用于高水平表达的新型启动子的制作方法

文档序号：12285346阅读：248来源：国知局

本申请参考2014年6月18日提交并如期分配申请号10201403371T的新加坡专利申请并要求该专利申请的优先权权益。于2014年6月18日提交的所述申请的内容出于所有目的以引用方式并入本文，包括将其说明书、权利要求书或附图未在本文包含的但根据PCT细则4.18在PCT细则20.5(a)中提到的任何要素或部分并入本文。

技术领域

本发明涉及能够在诸如基因疗法和重组蛋白表达的体外和体内应用中驱动强烈且持续的异源基因表达的重组启动子变体领域。

背景技术：

强启动子是高水平的重组蛋白制备所需的，以便提供大量的所需重组蛋白，从而允许用于多种多样的可能用途，包括工业过程、诊断和疾病治疗。

用于重组蛋白制备的典型启动子包含启动子元件、立即上游增强子和如果需要的其他顺式作用调控元件。任选地，发挥协同作用以增强转录活性的转录因子被特定的序列基序募集到相应位点。

通过改善转录以及通过防止启动子沉默来提高重组蛋白表达对于优化产量是可取的。为了能够提供功能性蛋白，通常在哺乳动物细胞系中表达哺乳动物蛋白，因为这些蛋白可确保所需的翻译后修饰，诸如“天然”哺乳动物糖基化模式和分子折叠步骤。因此，哺乳动物细胞是制备临床相关重组蛋白的重要宿主。最广泛用于此目的的方法是建立具有稳定整合在其基因组中的主动表达重组基因的细胞系。或者，可在有限的时间段内在不要求重组基因整合的情况下在细胞中短暂制备蛋白。

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是供大规模商业制备治疗性蛋白的最常使用的哺乳动物宿主。第一个CHO细胞系在1957年通过单细胞克隆得到。随后通过该祖细胞系得到细胞系CHO-K1，该细胞系包含比原始CHO明显更低量的DNA。后来，对原始CHO细胞系的另一衍生物进行诱变处理而得到CHO-DG44，这是一种两个dhfr等位基因都缺失的细胞系。虽然CHO细胞用于遗传学、毒性筛选、营养学和基因表达研究，但是最突出的用途是重组蛋白表达。

使用CHO细胞系的工艺开发专注于实现最大产量的活性产物。对活性产物的量的优化可经由提高比生产率(即，每个细胞的产物)和/或通过细胞系开发来实现。细胞系开发既可包括对细胞系进行亚克隆以选择高产克隆体，也包括使用基因扩增。

实现较高重组蛋白产量的另一种方式是提高工艺的细胞产量(即，单位体积的细胞数)。这可通过工艺开发(例如，分批、补料分批、灌注等)和培养基开发来实现。通过增加每天单位体积的细胞数，可以产生更高水平的产物。

然而，即使近年来重组蛋白制备的效率和产量已实质性提高，但是本领域仍然需要允许实现甚至更高表达水平的替代方法。

技术实现要素：

本申请的发明人已发现，所述需要可通过新型嵌合基因调控单元满足。

因此在第一方面，本发明涉及一种分离的核酸分子，该核酸分子包含功能性嵌合基因调控单元，该单元包含(a)功能性增强子核苷酸序列，(b)功能性核心启动子核苷酸序列，和(c)至少一个编码内含子的核苷酸序列，其中增强子核苷酸序列在启动子核苷酸序列的5’而内含子核苷酸序列在启动子序列的3’，并且其中增强子核苷酸序列、启动子核苷酸序列或至少一个编码内含子的核苷酸序列中的至少一个核苷酸序列衍生自与其他核苷酸序列不同的物种。

在多种实施方案中，该分离的核酸分子还包含至少一个编码多肽、肽或RNA分子的核苷酸序列，其中所述序列可操作地连接到嵌合基因调控单元。所述至少一个编码感兴趣的多肽、肽或RNA分子的核苷酸序列可位于内含子核苷酸序列的3’，优选地与内含子序列直接相邻。在多种实施方案中，如果核苷酸序列编码感兴趣的多肽，所述感兴趣的多肽是天然存在的免疫球蛋白或人工免疫球蛋白的多肽链。在多种实施方案中，感兴趣的多肽可以是抗体或其片段。抗体可以是人抗体或人源化抗体或其片段。

在多种实施方案中，嵌合基因调控单元具有增加的对转录沉默的抗性。

在多种实施方案中，该分离的核酸分子还包含至少一个编码限制性内切酶识别位点的核苷酸序列。所述至少一个编码限制性内切酶识别位点的核苷酸序列可以(i)在增强子核苷酸序列的3’和启动子核苷酸序列的5’，或(ii)在启动子核苷酸序列的3’和所述至少一个编码内含子的核苷酸序列的5’。

在多种实施方案中，增强子序列衍生自病毒，优选地衍生自双链DNA病毒。所述病毒可以是疱疹病毒科和多瘤病毒科的组，优选地由人巨细胞病毒、鼠巨细胞病毒和猴病毒40组成的组。

在多种实施方案中，增强子序列、启动子序列和内含子中的任一个或多个衍生自人巨细胞病毒、鼠巨细胞病毒、猴病毒40、人EF-1α基因或鸡β-肌动蛋白基因。更优选地，启动子可衍生自人巨细胞病毒、鼠巨细胞病毒、猴病毒40、人EF-1α基因或鸡β-肌动蛋白基因，增强子可衍生自人巨细胞病毒、鼠巨细胞病毒或猴病毒40，和/或内含子序列可衍生自人巨细胞病毒、人EF-1α基因或鸡β-肌动蛋白基因。

在多种实施方案中，增强子序列包含以下部分、基本上由以下部分组成或由以下部分组成：(i)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3中任一者所示的核苷酸序列或其互补序列；或(ii)与(i)的核苷酸序列享有至少75％序列相同性的核苷酸序列或其互补序列。

在多种实施方案中，启动子序列包含以下部分、基本上由以下部分组成或由以下部分组成：(i)如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8中任一者所示的核苷酸序列或其互补序列；或(ii)与(i)的核苷酸序列享有至少75％序列相同性的核苷酸序列或其互补序列。

在多种实施方案中，内含子核苷酸序列包含以下部分、基本上由以下部分组成或由以下部分组成：(i)如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11中任一者所示的核苷酸序列或其互补序列；或(ii)与(i)的核苷酸序列享有至少75％序列相同性的核苷酸序列或其互补序列。

