酰基氨基酸的生物合成生产的制作方法

本发明涉及用于生产至少一种酰基氨基酸的生物技术方法和细胞。具体地，所述酰基氨基酸是来自至少一种脂肪酸的酰基甘氨酸盐。
背景技术：
：酰基氨基酸是一类具有多种用途的表面活性剂，例如作为用于洗涤目的的去污剂、食物产品中的乳化剂以及作为各种个人护理产品（诸如洗发剂、肥皂、补水剂等）中基本成分。除了具有疏水区和亲水区（用作表面活性剂的先决条件）以外，所述化合物由天然存在的分子（更具体地，氨基酸和脂肪酸）制成，其不仅是无害的而且是在环境上可接受的，但是可以使用廉价的生物原料容易地大规模生产。在药理学研究中，酰基氨基酸被用作新药物靶标的神经调质和探针。已经从许多生物学来源分离出酰基氨基酸，并且据信其具有一系列功能，包括例如作为哺乳动物组织中的信号传递分子。并且，基于靶向脂质组学方案对内源性酰基氨基酸的鉴别允许它们被用作细菌培养物中的抗生素的结构单元。例如，由于环amp直接活化nasp（从未培养的β-变形杆菌克隆的n-酰基氨基酸抗生素生物合成酶），这些n-酰基氨基酸可以容易地用在抗生素生产中。它们也被用作涉及细菌蛋白分选的化合物。常规地，已经在工业规模上从来源于石油化学制品的材料开始生产酰基氨基酸。更具体地，以酰基氯形式提供的活化的脂肪酸可被用于在碱性水介质中酰化氨基酸（如gb1483500中所述）。此类方案的缺点包括需要添加有害的化学品诸如硫酸或其酸酐。其它合成方案伴有对表面活性具有不希望的影响的副产物（诸如氯盐）的积累。有用的酰基氨基酸的一个实例是脂肪酰基甘氨酸盐，其在几种个人护理应用中用作表面活性剂，因为它的提供较高级皮肤益处的能力。由微生物发酵合成的脂肪酰基甘氨酸盐的生产将允许可持续的生产方式。本领域中已经描述了一系列生产酰基氨基酸的生物技术途径。但是，由于低产率、纯度不足以及需要多步纯化程序，它们都不适合用于酰基氨基酸的商业大规模生产。具体地，给在生物技术上可用的生物体饲喂的碳基质的仅一小部分实际被转化成期望的产物，而其大部分通过基础代谢的反应被消耗掉。与可得到的生物技术途径相关的另一个问题是以下事实：得到产物的混合物，因而组成难以控制。更具体地，一系列脂肪酸可以被转化成酰基氨基酸，即使可能仅需要生产单一加成化合物。由于所述混合物包含在化学结构上高度相关的化合物，以有效且直接的方式纯化或至少富集单一组分经常不具有技术可行性。因此，本领域需要生产酰基氨基酸的高效且有效的生物技术方法。技术实现要素：本发明尝试通过如下解决以上问题：提供至少一种使用生物技术方法生产酰基氨基酸的方法，所述生物技术方法可以在生产期望的酰基氨基酸中是高效的且特异性的。具体地，从遗传工程改造的微生物生产酰基氨基酸。更具体地，通过培养微生物来生产酰基氨基酸，所述微生物被遗传工程改造成表达至少一种氨基酸-n-酰基-转移酶和至少一种酰基辅酶a合成酶且不表达在甘氨酸代谢中涉及的至少一种酶/减少在甘氨酸代谢中涉及的至少一种酶的表达。具体地，所述在甘氨酸代谢中涉及的酶可以选自：甘氨酸裂解系统的酶、甘氨酸羟甲基转移酶(glya)、苏氨酸醛缩酶(ltae)、苏氨酸脱氢酶(tdh)、2-氨基-3-酮丁酸盐辅酶a-连接酶(kbl)和别苏氨酸脱氢酶(ydfg)。在一个实例中，所述酰基氨基酸是至少一种脂肪酰基甘氨酸盐。这些问题可以通过所附权利要求的主题来解决。根据本发明的一个方面，提供了一种用于生产酰基氨基酸的细胞，其中所述细胞经遗传修饰以包含-至少与野生型细胞相比增加氨基酸-n-酰基-转移酶的表达的第一基因突变，-至少与野生型细胞相比增加酰基辅酶a合成酶的表达的第二基因突变，和/或-至少与野生型细胞相比减少选自以下的至少一种酶的表达的第三基因突变：甘氨酸裂解系统的酶、甘氨酸羟甲基转移酶(glya)苏氨酸醛缩酶(ltae)苏氨酸脱氢酶(tdh)，2-氨基-3-酮丁酸盐辅酶a-连接酶(kbl)，和别苏氨酸脱氢酶(ydfg)。具体地，根据本发明的任何方面的细胞和方法可以提供通向酰基氨基酸的高效的生物技术途径。与现有技术中的方法相比。可以在催化剂或不希望的副产物方面改善来自根据本发明的任何方面的细胞和方法的产物的产率和纯度。根据本发明的任何方面的细胞和方法还可以提供一种用于制备酰基氨基酸的方法，其中被转化成酰基氨基酸的脂肪酸的范围可以比现有技术中已知的方法更宽。例如，根据本发明的任何方面的细胞和方法可以适合用于将短和不饱和脂肪酸转化成酰基氨基酸。根据本发明的任何方面的细胞和方法还可以提供一种用于制备酰基氨基酸的生物技术方法，其中可以控制酰基氨基酸产物中的酰基残基的长度，例如月桂基可以是富集的或普遍的。根据本发明的任何方面的细胞和方法是基于以下惊人发现：氨基酸-n-酰基转移酶、酰基辅酶a合成酶以及在甘氨酸代谢中涉及的至少一种酶的表达的减少的组合可以用于将多种脂肪酸转化成酰基氨基酸。具体地，可能存在可以用于将短不饱和脂肪酸（诸如月桂烯酸）转化成酰基氨基酸的氨基酸-n-酰基转移酶。更具体地，这些氨基酸-n-酰基-转移酶可以能够将短不饱和脂肪酸（诸如月桂烯酸）转化成与本领域已知的方法相比更高的酰基氨基酸产率。甚至更具体地，通过特别地改变掺入这样的酰基氨基酸中的脂肪酸的长度，可以调节在根据本发明的任何方面的细胞中生产的酰基氨基酸的组成。例如，通过在所述细胞中引入一种或多种特异性酰基辅酶a硫酯酶，或改变由所述细胞内源性地表达的一种或多种酰基辅酶a硫酯酶的表达，可以控制在所述细胞中生产的酰基氨基酸的所得组成。与野生型细胞相比增加氨基酸-n-酰基-转移酶和酰基辅酶a合成酶的表达和与野生型细胞相比减少甘氨酸代谢中涉及的至少一种酶的表达的组合可以产生协同效应，其能够与本领域已知的方法相比增加酰基氨基酸的收率。在一个实例中，形成的酰基氨基酸可以是月桂酰基甘氨酸盐。本文中使用的术语“氨基酸-n-酰基转移酶”表示能够催化酰基辅酶a（例如月桂烯酸的辅酶a酯）和氨基酸（例如蛋白质氨基酸，尤其是甘氨酸）向酰基氨基酸的转化的酶。合适的氨基酸-n-酰基转移酶已经描述在现有技术中，例如waluk,d.p.等人,2010。在一个实例中，根据本发明的任何方面使用的氨基酸-n-酰基转移酶可以包含seqidno:4或5的核苷酸序列。具体地，氨基酸-n-酰基转移酶的氨基酸序列可以选自：np_001010904.1、np_659453.3、xp_001147054.1、aah16789.1、aao73139.1、xp_003275392.1、xp_002755356.1、xp_003920208.1、xp_004051278.1、xp_006147456.1、xp_006214970.1、xp_003801413.1、xp_006189704.1、xp_003993512.1、xp_005862181.1、xp_007092708.1、xp_006772167.1、xp_006091892.1、xp_005660936.1、xp_005911029.1、np_001178259.1、xp_004016547.1、xp_005954684.1、elr45061.1、xp_005690354.1、xp_004409352.1、xp_007519553.1、xp_004777729.1、xp_005660935.1、xp_004824058.1、xp_006068141.1、xp_006900486.1、xp_007497585.1、xp_002821801.2、xp_007497583.1、xp_003774260.1、xp_001377648.2、xp_003909843.1、xp_003801448.1、xp_001091958.1、xp_002821798.1、xp_005577840.1、xp_001092197.1、np_001207423.1、np_001207425.1、xp_003954287.1、np_001271595.1、xp_003909848.1、xp_004087850.1、xp_004051279.1、xp_003920209.1、xp_005577835.1、xp_003774402.1、xp_003909846.1、xp_004389401.1、xp_002821802.1、xp_003774401.1、xp_007497581.1、ehh21814.1、xp_003909845.1、xp_005577839.1、xp_003774403.1、xp_001092427.1、xp_003275395.2、np_542392.2、xp_001147271.1、xp_005577837.1、xp_003826420.1、xp_004051281.1、xp_001147649.2、xp_003826678.1、xp_003909847.1、xp_004682812.1、xp_004682811.1、xp_003734315.1、xp_004715052.1、bag62195.1、xp_003777804.1、xp_003909849.1、xp_001092316.2、xp_006167891.1、xp_540580.2、xp_001512426.1、eaw73833.1、xp_003464217.1、xp_007519551.1、xp_003774037.1、xp_005954680.1、xp_003801411.1、np_803479.1、xp_004437460.1、xp_006875830.1、xp_004328969.1、xp_004264206.1、xp_004683490.1、xp_004777683.1、xp_005954681.1、xp_003480745.1、xp_004777682.1、xp_004878093.1、xp_007519550.1、xp_003421399.1、ehh53167.1、xp_006172214.1、xp_003993453.1、aai12537.1、xp_006189705.1、q2kir7.2、xp_003421465.1、np_001009648.1、xp_003464328.1、xp_001504745.1、elv11036.1、xp_005690351.1、xp_005216632.1、epy77465.1、xp_005690352.1、xp_004016544.1、xp_001498276.2、xp_004264205.1、xp_005690353.1、xp_005954683.1、xp_004667759.1、xp_004479306.1、xp_004645843.1、xp_004016543.1、xp_002928268.1、xp_006091904.1、xp_005331614.1、xp_007196549.1、xp_007092705.1、xp_004620532.1、xp_004869789.1、eha98800.1、xp_004016545.1、xp_004479307.1、xp_004093105.1、np_001095518.1、xp_005408101.1、xp_004409350.1、xp_001498290.1、xp_006056693.1、xp_005216639.1、xp_007455745.1、xp_005352049.1、xp_004328970.1、xp_002709220.1、xp_004878092.1、xp_007196553.1、xp_006996816.1、xp_005331615.1、xp_006772157.1、xp_007196552.1、xp_004016546.1、xp_007628721.1、np_803452.1、xp_004479304.1、daa21601.1、xp_003920207.1、xp_006091906.1、xp_003464227.1、xp_006091903.1、xp_006189706.1、xp_007455744.1、xp_004585544.1、xp_003801410.1、xp_007124812.1、xp_006900488.1、xp_004777680.1、xp_005907436.1、xp_004389356.1、xp_007124811.1、xp_005660937.1、xp_007628724.1、xp_003513512.1、xp_004437813.1、xp_007628723.1、ere78858.1、epq15380.1、xp_005862178.1、xp_005878672.1、xp_540581.1、xp_002928267.1、xp_004645845.1、epq05184.1、xp_003513511.1、xp_006214972.1、xp_007196545.1、xp_007196547.1、xp_006772160.1、xp_003801409.1、np_001119750.1、xp_003801412