8⁺细胞进一步分选为初始细胞、中枢记忆型细胞和效应细胞。

在某些实施方案中，初始CD8⁺T淋巴细胞的特征为初始T细胞的表型标志物的表达，所述表型标志物包括CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127和CD45RA。

在具体实施方案中，记忆T细胞存在于CD8⁺外周血淋巴细胞的CD62L⁺和CD62L^-亚群中。在用抗CD8和抗CD62L抗体染色之后，PBMC被分选为CD62L^-CD8⁺和CD62L⁺CD8⁺级分。在一些实施方案中，中枢记忆型T细胞表达的表型标志物包括CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和CD127，并且对于颗粒酶B而言是阴性的。在一些实施方案中，中枢记忆型T细胞为CD45RO⁺T细胞、CD62L⁺T细胞、CD8⁺T细胞。

在一些实施方案中，效应T细胞对于CD62L、CCR7、CD28和CD127而言是阴性的，并且对于颗粒酶B和穿孔素而言是阳性的。

在某些实施方案中，将CD4⁺T细胞进一步分选为亚群。例如，可以通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将CD4⁺辅助性T细胞分选为初始细胞、中枢记忆型细胞和效应细胞。通过标准的方法可以获得CD4⁺淋巴细胞。在一些实施方案中，初始CD4⁺T淋巴细胞为CD45RO^-T细胞、CD45RA⁺T细胞、CD62L⁺CD4⁺T细胞。在一些实施方案中，中枢记忆型CD4⁺细胞为CD62L阳性且CD45RO阳性。在一些实施方案中，效应CD4⁺细胞为CD62L和CD45RO阴性。

可以使用已知的方法在分离之后，对免疫效应细胞(如T细胞)进行遗传修饰，或者可在进行遗传修饰之前，在体外活化并扩增(或者在祖细胞的情况下，分化)免疫效应细胞。在具体实施方案中，将免疫效应细胞(如T细胞)用本文考虑的嵌合抗原受体进行遗传修饰(例如，用包含MND启动子和编码CAR的核酸的病毒载体转导)，然后在体外进行活化并扩增。在不同的实施方案中，可以使用如例如美国专利6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041；以及美国专利申请公开号20060121005中所述的方法，在进行遗传修饰以表达CAR之前或之后，将T细胞活化并扩增。

通常，通过使T细胞与连接有刺激CD3TCR复合物相关信号的物质和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体接触，来扩增所述T细胞。通过使T细胞群体与固定于表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或者抗CD2抗体接触，或者通过使T细胞群与结合有钙离子载体的蛋白激酶C激活剂(例如苔藓抑素)接触，可以刺激T细胞群。也考虑T细胞表面的辅助分子的共刺激。

在具体实施方案中，在含有合适的细胞因子(如IL-2、IL-7和/或IL-15)的培养基中，使PBMC或分离的T细胞与通常被连接至珠子或其它表面的刺激剂和共刺激剂(如抗CD3和抗CD28抗体)接触。为了刺激CD4⁺T细胞或CD8⁺T细胞的增殖，使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3,B-T3,XR-CD28(Diacione,Besancon,France)，其可以同本领域众所周知的其它方法一样来使用(Berg等，Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等，J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等，J.Immunol Meth.227(1-2):53-63,1999)。与同一珠子相连的抗CD3抗体和抗CD28抗体作为“替代”抗原递呈细胞(APC)。在其它实施方案中，可以利用如US6040177、US5827642和WO2012129514中所述的那些方法，用饲养细胞以及合适的抗体和细胞因子来活化T细胞并刺激其增殖。

在其它实施方案中，通过将K562、U937、721.221、T2和C1R细胞工程化来制备人工APC(aAPC)，以引导多种共刺激分子和细胞因子的稳定表达和分泌。在具体实施方案中，K32或U32aAPC用于引导一种或多种基于抗体的刺激分子在AAPC细胞表面上的展示。aAPC上基因的多种组合的表达使得能够准确确定人T细胞活化的需求，以使aAPC能够适用于具有特定生长需求和不同功能的T细胞亚群的最优增殖。相比于天然APC的使用，aAPC支持功能性CD8T细胞的离体生长和长期扩增，而不需要添加外源生长因子。可以通过表达多种共刺激分子的aAPC来扩增T细胞群体，所述共刺激分子包括但不限于：CD137L(4-1BBL)、CD134L(OX40L)和/或CD80或CD86。最后，aAPC为扩增遗传修饰的T细胞和维持CD8T细胞上的CD28的表达提供有效平台。在此，将WO03/057171和US2003/0147869中提供的aAPC通过引用整体并入。

在一个实施方案中，用根据本发明所述的核酸构建体转导CD34⁺细胞。在某些实施方案中，向对象施用之后，转导的CD34⁺细胞在体内分化为成熟的免疫效应细胞，通常，所述对象为所述细胞最初分离自的对象。在另一实施方案中，可在暴露于本文所述的CAR之前或者用本文所述的CAR进行遗传修饰之后，根据之前所述的方法(Asheuer等，2004；Imren等，2004)，用下述细胞因子中的一种或多种在体外刺激CD34⁺细胞：Flt-3配体(FLT3)、干细胞因子(SCF)、巨核细胞生长和分化因子(TPO)、IL-3和IL-6。

本发明提供用于治疗癌症的修饰的免疫效应细胞群，所述修饰的免疫效应细胞包含如本文所公开的CAR。例如，从获自被诊断患有本文所述的B细胞恶性肿瘤的患者(自体供体)的外周血单核细胞(PBMC)制备修饰的免疫效应细胞群。PBMC形成可以是CD4⁺、CD8⁺或者CD4⁺及CD8⁺的异源T淋巴细胞群。

PBMC还可以包含其它细胞毒性淋巴细胞，如NK细胞或NKT细胞。可将包含启动子(例如MND启动子)和本文考虑的CAR编码序列的表达载体引入人供体T细胞群、NK细胞群或NKT细胞群。除了利用抗CD3抗体和/或抗CD28抗体和IL-2或者如本文别处所述的本领域已知的任何其它方法进行细胞活化之外，可以利用流式细胞术对携带表达载体的成功转导的T细胞进行分选，以分离CD3阳性细胞，然后进一步增殖，从而增加这些表达CAR蛋白的T细胞的数目。使用标准程序对表达CAR蛋白的T细胞进行低温保藏，用于储存和/或制备在人对象中使用的T细胞。在一个实施方案中，在无非人的动物来源的产物(如胎牛血清(fetal calf serum)和胎牛血清(fetal bovine serum))不存在的情况下进行T细胞的体外转导、培养和/或扩增。由于异源PBMC群体是遗传修饰的，因此得到的转导细胞是包含如本文考虑的抗原特异性靶向的CAR的修饰的异源细胞群体。

在又一实施方案中，可将例如一种、两种、三种、四种、五种或者更多种不同的表达载体的混合物用于对供体的免疫效应细胞群体进行遗传修饰，其中各载体编码如本文考虑的不同嵌合抗原受体蛋白。得到的修饰的免疫效应细胞形成混合的修饰细胞群，其中修饰的细胞中的一部分表达多种不同的CAR蛋白。

在一个实施方案中，本发明提供储存表达遗传修饰的鼠CAR蛋白、人CAR蛋白或人源化CAR蛋白的免疫效应细胞的方法，所述方法包括将所述免疫效应细胞低温保藏，以使所述细胞在解冻时仍可存活。可以通过本领域已知的方法低温保藏表达CAR蛋白的免疫效应细胞的级分，为受癌症折磨的患者的未来治疗提供此类细胞的永久来源。当需要时，可以使低温保藏的转化的免疫效应细胞解冻、生长并扩增为更多此类细胞。

本文所使用“低温保藏(cryopreserving)”指通过冷却至零度以下的温度(如(通常)77K或-196℃(液氮的沸点))保存细胞。通常在零度以下的温度下使用低温保护剂，以防止被保存的细胞受到由于在低温下冻存或升温至室温导致的损害。低温保护剂和最佳冷却速率可以保护免受细胞损伤。可以使用的低温保护剂包括但不限于二甲基亚砜(DMSO)(Lovelock和Bishop,Nature,1959；183:1394-1395；Ashwood-Smith,Nature,1961；190:1204-1205)、甘油、聚乙烯吡咯烷(Rinfret,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1960；85:576)和聚乙二醇(Sloviter和Ravdin,Nature,1962；196:48)。优选的冷却速率为1°至3℃/分钟。在至少两个小时之后，T细胞达到-80℃的温度，并且可将其直接置于液氮(-196℃)中，以在如长期的低温储藏容器中永久保藏。