在多种实施方案中，嵌合基因调控单元包含以下部分、基本上由以下部分组成或由以下部分组成：

(1)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其互补序列；

(2)如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其互补序列；

(3)如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其互补序列；

(4)如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列或其互补序列；

(5)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:1 1所示的核苷酸序列或其互补序列；

(6)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列或其互补序列；

(7)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其互补序列；

(8)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:1 1所示的核苷酸序列或其互补序列；

(9)如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列或其互补序列；

(10)如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或其互补序列；

(11)如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或其互补序列；

(12)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其互补序列；

(13)如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或其互补序列；

(14)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或其互补序列；

(15)如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其互补序列；

(16)如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列或其互补序列；

(17)如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其互补序列；

(18)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或其互补序列；

(19)如SEQ ID NO:2；SEQ ED NO:5和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或其互补序列；

(20)如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其互补序列；

(21)如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列或其互补序列；

(22)如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或其互补序列；

(23)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其互补序列；

(24)如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或其互补序列；

(25)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或其互补序列；或

(26)与(l)-(25)的一个核苷酸序列享有至少75％序列相同性的核苷酸序列或其互补序列。

在多种实施方案中，包含功能性嵌合基因调控单元和所述至少一个编码感兴趣的多肽、肽或RNA分子的核苷酸序列的本发明的分离的核酸分子与包含天然存在的基因调控单元和编码相同的感兴趣的多肽、肽或RNA分子的核苷酸序列的分离的核酸分子相比，具有增加的在CHO(中国仓鼠卵巢)K1或CHO DG44细胞中表达感兴趣的多肽、肽或RNA分子的表达活性。在CHO K1细胞中具有增加的表达活性的嵌合基因调控单元可包含以下部分、基本上由以下部分组成或由以下部分组成：(i)如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65所示的核苷酸序列或其互补序列；或(ii)与(i)的核苷酸序列享有至少75％序列相同性的核苷酸序列或其互补序列。在CHO DG44细胞中具有增加的表达活性的嵌合基因调控单元包含以下部分、基本上由以下部分组成或由以下部分组成：(i)如SEQ ID No.34、36、37、45、47-52、56、57、59-62、64-67、71所示的核苷酸序列或其互补序列；或(ii)与(i)的核苷酸序列享有至少75％序列相同性的核苷酸序列或其互补序列。

在多种实施方案中，启动子包含转录因子的至少一个结合位点。转录因子可以是特化蛋白1(Sp1)转录因子。Sp1转录因子可包含以下部分、基本上由以下部分组成或由以下部分组成：如SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:75中任一者所示的多肽序列，或其片段。在多种实施方案中，所述转录因子的至少一个结合位点包含以下部分、基本上由以下部分组成或由以下部分组成：如SEQ ID NO:76(5'-(G/T)GGGCGG(G/A)(G/A)(C/T)-3')所示的核苷酸序列。

在另一个方面，本发明涉及一种包含如本文所述的分离的核酸分子的载体，优选质粒。

在又一个方面，本发明还涉及一种包含如本文所述的分离的核酸分子或载体的宿主细胞。宿主细胞可以是真核细胞，诸如CHO细胞，优选CHO K1细胞或CHO DG44细胞。

本发明的另一方面涉及本发明的分离的核酸分子在促进或增强感兴趣的多肽、肽或RNA表达方面的用途，其中所述分离的核酸分子包含编码感兴趣的多肽、肽或RNA的核苷酸序列，其中所述编码感兴趣的多肽、肽或RNA的核苷酸序列可操作地连接到分离的核酸分子的所述嵌合基因调控单元。

又一个方面涉及一种制备感兴趣的多肽、肽或RNA的方法，包括：

(i)提供如本文所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子包含编码感兴趣的多肽、肽或RNA的核苷酸序列，其中所述编码感兴趣的多肽、肽或RNA的核苷酸序列可操作地连接到分离的核酸分子的嵌合基因调控单元；以及

(ii)通过体外转录和翻译或在合适的宿主细胞中在允许感兴趣的多肽、肽或RNA产生的条件下制备感兴趣的多肽、肽或RNA。在此类方法中，宿主细胞可以是真核细胞，诸如CHO细胞，优选CHO K1细胞或CHO DG44细胞。

附图说明

当与非限制实例和附图结合考虑时，参考详细描述将更好地理解本发明。

图1显示了嵌合基因调控单元的设计的概览示意图。将存在于人巨细胞病毒立即早期基因(hCMV)、鼠巨细胞病毒立即早期基因(mCMV)、猴病毒40(SV40)、人延长因子-1α基因(hEF-1α)和鸡β-肌动蛋白基因(cA)上游的五个天然基因调控单元分割成增强子(E)、核心启动子(CP)和内含子(I)。然后将这些来自不同来源的增强子、核心启动子和内含子组合生成五十七个新的增强子-核心启动子和增强子-核心启动子-内含子组合，称为嵌合基因调控单元或杂合启动子。

图2显示了用于比较不同的嵌合启动子的单克隆抗体表达载体的示意图。(A)用于在CHO K1细胞中比较嵌合启动子的抗体表达载体。(B)用于在CHO DG44细胞中比较嵌合启动子的抗体表达载体。ChiP：嵌合基因调控单元；LC：抗体轻链编码序列；HC：抗体重链编码序列；Zeo：博莱霉素编码序列；DHFR：二氢叶酸还原酶编码序列；IRESwt：野生型脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点；mIRES：具有降低的翻译效率的突变IRES；pA：多腺苷酸化信号。

图3显示了根据图2和表2的新生成的嵌合基因调控单元与野生型启动子在稳定转染的CHO K1(A)和CHO DG44(B)细胞中的表达水平的比较结果。通过将CHO K1/CHO DG44细胞用包含不同嵌合启动子的单克隆抗体(mAb)表达型载体转染并使用博莱霉素选择稳定的转然子，而生成稳定转染的库。稳定转染的库的抗体滴度在摇瓶分批培养中测定。黑色的条表示来自最强野生型启动子的滴度。七个杂合启动子在CHO K1细胞中表现出了比任何野生型启动子更高的重组蛋白产量。21个杂合启动子在CHO DG44细胞中表现出了比任何野生型启动子更高的表达。

具体实施方式

以下以举例说明的方式详细描述指出可实践本发明的具体细节和实施方案。这些实施方案足够详细地予以描述以使得本领域的技术人员能够实践本发明。在不脱离本发明范围的情况下，可以利用其他实施方案，并且可以进行结构性和逻辑性的修改。各种实施方案未必互相排斥，因为一些实施方案可与一个或多个其他实施方案组合以形成新的实施方案。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的相同含义。如有冲突，则以本文档(包括定义)为准。

本发明的目标是提供用于高水平表达感兴趣的分子的新型嵌合基因调控单元。

在一个第一方面，本发明涉及一种分离的核酸分子，该核酸分子包含功能性嵌合基因调控单元，该单元包含(a)功能性增强子核苷酸序列，(b)功能性启动子核苷酸序列，和(c)至少一个编码内含子的核苷酸序列，其中增强子核苷酸序列在启动子核苷酸序列的5’而内含子核苷酸序列在启动子序列的3’，并且其中增强子核苷酸序列、启动子核苷酸序列或至少一个编码内含子的核苷酸序列中的至少一个核苷酸序列衍生自与其他核苷酸序列不同的物种。