.1、xp_006772159.1、eaw73832.1、xp_006091897.1、xp_006772163.1、xp_006091898.1、xp_005408105.1、xp_006900487.1、xp_003993454.1、xp_003122754.3、xp_007455746.1、xp_005331618.1、xp_004585337.1、xp_005063305.1、xp_006091895.1、xp_006772156.1、xp_004051276.1、xp_004683488.1、np_666047.1、np_001013784.2、xp_006996815.1、xp_006996821.1、xp_006091893.1、xp_006173036.1、xp_006214971.1、epy89845.1、xp_003826423.1、np_964011.2、xp_007092707.1、xp_005063858.1、bal43174.1、xp_001161154.2、xp_007124813.1、np_083826.1xp_003464239.1、xp_003275394.1、elk23978.1、xp_004878097.1、xp_004878098.1、xp_004437459.1、xp_004264204.1、xp_004409351.1、xp_005352047.1、q5rfp0.1、xp_005408107.1、xp_007659164.1、xp_003909852.1、xp_002755355.1、np_001126806.1、aap92593.1、np_001244199.1、baa34427.1、xp_005063859.1、np_599157.2、xp_004667761.1、xp_006900489.1、xp_006215013.1、xp_005408100.1、xp_007628718.1、xp_003514769.1、xp_006160935.1、xp_004683489.1、xp_003464329.1、xp_004921258.1、xp_003801447.1、xp_006167892.1、xp_004921305.1、aah89619.1、xp_004706162.1、xp_003583243.1、efb16804.1、xp_006728603.1、epq05185.1、xp_002709040.1、xp_006875861.1、xp_005408103.1、xp_004391425.1、edl41477.1、xp_006772158.1、egw06527.1、aah15294.1、xp_006772162.1、xp_005660939.1、xp_005352050.1、xp_006091901.1、xp_005878675.1、xp_004051323.1、eha98803.1、xp_003779925.1、edm12924.1、xp_003421400.1、xp_006160939.1、xp_006160938.1、xp_006160937.1、xp_006160936.1、xp_005702185.1、xp_005313023.1、xp_003769190.1、xp_002714424.1、xp_004715051.1、xp_007661593.1、xp_004590594.1、elk23975.1、xp_004674085.1、xp_004780477.1、xp_006231186.1、xp_003803573.1、xp_004803176.1、efb16803.1、xp_006056694.1、xp_005441626.1、xp_005318647.1xp_004605904.1、xp_005862182.1、xp_003430682.1、xp_004780478.1、xp_005239278.1、xp_003897760.1、xp_007484121.1、xp_004892683.1、xp_004414286.1、xp_006927013.1、xp_003923145.1、xp_852587.2、aap97178.1、ehh53105.1、xp_005408113.1、xp_002915474.1、xp_005377590.1、xp_527404.2、xp_005552830.1、xp_004044211.1、np_001180996.1、xp_003513513.2、xp_001498599.2、xp_002746654.1、xp_005072349.1、xp_006149181.1、eax04334.1、xp_003833230.1、xp_005216635.1、xp_003404197.1、xp_007523363.1、xp_007433902.1、xp_003254235.1、xp_004471242.1、xp_005216634.1、xp_006860675.1、xp_004771956.1、xp_006038833.1、np_001138534.1、xp_007068532.1、xp_003510714.1、ere87950.1、xp_003986313.1、xp_006728644.1、xp_004878099.1、xp_003468014.1、xp_007095614.1、xp_004648849.1、xp_004869795.1、xp_004018927.1、xp_005696454.1、xp_006201985.1、xp_005960697.1、xp_004813725.1、xp_005496926.1、elr45088.1、xp_004696625.1、xp_005860982.1、xp_005911003.1、xp_006260162.1、epq04414.1、xp_006099775.1、np_001138532.1、xp_006190795.1、xp_004649775.1、xp_004424497.1、xp_004390885.1、xp_005911004.1、xp_003777803.1、xp_004312259.1、xp_005529140.1、xp_005314582.1、xp_006926523.1、xp_006926522.1、xp_004683491.1、xp_003826680.1、xp_003215018.1、xp_003215087.1、egw12611.1、xp_006113023.1、xp_006882182.1、xp_007425200.1、xp_006041342.1、np_001138533.1、emp27694.1、xp_007497753.1、xp_006034252.1及其变体。本文中与氨基酸-n-酰基转移酶结合使用的术语‘变体’表示这样的多肽：其基本上具有至少一种上述氨基酸-n-酰基转移酶的氨基酸序列，但是其中已经通过常规方法有意地造成一个或多个插入、缺失、添加和/或置换。所述变体与上述氨基酸-n-酰基转移酶中的任一种相比可能在序列上变化，但是它们能够维持它们的功能。在一个实例中，所述变体相对于上述氨基酸-n-酰基转移酶中的任一个包含50%、60%、65%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、97%、98%、99%序列同一性。具体地，氨基酸-n-酰基转移酶的每种变体能够维持氨基酸-n-酰基转移酶的功能。具体地，根据本发明的任何方面使用的氨基酸-n-酰基转移酶相对于seqidno:63和64可以包含50%、60%、65%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、97%、98%、99%序列同一性。根据本发明的任何方面，术语“变体”表示在功能必需的那些氨基酸以外包含氨基酸差异的多核苷酸和/或多肽。例如，一种特定酶的变体包含导致所述酶的催化活性的序列/部分、或所述酶的折叠或结构。仅有的变化是在所述酶的非必需部分中。这些非如此必需的氨基酸可以通过插入来删除、置换或替换，或必需氨基酸可以以保守的方式被替换以达到参照序列或从其衍生出的分子的生物活性被保留的效果。现有技术包括可以用于比对两个给出的核酸或氨基酸序列和计算同一性程度的算法，例如参见lesk,2008,thompson等人,1994,和katoh等人,2005。术语“变体”与术语“同系物”同义地和可互换地使用。这样的变体可以如下制备：在氨基酸或核酸序列以及包含这样的大分子或其变体的融合体中引入缺失、插入或置换。在一个实例中，关于氨基酸序列，术语“变体”除了包含所述序列同一性以外，还包含与各个参照或野生型序列相比包含一个或多个保守氨基酸变化的氨基酸序列，或包含编码含有一个或多个保守氨基酸变化的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实例中，氨基酸序列或核酸序列的术语“变体”除了包含所述序列同一性程度以外，还包含所述氨基酸序列或核酸序列各自的任意活性部分和/或片段，或编码氨基酸序列的活性部分和/或片段的任意核酸序列。在一个优选的实施方案中，本文中使用的术语“活性部分”表示这样的氨基酸序列或核酸序列：其分别小于全长氨基酸序列或编码小于全长氨基酸序列，其中所述氨基酸序列或所述编码的氨基酸序列分别保留至少一些它的基本生物活性。例如蛋白酶的活性部分和/或片段能够水解多肽中的肽键。在一个实例中，本文中使用的术语“保留它的至少一些基本生物活性”是指，目标氨基酸序列具有超过和不同于背景活性的生物活性和表征所述活性的动力学参数，更具体地kcat和km是在参照分子相对于特定底物表现出的值的3、2或1个数量级内。在一个实例中，术语核酸的“变体”包含这样的核酸，其互补链在严谨条件下与参照或野生型核酸杂交。氨基酸-n-酰基-转移酶的变体的实例可以至少提供在图3中。杂交反应的严谨性可以由本领域普通技术人员容易地确定，且通常是依赖于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算。一般而言，较长的探针需要较高的温度才能适当对合，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当存在于低于它们的熔化温度的环境中时变性的dna与互补链重新对合的能力。探针和可杂交的序列之间的期望同源性程度越高，可以使用的相对温度越高。所以，接下来较高的相对温度将倾向于使反应条件更严谨，而较低的温度使反应条件不太严谨。关于杂交反应的额外细节和严谨性的解释，参见f.m.ausubel(1995)。本领域技术人员可以遵循在手册“thedigsystemusersguideforfilterhybridization”,1993和在liebl等人,1991（关于如何借助于杂交来鉴别dna序列）中提供的指导。可以将严谨条件应用于任何杂交，即仅当探针与靶序列具有70%或更多同一性时发生杂交。与靶序列具有较低同一性程度的探针可以杂交，但是这样的杂交体是不稳定的，且将在严谨条件下在洗涤步骤中除去，例如通过将盐浓度降低至2xssc，或者，任选地和随后，降低至0.5xssc，而温度以递增优先顺序为大约50℃-68℃、大约52℃-68℃、大约54℃-68℃、大约56℃-68℃、大约58℃-68℃、大约60℃-68℃、大约62℃-68℃、大约64℃-68℃、大约66℃-68℃。在一个实例中，温度可以是大约64℃-68℃或大约66℃-68℃。可能将盐浓度调至0.2xssc或甚至0.1xssc。可以分离与参照或野生型序列具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性程度的多核苷酸片段。在一个实例中，本文中使用的术语核酸序列的“同系物”表示，按照遗传密码的简并性，编码与参照核酸序列相同的氨基酸序列的任何核酸序列。技术人员能够容易地确定将能够制备蛋白质氨基酸和/或脂肪酸的氨基酸-n-酰基-转移酶。具体地，所述变体可以包括、但不限于来自选自由以下成员组成的生物集合的任何生物的氨基酸-n-酰基-转移酶：白颊长臂猿（nomascusleucogenys）(nl,xp_003275392.1)、亚马逊松鼠猴（saimiriboliviensis）(sb,xp_003920208.1)、家猫（feliscatus）(fc,xp_003993512.1)、欧洲牛（bostaurus）(bt,np_001178259.1)和小家鼠（musmusculus）(mm,np_666047.1)。本文中使用的术语“酰基氨基酸”表示由氨基酸-n-酰基转移酶催化的反应的产物，具体地，由式酰基-co-nh-chr-cooh代表的化合物，其中r是蛋白质氨基酸的侧链，且其中术语“酰基”表示脂肪酸的酰基残基。