H.组合物和制剂

本文考虑的组合物可以包含如本文所考虑的一种或多种多肽、多核苷酸、包含多核苷酸的载体、遗传修饰的免疫效应细胞等。组合物包括但不限于药物组合物。“药物组合物”指在药学可接受的或生理学可接受的溶液中配制的组合物，其用于向细胞或动物单独施用或者与一种或多种其它治疗形式组合施用。也将理解，如果需要，可将本发明的组合物也与其它物质组合施用，所述其它物质如例如细胞因子、生长因子、激素、小分子、化学治疗剂、前药、药物、抗体或其它各种药学活性剂。实际上不限于也可包含于组合物中的其它组分，条件是另外的组分未不利地影响所述组合物提供预期治疗的能力。

短语“药学可接受的”在本文用来指这样的化合物、材料、组合物和/或剂型：在合理的医学判断的范围内，其适于与人和动物的组织接触使用而无过度的毒性、刺激性、过敏反应或者其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相对应。

本文所使用“药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括不限于已经被美国食品和药品管理局批准为可接受用于人或家养动物的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等张剂、溶剂、表面活性剂或者乳化剂。示例性的药学可接受的载体包括但不限于：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石粉；可可脂、蜡、动物和植物油脂、石蜡、硅酮、膨润土、硅酸、氧化锌；油类，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，如丙二醇；多元醇，如丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲液，如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等张盐水；林格氏液；乙醇；磷酸盐缓冲液；以及药学制剂中采用的任何其它相容的物质。

在具体实施方案中，本发明的组合物包含一定量的本文考虑的遗传修饰的免疫效应细胞。本文使用的术语“量”指达到有益的或期望的预防性或治疗性结果(包括临床结果)的遗传修饰的治疗性细胞(例如T细胞)的“有效量(an amount effective)”或者“有效量(an effective amount)”。

“预防有效量”指有效实现期望的预防性结果的遗传修饰的治疗性细胞的量。通常但不一定，由于在疾病之前或者在疾病的早期阶段在对象中使用预防剂量，因此预防有效量低于治疗有效量。

遗传修饰的治疗性细胞的“治疗有效量”可以根据诸如以下的因素而变化：个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及干细胞和祖细胞在所述个体中引发期望的应答的能力。治疗有效量也是这样的量：其中病毒或转导的治疗性细胞的任何毒性作用或有害作用被治疗有益效果超过。术语“治疗有效量”包括有效“治疗”对象(例如患者)的量。当标明治疗量时，待施用的本发明的组合物的精确量可以由医师通过考虑个体的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(对象)的病况的差异来确定。通常可以规定，可以以下述剂量施用包含本文所述的T细胞的药物组合物：10²至10¹⁰个细胞/kg体重，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重，包括这些范围内的所有中间值。细胞的数目将取决于组合物所意图的最终用途以及其中包含的细胞类型。对于本文提供的用途，细胞的体积通常为1升或者更少，可以是500mL或者更少，甚至是250mL或100mL或者更少。因此，期望的细胞的密度通常大于10⁶个细胞/ml，并且通常大于10⁷个细胞/ml，通常为10⁸个细胞/ml或者更高。可将临床相关的免疫细胞数分为多次输注，所述多次输注累积地等于或者超过10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹或10¹²个细胞。在本发明的一些方面，特别地，由于所有输注的细胞将重定向至特定的靶抗原(例如，κ或λ轻链)，因此可以施用10⁶/千克(10⁶-10¹¹/患者)范围内的较低数目的细胞。表达CAR的细胞组合物可以以这些范围内的剂量多次施用。细胞与正经受治疗的患者可以是同种异体的、同基因的、异基因的或者是自体的。如果需要，治疗也可以包括施用如本文所述的丝裂原(例如PHA)或淋巴因子、细胞因子和/或趋化因子(例如IFN-γ、IL-2、IL-12、TNF-α、IL-18和TNF-β、GM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L、RANTES、MIP1α等)，以增强免疫应答的诱导。

通常，包含如本文所述活化或扩增的细胞的组合物可以用于治疗或预防在免疫功能不全的个体中出现的疾病。具体而言，将包含本文考虑的CAR修饰的T细胞的组合物用于癌症的治疗。本发明的CAR修饰的T细胞可以单独施用，或者可以作为与载体、稀释剂、赋形剂和/或与其它组分(如IL-2)或其它细胞因子或细胞群组合的药物组合物施用。在具体实施方案中，本文考虑的药物组合物包含与一种或多种药学或生理学可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的一定量的遗传修饰的T细胞。

包含表达CAR的免疫效应细胞群(如T细胞)的药物组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。优选地，将本发明的组合物配制为肠胃外施用，例如血管内(静脉内或动脉内)施用、腹膜内施用或肌肉内施用。

液体药物组合物，无论其为溶液、悬液或其它类似形式，均可以包含下述中的一种或多种：无菌稀释剂，如用于注射的水、盐溶液(优选生理盐水)、林格氏液、等张氯化钠、固定油(如可作为溶剂或悬浮介质的合成的甘油单酯或甘油二酯)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张度的试剂，如氯化钠或右旋糖。可将肠胃外制备物装入由玻璃或塑料制得的安瓿、一次性注射器或多剂量瓶中。可注射的药物组合物优选是无菌的。

在具体实施方案中，本文考虑的组合物包含单独地或与一种或多种治疗剂组合的有效量的表达CAR的免疫效应细胞。因此，表达CAR的免疫效应细胞组合物可以单独施用或者与其它已知的癌症疗法联合施用，所述其它已知的癌症疗法如放疗、化疗、移植、免疫疗法、激素疗法、光动力疗法等。还可将组合物与抗生素组合施用。在本领域，可以接受此类治疗剂作为如本文所述的具体疾病状态(如具体的癌症)的标准疗法。考虑的示例性治疗剂包括细胞因子、生长因子、类固醇、NSAID、DMARD、抗炎剂、化疗剂、放疗剂、治疗性抗体或者其它活性剂和辅助剂。

在某些实施方案中，可将包含本文公开的表达CAR的免疫效应细胞的组合物与任何数目的化疗剂联合施用。化疗剂的示例性实例包括：烃化剂，如噻替哌和环磷酰胺(CYTOXAN^TM)；烃基磺酸酯，如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮杂环丙烷(aziridine)，如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺(ethylenimine)和甲基蜜胺类(methylamelamine)，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和trimethylolomelamine resume；氮芥类(nitrogen mustards)，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌二醇氮芥、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、氮芥氧化物盐酸盐、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、胆甾醇对苯乙酸氮芥(phenesterine)、泼尼氮芥、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosureas)，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，如阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡奇霉素、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、放线菌素D(dactinomycin)、道诺红菌素、地拖比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素、链脲佐菌素、杀结核菌素、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷、5-FU；雄激素，如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺类，如氨鲁米特、米托坦(mitotane)、曲洛斯坦；叶酸补充物，如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidamol)；硝氨丙吖啶；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸；2-乙酰肼；丙卡巴肼；雷佐生(razoxane)；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；尿烷；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫衫烷类，例如紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology、Princeton、N.J.)和多西紫衫醇(doxetaxel)(Rhne-Poulenc Rorer、Antony、France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本(navelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylomithine)(DMFO)；视黄酸衍生物，如Targretin^TM(蓓萨罗丁)、Panretin^TM(阿利维a酸)；ONTAK^TM(地尼白介素-2(denileukin diftitox))；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他滨；以及上述任一种的药学可接受的盐、酸或衍生物。该定义中还包含调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，如抗雌激素，包括例如他莫西芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑类、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、可莫昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通(Fareston))；以及抗雄激素，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及以上任一种的药学可接受的盐、酸或衍生物。

可将多种其它治疗剂与本文所述的组合物联合使用。在一个实施方案中，将包含表达CAR的免疫效应细胞的组合物与抗炎剂一同施用。抗炎剂或抗炎药包括但不限于：类固醇和糖皮质激素(包括倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松、醋酸氢化可的松、氢化可的松(hydrocortisone)、氢化可的松(hydrocortisone)、甲基泼尼松龙、泼尼松龙、泼尼松、曲安西龙)；非甾类抗炎药(NSAID)，包括阿司匹林、布洛芬、萘普生、甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、来氟米特、抗TNF药物、环磷酰胺以及麦考酚酯。