在本文中，术语“功能性”是指这样一种实体，该实体具有其类型的天然存在实体的天然生物活性，或任何特定的所需活性，例如就启动子而言，通过其引发基因转录的能力来判定。

在本文中，术语“分离的核酸分子”涉及可独立于其天然遗传环境和/或背景出现并优选地与其他核酸或细胞组分分开的核酸分子。分离可通过纯化进行，用于纯化的各种技术是本领域已知的。

术语“核酸分子”是指以单链形式或以双链螺旋存在的核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式，其任何磷酸酯类似物，诸如硫代磷酸酯和硫代酯，以及人工核酸类似物，诸如肽核酸、吗啉代核酸和锁核酸，以及二醇核酸和苏糖核酸。这些人工核酸类似物中的每一者因分子主链的变化而有别于天然存在的DNA或RNA。在优选的实施方案中，分离的核酸分子是DNA分子。

本文中的“至少一个(种)”涉及一个(种)或多个(种)，具体地讲1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个(种)或更多个(种)

本文使用冠词“一个”和“一种”(a或an)表示一个(种)或不止一个(种)(即至少一个(种))该冠词的语法对象。以举例的方式，“要素”是指至少一个要素并可包括不止一个要素。

本文中关于核酸的术语“序列”涉及核酸分子的一级序列。

在本文中，术语“功能性嵌合基因调控单元”或“杂合启动子”是指本文所述的增强子、核心启动子和至少一个内含子的组合。

在本文中，术语“嵌合”或“杂合”是指这样一种事实：调控单元的不同元件衍生自不同基因，即，在自然界，本文的调控单元的元件的组合并不存在。这可通过使用来自不同物种的至少一个元件并将其与调控单元的其他元件进行组合而实现。增强子、核心启动子和内含子中的至少一者因此相对于另两者中的至少一者是异源的。

在本文中，术语“功能性增强子”是指可例如通过能够结合蛋白而激活(基因的)转录(激活剂)的短DNA区域。

一般来讲，术语“启动子”是指引发特定基因转录的DNA区域。

在本文中，术语“功能性启动子”或“核心启动子”是指启动子中的核心区，该区是正确引发基因转录所需的最小启动子部分。

在本文中，术语“内含子”是在最终RNA产物的成熟期间通过RNA剪切而移除的基因内的核苷酸序列。术语内含子既指基因内的DNA序列，也指RNA转录物中的相应序列。在RNA剪切后在最终成熟RNA中连在一起的序列是外显子。

本文中的术语“5’”是指核酸的单链的方向性，即，端对端化学取向。核苷酸糖环中命名碳原子的化学转化在数字上产生5-端和3-端。结构沿着核酸链的相对位置(包括基因和各种蛋白结合位点)通常称为上游(朝向5-端)或下游(朝向3-端)。该命名约定具有重要意义，因为核酸在体内只能以5至3'方向合成，这是由于组装新链的聚合酶通过磷酸二酯键仅将新的核苷酸附接到3-羟基(-OH)基团。

在多种实施方案中，分离的核酸分子还包含至少一个编码感兴趣的肽、多肽或RNA分子的核苷酸序列。如果希望高表达水平，那么所述感兴趣的分子是那些将使用新型嵌合基因调控单元而表达的分子。优选地，其为重组多肽或蛋白。

在本文中，术语“肽”涉及通过肽键连接的两个或更多个核酸，并因此包括二肽、寡肽和多肽。

本文中的术语“多肽”是指长度优选地为至少50个氨基酸的长的连续肽链。

本文中的术语“蛋白”涉及以生物学上有功能的方式布置的一个或多个多肽。蛋白可由多于一条多肽链组成，诸如抗体，其由两条轻链和两条重链组成，其中每条链为多肽。蛋白可结合到配体，诸如辅酶和辅因子，或结合到另一蛋白或其他大分子。

在多种实施方案中，所述编码感兴趣的分子的序列可操作地连接到嵌合基因调控单元。在优选的实施方案中，所述至少一个编码感兴趣的分子的核苷酸序列位于相对于内含子核苷酸序列的3’(下游)。在更优选的实施方案中，所述至少一个编码感兴趣的分子的核苷酸序列与内含子序列直接相邻。

“直接相邻”意味着内含子序列和编码序列由磷酸二酯键直接连接并且在这两个元件之间不插入接头核苷酸序列。

在本文中，术语“可操作地连接”意指以如下方式相连，使得嵌合基因调控单元可控制感兴趣的分子的表达。

有利的是，所述至少一个编码感兴趣分子的核苷酸序列与内含子序列直接相邻，因为这提高正确和高水平表达的机会。

在多种实施方案中，其中所述至少一个编码感兴趣的分子的核苷酸序列编码感兴趣的多肽，所述多肽是天然存在的免疫球蛋白或人工免疫球蛋白的多肽链。在优选的实施方案中，感兴趣的多肽是蛋白，而蛋白是抗体。在更优选的实施方案中，抗体是人抗体或人源化抗体或其片段。应当理解，在此类实施方案中，其中希望免疫球蛋白具体地讲抗体的表达，则分离的核酸分子包含编码多于一种多肽的核苷酸序列。例如，在希望抗体表达的情况下，分离的核酸分子可包含编码感兴趣的多肽的两个核酸序列，即，一个序列编码重链，一个序列编码轻链。在此类实施方案中，不同的编码序列可直接连接或可由接头核苷酸序列分开。所述接头核苷酸序列可以是功能性的，因为它们允许核糖体结合并因此例如可包含内部核糖体进入位点(IRES)。

在本文中并与上文一致，术语“免疫球蛋白”是指由一个或多个基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白。

在多种实施方案中，嵌合基因调控单元具有增加的对转录沉默的抗性。

术语“转录沉默”是指基因表达借以在转录水平上下调的任何机制，例如，经由DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑，这使得DNA永久性不能进一步转录。

有利的是，如果嵌合基因调控单元具有增加的对转录沉默的抗性，则这将导致所表达产物更高的总体产量。

在多种实施方案中，该分离的核酸分子还包含至少一个编码限制性内切酶识别位点的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述至少一个编码限制性内切酶识别位点的核苷酸序列在增强子核苷酸序列的3’和启动子核苷酸序列的5’。或者，在多种优选的实施方案中，所述编码限制性内切酶识别位点的核苷酸序列在启动子核苷酸序列的3’和所述至少一个编码内含子的核苷酸序列的5’。该位置使得能够以特定的方式分离和组合调控单元的不同元件，例如，连接增强子、启动子和内含子序列。