根据本发明的任何方面，本文中使用的术语“脂肪酸”是指羧酸，在一个实例中，所述脂肪酸包含6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个碳原子。具体地，所述脂肪酸可以是具有至少6、8、10或12个碳原子的链烷酸。更具体地，所述脂肪酸具有12个碳原子。在一个实例中，可以使用直链脂肪酸。在另一个实例中，所述脂肪酸可以是支链。在一个实例中，根据本发明的任何方面使用的脂肪酸可以是饱和脂肪酸。在另一个实例中，所述脂肪酸可以是不饱和的。具体地，根据本发明的任何方面使用的脂肪酸可以是具有至少12个碳原子的直链脂肪酸，其包含双键，例如在位置9。在另一个实例中，所述脂肪酸可以是具有一个双键的简单不饱和脂肪酸，其中所述双键可以位于位置9或11处。更具体地，根据本发明的任何方面使用的脂肪酸可以是月桂烯酸(9-十二烯酸)。在一个实例中，所述酰基氨基酸可以是脂肪酰基甘氨酸盐。在该实例中，任何脂肪酸可以与氨基酸甘氨酸结合使用。具体地，所述脂肪酸包含6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个碳原子。更具体地，所述脂肪酰基甘氨酸盐可以是选自c6-c24酰基甘氨酸盐的任何甘氨酸盐。例如，所述甘氨酸盐可以是c6酰基甘氨酸盐、c7酰基甘氨酸盐、c8酰基甘氨酸盐、c9酰基甘氨酸盐、c10酰基甘氨酸盐、c11酰基甘氨酸盐、c12酰基甘氨酸盐、c13酰基甘氨酸盐、c14酰基甘氨酸盐、c15酰基甘氨酸盐、c16酰基甘氨酸盐、c17酰基甘氨酸盐、c18酰基甘氨酸盐、c19酰基甘氨酸盐、c20酰基甘氨酸盐、c21酰基甘氨酸盐、c22酰基甘氨酸盐、c23酰基甘氨酸盐、c24酰基甘氨酸盐等。根据本发明的任何方面，表示化学基团（其代表能够在水溶液中解离的化合物的解离或未解离状态）的式包含解离状态和未解离状态以及所述基团的各种盐形式。例如，残余物-cooh包含质子化的(-cooh)以及未质子化的(-coo-)羧酸。根据本发明的任何方面使用的酰基辅酶a底物可以从至少一种细胞纯化，使用酰基辅酶a合成酶化学合成和/或生产。具体地，根据本发明的任何方面使用的酰基辅酶a底物可以使用酰基辅酶a合成酶生产。本文中使用的术语“酰基辅酶a合成酶”表示能够催化脂肪酸和辅酶a至酰基辅酶a的atp依赖性转化的酶。具体地，酰基辅酶a合成酶可以表示可以能够生产酰基甘氨酸盐和/或催化下述反应的酰基辅酶a/acp合成酶：脂肪酸+辅酶a/acp+atp→酰基辅酶a/acp+adp+pi酰基辅酶a/acp合成酶的实例可以包括、但不限于：ec6.2.1.3、ec6.2.1.10、ec6.2.1.15、ec6.2.1.20等。根据本发明的任何方面使用的酰基辅酶a合成酶可以选自：yp_001724804.1、wp_001563489.1、np_707317.1等。在一个实例中，所述酰基辅酶a合成酶可以包含seqidno:65或yp_001724804.1或其变体。结合酰基辅酶a合成酶在本文中使用的术语‘变体’表示基本上具有至少一种上述酰基辅酶a合成酶的氨基酸序列的多肽，但是其中已经通过常规方法有意地造成一个或多个插入、缺失、添加和/或置换。所述变体与上述酰基辅酶a合成酶中的任一个相比可以在序列上变化，但是它们能够维持它们的功能。在一个实例中，所述变体相对于上述酰基辅酶a合成酶中的任一个包含50%、60%、65%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、97%、98%、99%序列同一性。用于检测酰基辅酶a合成酶活性的多种方法是本领域已知的。例如，酰基辅酶a合成酶的活性可以如下测定：在有250µm月桂酰基辅酶a、500µm甘氨酸和dtnb(5,5’-二硫代双-2-硝基苯甲酸,也被称作ellman氏试剂)存在下，将目标样品在100mmtris-hcl（ph8）中温育，并且在随着反应进行以coash的形式释放游离硫醇基团以及与ellman氏试剂的反应以后通过分光光度计法监测在410nm的吸光度。可以如在现有技术（例如kang,y.,2010）中所述测定酰基辅酶a合成酶的活性。简而言之，如下确定呈未反应的coash的形式的游离硫醇的量：加入ellmann氏试剂并通过分光光度计法监测在410nm的吸光度，优选地在包含150mmtris-hcl(ph7.2)、10mmmgcl2、2mmedta、0.1%tritonx-100、5mmatp、0.5mm辅酶a(coash)和脂肪酸(30-300mm)的反应缓冲液中。在一个实例中，可以将根据本发明的任何方面的细胞遗传修饰以增加至少氨基酸-n-酰基转移酶和酰基辅酶a合成酶的表达。具体地，所述细胞可以过表达甘氨酸n-酰基转移酶和酰基辅酶a/acp合成酶。本文中使用的短语“增加的酶活性”和“酶的过表达”应理解为增加的细胞内活性。基本上，酶活性的增加可以如下实现：使用强启动子或采用编码对应的具有增加的活性的酶的基因或等位基因，并且任选地通过组合这些措施，增加编码所述酶的一个或多个基因序列的拷贝数。根据本发明的任何方面使用的遗传修饰的细胞是，例如，使用含有所需基因、该基因或其部分的等位基因的载体以及使该基因的表达成为可能的载体，通过转化、转导、接合或这些方法的组合而生产。具体地，异源表达通过将基因或等位基因整合进细胞的染色体中或在染色体外复制的载体中而实现。本文中使用的术语‘在甘氨酸代谢中涉及的酶’表示至少一种这样的酶：其可以能够通过催化甘氨酸的分解和/或催化甘氨酸向其它氨基酸的转化而减少细胞中甘氨酸的总量。在一个实例中，所述甘氨酸可以分解成二氧化碳和/或氨。在另一个实例中，所述甘氨酸可以转化成丝氨酸和/或苏氨酸。在另一个实例中，所述甘氨酸可以通过同时分解成二氧化碳和/或氨和转化成丝氨酸和/或苏氨酸而在细胞中代谢。图7显示了可能的甘氨酸代谢途径的总结。具体地，在甘氨酸代谢中涉及的酶可以选自：至少一种甘氨酸裂解系统的酶、甘氨酸羟甲基转移酶(glya)、苏氨酸醛缩酶(ltae)、苏氨酸脱氢酶(tdh)、2-氨基-3-酮丁酸盐辅酶a-连接酶(kbl)和别苏氨酸脱氢酶(ydfg)。根据本发明的任何方面的术语‘甘氨酸羟甲基转移酶’可以是指催化以下化学反应的酶：5,10-亚甲基四氢叶酸盐+甘氨酸+h2o四氢叶酸盐+l-丝氨酸甘氨酸羟甲基转移酶(ec2.1.2.1)属于转移单碳基团（具体地，羟甲基-、甲酰基-）的转移酶和有关的转移酶的家族。具体地，根据本发明的任何方面使用的glya可以包含seqidno:61的多肽序列或其变体。结合glya在本文中使用的术语‘变体’表示这样的多肽：其基本上具有与seqidno:61相同的序列，但是其中已经通过常规方法有意地造成一个或多个插入、缺失、添加和/或置换。所述变体与seqidno:61相比可以在序列上变化，但是它们能够维持它们的功能。在一个实例中，所述变体相对于seqidno:61包含50%、60%、65%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、97%、98%、99%序列同一性。类似地，根据本发明的任何方面使用的ltae可以包含seqidno:62的多肽序列或其变体。结合ltae在本文中使用的术语‘变体’表示这样的多肽：其基本上具有与seqidno:62相同的序列，但是其中已经通过常规方法有意地造成一个或多个插入、缺失、添加和/或置换。所述变体与seqidno:62相比可能在序列上变化，但是它们能够维持它们的功能。具体地，ltae的变体相对于seqidno:62可能包含50%、60%、65%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、97%、98%、99%序列同一性。类似地，根据本发明的任何方面使用的tdh可以包含seqidno:81的多肽序列或其变体。结合tdh在本文中使用的术语‘变体’表示这样的多肽：其基本上具有与seqidno:81相同的序列，但是其中已经通过常规方法有意地造成一个或多个插入、缺失、添加和/或置换。所述变体与seqidno:81相比可能在序列上变化，但是它们能够维持它们的功能。具体地，tdh的变体相对于seqidno:81可能包含50%、60%、65%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、97%、98%、99%序列同一性。根据本发明的任何方面使用的kbl可以包含seqidno:80的多肽序列或其变体。结合kbl在本文中使用的术语‘变体’表示这样的多肽：其基本上具有与seqidno:80相同的序列，但是其中已经通过常规方法有意地造成一个或多个插入、缺失、添加和/或置换。所述变体与seqidno:80相比可能在序列上变化，但是它们能够维持它们的功能。具体地，kbl的变体相对于seqidno:80可能包含50%、60%、65%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、97%、98%、99%序列同一性。并且，根据本发明的任何方面使用的ydfg可以包含seqidno:82的多肽序列或其变体。结合kbl在本文中使用的术语‘变体’表示这样的多肽：其基本上具有与seqidno:82相同的序列，但是其中已经通过常规方法有意地造成一个或多个插入、缺失、添加和/或置换。所述变体与seqidno:82相比可能在序列上变化，但是它们能够维持它们的功能。具体地，ydfg的变体相对于seqidno:82可能包含50%、60%、65%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、97%、98%、99%序列同一性。短语“至少一种来自甘氨酸裂解系统的酶”表示响应于高浓度的氨基酸甘氨酸而触发的一系列酶。所述甘氨酸裂解系统由四种蛋白组成：t-蛋白(gcvt)、p-蛋白(gcvp)、l-蛋白(gcvl)和h-蛋白(gcvh)。所述h-蛋白负责与其它三种蛋白相互作用并在甘氨酸脱羧中充当一些中间产物的穿梭体。在动物和植物中，甘氨酸裂解系统松散地附着于线粒体的内膜。根据本发明的任何方面可以减少这些酶中的任一种的表达。更具体地，甘氨酸裂解系统h蛋白携带硫辛酸并与甘氨酸裂解系统蛋白p、l和t相互作用；甘氨酸裂解系统p蛋白(ec1.4.4.2)催化反应甘氨酸+[甘氨酸-裂解复合物h蛋白]-n(6)-硫辛酰基-l-赖氨酸→[甘氨酸-裂解复合物h蛋白]-s-氨基甲基-n(6)-二氢硫辛酰基-l-赖氨酸+co2；甘氨酸裂解系统l蛋白(ec1.8.1.4)催化反应蛋白n6-(二氢硫辛酰基)赖氨酸+nad+→蛋白n6-(硫辛酰基)赖氨酸+nadh+h+；甘氨酸裂解系统t蛋白(ec2.1.2.10)催化反应[蛋白]-s8-氨基甲基二氢硫辛酰基赖氨酸+四氢叶酸盐→[蛋白]-二氢硫辛酰基赖氨酸+5,10-亚甲基四氢叶酸盐+nh3；苏氨酸醛缩酶(ec4.2.1.48)催化反应l-苏氨酸→甘氨酸+乙醛；丝氨酸羟基甲基转移酶(ec2.1.2.1)催化反应5,10-亚甲基四氢叶酸盐+甘氨酸+h2o+四氢叶酸盐+l-丝氨酸。根据本发明的任何方面使用的来自甘氨酸裂解系统的酶可以选自下面表1中提及的序列及其变体。结合来自甘氨酸裂解系统的酶在本文中使用的术语‘变体’表示这样的多肽：其基本上具有在表1中提及的至少一种来自甘氨酸裂解系统的酶的氨基酸序列，但是其中已经通过常规方法有意地造成一个或多个插入、缺失、添加和/或置换。所述变体与下面提及的来自甘氨酸裂解系统的酶中的任一种相比可能在序列上变化，但是它们能够维持它们的功能。在一个实例中，所述变体相对于下面提及的来自甘氨酸裂解系统的酶中的任一种包含50%、60%、65%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。更具体地，gcvt的序列可以是seqidno:58。gcvp的序列可以是seqidno:60。gcvh的序列可以是seqidno:59。甚至更具体地，gcvt、gcvp和gcvh的序列可以分别包含seqidno:58、seqidno:60和seqidno:59。在本申请中，除非相反地指示，否则任何数据库代码表示可从ncbi数据库（更具体地，在2014年8月6日在线版本）得到的序列，且如果这样的序列是核苷酸序列，则包含通过翻译所述核苷酸序列而得到的多肽序列。在一个实例中，根据本发明的任何方面的细胞可以包含：至少与野生型细胞相比增加氨基酸-n-酰基-转移酶的表达的第一基因突变和增加酰基辅酶a合成酶的表达的第二基因突变，和至少与野生型细胞相比减少选自以下的至少一种酶的表达的第三基因突变：甘氨酸裂解系统的酶、甘氨酸羟甲基转移酶(glya)、苏氨酸醛缩酶(ltae)、苏氨酸脱氢酶(tdh)、2-氨基-3-酮丁酸盐辅酶a-连接酶(kbl)和别苏氨酸脱氢酶(ydfg)。