其它示例性NSAID选自布洛芬、萘普生、萘普生钠、Cox-2抑制剂(如(罗非昔布)和(塞来考昔))以及唾液酸化剂(sialylate)。示例性的镇痛药选自醋氨酚、羟考酮、盐酸丙氧吩的曲马朵(tramadol of proporxyphene hydrochloride)。示例性的糖皮质激素选自：可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、泼尼松龙或者泼尼松。示例性的生物应答调节剂包括针对细胞表面标志物(例如，CD4、CD5等)的分子、细胞因子抑制剂如TNF拮抗剂(例如依那西普阿达木单抗和英夫利昔单抗)、趋化因子抑制剂和粘附分子抑制剂。生物应答调节剂包括单克隆抗体以及重组形式的分子。示例性的DMARD包括咪唑硫嘌呤、环磷酰胺、环孢菌素、甲氨蝶呤、青霉胺、来氟米特、柳氮磺吡啶、羟氯喹、Gold(口服施用(金诺芬)和肌肉内施用)以及米诺环素。

适于与本文考虑的CAR修饰的T细胞组合的治疗性抗体的示例性实例包括但不限于：阿巴伏单抗(abagovomab)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿托珠单抗(afutuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿妥莫单抗(altumomab)、阿麦妥昔(amatuximab)、anatumomab、阿西莫单抗(arcitumomab)、巴维昔单抗(bavituximab)、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝伐单抗(bevacizumab)、比伐单抗(bivatuzumab)、兰妥莫单抗(blinatumomab)、本妥昔单抗(brentuximab)、坎妥珠单抗(cantuzumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、西妥昔单抗(cetuximab)、西他土珠(citatuzumab)、西妥木单抗(cixutumumab)、clivatuzumab、可那木单抗(conatumumab)、达雷木单抗(daratumumab)、卓齐妥单抗(drozitumab)、度利戈妥单抗(duligotumab)、杜昔妥单抗(dusigitumab)、地莫单抗(detumomab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达洛珠单抗(dalotuzumab)、依美昔单抗(ecromeximab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、恩司昔单抗(ensituximab)、厄妥索单抗(ertumaxomab)、伊瑞西珠(etaracizumab)、法勒珠单抗(farietuzumab)、ficlatuzumab、芬土木单抗(figitumumab)、弗兰托单抗(flanvotumab)、弗妥昔单抗(futuximab)、盖尼塔单抗(ganitumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、吉瑞妥昔单抗(girentuximab)、格莱木单抗(glembatumumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、伊戈伏单抗(igovomab)、英加妥珠单抗(imgatuzumab)、英达妥昔单抗(indatuximab)、奥英妥珠单抗(inotuzumab)、英妥木单抗(intetumumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、伊妥木单抗(iratumumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、来沙木单抗(lexatumumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、lorvotuzumab、鲁卡木单抗(lucatumumab)、马帕木单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、米拉图珠单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗(minretumomab)、米妥莫单抗(mitumomab)、moxetumomab、纳那妥单抗(narnatumab)、那妥莫单抗(naptumomab)、奈昔木单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、诺非单抗(nofetumomab)、ocaratuzumab、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉珠单抗(olaratumab)、奥纳珠单抗(onartuzumab)、莫奥珠单抗(oportuzumab)、奥戈伏单抗(oregovomab)、帕尼单抗(panitumumab)、巴萨妥珠单抗(parsatuzumab)、帕曲土单抗(patritumab)、pemtumomab、帕妥珠单抗(pertuzumab)、平妥单抗(pintumomab)、普托木单抗(pritumumab)、雷妥莫单抗(racotumomab)、雷得妥单抗(radretumab)、rilotumumab、利妥昔单抗(rituximab)、罗妥木单抗(robatumumab)、沙妥莫单抗(satumomab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、simtuzumab、索利托单抗(solitomab)、他珠单抗(tacatuzumab)、帕他莫单抗(taplitumomab)、替妥莫单抗(tenatumomab)、替妥木单抗(teprotumumab)、替加珠单抗(tigatuzumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、西莫白介素单抗(tucotuzumab)、乌妥昔单抗(ublituximab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、伏司妥珠单抗(vorsetuzumab)、伏妥莫单抗(votumumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、CC49以及3F8。

在某些实施方案中，将本文所述的组合物与细胞因子联合施用。本文使用的“细胞因子”意为这样的蛋白的通用术语：其由一种细胞群体释放，作为细胞间的介质作用于另一细胞。此类细胞因子的实例为淋巴因子、单核因子和常规的多肽类激素。所述细胞因子中包括：生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原(prorelaxin)；糖蛋白类激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体生成素(LH)；肝细胞生长因子(hepatic growth factor)；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和-β；缪勒管抑制物；鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；促血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素-α、β和-γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15；肿瘤坏死因子如TNFα或TNF-β；以及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。本文使用的术语细胞因子包括来自天然来源或者来自重组细胞培养物的蛋白，以及天然序列的细胞因子的生物活性等同物。

I.靶细胞和抗原

本发明部分考虑重定向至靶细胞(例如，肿瘤细胞或癌细胞)并包含CAR的遗传修饰的免疫效应细胞，所述CAR具有与细胞上的靶抗原结合的结合结构域。本文使用的术语“癌症”通常涉及异常细胞不受控制地分裂并且能够侵袭附近组织的一类疾病或病况。癌细胞也可通过血液和淋巴系统扩散至身体的其它部分。存在几种主要类型的癌症。恶性上皮肿瘤(Carcinoma)是开始于皮肤或者衬于或覆盖内脏器官的组织的癌症。肉瘤是开始于骨、软骨、脂肪、肌肉、血管或者其它结缔组织或支持性组织的癌症。白血病是开始于造血组织(如骨髓)，并引起大量异常的血细胞产生并进入血液的癌症。淋巴瘤和多发性骨髓瘤是开始于免疫系统的细胞的癌症。中枢神经系统癌症是开始于脑和脊髓的组织的癌症。

本文使用的术语“恶性的”指肿瘤细胞组显示出以下一种或多种的癌症：不受控制的生长(即超出正常限制的分裂)、侵袭(即侵入并破坏邻近组织)和转移(即经淋巴和血液扩散至身体的其它部位)。本文使用的术语“转移”指癌症从身体的一个部位至另一部位的扩散。由扩散的细胞形成的肿瘤被称为“转移瘤(metastatic tumor)”或“转移”。转移瘤包含与初始(原发性)肿瘤中的细胞相同的细胞。

本文使用的术语“良性”或“非恶性的”指可能变大但不扩散至身体的其它部位的肿瘤。良性肿瘤自我限制，并通常不侵袭或转移。

“癌细胞”或“肿瘤细胞”指癌性生长或癌性组织的单个细胞。肿瘤通常指由细胞的异常生长形成的肿胀或损伤，其可以是良性的、恶化前的或者是恶性的。大部分癌症形成肿瘤，但是某些(例如白血病)不一定形成肿瘤。对于那些形成肿瘤的癌症，术语癌症(癌细胞)和肿瘤(肿瘤细胞)可互换使用。个体中肿瘤的量指“肿瘤负荷”，其可被测量为肿瘤的数目、体积或者重量。

在一个实施方案中，靶细胞表达在其它正常(期望的)细胞的表面上基本上不存在的抗原，例如靶抗原。在一个实施方案中，靶细胞为胰腺实质细胞、胰管细胞、肝细胞(hepatic cell)、心肌细胞、骨骼肌细胞、成骨细胞、骨骼成肌细胞、神经元、血管内皮细胞、色素细胞、平滑肌细胞、神经胶质细胞、脂肪细胞(fat cell)、骨细胞、软骨细胞、胰岛细胞、CNS细胞、PNS细胞、肝细胞(liver cell)、脂肪细胞(adipose cell)、肾细胞、肺细胞、皮肤细胞、卵巢细胞、卵泡细胞、上皮细胞、免疫细胞或者内皮细胞。

在某些实施方案中，靶细胞是下述组织的一部分：胰腺组织、神经组织、心脏组织、骨髓、肌肉组织、骨组织、皮肤组织、肝组织、毛囊、血管组织、脂肪组织、肺组织以及肾组织。

在具体实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞。在另一具体实施方案中，靶细胞是癌细胞，如患有癌症的患者中的细胞。可用本公开的方法杀死的示例性的细胞包括下述肿瘤的细胞：液体瘤，如白血病，包括急性白血病(如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病以及成髓细胞白血病、早幼粒细胞白血病、粒单核细胞白血病、单核细胞白血病和红白血病)、慢性白血病(如慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病)；真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、重链疾病)。