在本文中，术语“限制性内切酶”旨在表示识别核酸中的特定核苷酸序列并切割核酸的酶。限制性内切酶可识别长度例如为4、5、6、7个或更多个核苷酸的序列。限制性内切酶可识别多于一个序列，例如，在特定位置包含两个或更多个不同核苷酸中的一个的简并序列的两个或更多个变体。或者，限制性内切酶可以是单个识别序列特异性的。

在本文中，术语“识别位点”旨在表示具有特异性结合特定结合部分(moiety)诸如限制性内切酶，更具体地讲限制性内切酶的底物识别和结合位点的核酸部(portion)。通常，限制性内切酶识别位点由限制性内切酶切割。

在多种实施方案中，增强子序列衍生自病毒。在优选的实施方案中，增强子序列衍生自双链DNA病毒。在更优选的实施方案中，增强子序列衍生自由疱疹病毒科和多瘤病毒科的组所组成的病毒。在进一步优选的实施方案中，增强子序列衍生自由人巨细胞病毒、鼠巨细胞病毒和猴病毒40组成的组。

巨细胞病毒是缩写为CMV的疱疹病毒科下的病毒属。感染人类的种通常称为人CMV(hCMV)。其他CMV病毒诸如小鼠中的鼠巨细胞病毒存在于若干哺乳动物物种中，但是从动物中分离的种在基因组结构方面与hCMV不同。

猴病毒40(SV40)是既存在于猴子中也存在于人类中的多瘤病毒。

在多种实施方案中，增强子序列包含以下部分、基本上由以下部分组成或由以下部分组成：(i)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3中的任一者所示的核苷酸序列或其互补序列；或(ii)与(i)的核苷酸序列享有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98.0％、98.5％、99.0％或99.5％序列相同性的核苷酸序列或其互补序列。

本文中的“互补序列”涉及当将两种核酸分子反平行于彼此进行比对时与另一核酸分子互补的核酸分子，因为任一核酸分子的基本上所有的核苷酸均与另一分子上的对应核苷酸形成沃森-克里克碱基对。在多种实施方案中，互补序列是完全互补序列，因为相应分子或序列的每个核苷酸与另一条链上的对应核苷酸形成沃森-克里克碱基对。

本文中的术语“序列相同性”通常以百分率表示，并指当进行最佳比对时在两条序列之间相同的氨基酸残基或核苷酸(视情况而定)的百分比。出于本发明的目的，序列相同性意指使用熟知的基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)确定的序列相同性，该工具可通过国家癌症研究所/国家健康研究所(National Cancer Institute/National Institutes of Health(Bethesda,Maryland))公开获得，并在印刷出版物中进行了描述(参见例如Altschul et al.,J.Mol.Biol.,215(3):403-10(1990))。

在多种实施方案中，核心启动子的序列衍生自由人巨细胞病毒、鼠巨细胞病毒、猴病毒40、人EF-1α基因启动子和鸡β-肌动蛋白基因启动子组成的组。

延长因子1-α1(EF-1α)是在人类中由EEF1A1基因编码的蛋白。该基因编码延长因子-1复合物的α亚基的同种型，其负责将氨酰基tRNA酶促递送到核糖体。

在多种实施方案中，核心启动子序列包含以下部分、基本上由以下部分组成或由以下部分组成：(i)如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8中的任一者所示的核苷酸序列或其互补序列；或(ii)与(i)的核苷酸序列享有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98.0％、98.5％、99.0％或99.5％序列相同性的核苷酸序列或其互补序列。

在多种实施方案中，内含子核苷酸序列选自衍生自由人巨细胞病毒、人EF-1α基因和鸡β-肌动蛋白基因组成的组的序列。

在多种实施方案中，内含子核苷酸序列包含以下部分、基本上由以下部分组成或由以下部分组成：(i)如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11中的任一者所示的核苷酸序列或其互补序列；(ii)与(i)的核苷酸序列享有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98.0％、98.5％、99.0％或99.5％序列相同性的核苷酸序列或其互补序列。

以上元件可加以组合，以使得嵌合基因调控单元包含以下部分、基本上由以下部分组成或由以下部分组成：

(1)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其互补序列；

(2)如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其互补序列；

(3)如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其互补序列；

(4)如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列或其互补序列；

(5)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其互补序列；

(6)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列或其互补序列；

(7)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:1 1所示的核苷酸序列或其互补序列；或

(8)与(l)-(7)的一个核苷酸序列享有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98.0％、98.5％、99.0％或99.5％序列相同性的核苷酸序列或其互补序列。

此类嵌合基因调控单元是有利的，因为令人惊讶地发现，它们与野生型基因调控单元或不同的嵌合基因调控单元相比在CHO KG1细胞中表现出更高的重组蛋白产生水平。

本文中的术语“野生型”(WT)是指典型的、最常见或最传统的形式，如其存在于自然界中。

在多种实施方案中，包含功能性嵌合基因调控单元和所述至少一个编码感兴趣的分子的核苷酸序列的本发明的分离的核酸分子具有增加的表达活性，因为相对于包含天然存在的基因调控单元和编码相同的感兴趣的分子的核苷酸序列的分离的核酸分子，其在中国仓鼠卵巢(CHO)K1细胞中表达更高水平的感兴趣的分子。在优选的实施方案中，功能性嵌合基因调控单元增加的表达活性与天然存在的基因调控单元相比高至少1.1倍、1.15倍、1.2倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍或1.75倍。

CHO细胞出于以下方面的原因是有利的：其产生具有与人类相容的翻译后修饰的糖蛋白的能力，其对人类病毒的抗感染性，用于CHO细胞的明确的基因扩增系统的可获性连同细胞在无血清悬浮培养中适应和生长的能力。这些特性使得CHO细胞成为工业中大规模高滴度培养的理想之选。

在多种实施方案中，嵌合基因调控单元包含以下部分、基本上由以下部分组成或由以下部分组成：(i)如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:59、SEQ ID N0:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65所示的核苷酸序列或其互补序列；或(ii)与(i)的核苷酸序列享有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98.0％、98.5％、99.0％或99.5％序列相同性的核苷酸序列或其互补序列。据发现，所述构建体在CHO K1细胞中提供增加的表达活性。尤其优选的是包含以下部分、基本上由以下部分组成或由以下部分组成的嵌合基因调控单元：如SEQ ID NO:35所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:35的所述核苷酸序列享有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98.0％、98.5％、99.0％或99.5％序列相同性的核苷酸序列，或这些序列的相应互补序列。据发现，所述序列是尤其有利的，即便其不能提供更高的滴度，因为与如SEQ ID No.30、59、60、62、64和65中所示的嵌合启动子相比，用于生成稳定转染的具有所述嵌合基因调控单元的细胞库的时间明显更短，例如三周而不是两周。