来自甘氨酸裂解系统的这种酶可以是gcvt、gcvp、gcvl或gcvh。具体地，减少gcvt和gcvp、gcvt和gcvh、或gcvp和gcvh的表达。在一个实例中，可以减少gcvt、gcvp和gcvh的表达。更具体地，gcvt、gcvp和gcvh的序列可以分别是seqidno:58、seqidno:60和seqidno:59。glya的序列可以是seqidno:61，ltae的序列可以是seqidno:62，tdh的序列可以是seqidno:81，kbl的序列可以是seqidno:80，且ydfg的序列可以是seqidno:82。在另一个实例中，根据本发明的任何方面的细胞可以包含：至少与野生型细胞相比增加氨基酸-n-酰基-转移酶的表达的第一基因突变和增加酰基辅酶a合成酶的表达的第二基因突变，和至少与野生型细胞相比减少以下酶的表达的第三基因突变：gcvt、gcvp、gcvh、glya和ltae；或gcvt、gcvp、gcvh和glya；或gcvt、gcvp、gcvh和ltae；或gcvt和gcvh和glya和/或ltae；或gcvp和gcvh和glya和/或ltae；或gcvt和gcvp和glya和/或ltae；或gcvt、gcvp、gcvh、glya和tdh；或gcvt、gcvp、gcvh和tdh；或gcvt和gcvh和glya和/或tdh；或gcvp和gcvh和glya和/或tdh；或gcvt和gcvp和glya和/或tdh；或gcvt、gcvp、gcvh、glya和kbl；或gcvt、gcvp、gcvh和kbl；或gcvt和gcvh和glya和/或kbl；或gcvp和gcvh和glya和/或kbl；或gcvt和gcvp和glya和/或kbl或gcvt、gcvp、gcvh、glya和ydfg；或gcvt、gcvp、gcvh和ydfg；或gcvt和gcvh和glya和/或ydfg；或gcvp和gcvh和glya和/或ydfg；或gcvt和gcvp和glya和/或ydfg；在一个实例中，根据本发明的任何方面的细胞可以包含：至少与野生型细胞相比增加氨基酸-n-酰基-转移酶的表达的第一基因突变和增加酰基辅酶a合成酶的表达的第二基因突变，和与野生型细胞相比减少至少gcvt、gcvp、gcvh和至少一种选自ltae、tdh、kbl和ydfg的酶的表达的第三基因突变。在另一个实例中，根据本发明的任何方面的细胞可以包含：至少与野生型细胞相比增加氨基酸-n-酰基-转移酶的表达的第一基因突变和增加酰基辅酶a合成酶的表达的第二基因突变，和与野生型细胞相比减少至少glya和至少一种选自ltae、tdh、kbl和ydfg的酶的表达的第三基因突变。具体地，根据本发明的任何方面的细胞可以包含：至少与野生型细胞相比增加氨基酸-n-酰基-转移酶的表达的第一基因突变和增加酰基辅酶a合成酶的表达的第二基因突变，和与野生型细胞相比减少至少gcvt、gcvp、gcvh、glya和至少一种选自ltae、tdh、kbl和ydfg的酶的表达的第三基因突变。例如，根据本发明的任何方面的细胞可以包含-至少与野生型细胞相比增加氨基酸-n-酰基-转移酶的表达的第一基因突变，-至少与野生型细胞相比增加酰基辅酶a合成酶的表达的第二基因突变，和-至少与野生型细胞相比减少至少gcvt、gcvp、gcvh和ltae的表达的第三基因突变；或-至少与野生型细胞相比减少至少gcvt、gcvp、gcvh和tdh的表达的第三基因突变；或-至少与野生型细胞相比减少至少gcvt、gcvp、gcvh和kbl的表达的第三基因突变；或-至少与野生型细胞相比减少至少gcvt、gcvp、gcvh和ydfg的表达的第三基因突变；或-至少与野生型细胞相比减少至少glya和ltae的表达的第三基因突变；或-至少与野生型细胞相比减少至少glya和tdh的表达的第三基因突变；或-至少与野生型细胞相比减少至少glya和kbl的表达的第三基因突变；或-至少与野生型细胞相比减少至少glya和ydfg的表达的第三基因突变；或-至少与野生型细胞相比减少至少gcvt、gcvp、gcvh和glya和ltae的表达的第三基因突变；或-至少与野生型细胞相比减少至少gcvt、gcvp、gcvh和glya和tdh的表达的第三基因突变；或-至少与野生型细胞相比减少至少gcvt、gcvp、gcvh和glya和kbl的表达的第三基因突变；或-至少与野生型细胞相比减少至少gcvt、gcvp、gcvh和glya和ydfg的表达的第三基因突变；或-至少与野生型细胞相比减少至少gcvt、gcvp、gcvh、glya、ltae和kbl的表达的第三基因突变。根据本发明的任何方面可以维持或减少gcvl的表达。本文中使用的短语“减少的酶活性”应理解为减少的细胞内活性。基本上，酶活性的减少可以如下实现：减少编码所述酶的一个或多个基因序列的拷贝数，使用弱启动子或采用使各种酶沉默以降低活性的基因或等位基因，和任选地组合这些措施。根据本发明的任何方面使用的遗传修饰的细胞例如通过转化、转导、接合或这些方法与以下载体的组合而生产：含有结合该基因或其部分的沉默子的载体，和使得所述基因的关闭成为可能的载体。根据本发明的任何方面的细胞可以包含其它基因突变，所述其它基因突变产生与野生型细胞相比具有降低的脂肪酸降解能力的细胞。具体地，所述降低的脂肪酸降解能力可以是与野生型细胞相比选自以下的至少一种酶的表达下降的结果：酰基辅酶a脱氢酶、2,4-二烯酰辅酶a还原酶、烯酰辅酶a水合酶和3-酮酰基辅酶a硫解酶。具体地，本文中使用的术语“具有降低的脂肪酸降解能力”是指，各个细胞降解脂肪酸（特别是从环境吸收的那些）的速度低于具有正常脂肪酸降解能力的可比较细胞或野生型细胞在相同条件下的速度。更具体地，因为至少一个编码在β-氧化途径中涉及的酶的基因的缺失、抑制或灭活，这样的细胞的脂肪酸降解较低。在一个实例中，与各种野生型微生物中的相同酶在可比较条件下的活性相比，至少一种在β-氧化途径中涉及的酶已经丧失5%、10%、20%、40%、50%、75%、90或99%活性。本领域技术人员熟知可以用于缺失编码酶的基因或降低细胞中这样的酶的活性的各种技术，例如通过将细胞暴露于放射性、随后积累或筛选得到的突变体，点突变的定位引入，或编码活性酶的染色体整合基因的敲除，如在sambrook/fritsch/maniatis(1989)中所述。另外，可以过表达转录抑制子fadr达到在β-氧化途径中涉及的酶的表达被抑制的效果(fujita,y.,2007)。本文中使用的术语“基因的缺失”是指，编码所述基因的核酸序列可以经过修饰，使得由所述基因编码的活性多肽的表达减少。例如，可以如下缺失基因：在框架内除去包含编码多肽的催化活性中心的序列的序列的一部分。可替换地，可以改变核糖体结合位点，使得核糖体不再翻译相应的rna。本领域技术人员能够使用如在酶学教科书（例如cornish-bowden(1995)）中所述的标准测定常规地测量由活细胞表达的酶的活性。脂肪酸的降解可以通过一系列酶促催化反应来实现。首先，脂肪酸通过运输/酰基-活化机制而被吸收和跨细胞膜转移，所述机制包括至少一种外膜蛋白和一种内膜结合的具有脂肪酸辅酶a连接酶活性的蛋白，在大肠杆菌的情况下分别被称作fadl和fadd/fadk。在细胞内，要降解的脂肪酸遭受催化β-氧化途径的其它反应的酶。第一个细胞内步骤涉及酰基辅酶a通过酰基辅酶a脱氢酶转化成烯酰辅酶a，后者在大肠杆菌的情况下被称作fade。使用本领域已知的任意方法，可以测定酰基辅酶a脱氢酶的活性。例如，通过分光光度计法在340nm在100mmmops（ph7.4）、0.2mm烯酰辅酶a、0.4mmnad+中监测nadh的浓度。得到的烯酰辅酶a通过烯酰辅酶a水合酶/3-羟基酰基辅酶a脱氢酶（在大肠杆菌中被称作fadb和fadj）催化的水合和氧化经由3-羟基酰基辅酶a转化成3-酮酰基辅酶a。可以如在现有技术中所述（例如如关于fade所述）通过分光光度计法测定烯酰辅酶a水合酶/3-羟基酰基辅酶a脱氢酶活性，更具体地产物nadh的形成。最后，大肠杆菌中的3-酮脂酰基辅酶a硫解酶fada和fadi催化3-酮酰基辅酶a的裂解，以产生乙酰辅酶a和缩短了2个碳原子的输入酰基辅酶a。可以如在现有技术中（例如在antonenkov,v.,1997中）所述测定酮脂酰基辅酶a硫解酶的活性。具体地，本文中使用的术语“具有降低的脂肪酸降解能力的细胞”表示具有降低的吸收和/或降解脂肪酸（特别是具有至少8碳链的那些）的能力的细胞。可以以不同的方式降低细胞的脂肪酸降解能力。在一个实例中，所述细胞与其野生型相比具有降低的在β-氧化途径中涉及的酶的活性。在一个实例中，本文中使用的术语“在β-氧化途径中涉及的酶”表示这样的酶：其与通过β-氧化途径作为所述脂肪酸的降解的一部分而形成的脂肪酸或其衍生物直接地相互作用，β-氧化途径包含一系列实现脂肪酸转化为乙酰辅酶a和缩短的脂肪酸的辅酶a酯的反应，优选地通过将脂肪酸或其衍生物识别为底物，并将它转化为作为β-氧化途径的一部分而形成的代谢物。例如，酰基辅酶a脱氢酶是在β-氧化途径中涉及的酶，因为它与脂肪酸辅酶a相互作用并将脂肪酸辅酶a酯转化成烯酰辅酶a，后者是作为β-氧化的一部分而形成的代谢物。在一个实例中，本文中使用的术语“在β-氧化途径中涉及的酶”包含选自以下的任意多肽：酰基辅酶a脱氢酶、烯酰辅酶a水合酶、3-羟基酰基辅酶a脱氢酶和3-酮-酰基辅酶a硫解酶。随后，酰基辅酶a合成酶可以催化脂肪酸转化为脂肪酸的辅酶a酯，即这样的分子，其中羧基的官能团-oh被-s-coa替换，优选地用于将所述脂肪酸引入β-氧化途径。例如，大肠杆菌中的多肽fadd和fadk(登录号:baa15609.1)是酰基辅酶a脱氢酶。在一个实例中，本文中使用的术语“酰基辅酶a脱氢酶”是能够催化酰基辅酶a转化成烯酰辅酶a（优选地作为β-氧化途径的一部分）的多肽。例如，大肠杆菌中的多肽fade(登录号:baa77891.2)是酰基辅酶a脱氢酶。具体地，本文中使用的术语“2,4-二烯酰辅酶a还原酶”是这样的多肽：其能够催化2,4-二烯酰基辅酶a从不饱和脂肪酸转化成烯酰辅酶a，更具体地作为β-氧化途径的一部分。例如，大肠杆菌中的多肽fadh是2,4-二烯酰辅酶a还原酶。在一个实例中，本文中使用的术语“烯酰辅酶a水合酶”也被称作3-羟基酰基辅酶a脱氢酶，表示能够催化烯酰辅酶a通过水合和氧化转化成3-酮酰基辅酶a（优选地作为β-氧化途径的一部分）的多肽。例如，大肠杆菌中的多肽fadb和fadj(登录号:bae77457.1)是烯酰辅酶a水合酶。具体地，本文中使用的术语“酮酰基辅酶a硫解酶”表示这样的多肽：其能够催化裂解的3-酮酰基辅酶a的转化，从而产生缩短了2个碳原子的酰基辅酶a和乙酰辅酶a，作为β-氧化途径的最终步骤。例如，大肠杆菌中的多肽fada和fadi(登录号:ap009048.1)是酮酰基辅酶a硫解酶。在一个实例中，可以将根据本发明的任何方面的细胞遗传修饰以导致至少一种氨基酸n-酰基转移酶增加的活性、以及至少一种酰基辅酶a合成酶增加的活性、以及fadl和/或alkl的至少一种转运蛋白增加的活性。具体地，可以将根据本发明的任何方面的细胞遗传修饰成与野生型细胞相比过表达甘氨酸n-酰基转移酶、酰基辅酶a/acp合成酶、fadl和alkl的转运蛋白。这些细胞可以能够生产酰基甘氨酸盐。在另一个实例中，可以将根据本发明的任何方面的细胞相对于野生型细胞进行遗传修饰以：-增加氨基酸n-酰基转移酶、酰基辅酶a合成酶的表达；和-降低至少一种酶的活性，所述酶选自：酰基辅酶a脱氢酶fade、多功能的3-羟基丁酰基辅酶a差向异构酶、δ3-顺式-δ2-反式-烯酰基辅酶a异构酶、烯酰辅酶a水合酶、3-羟基酰基辅酶a脱氢酶fadb、3-酮酰基辅酶a硫解酶和电子转移黄素蛋白。在另一个实例中，可以将根据本发明的任何方面的细胞相对于野生型细胞进行遗传修饰以导致：-增加氨基酸n-酰基转移酶、酰基辅酶a合成酶和fadl和/或alkl的至少一种转运蛋白的表达；和-降低至少一种酶的活性，所述酶选自：酰基辅酶a脱氢酶fade、多功能的3-羟基丁酰基辅酶a差向异构酶、δ3-顺式-δ2-反式-烯酰基辅酶a异构酶、烯酰辅酶a水合酶、3-羟基酰基辅酶a脱氢酶fadb、3-酮酰基辅酶a硫解酶和电子转移黄素蛋白。