在另一实施方案中，细胞为实体瘤细胞，所述实体瘤如肉瘤和恶性上皮肿瘤(carcinomas)、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、肺癌、结肠直肠癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌(例如胰腺、结肠、卵巢、肺、乳腺、胃、前列腺、宫颈或食道的腺癌)、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌(papillary adenocarcinomas)、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、子宫颈癌、睾丸瘤、膀胱癌、CNS肿瘤(如神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤(craniopharyogioma)、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、黑素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。

在一个实施方案中，癌症选自：如权利要求所述的方法1，其中所述癌症选自：维尔姆斯瘤、尤文肉瘤、神经内分泌肿瘤、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤、黑素瘤、皮肤癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、肺癌、胆管癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、头颈癌、甲状腺髓样癌、卵巢癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤以及膀胱癌。

在一个实施方案中，靶细胞为肝脏、胰腺、肺、乳腺、膀胱、脑、骨、甲状腺、肾、皮肤和造血系统的恶性细胞。在另一实施方案中，靶细胞为肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、脑癌、骨癌、甲状腺癌、肾癌、皮肤癌或者血液癌症(hematological cancer)中的细胞。

在一个实施方案中，靶抗原为下述的表位：α叶酸受体、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或者VEGFR2多肽。

J.治疗方法

本文考虑的遗传修饰的T细胞为多种肿瘤和癌症的治疗提供改善的过继性免疫疗法的方法。在具体实施方案中，通过用本文考虑的CAT对初始T细胞进行遗传修饰，使初始T细胞的特异性重定向至肿瘤细胞或癌细胞。在不同的实施方案中，使用病毒载体对免疫效应细胞进行遗传修饰，所述病毒载体包含含有MND启动子并编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含抗原特异性结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和一个或多个胞内共刺激信号转导结构域以及CD3ζ初级信号转导结构域，所述抗原特异性结合结构域与下述结合：α叶酸受体、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或VEGFR2多肽；所述跨膜结构域包含TM结构域以及将TM结构域与CAR的胞内信号转导结构域连接的短的寡肽或多肽接头，所述TM结构域来源于选自CD8α，CD4、CD45、PD1和CD152的多肽，所述接头的长度优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，；所述一个或多个胞内共刺激信号转导结构域选自CD28、CD134和CD137。

在一个实施方案中，本发明包括一种类型的细胞疗法，其中对T细胞进行遗传修饰，以表达靶向表达靶抗原的癌细胞的CAR，以及将CAR T细胞输注进需要的接受者。输注的细胞能够杀死接受者中的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，CAR T细胞能够在体内复制，产生可以导致持续的癌症治疗的长期持续性。

在一个实施方案中，本发明的CAR T细胞可以经历稳健的体内T细胞扩增，并且能够坚持延长的时间。在另一实施方案中，本发明的CAR T细胞发展为特异性记忆T细胞，其能够再活化以抑制任何其它肿瘤的形成或生长。

在具体实施方案中，将包含用载体进行遗传修饰的免疫效应细胞的组合物用于实体瘤或实体癌的治疗，所述载体包含与编码CAR的多核苷酸可操作地连接的MND启动子，所述实体瘤或实体癌包括但不限于：肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、脑癌、骨癌、甲状腺癌、肾癌或者皮肤癌。

在具体实施方案中，将包含用载体进行遗传修饰的免疫效应细胞的组合物用于胰腺癌的治疗，所述载体包含与编码CAR的多核苷酸可操作地连接的MND启动子，所述CAR包含与PSCA或MUC1的表位结合的抗原特异性结合结构域。

在具体实施方案中，将包含用载体进行遗传修饰的免疫效应细胞的组合物用于多形性胶质母细胞瘤的治疗，所述载体包含与编码CAR的多核苷酸可操作地连接的MND启动子，所述CAR包含与EPHA2、EGFRvIII或CSPG4的表位结合的抗原特异性结合结构域。

在具体实施方案中，将包含用载体进行遗传修饰的免疫效应细胞的组合物用于膀胱癌的治疗，所述载体包含与编码CAR的多核苷酸可操作地连接的MND启动子，所述CAR包含与PSCA或MUC1的表位结合的抗原特异性结合结构域。

在具体实施方案中，将包含用载体进行遗传修饰的免疫效应细胞的组合物用于肺癌的治疗，所述载体包含与编码CAR的多核苷酸可操作地连接的MND启动子，所述CAR包含与PSCA或GD2的表位结合的抗原特异性结合结构域。

在具体实施方案中，将包含用载体进行遗传修饰的免疫效应细胞的组合物用于乳腺癌(例如三阴乳腺癌)的治疗，所述载体包含与编码CAR的多核苷酸可操作地连接的MND启动子，所述CAR包含与CSPG4或HER2的表位结合的抗原特异性结合结构域。

在具体实施方案中，将包含用载体进行遗传修饰的免疫效应细胞的组合物用于黑素瘤的治疗，所述载体包含与编码CAR的多核苷酸可操作地连接的MND启动子，所述CAR包含与GD2或CSPG4的表位结合的抗原特异性结合结构域。

在具体实施方案中，将包含用载体进行遗传修饰的免疫效应细胞的组合物用于液体瘤的治疗，所述载体包含与编码CAR的多核苷酸可操作地连接的MND启动子，所述液体瘤包括但不限于白血病，包括急性白血病(例如ALL、AML以及成髓细胞白血病、前髓细胞性白血病、骨髓单核细胞白血病、单核细胞白血病和红白血病)、慢性白血病(例如CLL、SLL、CML、HCL)；真性红细胞增多症,、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、原发性巨球蛋白血症以及重链疾病。

在具体实施方案中，将包含用载体遗传修饰的免疫效应细胞的组合物用于B细胞恶性肿瘤的治疗，所述载体包含与编码CAR的多核苷酸可操作地连接的MND启动子，所述B细胞恶性肿瘤包括但不限于多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。

多发性骨髓瘤是B细胞的成熟浆细胞恶性肿瘤，其形态学特征为这些类型的细胞的单克隆的致瘤性转化。这些浆细胞在BM中增殖，并且可能侵袭邻近的骨，以及有时侵袭血液。多发性骨髓瘤的变体形式包括：明显的多发性骨髓瘤、冒烟型多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、非分泌型骨髓瘤、IgD骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、孤立性骨浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤(参见，例如Braunwald等(eds),Harrison’s Principles of Internal Medicine，第15版(McGraw-Hill 2001))。

非霍奇金淋巴瘤包含一大组淋巴细胞(白细胞)癌。非霍奇金淋巴瘤可以发生于任何年龄，并且通常具有淋巴结大于正常的淋巴结、发热和体重减轻的特点。存在许多不同类型的非霍奇金淋巴瘤。例如，非霍奇金淋巴瘤可以分为侵略型(生长快速)和懒惰型(生长缓慢)。尽管非霍奇金淋巴瘤可以来源于B细胞和T细胞，但是本文使用的术语“非霍奇金淋巴瘤”与“B细胞非霍奇金淋巴瘤”可互换使用。B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)包括：伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞型大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤以及套细胞淋巴瘤。在骨髓或干细胞移植之后发生的淋巴瘤通常为B细胞非霍奇金淋巴瘤。

慢性淋巴细胞白血病(CLL)为引起未成熟的白细胞(称为B淋巴细胞或B细胞)缓慢增加的懒惰型(生长缓慢)癌症。癌细胞经血液和骨髓扩散，并且也可影响淋巴结和诸如肝脏和脾脏的其它器官。CLL最终引起骨髓衰竭。有时，在疾病晚期，该疾病被称为小淋巴细胞淋巴瘤。

在具体实施方案中，提供方法，所述方法包括将治疗有效量的本文考虑的表达CAR的免疫效应细胞或者包含本文考虑的表达CAR的免疫效应细胞的组合物，单独或者与一种或多种治疗剂组合施用于需要的患者。在某些实施方案中，将本发明的细胞用于处于发展为癌症的风险的患者的治疗。因此，本发明提供治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向需要的对象施用治疗有效量的本发明的CAR修饰的T细胞。

本文使用的术语“个体”和“对象”通常可互换使用，并且指显示癌症症状的任何动物，所述癌症症状可用基因治疗载体、基于细胞的治疗剂和本文别处公开的方法进行治疗。合适的对象(例如，患者)包括实验室动物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物以及家养动物或宠物(如猫或狗)。包括非人的灵长类，并且优选人患者。典型的对象包括患有癌症、已确诊患有癌症或者处于患有癌症风险的人患者。