在多种其他实施方案中，嵌合基因调控单元包含以下部分、基本上由以下部分组成或由以下部分组成

(1)如SEQ ED NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其互补序列；

(2)如SEQ ID NO:2；SEQ ED NO:5和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其互补序列；

(3)如SEQ ID NO:1；SEQ ED NO:5和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其互补序列；

(4)如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列或其互补序列；

(5)如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或其互补序列；

(6)如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或其互补序列；

(7)如SEQ ED NO:1、SEQ ID NO:6和SEQ ED NO:11所示的核苷酸序列或其互补序列；

(8)如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或其互补序列；

(9)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或其互补序列；

(10)如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其互补序列；

(11)如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列或其互补序列；

(12)如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其互补序列；

(13)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或其互补序列；

(14)如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或其互补序列；

(15)如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其互补序列；

(16)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其互补序列；

(17)如SEQ ED NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列或其互补序列；

(18)如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或其互补序列；

(19)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其互补序列；

(20)如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或其互补序列；

(21)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或其互补序列；或

(22)与(l)-(21)的一个核苷酸序列享有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98.0％、98.5％、99.0％或99.5％序列相同性的核苷酸序列或其互补序列。

此类嵌合基因调控单元是有利的，因为令人惊讶地发现，它们与野生型基因调控单元或不同的嵌合基因调控单元相比在CHO DG44细胞中表现出更高的重组蛋白产生水平。

因此，在多种实施方案中，包含功能性嵌合基因调控单元和所述至少一个编码感兴趣的分子的核苷酸序列的本发明的分离的核酸分子与包含天然存在的基因调控单元和编码感兴趣的分子的核苷酸序列的分离的核酸分子相比具有增加的在中国仓鼠卵巢(CHO)DG44细胞中表达感兴趣的分子的表达活性。在优选的实施方案中，功能性嵌合基因调控单元增加的表达活性与天然存在的基因调控单元相比高至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍或1.7倍。

在多种实施方案中，在CHO DG44细胞中具有增加的表达活性的嵌合基因调控单元包含以下部分、基本上由以下部分组成或由以下部分组成：(i)如SEQ ID No.34、36、37、45、47-52、56、57、59-62、64-67、71中所示的核苷酸序列或其互补序列；或(ii)与(i)的核苷酸序列享有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98.0％、98.5％、99.0％或99.5％序列相同性的核苷酸序列或其互补序列。

此类嵌合基因调控单元是有利的，因为令人惊讶地发现，它们与野生型基因调控单元或不同的嵌合基因调控单元所实现的相比表现出更高的重组蛋白产生水平。

在多种实施方案中，嵌合基因调控单元包含转录因子的至少一个结合位点。

在优选的实施方案中，所述转录因子的至少一个结合位点包含在增强子、核心启动子或内含子中。

在本文中，术语“转录因子”是指结合到特定DNA序列从而控制遗传信息从DNA向信使RNA(mRNA)的转录率的蛋白。转录因子通过促进(作为激活剂)或阻断(作为阻遏剂)RNA聚合酶向特定基因的募集而单独地或与复合物中的其他蛋白一起发挥该功能。转录因子的定义特征在于，它们包含一个或多个DNA结合域(DBD)，这些结合域附接到邻近它们所调控的基因的特定DNA序列。在本文，优选的是，所募集的转录因子激活RNA聚合酶结合和功能。

在优选的实施方案中，转录因子是特化蛋白1(Sp1)转录因子。这可以是有利的，因为据显示，SP1结合位点可在长期培养过程中增强表达。Sp1转录因子可包含以下部分、基本上由以下部分组成或由以下部分组成：如SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:75所示的多肽序列，或可以是其片段，而所述片段是功能性的，因为其保持全长序列的至少50％的活性。或者，在其他优选的实施方案中，包含在本文所述的核酸分子中的所述转录因子的至少一个结合位点包含以下部分、基本上由以下部分组成或由以下部分组成：如SEQ ID NO:76(5'-(G/T)GGGCGG(G/A)(G/A)(C/T)-3')所示的核苷酸序列。

使用转录因子是有利的，因为其代表了控制和改善传信息从DNA向信使RNA的转录率并因此实现更高表达水平的另外工具。

在又一个方面，本发明涉及一种包含本发明的分离的核酸分子的载体。

在本文中，术语“载体”是指用作将外来遗传物质人工运载到另一细胞中的媒介物的核酸分子，而遗传物质可在该细胞中复制和/或表达。四种主要类型的载体是质粒、病毒载体、粘粒和人工染色体。所有工程化载体的共同之处是复制起点、多克隆位点和选择性标记。载体本身通常是由插入序列(转基因)和充当载体“主链”的较大序列组成的核酸序列。将遗传信息传递到另一细胞的载体的目的通常是分离插入序列、使插入序列在目标细胞中倍增或使插入序列在目标细胞中表达。在优选的实施方案中，载体是质粒。

在又一个方面，本发明涉及一种包含本发明的分离的核酸分子和/或本发明的载体的宿主细胞。

本文中的术语“宿主细胞”意指具有包含如本文所述的嵌合基因调控单元的核酸分子的生物体。它们可整合到宿主细胞的基因组中或以单独的形式存在于细胞中。

在多种实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞。在优选的实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在进一步更优选的实施方案中，所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在更优选的实施方案中，宿主细胞是CHO K1细胞或CHO DG44细胞。

本文所述的核酸分子可用于促进或增强给定的感兴趣的分子在细胞中的表达。应当理解，在此类实施方案中，所述分离的核酸分子还包含编码感兴趣的分子的核苷酸序列，该核苷酸序列可操作地连接到分离的核酸分子的嵌合基因调控单元。

在用于表达感兴趣的分子尤其是多肽的此类方法中，实际的表达可通过体外转录和翻译或更优选地以重组方式在合适的宿主细胞中在允许产生感兴趣的分子的条件下进行。

宿主细胞可以是如上文所述的细胞。

允许产生感兴趣的分子的条件包括细胞培养的各种参数，包括培养基的选择和诸如温度、时间等培养条件。所有这些因素都是本领域技术人员熟知的并可使用常规技术容易地调整。

应当理解，本文关于本发明的核酸所公开的所有实施方案类似地适用于本文所述的载体、宿主细胞、用途和方法，反之亦然。

通过以下实施例对本发明做进一步阐释。然而，应当理解，本发明不限于这些举例说明的实施方案。

实施例

将存在于人巨细胞病毒立即早期基因(hCMV)、鼠巨细胞病毒立即早期基因(mCMV)、猴病毒40(SV40)、人延长因子-1α基因(hEF-1α)和鸡β-肌动蛋白基因(cA)上游的五个天然启动子分割成增强子(E)、核心启动子(CP)和内含子(I)(图1)。然后将这些来自不同来源的增强子、核心启动子和内含子重组以生成五十七个新的增强子-核心启动子和增强子-核心启动子-内含子组合，称为嵌合基因调控单元或杂合启动子。