具体地，酰基辅酶a脱氢酶fade(ec1.3.8.7、ec1.3.8.8或ec1.3.8.9)可以催化反应酰基辅酶a+电子转移黄素蛋白=反式-2,3-脱氢酰基辅酶a+还原的电子转移黄素蛋白；多功能的3-羟基丁酰基辅酶a差向异构酶(ec5.1.2.3)、δ3-顺式-δ2-反式-烯酰基辅酶a异构酶(ec5.3.3.8)、烯酰辅酶a水合酶(ec4.2.1.17)和3-羟基酰基辅酶a脱氢酶(ec1.1.1.35)fadb可以催化反应(s)-3-羟基丁酰基辅酶a→(r)-3-羟基丁酰基辅酶a，(3z)-3-烯酰基辅酶a→(2e)-2-烯酰基辅酶a，(3s)-3-羟基酰基辅酶a→反式-2-烯酰基辅酶a+h2o，(s)-3-羟基酰基辅酶a+nad+=3-氧代酰基辅酶a+nadh+h+；3-酮酰基辅酶a硫解酶(ec2.3.1.16)可以催化反应酰基辅酶a+乙酰辅酶a→辅酶a+3-氧代酰基辅酶a；和电子转移黄素蛋白(ec1.5.5.1)可以催化以下反应：还原的电子转移黄素蛋白+泛醌→电子转移黄素蛋白+泛醇。更具体地，可以将根据本发明的任何方面的细胞相对于野生型细胞进行遗传修饰以增加甘氨酸n-酰基转移酶、酰基辅酶a/acp合成酶、fadl和alkl的转运蛋白的表达；和减少酰基辅酶a脱氢酶fade、多功能的3-羟基丁酰基辅酶a差向异构酶、δ3-顺式-δ2-反式-烯酰基辅酶a异构酶、烯酰辅酶a水合酶、3-羟基酰基辅酶a脱氢酶fadb、3-酮酰基辅酶a硫解酶和电子转移黄素蛋白的活性。在一个实例中，可以将根据本发明的任何方面的细胞相对于野生型细胞进行遗传修饰以：-增加氨基酸n-酰基转移酶、酰基辅酶a合成酶的表达；和-降低至少一种酶的活性，所述酶选自：甘氨酸裂解系统h蛋白、甘氨酸裂解系统p蛋白、甘氨酸裂解系统l蛋白、甘氨酸裂解系统t蛋白、苏氨酸醛缩酶、甘氨酸羟甲基转移酶、苏氨酸脱氢酶、2-氨基-3-酮丁酸盐辅酶a-连接酶和别苏氨酸脱氢酶。在另一个实例中，可以将根据本发明的任何方面的细胞相对于野生型细胞进行遗传修饰以：-增加氨基酸n-酰基转移酶、酰基辅酶a合成酶和fadl和/或alkl的至少一种转运蛋白的表达；和-降低至少一种酶的活性，所述酶选自：酰基辅酶a脱氢酶fade、多功能的3-羟基丁酰基辅酶a差向异构酶、δ3-顺式-δ2-反式-烯酰基辅酶a异构酶、烯酰辅酶a水合酶、3-羟基酰基辅酶a脱氢酶fadb、3-酮酰基辅酶a硫解酶和电子转移黄素蛋白。在另一个实例中，可以将根据本发明的任何方面的细胞相对于野生型细胞进行遗传修饰以：-增加氨基酸n-酰基转移酶、酰基辅酶a合成酶和fadl和/或alkl的至少一种转运蛋白的表达；-降低至少一种酶的活性，所述酶选自：酰基辅酶a脱氢酶fade、多功能的3-羟基丁酰基辅酶a差向异构酶、δ3-顺式-δ2-反式-烯酰基辅酶a异构酶、烯酰辅酶a水合酶、3-羟基酰基辅酶a脱氢酶fadb、3-酮酰基辅酶a硫解酶和电子转移黄素蛋白；和-降低至少一种酶的活性，所述酶选自：甘氨酸裂解系统h蛋白、甘氨酸裂解系统p蛋白、甘氨酸裂解系统l蛋白、甘氨酸裂解系统t蛋白、苏氨酸醛缩酶和甘氨酸羟甲基转移酶、苏氨酸脱氢酶、2-氨基-3-酮丁酸盐辅酶a-连接酶和别苏氨酸脱氢酶。具体地，可以将根据本发明的任何方面的细胞相对于野生型细胞进行遗传修饰以增加甘氨酸n-酰基转移酶、酰基辅酶a/acp合成酶、fadl和alkl的转运蛋白的表达；减少酰基辅酶a脱氢酶fade、多功能的3-羟基丁酰基辅酶a差向异构酶、δ3-顺式-δ2-反式-烯酰基辅酶a异构酶、烯酰辅酶a水合酶、3-羟基酰基辅酶a脱氢酶fadb、3-酮酰基辅酶a硫解酶、电子转移黄素蛋白的活性；和减少甘氨酸裂解系统h蛋白、甘氨酸裂解系统p蛋白、甘氨酸裂解系统l蛋白、甘氨酸裂解系统t蛋白、苏氨酸醛缩酶、甘氨酸羟甲基转移酶、苏氨酸脱氢酶、2-氨基-3-酮丁酸盐辅酶a-连接酶和别苏氨酸脱氢酶的活性。更具体地，甘氨酸裂解系统h蛋白携带硫辛酸并与甘氨酸裂解系统蛋白p、l和t相互作用；甘氨酸裂解系统p蛋白(ec1.4.4.2)催化反应甘氨酸+[甘氨酸-裂解复合物h蛋白]-n(6)-硫辛酰基-l-赖氨酸→[甘氨酸-裂解复合物h蛋白]-s-氨基甲基-n(6)-二氢硫辛酰基-l-赖氨酸+co2；甘氨酸裂解系统l蛋白(ec1.8.1.4)催化反应蛋白n6-(二氢硫辛酰基)赖氨酸+nad+→蛋白n6-(硫辛酰基)赖氨酸+nadh+h+；甘氨酸裂解系统t蛋白(ec2.1.2.10)催化反应[蛋白]-s8-氨基甲基二氢硫辛酰基赖氨酸+四氢叶酸盐→[蛋白]-二氢硫辛酰基赖氨酸+5,10-亚甲基四氢叶酸盐+nh3；苏氨酸醛缩酶(ec4.2.1.48)催化反应l-苏氨酸→甘氨酸+乙醛；丝氨酸羟基甲基转移酶(ec2.1.2.1)催化反应5,10-亚甲基四氢叶酸盐+甘氨酸+h2o+四氢叶酸盐+l-丝氨酸。根据本发明的任何方面的细胞可以生产要转化成酰基氨基酸的脂肪酸。在一个实例中，正是生产酰基氨基酸的细胞可以能够生产用于生产酰基氨基酸的脂肪酸。具体地，可以将细胞遗传修饰成能够生产脂肪酸。在一个实例中，所述遗传修饰可以降低特定酶活性，且这可以通过基因破坏或遗传修饰来进行。所述遗传修饰还可以增加特定酶活性。具体地，所述遗传修饰可以增加选择的脂肪酸或脂肪酸衍生出的化学产物的微生物合成到对照或野生型细胞的速率以上。该对照或野生型细胞可能缺乏该遗传修饰以生产所选择的化学产物。可以能够生产脂肪酸和/或蛋白质氨基酸的细胞至少描述在us20140051136中。所述脂肪酸可以是不饱和脂肪酸，且可以选自肉豆蔻烯酸、月桂烯酸、棕榈油酸和顺式-异油酸。在另一个实例中，所述脂肪酸可以是饱和脂肪酸，且可以选自月桂酸盐、肉豆蔻酸盐和棕榈酸盐。根据本发明的任何方面的脂肪酸可以以有机相的形式提供，所述有机相包含液体有机溶剂和脂肪酸，其中所述有机溶剂可以是所述脂肪酸的酯。在一个实例中，可以将根据本发明的任何方面的细胞遗传修饰成增加氨基酸n-酰基转移酶、酰基辅酶a合成酶的表达，且在细胞中包含能够从至少一种碳水化合物生产至少一种脂肪酸的遗传修饰。对酶或酶活性的非限制性遗传修饰的列表提供在下面表2中。根据本发明的任何方面的细胞可以包含产生脂肪酸并将脂肪酸转化成n-酰基氨基酸的遗传修饰的组合。具体地，可以将根据本发明的任何方面的细胞遗传修饰成增加氨基酸n-酰基转移酶、酰基辅酶a合成酶的表达且包含在表2中列出的任何遗传修饰。更具体地，可以将细胞遗传修饰以增加n-酰基转移酶、酰基辅酶a合成酶、fadl和alkl的转运蛋白的表达且包含在表2中列出的任何遗传修饰。甚至更具体地，可以将细胞遗传修饰以增加n-酰基转移酶、酰基辅酶a合成酶、fadl和alkl的转运蛋白的表达，减少酰基辅酶a脱氢酶fade、多功能的3-羟基丁酰基辅酶a差向异构酶、δ3-顺式-δ2-反式-烯酰基辅酶a异构酶、烯酰辅酶a水合酶、3-羟基酰基辅酶a脱氢酶fadb、3-酮酰基辅酶a硫解酶、电子转移黄素蛋白的活性；减少甘氨酸裂解系统h蛋白、甘氨酸裂解系统p蛋白、甘氨酸裂解系统l蛋白、甘氨酸裂解系统t蛋白、苏氨酸醛缩酶、甘氨酸羟甲基转移酶、苏氨酸脱氢酶、2-氨基-3-酮丁酸盐辅酶a-连接酶和别苏氨酸脱氢酶的活性，且包含在表2中列出的任何遗传修饰。在一个实例中，所述alkl可以包含相对于seqidno:78具有50%、60%、65%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列，和/或所述fadl可以包含相对于seqidno:79具有50%、60%、65%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。在一个实例中，可以将根据本发明的任何方面的细胞遗传修饰成增加氨基酸n-酰基转移酶、酰基辅酶a/acp合成酶的表达和减少至少一种选自β-酮酰基-acp合酶i、3-氧代酰基-acp-合酶i、丙二酰基辅酶a-acp酰基转移酶、烯酰基acp还原酶和β-酮酰基-acp合酶iii的酶的表达。具体地，根据本发明的任何方面的细胞中的遗传修饰可以包含：与野生型细胞相比氨基酸n-酰基转移酶、酰基辅酶a/acp合成酶的表达的增加，和β-酮酰基-acp合酶i、3-氧代酰基-acp-合酶i、丙二酰基辅酶a-acp酰基转移酶、烯酰基acp还原酶和β-酮酰基-acp合酶iii的表达的减少。因此，本发明的细胞和方法可以包括：提供遗传修饰的微生物，所述微生物既包含得到脂肪酸或脂肪酸衍生产物的生产途径，还包含经修饰的多核苷酸，所述多核苷酸编码丙二酰基-acp依赖性的脂肪酸合酶系统的酶，所述酶表现出减少的活性，使得与缺少此类修饰的可比较（对照）微生物相比，丙二酰基辅酶a的利用转向所述生产途径。所述方法包括在提供有营养培养基的容器中，使用此类遗传修饰的微生物群体生产化学产物。本文所述的对其它酶（诸如乙酰辅酶a羧化酶和/或nadph依赖性的转氢酶）的其它遗传修饰可能存在于一些这样的实例中。经证实，提供编码表现出这些酶活性的多肽的多核苷酸的额外拷贝会增加脂肪酸或脂肪酸衍生产物产量。增加这些各种酶活性的其它方式是本领域已知的，并且可以应用于本发明的各个实例。并且，非限制性地，在一些制造脂肪酸的多阶段方法中的第一步可以举例如下：向容器（如培养或生物反应器容器）中提供营养培养基（诸如本领域技术人员已知的基本培养基）和遗传修饰的微生物的接种物，以便提供这样的微生物（诸如细菌，更具体地，肠杆菌科（enterobacteriaceae）的成员，诸如大肠杆菌）的群体，其中所述遗传修饰的微生物包含将丙二酰基辅酶a转化成脂肪酸的代谢途径。在容器中培养该接种物，使得细胞密度增加至适于达到一定脂肪酸或脂肪酸衍生产物的生产水平的细胞密度，所述生产水平满足整体生产力指标（将所述方法的下一步考虑在内）。在不同的替代实施方案中，可以将这些遗传修饰的微生物群体在第一制备容器中培养至第一细胞密度，然后转移至经标注的容器以便提供所选择的细胞密度。众多多容器培养策略是本领域技术人员已知的。任何这样的方法会提供根据本发明的任何方面的所选择的细胞密度。非限制性地，后续步骤可以用两个方案举例，所述两个方案也可以在不同的实施方案中组合实施。第一个方案为遗传修饰的微生物提供遗传修饰，使得可以控制它的烯酰基-acp还原酶酶活性。作为一个实例，可以进行遗传修饰以用温度敏感的突变型烯酰基-acp还原酶（例如，大肠杆菌中的fabits）替代天然烯酰基-acp还原酶。前者可能在30℃以上的温度表现出减少的酶活性，但在30℃表现出正常的酶活性，所以将培养温度升高至例如34℃、35℃、36℃、37℃或甚至42℃会减少烯酰基-acp还原酶的酶活性。在此情况下，相比在30℃时，更多的丙二酰基辅酶a被转化成脂肪酸或脂肪酸衍生产物或另一种化学产物，其中丙二酰基辅酶a向脂肪酸的转化不受低效率的烯酰基-acp还原酶阻碍。在根据本发明的任何方面的细胞中可以包括可用于生产脂肪酸和/或氨基酸的其它遗传修饰。例如，可以提供利用蔗糖的能力，并且这会扩大可以用于生产脂肪酸或脂肪酸衍生产物或其它化学产物的原料的范围。大肠杆菌的常见实验室和工业菌株，诸如本文描述的菌株，不能利用蔗糖作为唯一碳源。由于蔗糖和含有蔗糖的原料诸如糖蜜是丰富的并且经常用作用于微生物发酵生产的原料，可以在具有本文提供的其它特征的菌株中实现添加适当的遗传修饰以允许蔗糖的摄取和利用。多种蔗糖摄取和代谢系统是本领域已知的(例如，美国专利号6,960,455)。并且，可以提供遗传修饰以添加用于分解更复杂碳源（诸如纤维质生物质或其产物）的功能性，用于摄取和/或用于利用这样的碳源。例如，已经研究和表征了众多纤维素酶和基于纤维素酶的纤维素降解系统(beguin,p1994和ohima,k.等人,1997)。在某些实例中,遗传修饰会增加辅因子nadph的库和可用性，和/或，结果，也可以提供nadph/nadp+比率。例如，在大肠杆菌中，这可以通过增加一个或多个下述基因的活性（诸如通过遗传修饰）来实现：pgi(以突变形式)，pntab，过表达，gapa:gapn置换/替换，和破坏或修饰可溶性的转氢酶诸如stha，和/或zwf、gnd和edd中的一个或多个的遗传修饰。可以将任何这样的遗传修饰提供给不具有这样的功能性或具有小于这样的功能性的期望水平的物种。更一般地，且取决于为遗传修饰选择的微生物的特定代谢途径，可以做出遗传修饰的任何亚组以减少发酵产物的细胞生产，所述发酵产物选自乙酸盐、3-羟基2-丁酮、丙酮、丙烯酸、苹果酸盐、脂肪酸乙酯、类异戊二烯、甘油、乙二醇、乙烯、丙烯、丁烯、异丁烯、乙酸乙酯、乙酸乙烯酯、其它乙酸盐、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇、丁醇、异丁醇、仲丁醇、丁酸盐、异丁酸盐、2-oh-异丁酸盐、3-oh-丁酸盐、乙醇、异丙醇、d-乳酸盐、l-乳酸盐、丙酮酸盐、衣康酸盐、乙酰丙酸盐、葡萄糖二酸盐、戊二酸盐、己内酰胺、己二酸、丙醇、异丙醇、杂醇和1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、甲酸盐、富马酸、丙酸、琥珀酸、戊酸和马来酸。可以如本文中一般地公开的那样产生基因缺失，并且其它方案也可以用于实现所选发酵产物的所需降低的细胞产量。