本文使用的术语“患者”指已确诊患有具体癌症的对象，所述癌症可用基因治疗载体、基于细胞的治疗剂和本文别处公开的方法进行治疗。

本文使用的“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括对疾病或病理病况的症状或病理的任何有益或期望的效果，并且甚至可以包括待治疗的疾病或病况(例如癌症)的一种或多种可测量的标志物的最低降低。治疗可以任选地包括疾病或病况的症状的减轻或缓解，或者疾病或病况的进展的延迟。“治疗”不一定指疾病或病况或者其相关症状的完全根除或治愈。

本文使用的“预防(prevent)”和类似的词(如“预防(prevented)”、“预防(preventing)”等)指用于预防、抑制或降低疾病或病况(例如，癌症)发生或复发的可能性的方法。其也指延迟疾病或病况的发作或复发或者延迟疾病或病况的症状的发生或复发。如本文所使用的，“预防”及类似的词也包括在疾病或病况发作或复发之前，降低疾病或病况的强度、影响、症状和/或负担。

“增强”或“促进”或者“增加”或“扩展”通常指，与由媒介物或对照分子/组合物引起的应答相比，本文考虑的组合物(例如编码CAR的遗传修饰的T细胞或载体)产生、引发或引起更强的生理性应答(即下游效应)的能力。除了从本领域的理解和本文的描述显而易见的之外，可测量的生理性应答可以包括T细胞扩增、活化、持续性的增加和/或杀死癌细胞的能力的增加。“增加的”或“提高的”量通常为“统计学显著的”量，并且可以包含由媒介物或对照组合物产生的应答的1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或者更多倍(例如500倍、1000倍)(包括其间且超过1的所有整数和小数，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加。

“降低(decrease)”或“减低(lower)”或者“变少(lessen)”或“减少(reduce)”或者“减弱(abate)”通常指，与由媒介物或对照分子/组合物引起的应答相比，本文考虑的组合物产生、引发或引起较小的生理性应答(即，下游效应)的能力。“降低”或“减少的”量通常为“统计学显著的”量，并且可以包含由媒介物、对照组合物产生的应答(参照应答)或者特定细胞系中的应答的1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或者更多倍(例如500倍、1000倍)(包括其间且超过1的所有整数和小数，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的降低。

“维持(maintain)”或“保持(preserve)”或“维持(maintenance)”或“无变化(no change)”或“无实质变化(no substantial change)”或“无实质减少(no substantial decrease)”通常指，与由媒介物、对照分子/组合物引起的应答或者与特定细胞系中的应答相比，本文考虑的组合物在细胞中产生、引发或者引起较小的生理性应答(即，下游效应)的能力。可比较的应答是与参照应答显著不同或者明显不同的应答。

在一个实施方案中，治疗需要的对象中的癌症的方法包括施用有效量(例如治疗有效量)的组合物，所述组合物包含本文考虑的遗传修饰的免疫效应细胞。施用的量和频率将由诸如患者的情况、患者疾病的类型和严重性的因素决定，但是适当的剂量可由临床试验确定。

在某些实施方案中，下述是可取的：向对象施用活化的T细胞，然后随后再次抽血(或者实施清血法)，根据本发明，活化由此得到的T细胞，以及使患者再输注这些活化并扩增的T细胞。可以每隔几周多次实施该过程。在某些实施方案中，使来自10cc至400cc血液抽取物的T细胞活化。在某些实施方案中，使来自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、100cc、150cc、200cc、250cc、300cc、350cc或者400cc或者更多血液抽取物的T细胞活化。未受理论束缚，可以使用该多次抽血/多次再输注方案来选出某些T细胞群体。

可以以任何方便的方式进行本文考虑的组合物的施用，包括通过气雾剂吸入、注射、摄取、输液、植入或者移植的方式。在优选实施方案中，肠胃外施用组合物。本文使用的短语“肠胃外施用(parenteral administration)”和“肠胃外施用(administered parenterally)”指不同于肠内和局部施用的施用模式，通常通过注射施用，并且包括但不限于：血管内注射、静脉内注射、肌肉内注射、动脉内注射、鞘内注射、囊内注射、眶内注射、瘤内注射、心脏内注射、真皮内注射、腹膜内注射、经气管注射、皮下注射、表皮下注射、关节内注射、囊下注射、蛛网膜下注射、脊柱内注射和胸骨内注射以及输注。在一个实施方案中，本文考虑的组合物通过直接注射至肿瘤、淋巴结或者感染部位而被施用至对象。

在一个实施方案中，向需要的对象施用有效量的组合物，以增加针对对象中的癌症的细胞免疫应答。免疫应答可以包括由能够杀死感染的细胞的细胞毒性T细胞、调节性T细胞以及辅助性T细胞所介导的细胞免疫应答。也可诱导主要由能够活化B细胞从而导致抗体产生的辅助性T细胞介导的体液免疫应答。可将多种技术用于分析由本发明的组合物诱导的免疫应答的类型，其在本领域被充分描述：例如，由John E.Coligan,Ada M.Kruisbeek,David H.Margulies,Ethan M.Shevach,Warren Strober编辑的Current Protocols in Immunology，(2001)John Wiley&Sons,NY,N.Y。

在T细胞介导的死亡的情况下，CAR配体的结合起始CAR至T细胞的信号转导，导致多种T细胞信号通路的激活，所述信号通路诱导T细胞产生或者释放能够通过多种机制诱导靶细胞凋亡的蛋白。这些T细胞介导的机制包括(但不限于)胞内细胞毒性颗粒从T细胞至靶细胞的转移、T细胞分泌能够直接诱导(或者经其它杀伤效应细胞的募集间接诱导)杀死靶细胞的促炎性细胞因子以及T细胞表面上的死亡受体配体(例如FasL)的上调，所述死亡受体配体在与靶细胞上的其同源死亡受体(例如Fas)结合之后诱导靶细胞的凋亡。

在一个实施方案中，本发明提供治疗确诊患有癌症的对象的方法，所述方法包括从所述对象中移出免疫效应细胞，用包含编码如本文所考虑的CAR的核酸的载体对所述免疫效应细胞进行遗传修饰，从而产生修饰的免疫效应细胞群体，以及将所述修饰的免疫效应细胞群体施用于同一对象。在优选实施方案中，免疫效应细胞包含T细胞。

在某些实施方案中，本发明还提供针对对象中的靶细胞群体刺激免疫效应细胞介导的免疫调节物应答(immune modulator response)的方法，所述方法包括向对象施用表达核酸构建体的免疫效应细胞群体的步骤，所述核酸构建体编码CAR分子。

施用本文所述的细胞组合物的方法包括有效导致离体遗传修饰的免疫效应细胞再引入或者遗传修饰的免疫效应细胞的祖细胞再引入的任何方法，所述遗传修饰的免疫效应细胞在对象中直接表达本发明的CAR，所述遗传修饰的免疫效应细胞的祖细胞被引入对象时分化为表达CAR的成熟的免疫效应细胞。一种方法包括用根据本发明的核酸构建体离体转导外周血T细胞，并使转导的细胞返回至所述对象。

在某些实施方案中，α叶酸受体、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或VEGFR2的多核苷酸、多肽、多肽片段或其抗体是伴随诊断方法的一部分，通常以评估对象或对象群体是否会有利地响应具体的医学治疗。

本文使用的术语“伴随诊断(companion diagnostic)”指与特定的CAR或遗传修饰的免疫效应细胞疗法相关的诊断测试。在具体实施方案中，诊断方法和试剂盒包括生物样本中下述的表达水平的测定：α叶酸受体、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、

HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、

HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或VEGFR2的多肽或多核苷酸，从而允许快速鉴定适于根据本发明进行治疗的患者。

例如，基于对象是否具有给定的疾病或病况的一种或多种选择的生物标志物，可将给定的癌症治疗剂(例如，CAR或者表达本文考虑的CAR的遗传修饰的免疫效应细胞)鉴定为适于对象或者某对象群体。生物标志物的实例包括血清/组织标志物以及可以通过医学成像技术鉴定的标志物。在某些实施方案中，α叶酸受体、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或VEGFR2的多肽片段(或其相应的多核苷酸)本身可以提供血清和/或组织标志物，其可被用来测量药物结果或者评估在特定对象或特定对象群体中药物使用的可取性。在某些方面，鉴定表达α叶酸受体、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或VEGFR2多肽或多核苷酸参照序列的治疗指示可以包括如本文所述及本领域已知的，无论是在所选对象、所选组织还是别处，表征所述序列的差异表达。