表1显示了用于生成嵌合基因调控单元的不同元件，而表2显示了所测试的组合。

表1：天然存在的增强子、启动子和内含子

表2：所评估的基因调控单元

然后将不同的嵌合基因调控单元插入抗体表达载体，以在CHO K1和CHO DG44细胞中比较嵌合启动子，其中不同元件在载体中的布置在图2中示意性示出。

通过将l×10⁷个CHO K1细胞用5μg适当的线性化mAb表达型质粒转染而生成稳定转染的CHO K1库，该质粒包含特定的嵌合启动子和博莱霉素选择性标记基因(图2A)。转染用核因子(Nucleofactor)试剂盒V(Lonza,VCA1003)和核因子II(Nucleofector II)系统(Lonza,Cologne,Germany)上的程序U-24根据制造商说明进行。然后将转染后的细胞重悬在6孔悬浮培养板中的2mL无蛋白培养基中。在转染后24小时，将转染后的细胞培养物以～100xg离心5分钟。然后将细胞沉淀(cell pellet)在125mL摇瓶中重悬在25mL含有600μg/mL博莱霉素的无蛋白培养基中以选择稳定的转染子。当稳定转染的库的活力恢复到95％以上时，视为成功产生了稳定转染的库。每个稳定转染的库的产率在125mL摇瓶分批培养中测定。将细胞以2×l0⁵个细胞/mL接种。使用Vi-Cell每天监测细胞密度和活力，直到活力降到50％以下。在培养结束时收集上清液，并使用浊度法在IMMAGE 800免疫化学系统(Beckman Coulter,Buckinghamshire,England)上分析mAb浓度。IMMAGE 800系统使用抗人Fc区抗体来检测IgG。使用每种启动子生成的重复的库的平均滴度在图3A中示出。

使用与CHO K1细胞相同的方案进行CHO DG44细胞的转染。然后将转染后的细胞重悬在6孔悬浮培养板中的2mL无蛋白培养基中，该培养基含有次黄嘌呤和胸腺嘧啶(HT)。在转染后24小时，将转染后的细胞培养物以～100×g离心5分钟。然后将细胞沉淀在125mL摇瓶中重悬在25mL无蛋白培养基(无HT)中以选择稳定的转染子。当稳定转染的库的活力恢复到95％以上时，以50nM至500nM的浓度进行逐步甲氨蝶呤(MTX,Sigma,M8407)扩增。使用与稳定转染的CHO K1细胞相同的方案测定500nM下扩增库的产率。使用每种启动子生成的重复的库的平均滴度在图3b中示出。

SEQUENCE LISTING

<110> The Bioprocessing Technology Institute (BTI) Agency For

<120> NOVEL PROMOTERS FOR HIGH LEVEL EXPRESSION

<130> P109649

<160> 76

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 377

<212> DNA

<213> Human cytomegalovirus

<400> 1

tgacattgat tattgagtag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc 60

ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc 120

aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 180

actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 240

caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 300

tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta 360

ttagtcatcg ctattac 377

<210> 2

<211> 422

<212> DNA

<213> Mouse cytomegalovirus 1

<400> 2

agtcaatggg aaaaacccat tggagccaag tacactgact caatagggac tttccattgg 60

gttttgccca gtacataagg tcaatagggg gtgagtcaac aggaaagtcc cattggagcc 120

aagtacattg agtcaatagg gactttccaa tgggttttgc ccagtacata aggtcaatgg 180

gaggtaagcc aatgggtttt tcccattact ggcacgtata ctgagtcatt agggactttc 240

caatgggttt tgcccagtac ataaggtcaa taggggtgaa tcaacaggaa agtcccattg 300

gagccaagta cactgagtca atagggactt tccattgggt tttgcccagt acaaaaggtc 360

aatagggggt gagtcaatgg gtttttccca ttattggcac gtacataagg tcaatagggg 420

tg 422

<210> 3

<211> 168

<212> DNA

<213> Simian virus 40

<400> 3

tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta 60

tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag 120

caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatag 168

<210> 4

<211> 222

<212> DNA

<213> Human cytomegalovirus

<400> 4

catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 60

atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 120

ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 180

acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cg 222

<210> 5

<211> 285

<212> DNA

<213> Mouse cytomegalovirus 1

<400> 5

agtcattggg tttttccagc caatttaatt aaaacgccat gtactttccc accattgacg 60

tcaatgggct attgaaacta atgcaacgtg acctttaaac ggtactttcc catagctgat 120

taatgggaaa gtaccgttct cgagccaata cacgtcaatg ggaagtgaaa gggcagccaa 180

aacgtaacac cgccccggtt ttccctggaa attccatatt ggcacgcatt ctattggctg 240

agctgcgttc acgtgggtat aagaggcgcg accagcgtcg gtacc 285

<210> 6

<211> 109

<212> DNA

<213> Simian virus 40

<400> 6

tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc 60

cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctc 109

<210> 7

<211> 203

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60

tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120

aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180

gtgcagtagt cgccgtgaac gtt 203

<210> 8

<211> 276

<212> DNA

<213> Gallus gallus

<400> 8

tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 60

ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg 120

cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg 180

gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg 240

cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcg 276

<210> 9

<211> 955

<212> DNA

<213> Human cytomegalovirus

<400> 9

tcagatcgcc tggagacgcc atccacgctg ttttgacctc catagaagac accgggaccg 60

atccagcctc cgcggccggg aacggtgcat tggaacgcgg attccccgtg ccaagagtga 120

cgtaagtacc gcctatagac tctataggca cacccctttg gctcttatgc atgctatact 180

gtttttggct tggggcctat acacccccgc ttccttatgc tataggtgat ggtatagctt 240

agcctatagg tgtgggttat tgaccattat tgaccactcc cctattggtg acgatacttt 300

ccattactaa tccataacat ggctctttgc cacaactatc tctattggct atatgccaat 360

actctgtcct tcagagactg acacggactc tgtattttta caggatgggg tcccatttat 420

tatttacaaa ttcacatata caacaacgcc gtcccccgtg cccgcagttt ttattaaaca 480

tagcgtggga tctccacgcg aatctcgggt acgtgttccg gacatgggct cttctccggt 540

agcggcggag cttccacatc cgagccctgg tcccatgcct ccagcggctc atggtcgctc 600

ggcagctcct tgctcctaac agtggaggcc agacttaggc acagcacaat gcccaccacc 660

accagtgtgc cgcacaaggc cgtggcggta gggtatgtgt ctgaaaatga gcgtggagat 720

tgggctcgca cggctgacgc agatggaaga cttaaggcag cggcagaaga agatgcaggc 780

agctgagttg ttgtattctg ataagagtca gaggtaactc ccgttgcggt gctgttaacg 840

gtggagggca gtgtagtctg agcagtactc gttgctgccg cgcgcgccac cagacataat 900

agctgacaga ctaacagact gttcctttcc atgggtcttt tctgcagtca ccgtc 955

<210> 10

<211> 985

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggtaagtg ccgtgtgtgg ttcccgcggg 60