具体地，根据本发明的任何方面的细胞可以包含至少：-与野生型细胞相比增加氨基酸-n-酰基-转移酶(其可以是人氨基酸-n-酰基-转移酶)的表达的第一基因突变；-至少与野生型细胞相比增加酰基辅酶a合成酶的表达的第二基因突变，和-至少与野生型细胞相比减少选自以下的至少一种酶的表达的第三基因突变：甘氨酸裂解系统的酶、甘氨酸羟甲基转移酶(glya)、苏氨酸醛缩酶(ltae)、苏氨酸脱氢酶(tdh)、2-氨基-3-酮丁酸盐辅酶a-连接酶(kbl)，和别苏氨酸脱氢酶(ydfg)。具体地，所述氨基酸-n-酰基-转移酶与seqidno:63或seqidno:64具有50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、97%、98%、99%序列同一性。更具体地，所述氨基酸-n-酰基-转移酶与seqidno:63或seqidno:64具有85%序列同一性。根据本发明的任何方面的细胞可以进一步被遗传修饰成包含第四基因突变以与野生型细胞相比增加至少一种转运蛋白的表达。所述转运蛋白可以是fadl和alkl。在一个实例中，与野生型细胞相比，在根据本发明的任何方面的细胞中仅fadl或alkl可以表达/过表达。在另一个实例中，与野生型细胞相比，在根据本发明的任何方面的细胞中fadl和alkl都可以表达/过表达。本文中使用的术语“细胞”表示任何永久单细胞的生物体，包括细菌、古细菌、真菌、藻类等。具体地，根据本发明的任何方面使用的细胞可以是细菌细胞。更具体地，所述细胞可以选自假单胞菌属（pseudomonas）、棒杆菌属（corynebacterium）、芽孢杆菌属（bacillus）和埃希氏菌属（escherichia）。甚至更具体地，所述细胞可以是大肠杆菌。在一个实例中，所述细胞可以是低等真核生物，尤其是选自酵母属（saccharomyces）、假丝酵母属（candida）、毕赤酵母属（pichia）、裂殖酵母属（schizosaccharomyces）和耶氏酵母属（yarrowia）的真菌，具体地，酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）。所述微生物可以是分离的细胞，换而言之，单个菌株的纯培养物，或可以包含至少两个菌株的混合物。生物技术上有关的细胞是商购可得的，例如得自美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection，atcc)或德国微生物和细胞培养物保藏中心(germancollectionofmicroorganismsandcellcultures，dsmz)。用于保持和改变细胞的颗粒可得自现有技术，例如sambrook/fritsch/maniatis(1989)，等。短语“与它的野生型相比具有增加的或减少的活性”是指，所述微生物已经经过遗传修饰从而分别具有这种增加的或减少的活性。技术人员会理解，细胞中酶的过表达或外源酶的表达可以是可适用的。使用野生型细胞或重组细胞可以实践本发明的任何方面。具体地，根据本发明的任何方面提及的至少一种酶，尤其是来自氨基酸n-酰基-转移酶、酰基辅酶a合成酶、酰基辅酶a硫酯酶中的至少一种或全部，选自甘氨酸裂解系统的酶、甘氨酸羟甲基转移酶(glya)、苏氨酸醛缩酶(ltae)苏氨酸脱氢酶(tdh)、2-氨基-3-酮丁酸盐辅酶a-连接酶(kbl)和/或别苏氨酸脱氢酶(ydfg)的酶，可以是重组的。本文中使用的术语“重组的”表示非天然存在、而是基因工程的结果的分子或由这样的分子编码，例如多肽或核酸，或表示包含重组分子的细胞。例如，在以下情况下，核酸分子是重组的：核酸分子包含在功能上与编码催化活性多肽的序列连接的启动子，且所述启动子已经经过工程改造使得所述催化活性多肽相对于包含原始的未改变的核酸分子的对应野生型细胞中的多肽水平过表达。核酸分子、多肽（更具体地，根据本发明的任何方面需要的酶）是否是重组的可能不一定影响它的表达水平。但是，根据本发明的任何方面，可能需要一种或多种重组核酸分子、多肽或酶以允许所述酶产生期望的酶表达的增加或减少。在一个实例中，本文中使用的术语“过表达”是指，编码或表达的各种多肽的表达水平或活性高于在没有用于增加表达的遗传修饰存在下在相同条件下在所述细胞中（例如在各种野生型细胞中）通常存在的。本领域技术人员熟知众多实现过表达的方式。例如，要过表达的核酸分子或编码要过表达的多肽或酶的核酸分子可以置于强诱导型启动子（诸如lac启动子）的控制下。现有技术描述了可以用于该目的的标准质粒，例如以pet-3a为代表的pet载体系统(可商购得自novagen)。通过定量pcr反应（在核酸分子的情况下）、sds聚丙烯酰胺电泳、蛋白质印迹法或比较活性测定（在多肽的情况下），可以确定核酸或多肽是否被过表达。遗传修饰可以指向在选择的和/或鉴别的培养条件下导致酶活性和/或选择性的变化的转录修饰、翻译修饰和/或翻译后修饰。因而，在本发明的不同实例中，为了更有效地发挥功能，微生物可以包含一个或多个基因缺失。基因缺失可以通过突变性基因缺失方案来完成，和/或开始于具有减少的这些酶中的一种或多种的表达或不表达的突变株，和/或本领域技术人员已知的其它方法。在一个实例中，来自n-酰基-转移酶、酰基辅酶a合成酶、酰基辅酶a硫酯酶、甘氨酸裂解系统的酶、甘氨酸羟甲基转移酶(glya)苏氨酸醛缩酶(ltae)、苏氨酸脱氢酶(tdh)、2-氨基-3-酮丁酸盐辅酶a-连接酶(kbl)和别苏氨酸脱氢酶(ydfg)中的至少一种或全部可以是分离的酶。在每种情况下，根据本发明的任何方面的任何酶可以以活性状态和在有它的活性所必需的所有辅因子、底物、辅助和/或活化多肽或因子存在下使用。本文中使用的术语“分离的”是指，目标酶与它在其中天然存在的细胞相比被富集。通过sds聚丙烯酰胺电泳和/或活性测定，可以确定酶是否被富集。例如，目标酶可以占存在于制品中的所有多肽的超过5%、10%、20%、50%、75%、80%、85%、90%、95%或99%，如用考马斯蓝染料染色以后目检聚丙烯酰胺凝胶所判断的。具有增加的氨基酸-n-酰基-转移酶和酰基辅酶a合成酶的表达和减少的选自甘氨酸裂解系统的酶、甘氨酸羟甲基转移酶(glya)苏氨酸醛缩酶(ltae)、苏氨酸脱氢酶(tdh)、2-氨基-3-酮丁酸盐辅酶a-连接酶(kbl)和别苏氨酸脱氢酶(ydfg)的至少一种酶的表达、任选地具有降低的脂肪酸降解能力的根据本发明的任何方面的细胞可以能够产生蛋白质氨基酸和/或脂肪酸。在一个实例中，本文中使用的术语“蛋白质氨基酸”表示选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸的氨基酸。在反应中并使用已经在生物化学教科书（例如jeremymberg,2002）中详细描述的酶，作为许多野生型细胞的主要代谢的组成部分，合成蛋白质氨基酸和脂肪酸。在一个实例中，根据本发明的任何方面的细胞表达酰基辅酶a硫酯酶。具体地，本文中使用的术语“酰基辅酶a硫酯酶”表示能够水解酰基辅酶a的酶。在一个实例中，所述酰基辅酶a硫酯酶包含来自seqidno:1、aem72521.1和aac49180.1的序列或其变体。具体地，所述酰基辅酶a硫酯酶包含seqidno:1。使用现有技术中描述的各种测定，可以测定酰基辅酶a硫酯酶的活性。简而言之，通过用分光光度计测量法监测在412nm的吸光度，可以检测ellman氏试剂的反应，所述ellman氏试剂与在酰基辅酶a的水解后形成的coash的相关游离硫醇基团反应。根据本发明的另一个方面，提供了一种用于生产酰基氨基酸的方法，所述方法包括在有根据本发明的任何方面的至少一种细胞存在下接触氨基酸和脂肪酸和/或其酰基辅酶a。所述氨基酸-n-酰基-转移酶可以是分离的和/或重组的，其中所述氨基酸-n-酰基-转移酶可以是人氨基酸-n-酰基-转移酶，尤其是seqidno:63、seqidno:64或其变体，其中所述酰基辅酶a合成酶可以具体地是seqidno:65或其变体，所述gcvt、gcvp和gcvh可以分别是seqidno:58、seqidno:60和seqidno:59，所述glya可以是seqidno:61，且所述ltae可以是seqidno:62，或根据本发明的任何方面的培养细胞。根据本发明的任何方面的方法还可以包括以下额外步骤-使用酰基辅酶a合成酶（其可以是分离的和/或重组的）将脂肪酸转化成酰基辅酶a；和/或-氢化。根据本发明的任何方面的所有酶（具体地选自氨基酸-n-酰基-转移酶、酰基辅酶a合成酶、gcvt、gcvp、gcvh、glya、ltae、tdh、kbl和ydfg）可以以表达所述一种或多种酶的细胞的形式提供。本文中使用的术语“接触”是指，实现根据本发明的任何方面的氨基酸、酰基辅酶a和细胞之间的直接接触。在一个实例中，在水溶液中使根据本发明的任何方面的氨基酸、酰基辅酶a和细胞处于一起。例如，细胞、氨基酸和酰基辅酶a可以不在被屏障（诸如无机膜）隔开的不同隔室中。如果氨基酸或脂肪酸是可溶性的且可以被细胞吸收或可以跨生物膜扩散，可以将它简单地加给在水溶液中的根据本发明的任何方面的细胞。在它的可溶性不足的情况下，可以将它在加入水溶液中之前溶解在合适的有机溶剂中。本领域技术人员通过加入合适的有机溶剂和/或极性溶剂能够制备具有不足可溶性的氨基酸或脂肪酸的水溶液。这样的溶剂可以以包含液体有机溶剂的有机相的形式提供。在一个实例中，当在25℃和标准大气压为液体时，有机溶剂或相可以视作液体。在另一个实例中，脂肪酸可以以脂肪酸酯（诸如各种甲酯或乙酯）的形式提供。例如，脂肪酸月桂酸酯可以溶解在如ep11191520.3中所述的月桂酸甲酯中。根据本发明的任何方面，可以在体外使化合物和催化剂接触，即以大致上富集的或甚至纯化的状态，或可以在原位接触，即它们作为细胞代谢的一部分而产生，并随后在细胞内反应。术语“水溶液”包含任何含水的溶液（主要是水）作为溶剂，所述溶剂可以用于至少暂时地将根据本发明的任何方面的细胞维持在有代谢活性的和/或可存活的状态，且包含（如果这是必要的话）任何额外的底物。本领域技术人员熟知众多水溶液的制备，所述水溶液经常指的是可以用于维持根据本发明的任何方面的细胞的培养基，例如就大肠杆菌而言的lb培养基。有利的是使用基本培养基作为水溶液，所述基本培养基即适当简化组成的培养基，其与复合培养基相比仅包含将细胞维持在有代谢活性的和/或可存活的状态所必不可少的盐和营养物的最小集合，以避免不希望的副产物对产物的不必要污染。例如，m9培养基可以用作基本培养基。有利地，根据本发明的任何方面的细胞和方法可以不仅使用饱和脂肪酸，而且可以将不饱和脂肪酸转化成酰基氨基酸。在寻求的终产物包含与根据本发明的任何方面的方法开始时存在的产率相比更高的饱和酰基残基产率的情况下，可能通过氢化酰基氨基酸的酰基残基来补充所述过程。所述氢化可以根据各种现有技术方法（例如在us5734070中描述的那些）来进行。简而言之，在有氢和合适的催化剂（例如在作为支持物的氧化硅上的镍催化剂）存在下在100℃温育要氢化的化合物。根据本发明的另一个方面，提供了一种反应混合物，其包含氨基酸-n-酰基-转移酶，其可以是分离的和/或重组的，酰基辅酶a合成酶，其可以是分离的和/或重组的，氨基酸和/或酰基辅酶a或脂肪酸和酰基辅酶a-合成酶，其中所述氨基酸-n-酰基-转移酶可以是人氨基酸-n-酰基-转移酶，尤其是seqidno:4、seqidno:5或其变体，其中所述酰基辅酶a合成酶可以是seqidno:6或其变体，其中所述gcvt、gcvp和gcvh可以分别是seqidno:58、seqidno:60和seqidno:59或其变体，其中所述glya可以是seqidno:61；其中所述ltae可以是seqidno:62；其中所述tdh可以是seqidno:81；其中所述kbl可以是seqidno:80；且其中所述ydfg可以是seqidno:82。根据本发明的另一个方面，提供了一种组合物，其包含第一酰基氨基酸，其由具有8-16个碳原子的饱和酰基和甘氨酸组成，第二酰基氨基酸，其由具有10-18个碳原子的不饱和酰基和甘氨酸组成，和任选的第三酰基氨基酸，其由具有12个碳原子的饱和或不饱和酰基和选自谷氨酰胺、谷氨酸、丙氨酸和天冬酰胺的氨基酸组成。根据本发明的任何方面的组合物可以包含第一酰基氨基酸，其包含具有12个碳原子的饱和酰基（尤其是月桂基）和甘氨酸。所述第二酰基氨基酸可以包含具有12或14个碳原子的不饱和酰基和甘氨酸。具体地，形成的酰基氨基酸可以是氨基酸的混合物。所述氨基酸的混合物可以包含至少两种如下定义的蛋白质氨基酸。具体地，所述氨基酸的混合物可以具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21种蛋白质氨基酸。在一个实例中，所述氨基酸的混合物可以用于形成椰油酰基甘氨酸及其盐。