在具体实施方案中，本文考虑的方法包括测量或定量对象的癌症中下述的pre-mRNA、mRNA或蛋白表达的水平：α叶酸受体、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或VEGFR2多肽。在一个实施方案中，如果生物样本中标志物的表达高于对照样本中标志物的表达或者已知标准的10倍、25倍、50倍、100倍或者1000倍，则将对象鉴定为患有可用本文考虑的组合物进行治疗的特定癌症。在具体实施方案中，如果生物样本中生物标志物的表达是可检测的，并且所述标志物的表达低于使用相同方法检测的对照样本中的水平或者已知标准，则将对象鉴定为具有可治疗的指示。

可以通过例如，组织化学技术、免疫学技术、电泳、蛋白质印迹分析、FACS分析、流式细胞术等来分析可能的癌症中生物标志物蛋白表达的存在、不存在或者相对水平。此外，可以例如使用PCR技术、Northern印迹分析、合适的寡核苷酸探针的使用等来检测生物标志物RNA表达的存在、不存在或者相对水平。

将本说明书中引用的所有出版物、专利申请和授权专利通过引用并入本文，如同明确且单独地指示将各单独的出版物、专利申请或者授权专利通过引用并入。

尽管出于清楚理解的目的，通过示例和实例的方式一定程度上详细地描述了上述发明，但是鉴于本发明的教导，在不脱离所附的权利要求的精神或范围的情况下，可对本发明作出某些改变和修改，这对于本领域技术人员将是显而易见的。仅通过示例性的方式且不通过限制性的方式提供下述实施例。本领域技术人员将容易地识别出可被改变或修改以得到基本上类似结果的多个非关键参数。

实施例

实施例1

CAR的构建

1.CD19特异性CAR(pMND-CD19 CAR)

设计CD19特异性CAR，以包含与以下可操作地连接的MND启动子：抗CD19 scFv，来自CD8α的铰链结构域和跨膜结构域以及CD137共刺激结构域，然后是CD3ζ链的胞内信号转导结构域。图1A。CD19 CAR包含CD8α信号肽(SP)序列，以在免疫效应细胞的表面表达。pMND-CD19CAR的多核苷酸序列在SEQ ID NO：2中示出，以及载体图谱显示于图2中。表3显示了pMND-CD19 CAR慢病毒载体的各核苷酸片段的身份(Identity)、Genbank参考、来源名称和引用。

表3.

2.κ轻链(κ_LC)特异性CAR(pMND-κCAR)

设计κ轻链特异性CAR，以包含与以下可操作地连接的MND启动子：抗κ轻链scFv、来自CD8α的铰链和跨膜结构域以及CD137共刺激结构域，然后是CD3ζ链的胞内信号转导结构域。图1B。κ_LC CAR包含CD8α信号肽(SP)序列，以在免疫效应细胞的表面表达。pMND-κ_LC CAR的多核苷酸序列在SEQ ID NO:3中示出，以及载体图谱显示于图3中。表4显示了pMND-κ轻链CAR慢病毒载体的各核苷酸片段的身份、Genbank参考、来源名称和引用。

表4.

实施例2

T细胞转导

如文献(Naldini等，1996,Dull等，1998以及Zufferey等，1998)中所述，在HEK 293T细胞中产生慢病毒载体(LV)的上清液。如PCT公开第WO2012/170911号中所述，进行5-质粒(编码HIV gag-pol的HPV 275、编码VSV-G包膜蛋白的ψN 15、编码HIV rev蛋白的p633、编码HIV tat蛋白的HPV601以及CAR表达载体)的瞬时转染。然后将LV上清液通过超速离心或者离子交换柱浓缩，随后进行切向流过滤(TFF)，配制进SCGM(CellGenix Inc.,DE)培养基，并在<-70℃下于一次性冷冻管中低温保藏。通过对转导的人骨肉瘤(HOS)细胞进行流式细胞术分析测定感染滴度(Kutner等，2009,Nature Protocols 4:495-505)。对于人T淋巴细胞的转导，从健康志愿者供体分离初始人T细胞，随后利用RosetteSep试剂盒(Stem Cell Technologies)通过阴性选择进行白细胞去除。在补充有10％FCS、100U/ml青霉素、100g/ml硫酸链霉素、10mM Hepes的RPMI 1640中培养T细胞，并以1:3的细胞与珠子比，用包被有抗CD3/抗CD28抗体的磁珠进行刺激。对于CD8T细胞，每隔一天添加人IL-2(Chiron)至30IU/ml的终浓度。在活化后大约24h，以5的MOI用慢病毒载体转导T细胞。通过聚合酶链式反应，利用病毒载体特异性的引物以及在转导之后7至10天通过流式细胞术评估细胞的转导。

实施例3

CAR转导的T细胞的VCN

测定用pMND-κ_LC CAR慢病毒转导的初始人T细胞的载体拷贝数。从正常的供体获得外周血单核细胞(PBMC)，以及在包含IL-2(CellGenix)的培养基中通过用CD3和CD28特异性的抗体(Miltenyi Biotec)培养而进行活化。活化之后，用慢病毒载体转导PBMC培养物或者不处理。维持培养以允许T细胞的生长(outgrowth)和扩增(7-10天)。在收获时，培养物包含已扩增大约2个log的T细胞。

在转导后9天，通过q-PCR测定整合的慢病毒颗粒的载体拷贝数(VCN)。来自6个供体的12个单一培养物的平均VCN为3.1。图4。

实施例4

转导的T细胞中CAR的表达

测定由MND启动子(pMND-κ_LC CAR)在初始人T细胞上表达的κ特异性嵌合抗原受体的细胞表面表达。从正常供体中获得外周血单核细胞(PBMC)，以及在包含IL-2(CellGenix)的培养基中通过用CD3和CD28特异性抗体(Miltenyi Biotec)培养进行活化。活化之后，用慢病毒载体转导PBMC培养物或者不处理。维持培养以允许T细胞的生长(outgrowth)和扩增(7-10天)。在收获时，培养物包含已扩增大约2个log的T细胞。

通过流式细胞术，利用对小鼠Ig具有特异性的抗体(BD Biosciences)，测定仅存在于pMND-κ_LC CAR修饰的T细胞上的κ_LC的表达。在转导之后6至9天进行流式细胞术。来自6个供体的12个单一培养物中κ_LC的平均表达水平为35.6％。图5。

实施例5

MND启动子驱使CAR在T细胞中的表达可与EF1α启动子相比

驱使CD19 CAR在修饰的T细胞上表达的MND启动子与驱使CD19 CAR表达的EF1α启动子可比较。从正常供体获得外周血单核细胞(PBMC)，以及在包含IL-2(CellGenix)的培养基中通过用CD3和CD28特异性抗体(Miltenyi Biotec)培养进行活化。活化之后，用慢病毒载体转导PBMC培养物，或者不处理。维持培养以允许T细胞的生长(outgrowth)和扩增(7-10天)。在收获时，培养物包含已扩增大约2个log的T细胞。在培养结束时，通过定量聚合酶链式反应(qPCR)，利用对病毒颗粒具有特异性的引物来分析T细胞的转导。在转导之后6天，通过流式细胞术，利用对小鼠Ig具有特异性的抗体(BD Biosciences)测定仅存在于CD19CAR修饰的T细胞上的CD19 CAR的表达。不同构建体中CD19 CAR的表达和VCN均是可比较的。图6。

实施例6

CAR T细胞的抗原特异性反应

测定pMNDκ_LC CAR T细胞的抗原特异性反应。从正常供体获得外周血单核细胞(PBMC)，以及在包含IL-2(CellGenix)的培养基中通过用CD3和CD28特异性抗体(Miltenyi Biotec)培养进行活化。活化之后，用慢病毒载体转导PBMC培养物，或者不处理。维持培养物，以允许T细胞的生长(outgrowth)和扩增(7-10天)。在收获时，培养物包含已扩增大约2个log的T细胞。

在培养结束时，利用干扰素γ(IFNγ)的释放来分析肿瘤反应性。在与κ⁺Daudi细胞(表达κ_LC)共培养之后，用pMND-κ_LC CAR修饰的T细胞分泌IFNγ。相比之下，将用pMND-κ_LCCAR修饰的T细胞与κ阴性HDLM-2细胞共培养，导致IFNγ的释放与单独培养T细胞时观察到的量可比较。在与κ阳性Daudi细胞或者κ阴性HDLM-2细胞共培养24小时之后，利用ELISA试剂盒测定IFNγ的释放。图7。