cctggcctct ttacgggtta tggcccttgc gtgccttgaa ttacttccac gcccctggct 120

gcagtacgtg attcttgatc ccgagcttcg ggttggaagt gggtgggaga gttcgaggcc 180

ttgcgcttaa ggagcccctt cgcctcgtgc ttgagttgag gcctggcctg ggcgctgggg 240

ccgccgcgtg cgaatctggt ggcaccttcg cgcctgtctc gctgctttcg ataagtctct 300

agccatttaa aatttttgat gacctgctgc gacgcttttt ttctggcaag atagtcttgt 360

aaatgcgggc caagatctgc acactggtat ttcggttttt ggggccgcgg gcggcgacgg 420

ggcccgtgcg tcccagcgca catgttcggc gaggcggggc ctgcgagcgc ggccaccgag 480

aatcggacgg gggtagtctc aagctggccg gcctgctctg gtgcctggcc tcgcgccgcc 540

gtgtatcgcc ccgccctggg cggcaaggct ggcccggtcg gcaccagttg cgtgagcgga 600

aagatggccg cttcccggcc ctgctgcagg gagctcaaaa tggaggacgc ggcgctcggg 660

agagcgggcg ggtgagtcac ccacacaaag gaaaagggcc tttccgtcct cagccgtcgc 720

ttcatgtgac tccacggagt accgggcgcc gtccaggcac ctcgattagt tctcgagctt 780

ttggagtacg tcgtctttag gttgggggga ggggttttat gcgatggagt ttccccacac 840

tgagtgggtg gagactgaag ttaggccagc ttggcacttg atgtaattct ccttggaatt 900

tgcccttttt gagtttggat cttggttcat tctcaagcct cagacagtgg ttcaaagttt 960

ttttcttcca tttcaggtgt cgtga 985

<210> 11

<211> 999

<212> DNA

<213> Gallus gallus

<400> 11

ggagtcgctg cgttgccttc gccccgtgcc ccgctccgcg ccgcctcgcg ccgcccgccc 60

cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg 120

ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg ctcgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc 180

cttaaagggc tccgggaggg ccctttgtgc gggggggagc ggctcggggg gtgcgtgcgt 240

gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg cccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc 300

gggcgcggcg cggggctttg tgcgctccgc gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 360

gtgccccgcg gtgcgggggg gctgcgaggg gaacaaaggc tgcgtgcggg gtgtgtgcgt 420

gggggggtga gcagggggtg tgggcgcggc ggtcgggctg taaccccccc ctgcaccccc 480

ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtgcg gggcgtggcg 540

cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 600

cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg ccccggagcg ccggcggctg 660

tcgaggcgcg gcgagccgca gccattgcct tttatggtaa tcgtgcgaga gggcgcaggg 720

acttcctttg tcccaaatct ggcggagccg aaatctggga ggcgccgccg caccccctct 780

agcgggcgcg ggcgaagcgg tgcggcgccg gcaggaagga aatgggcggg gagggccttc 840

gtgcgtcgcc gcgccgccgt ccccttctcc atctccagcc tcggggctgc cgcaggggga 900

cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg tgaccggcgg 960

ggtttatatc ttcccttctc tgttcctccg cagccagcc 999

<210> 12

<211> 620

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gene regulatory unit

<400> 12

acgcgttgac attgattatt gagtagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt 60

catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga 120

ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca 180

atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca 240

gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg 300

cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc 360

tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt 420

ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt 480

ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg 540

acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tcgtttagtg 600

aaccggcggc cgcaggatcc 620

<210> 13

<211> 728

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gene regulatory unit

<400> 13

acgcgtagtc aatgggaaaa acccattgga gccaagtaca ctgactcaat agggactttc 60

cattgggttt tgcccagtac ataaggtcaa tagggggtga gtcaacagga aagtcccatt 120

ggagccaagt acattgagtc aatagggact ttccaatggg ttttgcccag tacataaggt 180

caatgggagg taagccaatg ggtttttccc attactggca cgtatactga gtcattaggg 240

actttccaat gggttttgcc cagtacataa ggtcaatagg ggtgaatcaa caggaaagtc 300

ccattggagc caagtacact gagtcaatag ggactttcca ttgggttttg cccagtacaa 360

aaggtcaata gggggtgagt caatgggttt ttcccattat tggcacgtac ataaggtcaa 420

taggggtgag tcattgggtt tttccagcca atttaattaa aacgccatgt actttcccac 480

cattgacgtc aatgggctat tgaaactaat gcaacgtgac ctttaaacgg tactttccca 540

tagctgatta atgggaaagt accgttctcg agccaataca cgtcaatggg aagtgaaagg 600

gcagccaaaa cgtaacaccg ccccggtttt ccctggaaat tccatattgg cacgcattct 660

attggctgag ctgcgttcac gtgggtataa gaggcgcgac cagcgtcggt accgcggccg 720

caggatcc 728

<210> 14

<211> 298

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gene regulatory unit

<400> 14

acgcgttgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca 60

gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag gtgtggaaag tccccaggct 120

ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc 180

ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg 240

gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcgcggccg caggatcc 298

<210> 15

<211> 1200

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gene regulatory unit

<400> 15

acgcgtcgtg aggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg 60

agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa 120

actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt 180

atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac 240

aggtaagtgc cgtgtgtggt tcccgcgggc ctggcctctt tacgggttat ggcccttgcg 300

tgccttgaat tacttccacg cccctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg 360

gttggaagtg ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct 420

tgagttgagg cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc 480

gcctgtctcg ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg 540

acgctttttt tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt 600

tcggtttttg gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg 660

aggcggggcc tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg 720

cctgctctgg tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg 780

gcccggtcgg caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg 840

agctcaaaat ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg 900

aaaagggcct ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg 960

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gggttttatg cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct 1080

tggcacttga tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt 1140

ctcaagcctc agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtgaggatcc 1200

<210> 16

<211> 1293

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gene regulatory unit

<400> 16

acgcgtacta gttcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc tcccccccct 60

ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg 120

gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg 180

cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg 240

aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg agtcgctgcg 300

ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgcgcc gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg 360

accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag 420

cgcttggttt aatgacggct cgtttctttt ctgtggctgc gtgaaagcct taaagggctc 480

cgggagggcc ctttgtgcgg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt gtgtgtgcgt 540

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gggctttgtg cgctccgcgt gtgcgcgagg ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt 660

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agggggtgtg ggcgcggcgg tcgggctgta acccccccct gcacccccct ccccgagttg 780