有利地，通过在细胞中引入一种或多种酰基辅酶a硫酯酶或改变由细胞内源性地表达的一种或多种酰基辅酶a硫酯酶的表达，可以控制根据本发明的任何方面生产的酰基氨基酸的组成，更具体地掺入这样的酰基氨基酸中的脂肪酸的长度。附图简述以下附图和非限制性实例进一步解释了本发明，从以下附图和非限制性实例可以明白本发明的其它实施方案、方面和优点。图1的图描绘了来自大肠杆菌w3110δfadepj294{ptac}[synucte]/pcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)_fadd_ec]发酵的48h样品的总离子色谱图。图2的图描绘了来自大肠杆菌w3110δfadepj294{ptac}[synucte]/pcdf{ptac}[hglyat3(co_ec)_fadd_ec]发酵的48h样品的总离子色谱图。图3的图描绘了来自大肠杆菌w3110δfadepj294{ptac}[synucte]/pcdfduet-1发酵(阴性对照)的48h样品的总离子色谱图。图4的图显示了大肠杆菌菌株w3110δfadepcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]对月桂酰基甘氨酸盐的生产。图5的图显示了大肠杆菌菌株w3110δfadeδgcvthppcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]对月桂酰基甘氨酸盐的生产。图6是显示在实例18中测试的各种生物中的glyat2的序列同一性百分比的树。图7是显示甘氨酸的代谢途径的图解。实施例前面描述了优选的实施方案，其如本领域技术人员将理解的，可以进行设计、构造或运行方面的变化或修改，而不脱离权利要求的范围。例如，这些变化意图被权利要求的范围涵盖。序列idno：贯穿本申请使用了一系列seqidno。这些显示在下面的表3中。seqidno:评论1加州伞桂（umbellulariacalifornica）synucte(一种酰基辅酶a硫酯酶)基因(经密码子优化)2tac启动子3载体pj294[ptac-synucte]，参见实施例14智人（homosapiens）基因hglyat2(一种氨基酸n-酰基转移酶)5智人基因hglyat3(另一种氨基酸n-酰基转移酶)6大肠杆菌fadd(一种酰基辅酶a合成酶)7载体pcdf[atfa1_ab(co_ec)-fadd_ec]，参见实施例28载体pcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]，参见实施例29载体pcdf{ptac}[hglyat3(co_ec)-fadd_ec]，参见实施例210alkl(一种促进疏水酰基跨细胞膜运输的输入物)基因，参见实施例311lacuv5启动子，参见实施例312载体pcdf[alklmod1]，参见实施例313载体pcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]，参见实施例314载体pet-28b，参见实施例1015载体pet-28b{ptac}[hglyat2(co_ec)]，参见实施例1016pet-28b{ptac}[hglyat3(co_ec)]，参见实施例10表3.在实施例中使用的序列。实施例1加州伞桂基因synucte的表达载体的制备为了制备编码加州伞桂酰基辅酶a-硫酯酶的加州伞桂synucte基因(seqidno:1)的表达载体，将该基因为了在大肠杆菌中表达进行密码子优化。所述基因与tac启动子(seqidno:2)一起合成，并且同时，在启动子的上游引入一个切割位点以及在终止子的下游引入一个切割位点。将所述合成的dna片段ptac-synucte用限制性内切核酸酶bamhi和noti消化，并连接进相应地切割的载体pj294(dna2.0inc.,menlopark,ca,usa)中。完成的大肠杆菌表达载体被称作pj294[ptac-synucte](seqidno:3)。实施例2大肠杆菌fadd与智人基因hglyat3和hglyat2的共表达载体的制备为了制备编码人甘氨酸-n-酰基转移酶的智人基因hglyat2(seqidno:4)或hgylat3(seqidno:5)与编码大肠杆菌酰基辅酶a合成酶的大肠杆菌fadd(seqidno:6)的共表达载体，将基因hglyat2和hglyat3为了在大肠杆菌中表达进行密码子优化并合成。将合成的dna片段用限制性内切核酸酶sacii和eco47iii消化，并连接进相应地切割的移除了afta1基因的pcdf[atfa1_ab(co_ec)-fadd_ec](seqidno:7)中。在此过程中被另外移除的序列区段在基因合成期间共合成。此载体为pcdf衍生物，其已经包含合成的tac启动子(seqidno:2)和大肠杆菌fadd基因。将得到的表达载体命名为pcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec](seqidno:8)和pcdf{ptac}[hglyat3(co_ec)-fadd_ec](seqidno:9)。实施例3智人hglyat2、大肠杆菌fadd和恶臭假单胞菌（pseudomonasputida）alkl基因的共表达载体的制备为了制备hglyat2基因与经修饰的恶臭假单胞菌alkl基因（其编码alkl，一种促进疏水底物向细胞中的输入的外膜蛋白）的共表达载体，借助于序列特异性的寡核苷酸，将alkl基因(seqidno:10)与lacuv5启动子(seqidno:11)一起从质粒pcdf[alklmod1](seqidno:12)扩增。将pcr产物用限制性内切核酸酶bamhi和nsii切割，并连接进相应地切割的载体pcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec](seqidno:8)中。通过限制性分析来检查靶基因的正确插入，并通过dna测序来验证所引入基因的真实性。将得到的表达载体命名为pcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1](seqidno:13)。将下述参数用于pcr：1x：初始变性，98℃，3:00min；35x变性，98℃，0:10min；退火，65℃，0:20min；延伸，72℃，0:17min；1x：最终延伸，72℃，10min。对于扩增，根据生产商的手册使用来自newenglandbiolabs（frankfurt）的phusiontmhigh-fidelitymastermix。在1%tae琼脂糖凝胶上分析50µlpcr反应物。pcr操作、琼脂糖凝胶电泳、dna的溴化乙锭染色和pcr片段大小的确定均以本领域技术人员已知的方式进行。实施例4具有fade基因缺失的大肠杆菌菌株的制备，所述菌株过表达加州伞桂synucte、大肠杆菌fadd和智人hglyat2和hglyat3基因为了制备共表达加州伞桂synucte以及大肠杆菌fadd和智人hglyat2或智人hglyat3基因的大肠杆菌菌株，使用质粒pj294{ptac}[synucte]和pcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)_fadd_ec]或pcdf{ptac}[hglyat3(co_ec)_fadd_ec]借助于电穿孔转化菌株大肠杆菌w3110δfade，并铺板在补充了大观霉素(100µg/ml)和氨苄青霉素(100µg/ml)的lb琼脂平板上。通过质粒制备和分析型限制性分析，针对正确质粒的存在而检查转化体。如此制备菌株大肠杆菌w3110δfadepj294{ptac}[synucte]/pcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)_fadd_ec]和大肠杆菌w3110δfadepj294{ptac}[synucte]/pcdf{ptac}[hglyat3(co_ec)_fadd_ec]。实施例5具有fade基因缺失的大肠杆菌菌株的制备，所述菌株过表达大肠杆菌fadd和智人hglyat2或hglyat3基因为了制备过表达大肠杆菌fadd基因以及智人hglyat2或hglyat3基因的大肠杆菌菌株，制备了大肠杆菌菌株w3110δfade的电感受态细胞。将大肠杆菌w3110δfade用质粒pcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]转化，并铺板在补充了大观霉素(100µg/ml)的lb琼脂平板上。通过质粒制备和分析型限制性分析，针对正确质粒的存在而检查转化体。如此制备的菌株被命名为大肠杆菌w3110δfadepcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]。实施例6由具有fade基因缺失的大肠杆菌菌株生产脂肪酸/氨基酸加合物，所述菌株过表达synucte和fadd基因以及hglyat2或hglyat3使用在实施例4中制备的菌株研究其生产脂肪酸/氨基酸加合物的能力。从-80℃甘油培养物开始，首先将待研究的菌株铺板在补充了100µg/ml氨苄青霉素和100µg/ml大观霉素的lb琼脂平板上，并在37℃温育过夜。在每种情况下从单个菌落开始，然后使菌株在补充了100µg/ml氨苄青霉素和100µg/ml大观霉素的luria-bertani液体培养基，miller（merck,darmstadt）中生长为5ml预培养物。进一步的培养步骤在m9培养基中进行。将由38mm磷酸氢二钠二水合物、22mm磷酸二氢钾、8.6mm氯化钠、37mm氯化铵、2%(w/v)葡萄糖、2mm硫酸镁七水合物（所有化学品均来自merck,darmstadt）和0.1%(v/v)痕量元素溶液组成的培养基用25%浓度的氢氧化铵溶液调整至ph7.4。将所加入的溶解在1m盐酸（所有化学品均来自merck,darmstadt）中的由9.7mm氯化锰（ii）四水合物、6.5mm硫酸锌七水合物、2.5mm钠-edta(titriplexiii)、4.9mm硼酸、1mm钼酸钠二水合物、32mm氯化钙二水合物、64mm硫酸亚铁(ii)七水合物和0.9mm氯化铜(ii)二水合物组成的痕量元素溶液在加入m9培养基中之前过滤除菌。将20ml补充了100µg/ml大观霉素和100µg/ml氨苄青霉素的m9培养基引入带有挡板的100-ml锥形烧瓶中，并用0.5ml预培养物接种。将烧瓶在37℃和200rpm在振荡培养箱中培养。在8小时的培养时间以后，将50ml补充了100µg/ml大观霉素和100µg/ml氨苄青霉素的m9培养基引入带有挡板的250-ml锥形烧瓶中，并用10-ml培养物接种以达到0.2的光密度(600nm)。将烧瓶在37℃和200rpm在振荡培养箱中培养。当达到0.7-0.8的光密度(600nm)时，通过加入1mmiptg诱导基因表达。将菌株在30℃和200rpm培养另外48小时。在诱导的同时，向一些培养物中加入1g/l甘氨酸。在培养过程中，取样，并分析脂肪酸/氨基酸加合物存在。结果显示在图1和2中。已经可能证实，大肠杆菌菌株w3110δfadepj294{ptac}[synucte]/pcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)_fadd_ec]和大肠杆菌菌株w3110δfadepj294{ptac}[synucte]/pcdf{ptac}[hglyat3(co_ec)_fadd_ec]都能够从葡萄糖形成多种脂肪酸/氨基酸加合物，例如月桂酰基-谷氨酸。与此相比，在缺乏所述质粒的细胞（作为阴性对照）中没有发现这样的加合物(图3)。似乎轻微的序列变异，例如将hglyat2与hglyat3区分开的氨基酸置换，不会损害所述细胞的制造脂肪酸/酰基氨基酸加合物的能力，如在表4中所示。实施例7通过hplc/ms对产物的色谱定量通过hplc-esi/ms对发酵样品中的n-月桂酰基甘氨酸、n-肉豆蔻酰基甘氨酸和n-棕榈酰基甘氨酸进行定量并且检测其它酰基氨基酸。在“单离子监测”模式（sim）中，借助于外部校准(大约0.1-50mg/l)执行三种目标化合物的定量。平行地，在质量范围m/z=100-1000上进行扫描以便鉴别另外的酰基氨基酸。如下制备用于测定脂肪酸甘氨酸盐的样品：将800µl溶剂(丙酮)和200µl样品移入2-ml反应容器中。将混合物在retsch磨机中在30hz摇动1分钟，并然后在大约13000rpm离心5min。将澄清上清液用移液器取出，并在用稀释剂(80%乙腈/20%水+0.1%甲酸)适当稀释后进行分析。将所用的校准标准物同样溶解并稀释在该稀释剂中。