实施例7

CAR T细胞的抗肿瘤功能

测定被工程化以表达pMND-κ_LC CAR的CAR T细胞的抗肿瘤功能。从正常供体获得外周血单核细胞(PBMC)，以及在包含IL-2(CellGenix)的培养基中通过用CD3和CD28特异性抗体(Miltenyi Biotec)培养进行活化。活化之后，用慢病毒载体转导PBMC培养物，或者不处理。维持培养，以允许T细胞的生长(outgrowth)和扩增(7-10天)。在收获时，培养物包含已扩增大约2个log的T细胞。

通过静脉内注射，在NOD scid IL-2受体γ链敲除的小鼠(NSG)中建立2×10⁶个用萤火虫荧光素酶基因标记的Daudi细胞。在将肿瘤细胞注射进小鼠之后3天、6天和9天，将1×10⁷个pMND-κ_LC CAR修饰的T细胞过继性地转移至小鼠，并通过生物发光，利用Xenogen-IVIS成像系统监测肿瘤的生长。与未处理的小鼠中的肿瘤负荷相比，施用了修饰的CAR T细胞的小鼠中，肿瘤负荷降低。图8。

实施例8

功能性CAR T药品的产生

如以上实施例1中所述，制备表达抗BCMA的CAR T细胞。这些CAR T细胞显示抗原特异性肿瘤的清除。将表达抗BCMA的CAR T细胞与K562细胞或被修饰以表达BCMA的K562细胞共培养4小时。用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记表达抗原的肿瘤细胞，并通过FACS测量荧光。表达BCMA的CAR T细胞杀死表达BCMA的K562细胞(图9A)，并释放IFN-γ(图9B)。(n＝3)。

一般而言，在下述权利要求中，使用的术语不应被解释为将权利要求限于说明书和权利要求书中公开的具体实施方案，而应被解释为包括所有可能的实施方案以及此权利要求所授权的等同物的全部范围。因此，权利要求不受本公开的限制。

序列表

<110> 蓝鸟生物公司

<120> MND启动子嵌合抗原受体

<130> BLBD-027/01WO

<150> US 61/984,561

<151> 2014-04-25

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 骨髓增生性肉瘤病毒增强子负调控区域缺失的dl587rev引物结合位点取代的(MND)增强子的多核苷酸序列

<400> 1

tttatttagt ctccagaaaa aggggggaat gaaagacccc acctgtaggt ttggcaagct 60

aggatcaagg ttaggaacag agagacagca gaatatgggc caaacaggat atctgtggta 120

agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagttggaa cagcagaata tgggccaaac 180

aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga tggtccccag 240

atgcggtccc gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg gtgccccaag 300

gacctgaaat gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc tcgcttctgt 360

tcgcgcgctt ctgctccccg agctcaataa aagagccca 399

<210> 2

<211> 7425

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MND启动子抗CD19 CAR构建体的多核苷酸序列

<400> 2

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatcatat gccagcctat ggtgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat 240

tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 300

tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 360

tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 420

aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 480

caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 540

tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca 600

gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat 660

tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 720

caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 780

cagagctcgt ttagtgaacc gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct 840

ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgctcaaag 900

tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt 960

cagtgtggaa aatctctagc agtggcgccc gaacagggac ttgaaagcga aagtaaagcc 1020

agaggagatc tctcgacgca ggactcggct tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg 1080

gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt gactagcgga ggctagaagg agagagtagg 1140

gtgcgagagc gtcggtatta agcgggggag aattagataa atgggaaaaa attcggttaa 1200

ggccaggggg aaagaaacaa tataaactaa aacatatagt tagggcaagc agggagctag 1260

aacgattcgc agttaatcct ggccttttag agacatcaga aggctgtaga caaatactgg 1320

gacagctaca accatccctt cagacaggat cagaagaact tagatcatta tataatacaa 1380

tagcagtcct ctattgtgtg catcaaagga tagatgtaaa agacaccaag gaagccttag 1440

ataagataga ggaagagcaa aacaaaagta agaaaaaggc acagcaagca gcagctgaca 1500

caggaaacaa cagccaggtc agccaaaatt accctatagt gcagaacctc caggggcaaa 1560

tggtacatca ggccatatca cctagaactt taaattaaga cagcagtaca aatggcagta 1620

ttcatccaca attttaaaag aaaagggggg attggggggt acagtgcagg ggaaagaata 1680

gtagacataa tagcaacaga catacaaact aaagaattac aaaaacaaat tacaaaaatt 1740

caaaattttc gggtttatta cagggacagc agagatccag tttggaaagg accagcaaag 1800

ctcctctgga aaggtgaagg ggcagtagta atacaagata atagtgacat aaaagtagtg 1860

ccaagaagaa aagcaaagat catcagggat tatggaaaac agatggcagg tgatgattgt 1920

gtggcaagta gacaggatga ggattaacac atggaaaaga ttagtaaaac accatagctc 1980

tagagcgatc ccgatcttca gacctggagg aggagatatg agggacaatt ggagaagtga 2040

attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca ccaaggcaaa 2100

gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt tccttgggtt 2160

cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg tacaggccag 2220

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acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa gaatcctggc 2340

tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct ctggaaaact 2400

catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc tggaacagat 2460

ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca caagcttggt 2520

aggtttaaga atagtttttg ctgtactttc tatagtgaat agagttaggc agggatattc 2580

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agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt cgattagtga acggatccat 2700

cgattagtcc aatttgttaa agacaggata tcagtggtcc aggctctagt tttgactcaa 2760

caatatcacc agctgaagcc tatagagtac gagccataga tagaataaaa gattttattt 2820

agtctccaga aaaagggggg aatgaaagac cccacctgta ggtttggcaa gctaggatca 2880

aggttaggaa cagagagaca gcagaatatg ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt 2940

cctgccccgg ctcagggcca agaacagttg gaacagcaga atatgggcca aacaggatat 3000

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cccgccctca gcagtttcta gagaaccatc agatgtttcc agggtgcccc aaggacctga 3120

aatgaccctg tgccttattt gaactaacca atcagttcgc ttctcgcttc tgttcgcgcg 3180

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agccaccatg gccttaccag tgaccgcctt gctcctgccg ctggccttgc tgctccacgc 3300

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cagagtcacc atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca 3420

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cctggagcaa gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac 3600

gttcggaggg gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctccggcg gtggtgggtc 3660

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ctggattcgc cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga 3840

aaccacatac tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa 3900

gagccaagtt ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg 3960

tgccaaacat tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggtc aaggaacctc 4020

ggtcaccgtc tcctcaacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat 4080

cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt 4140

gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac 4200

ttgtggggtc cttctcctgt cactggtgat caccctttac tgcaaacggg gcagaaagaa 4260

actcctgtat atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga 4320

tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt 4380

cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct 4440

caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga 4500

gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa 4560

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ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct 4680

tcacatgcag gccctgcccc ctcgctaatg acaggtacct ttaagaccaa tgacttacaa 4740

ggcagctgta gatcttagcc actttttaaa agaaaagggg ggactggaag ggctaattca 4800

ctcccaaaga agacaagatc tgctttttgc ctgtactggg tctctctggt tagaccagat 4860

ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc aataaagctt 4920

gccttgagtg cttcaatgtg tgtgttggtt ttttgtgtgt cgaaattcta gcgattctag 4980

cttggcgtac cagcctatgg cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa 5040

gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact 5100

gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 5160

ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 5220

ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 5280

cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 5340

gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 5400

tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 5460

ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 5520

atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag 5580

gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 5640

tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 5700

cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 5760

cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt 5820

tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 5880

cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 5940

cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 6000

gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 6060

gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 6120

gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 6180

ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 6240

atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 6300

agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 6360

ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 6420

tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 6480

ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 6540

caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt 6600

gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 6660

atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg 6720

accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt 6780

aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 6840

gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac 6900

tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 6960

aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat 7020

ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca 7080

aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gggactagct ttttgcaaaa 7140

gcctaggcct ccaaaaaagc ctcctcacta cttctggaat agctcagagg ccgaggcggc 7200

ctcggcctct gcataaataa aaaaaattag tcagccatgg ggcggagaat gggcggaact 7260

gggcggagtt aggggcggga tgggcggagt taggggcggg actatggttg ctgactaatt 7320

gagatgagct tgcatgccga cattgattat tgactagtcc ctaagaaacc attcttatca 7380

tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtc 7425

<210> 3

<211> 7450

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MND启动子抗κ轻链CAR构建体的多核苷酸序列

<400> 3

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatcatat gccagcctat ggtgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat 240

tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 300

tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 360

tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 420

aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 480

caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 540

tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca 600

gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat 660

tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 720

caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 780

cagagctcgt ttagtgaacc gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct 840

ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgctcaaag 900

tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt 960

cagtgtggaa aatctctagc agtggcgccc gaacagggac ttgaaagcga aagtaaagcc 1020

agaggagatc tctcgacgca ggactcggct tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg 1080

gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt gactagcgga ggctagaagg agagagtagg 1140

gtgcgagagc gtcggtatta agcgggggag aattagataa atgggaaaaa attcggttaa 1200

ggccaggggg aaagaaacaa tataaactaa aacatatagt tagggcaagc agggagctag 1260

aacgattcgc agttaatcct ggccttttag agacatcaga aggctgtaga caaatactgg 1320

gacagctaca accatccctt cagacaggat cagaagaact tagatcatta tataatacaa 1380

tagcagtcct ctattgtgtg catcaaagga tagatgtaaa agacaccaag gaagccttag 1440

ataagataga ggaagagcaa aacaaaagta agaaaaaggc acagcaagca gcagctgaca 1500

caggaaacaa cagccaggtc agccaaaatt accctatagt gcagaacctc caggggcaaa 1560

tggtacatca ggccatatca cctagaactt taaattaaga cagcagtaca aatggcagta 1620

ttcatccaca attttaaaag aaaagggggg attggggggt acagtgcagg ggaaagaata 1680

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gtggcaagta gacaggatga ggattaacac atggaaaaga ttagtaaaac accatagctc 1980

tagagcgatc ccgatcttca gacctggagg aggagatatg agggacaatt ggagaagtga 2040

attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca ccaaggcaaa 2100

gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt tccttgggtt 2160

cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg tacaggccag 2220

acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta ttgaggcgca 2280

acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa gaatcctggc 2340

tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct ctggaaaact 2400

catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc tggaacagat 2460

ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca caagcttggt 2520

aggtttaaga atagtttttg ctgtactttc tatagtgaat agagttaggc agggatattc 2580

accattatcg tttcagaccc acctcccaac cccgagggga cccgacaggc ccgaaggaat 2640

agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt cgattagtga acggatccat 2700

cgattagtcc aatttgttaa agacaggata tcagtggtcc aggctctagt tttgactcaa 2760

caatatcacc agctgaagcc tatagagtac gagccataga tagaataaaa gattttattt 2820

agtctccaga aaaagggggg aatgaaagac cccacctgta ggtttggcaa gctaggatca 2880

aggttaggaa cagagagaca gcagaatatg ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt 2940

cctgccccgg ctcagggcca agaacagttg gaacagcaga atatgggcca aacaggatat 3000

ctgtggtaag cagttcctgc cccggctcag ggccaagaac agatggtccc cagatgcggt 3060

cccgccctca gcagtttcta gagaaccatc agatgtttcc agggtgcccc aaggacctga 3120

aatgaccctg tgccttattt gaactaacca atcagttcgc ttctcgcttc tgttcgcgcg 3180

cttctgctcc ccgagctcaa taaaagagcc cacaacccct cactcggcgc gacgcgttag 3240

ccaccatgga gtttgggctg agctggcttt ttcttgtggc tattttaaaa ggtgtccagt 3300

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ccatctcttg cagatctagt cagagcattt tacatagtac tggagacacc tatttagaat 3420

ggtacctgca gaaaccaggc cagtctccaa agctcctgat caacaaagtt tccaatcgat 3480

tgtctggggt cccagacagg ttcagtggca gtggatcagg gacagatttc acactcaaga 3540

tcagcagagt ggaggctgag gatctgggag tttattactg ctttcaaggt tcacatgttc 3600

cgtggacgtt cggtggaggc accaagctgg aaatcaaacg ggctgatgct gcaccaactg 3660

tatccatctt cccaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc ggcggatcac 3720

aggtgaagct tcagcagtca ggacctagcc tggtgaagcc tggggcttca gtgaagatgt 3780

cctgcaaggc ttctggatac accttcactg acttctacat gaagtgggtg aagcagagcc 3840

atggaaagag ccttgagtgg attggagata ttaatcctaa cattggtgat actttctaca 3900

accagaaatt caagggcaag gccacattga ctgtcgacaa atcctccagc acagcctaca 3960

tgcagctcaa cagcctgaca tctgaggact ctgcagtcta tttctgttca gttgggtact 4020

tcgatgtctg gggcgcaggg accacggtca ccgtctcctc aaccacgacg ccagcgccgc 4080

gaccaccaac accggcgccc accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt 4140

gccggccagc ggcggggggc gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct 4200

acatctgggc gcccttggcc gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gtgatcaccc 4260

tttactgcaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac 4320

cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag 4380

gaggatgtga actgagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg 4440

gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg 4500

acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg 4560

aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga 4620

tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag 4680

ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc taatgacagg 4740

tacctttaag accaatgact tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa 4800

aggggggact ggaagggcta attcactccc aaagaagaca agatctgctt tttgcctgta 4860

ctgggtctct ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc 4920

cactgcttaa gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca atgtgtgtgt tggttttttg 4980

tgtgtcgaaa ttctagcgat tctagcttgg cgtaccagcc tatggcgctc acaattccac 5040

acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac 5100

tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc 5160

tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg 5220

cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 5280

actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 5340

gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 5400

ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 5460

acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 5520

ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 5580

cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 5640

tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 5700

gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 5760

ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 5820

acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 5880

gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 5940

ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 6000

tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 6060

gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 6120

tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 6180

ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga 6240

taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc 6300

cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca 6360

gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta 6420

gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg 6480

tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc 6540

gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg 6600

ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt 6660

ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt 6720

cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata 6780

ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc 6840

gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac 6900

ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa 6960

ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct 7020

tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 7080

ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 7140

cacctgggac tagctttttg caaaagccta ggcctccaaa aaagcctcct cactacttct 7200

ggaatagctc agaggccgag gcggcctcgg cctctgcata aataaaaaaa attagtcagc 7260

catggggcgg agaatgggcg gaactgggcg gagttagggg cgggatgggc ggagttaggg 7320

gcgggactat ggttgctgac taattgagat gagcttgcat gccgacattg attattgact 7380

agtccctaag aaaccattct tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg 7440

ccctttcgtc 7450

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性肽接头

<400> 4

Asp Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性肽接头

<400> 5

Thr Gly Glu Lys Pro

1 5

<210> 6

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性肽接头

<400> 6

Gly Gly Arg Arg

1

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性肽接头

<400> 7

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 8

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性肽接头

<400> 8

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp

1 5 10

<210> 9

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性肽接头

<400> 9

Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser

1 5 10 15

Leu Asp

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性肽接头

<400> 10

Gly Gly Arg Arg Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性肽接头

<400> 11

Leu Arg Gln Arg Asp Gly Glu Arg Pro

1 5

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性肽接头

<400> 12

Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro

1 5 10

<210> 13

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性肽接头

<400> 13

Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro

1 5 10 15

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多肽切割序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = 任何氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = 任何氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa 位Gly或Ser

<400> 14

Glu Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa

1 5

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多肽切割序列

<400> 15

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

1 5

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多肽切割序列

<400> 16

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser

1 5

<210> 17

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的自我切割多肽

<400> 17

Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 18

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的自我切割多肽

<400> 18

Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 19

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的自我切割多肽

<400> 19

Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

1 5 10

<210> 20

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的自我切割多肽

<400> 20

Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly

1 5 10 15

Pro

<210> 21

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的自我切割多肽

<400> 21

Gln Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 22

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的自我切割多肽

<400> 22

Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly

1 5 10 15

Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20

<210> 23

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的自我切割多肽

<400> 23

Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro

1 5 10 15

Arg Pro Leu Leu Ala Ile His Pro Thr Glu Ala Arg His Lys Gln Lys

20 25 30

Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr

35 40

<210> 24

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的自我切割多肽

<400> 24

Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 25

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的自我切割多肽

<400> 25

Leu Leu Ala Ile His Pro Thr Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val

1 5 10 15

Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly

20 25 30

Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

35 40

<210> 26

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的自我切割多肽

<400> 26

Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu

1 5 10 15

Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly

20 25 30

Pro

<210> 27

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 共有的Kozak序列

<400> 27

gccrccatgg 10