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tgccgggcgg ggggtggcgg caggtggggg tgccgggcgg ggcggggccg cctcgggccg 900

gggagggctc gggggagggg cgcggcggcc ccggagcgcc ggcggctgtc gaggcgcggc 960

gagccgcagc cattgccttt tatggtaatc gtgcgagagg gcgcagggac ttcctttgtc 1020

ccaaatctgg cggagccgaa atctgggagg cgccgccgca ccccctctag cgggcgcggg 1080

cgaagcggtg cggcgccggc aggaaggaaa tgggcgggga gggccttcgt gcgtcgccgc 1140

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ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg accggcgggg tttatatctt 1260

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<210> 17

<211> 683

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> chimeric gene regulatory unit

<400> 17

acgcgttgac attgattatt gagtagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt 60

catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga 120

ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca 180

atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca 240

gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg 300

cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg gcagtacatc 360

tacgtattag tcatcgctat tacagtcatt gggtttttcc agccaattta attaaaacgc 420

catgtacttt cccaccattg acgtcaatgg gctattgaaa ctaatgcaac gtgaccttta 480

aacggtactt tcccatagct gattaatggg aaagtaccgt tctcgagcca atacacgtca 540

atgggaagtg aaagggcagc caaaacgtaa caccgccccg gttttccctg gaaattccat 600

attggcacgc attctattgg ctgagctgcg ttcacgtggg tataagaggc gcgaccagcg 660

tcggtaccgc ggccgcagga tcc 683

<210> 18

<211> 507

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> chimeric gene regulatory unit

<400> 18

acgcgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt 60

catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga 120

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atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca 240

gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg 300

cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc 360

tacgtattag tcatcgctat tactcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc 420

gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc 480

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<210> 19

<211> 607

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> chimeric gene regulatory unit

<400> 19

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catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga 120

ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca 180

atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca 240

gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg 300

cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc 360

tacgtattag tcatcgctat tacactagtc gtgaggctcc ggtgcccgtc agtgggcaga 420

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ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc gtgtactggc tccgcctttt 540

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aggatcc 607

<210> 20

<211> 677

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> chimeric gene regulatory unit

<400> 20

acgcgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt 60

catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga 120

ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca 180

atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca 240

gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg 300

cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc 360

tacgtattag tcatcgctat tacactagtt cgaggtgagc cccacgttct gcttcactct 420

ccccatctcc cccccctccc cacccccaat tttgtattta tttatttttt aattattttg 480

tgcagcgatg ggggcggggg gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg 540

ggcggggcgg ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa 600

agtttccttt tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc 660

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<210> 21

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> chimeric gene regulatory unit

<400> 21

acgcgtagtc aatgggaaaa acccattgga gccaagtaca ctgactcaat agggactttc 60

cattgggttt tgcccagtac ataaggtcaa tagggggtga gtcaacagga aagtcccatt 120

ggagccaagt acattgagtc aatagggact ttccaatggg ttttgcccag tacataaggt 180

caatgggagg taagccaatg ggtttttccc attactggca cgtatactga gtcattaggg 240

actttccaat gggttttgcc cagtacataa ggtcaatagg ggtgaatcaa caggaaagtc 300

ccattggagc caagtacact gagtcaatag ggactttcca ttgggttttg cccagtacaa 360

aaggtcaata gggggtgagt caatgggttt ttcccattat tggcacgtac ataaggtcaa 420

taggggtgac tagtcatggt gatgcggttt tggcagtaca ccaatgggcg tggatagcgg 480

tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg 540

caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaataacc ccgccccgtt gacgcaaatg 600

ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccggcgg 660

ccgcaggatc c 671

<210> 22

<211> 558

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> chimeric gene regulatory unit

<400> 22

acgcgtagtc aatgggaaaa acccattgga gccaagtaca ctgactcaat agggactttc 60

cattgggttt tgcccagtac ataaggtcaa tagggggtga gtcaacagga aagtcccatt 120

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caatgggagg taagccaatg ggtttttccc attactggca cgtatactga gtcattaggg 240

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ccattggagc caagtacact gagtcaatag ggactttcca ttgggttttg cccagtacaa 360

aaggtcaata gggggtgagt caatgggttt ttcccattat tggcacgtac ataaggtcaa 420

taggggtgac tagttcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc 480

cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc 540

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<210> 23

<211> 652

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> chimeric gene regulatory unit

<400> 23

acgcgtagtc aatgggaaaa acccattgga gccaagtaca ctgactcaat agggactttc 60

cattgggttt tgcccagtac ataaggtcaa tagggggtga gtcaacagga aagtcccatt 120

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caatgggagg taagccaatg ggtttttccc attactggca cgtatactga gtcattaggg 240

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taggggtgac tagtcgtgag gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac 480

agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg 540

cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg 600

agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttgcg gccgcaggat cc 652

<210> 24

<211> 722

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> chimeric gene regulatory unit

<400> 24

acgcgtagtc aatgggaaaa acccattgga gccaagtaca ctgactcaat agggactttc 60

cattgggttt tgcccagtac ataaggtcaa tagggggtga gtcaacagga aagtcccatt 120

ggagccaagt acattgagtc aatagggact ttccaatggg ttttgcccag tacataaggt 180

caatgggagg taagccaatg ggtttttccc attactggca cgtatactga gtcattaggg 240

actttccaat gggttttgcc cagtacataa ggtcaatagg ggtgaatcaa caggaaagtc 300

ccattggagc caagtacact gagtcaatag ggactttcca ttgggttttg cccagtacaa 360

aaggtcaata gggggtgagt caatgggttt ttcccattat tggcacgtac ataaggtcaa 420

taggggtgac tagttcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca tctccccccc 480

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cc 722

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> chimeric gene regulatory unit

<400> 25

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gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag gtgtggaaag tccccaggct 120

ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc atagactagt 180

catggtgatg cggttttggc agtacaccaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 240

atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 300

ggactttcca aaatgtcgta ataaccccgc cccgttgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 360

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<213> Artificial Sequence

<220>

<223> chimeric gene regulatory unit

<400> 26

acgcgttgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca 60

gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag gtgtggaaag tccccaggct 120

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<400> 27

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<223> chimeric gene regulatory unit

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tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac caatgggcgt 420

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ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc cgccccgttg 540

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aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg acctccatag aagacaccgg 660

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actttccatt actaatccat aacatggctc tttgccacaa ctatctctat tggctatatg 960

ccaatactct gtccttcaga gactgacacg gactctgtat ttttacagga tggggtccca 1020

tttattattt acaaattcac atatacaaca acgccgtccc ccgtgcccgc agtttttatt 1080

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cgctcggcag ctccttgctc ctaacagtgg aggccagact taggcacagc acaatgccca 1260

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<211> 1636

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> chimeric gene regulatory unit

<400> 30