采用下述设备：•surveyorhplc系统（thermoscientific,waltham,massachusetts,usa），其由ms泵、autosamplerplus和pdadetectorplus组成•具有hesiii源的质谱仪tsqvantage（thermoscientific,waltham,massachusetts,usa）•hplc柱：100x2mmpursuitxrsultrac8;2.8µm（agilent,santaclara,california,usa）化学品：•来自millipore系统的水•用于hplc的乙腈（merckag,darmstadt,德国）•甲酸，p.a.级（merck,darmstadt,德国）•n-丙醇lichrosolv（merck,darmstadt,德国）•n-月桂酰基甘氨酸99%（chem-impexinternational,wooddale,il,usa）•n-肉豆蔻酰基甘氨酸>98%（santacruzbiotechnology,texas,usa）•n-棕榈酰基甘氨酸>99%（出处未知）使用上述hplc柱进行hplc分离。注射体积为2µl，柱温为40℃，流速为0.3ml/min。流动相由洗脱液a(0.1%浓度(v/v)的甲酸水溶液)和洗脱液b(含有0.1%(v/v)甲酸的75%乙腈/25%正丙醇(v/v))组成。使用下述梯度概况：表5.在实施例7中使用的梯度概况。在正离子化模式下采用下述esi源参数进行hplc/ms分析：喷雾电压：3500v汽化器温度：50℃鞘气压：40辅助气压：10毛细管温度：250℃喷雾器距离：环c。通过“单离子监测”（sim）采用表6中所示的下述参数执行三种分析物的检测和定量。实施例8由具有fade基因缺失的大肠杆菌菌株生产脂肪酸氨基酸加合物，所述菌株在平行发酵系统中过表达synucte和fadd基因以及hglyat2或hglyat3将在实施例4中制备的菌株用于研究其从葡萄糖生产脂肪酸氨基酸加合物的能力。为此目的，将菌株在摇瓶中和在补料分批发酵中培养。在具有8个生物反应器的、来自dasgip的平行发酵系统中进行发酵。如在实施例6中所述制备生产细胞。使用配备了顶部搅拌器和叶轮桨叶的1l反应器进行发酵。在线测量ph和po2用于过程监测。otr/ctr测量结果用于估计尤其是代谢活性和细胞适合性。如dasgip的技术说明书中所规定的，使用ph4.0和ph7.0的标准溶液，借助于两点校准对ph电极进行校准。如技术说明书中所规定的，反应器设置有必要的传感器和连接件，并且装配了搅拌轴。然后给反应器装入300ml水并在121℃高压灭菌20min以确保无菌。将po2电极连接至测量放大器并极化过夜（至少6h）。此后，在洁净台下移除水并用m9培养基(ph7.4)替代，所述m9培养基由kh2po43.0g/l、na2hpo46.79g/l、nacl0.5g/l、nh4cl2.0g/l、2ml无菌1mmgso4*7h2o溶液和1ml/l的过滤除菌的痕量元素储备溶液（由hcl(37%)36.50g/l、mncl2*4h2o1.91g/l、znso4*7h2o1.87g/l、乙二胺四乙酸二水合物0.84g/l、h3bo30.30g/l、na2moo4*2h2o0.25g/l、cacl2*2h2o4.70g/l、feso4*7h2o17.80g/l、cucl2*2h2o0.15g/l组成）组成，其含有15g/l葡萄糖作为碳源（按30ml/l的计量添加无菌补料溶液，所述补料溶液由500g/l葡萄糖、1.3%(w/v)mgso4*7h2o组成)并补充了100mg/l大观霉素和3ml/ldow1500。此后，使用一点校准将po2电极校准至100%（搅拌器：400rpm/通气：10sl/h空气），并且如技术说明书中所规定的，通过“就地清洁”来清洁补料、校正剂和诱导剂管线。为此目的，将管道首先用70%乙醇冲洗，然后用1mnaoh冲洗，然后用无菌的充分脱矿质的水冲洗，并最后，用各种培养基填充。使用实施例4的大肠杆菌菌株，首先用冷冻培养物在补充了100mg/l大观霉素的lb琼脂平板上进行稀释划线，并将平板在37℃温育大约16h。然后用单个菌落接种补充了100mg/l大观霉素的lb培养基（10ml，在100-ml挡板烧瓶中），并使培养物在37℃和200rpm生长过夜大约16h。此后，将此培养物用于第二预培养阶段，其在50mlm9培养基中的初始od为0.2，所述m9培养基由kh2po43.0g/l、na2hpo46.79g/l、nacl0.5g/l、nh4cl2.0g/l、2ml无菌1mmgso4*7h2o溶液和1ml/l的过滤除菌的痕量元素储备溶液（由hcl(37%)36.50g/l、mncl2*4h2o1.91g/l、znso4*7h2o1.87g/l、乙二胺四乙酸二水合物0.84g/l、h3bo30.30g/l、na2moo4*2h2o0.25g/l、cacl2*2h2o4.70g/l、feso4*7h2o17.80g/l、cucl2*2h2o0.15g/l组成）组成，其补充了20g/l葡萄糖作为碳源（按40ml/l的计量添加无菌补料溶液，所述补料溶液由500g/l葡萄糖组成)，将所述第二预培养物与上述抗生素一起转移进500-ml挡板烧瓶中并在37℃/200rpm温育8-12h。为了以0.1的光密度给反应器接种，测量第二预培养阶段的od600并计算接种所需的培养物的量。借助于5-ml注射器透过隔膜将所需量的培养物置于加热并通气的反应器中。使用了表7a-c中所示的标准程序：表7.使用实施例8中的加热并通气的反应器的标准程序。使用12.5%浓度的氨溶液将ph单向地调节至ph7.0。在生长期和生物转化期间，通过搅拌器速度和通气速率将培养物中的溶解氧(po2或do)调节到至少30%。在接种以后，do从100%下降至这些30%，其中它在发酵的剩余时间中稳定地维持。发酵以补料分批方式进行，以5g/l*h葡萄糖补料（由500g/l葡萄糖、1.3%(w/v)mgso4*7h2o组成）开始补料作为补料阶段的起点，由指示分批阶段的终点的do峰触发。从补料开始起，将温度从37℃降至30℃。补料开始以后2h，用1mmiptg诱导表达。为了定量月桂酰基甘氨酸盐、肉豆蔻酰基甘氨酸盐和棕榈酰基甘氨酸盐，在发酵开始后47h和64h取样。这些样品经制备用于分析，并如实施例7中所述进行分析。已经可能证实，菌株大肠杆菌w3110δfadepj294{ptac}[synucte]/pcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)_fadd_ec]能够从葡萄糖形成月桂酰基甘氨酸盐。实施例9在补料分批发酵中对实施例5的菌株进行发酵以研究连接月桂酸和甘氨酸而得到月桂酰基甘氨酸盐的能力。该发酵在具有8个生物反应器的、来自dasgip的平行发酵系统中进行。实验设定如在实施例8中所述，例外是，补加100g/l甘氨酸（在脱矿质水中）和100g/l月桂酸盐（在月桂酸甲酯中）而非葡萄糖。为了定量发酵样品中的月桂酰基甘氨酸盐、肉豆蔻酰基甘氨酸盐和棕榈酰基甘氨酸盐，在发酵开始以后23h和42h取样。这些样品经制备用于分析，并如实施例7中所述进行分析。结果显示在表10和11中。已经可能证实，菌株大肠杆菌w3110δfadepcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)_fadd_ec]{plavuv5}[alklmod1]能够连接月桂酸和甘氨酸并生产月桂酰基甘氨酸盐。实施例10在大肠杆菌菌株中表达智人基因hglyat3和hglyat2的载体的制备，所述大肠杆菌菌株通过丙二酰基辅酶a和乙酰辅酶a生产脂肪酸为了制备在下表3（来自wo2014026162a1的表3.2）中所列的生产脂肪酸的菌株中表达智人基因hglyat2(seqidno:4)或hgylat3(seqidno:5)的载体，首先扩增基因hglyat2和hgylat3。借助于序列特异性的寡核苷酸从质粒pcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1](seqidno:13)扩增基因hglyat2并从质粒pcdf{ptac}[hglyat3(co_ec)-fadd_ec](seqidno:9)扩增hgylat3基因。将pcr产物用限制性内切核酸酶noti和saci切割，并连接进相应地切割的载体pet-28b(seqidno:14)中。通过限制性分析检查靶基因的正确插入，并通过dna测序验证所引入基因的真实性。将得到的表达载体命名为pet-28b{ptac}[hglyat2(co_ec)](seqidno:15)和pet-28b{ptac}[hglyat3(co_ec)](seqidno:16)。实施例11在摇瓶实验中由过表达hglyat2或hglyat3的菌株通过丙二酰基辅酶a和乙酰辅酶a生产脂肪酸氨基酸加合物然后使用本领域已知的任何转化方法使用根据实施例6生产的载体制备来自下表12（opxbiotechnologiesinc.,usa）的微生物菌株。具体地，使用在wo2014026162a1的第iv部分中所提供的方法。所制备的菌株被用于研究其从葡萄糖生产脂肪酸（特别是氨基酸加合物）的能力。为此目的，将菌株用载体pet-28b{ptac}[hglyat2(co_ec)](seqidno:15)和pet-28b{ptac}[hglyat3(co_ec)](seqidno:16)转化并在摇瓶中培养（wo2014026162a1的第iv部分的c分部）。使用携带空载体pet-28b的菌株bxf_031（opxbiotechnologiesinc.,usa）作为对照。进行一式三份的评价。简而言之，在50ml包含适当抗生素的terrificbroth中制备过夜启动培养物，并在30℃温育16-24小时，同时在225rpm摇动。将这些培养物用于接种150ml在sm11基本培养基中的每种菌株的培养物至0.8的od600，以5%tb培养遗留物作为起始接种物，并外加抗生素。1lsm11培养基由下述物质组成：2mlfm10微量矿物储备溶液、2.26ml1mmgso4、30g葡萄糖、200mmmops(ph7.4)、1g/l酵母浸出物、1.25mlvm1维生素混合物、0.329gk2hpo4、0.173gkh2po4、3g(nh4)2so4、0.15g柠檬酸(无水)；fm10微量矿物储备溶液由下述物质组成：1ml浓hcl、4.9gcacl2*2h2o、0.97gfecl3*6h2o、0.04gcocl2*6h2o、0.27gcucl2*2h2o、0.02gzncl2、0.024gna2moo4*2h2o、0.007gh3bo3、0.036gmncl2*4h2o，加入适量去离子水至100ml；vm1维生素混合物溶液由下述物质组成：5g硫胺素、5.4g泛酸、6.0g烟碱酸、0.06g，加入适量去离子水至1000ml。在（wo2014026162a1的第iv部分的a分部）中提供了在本实施例中所用的培养基的所有成分。将培养物在30℃温育2小时，同时在225rpm摇动。2小时后，用sm11（不含磷酸盐的sm11培养基）洗涤细胞。将细胞离心两次(4,000rpm,15min)，倾析出上清液，将沉淀物再悬浮于150mlsm11（不含磷酸盐的sm11培养基）中。将培养物用于接种3×50ml在sm11（无磷酸盐）中的每种菌株。使培养物在30℃生长大约2h，2h以后达到1.0-1.5的od600并将温度转换至37℃，并历时72小时定期取样用于产物测量。通过hplc-esi/ms执行发酵样品中的n-月桂酰基甘氨酸、n-肉豆蔻酰基甘氨酸和n-棕榈酰基甘氨酸的定量和其它酰基氨基酸的检测。表12.在实施例10和11中用于引入基因hglyat2或hglyat3的微生物菌株的列表。在wo2014026162a1（opxbiotechnologiesinc.,usa）的表3.2中提供了生产方法和菌株序列。实施例12用于在大肠杆菌w3110δfade中缺失gcvthp操纵子的载体的制备为了制备用于缺失大肠杆菌w3110的gcvthp操纵子的载体，所述操纵子编码甘氨酸裂解系统（gcvt：氨基甲基转移酶，四氢叶酸盐依赖性的，甘氨酸裂解复合物的亚基(t蛋白)；gcvh：甘氨酸裂解复合物硫辛酰基蛋白；gcvp：甘氨酸脱羧酶，plp依赖性的,甘氨酸裂解复合物的亚基(蛋白p)），通过pcr扩增gcvthp操纵子的上游和下游大约500bp。使用寡核苷酸o-mo-40(seqidno:22)和o-mo-41(seqidno:23)扩增gcvthp的上游区域。使用寡核苷酸o-mo-42(seqidno:24)和o-mo-43(seqidno:25)扩增gcvthp的下游区域。在上面实施例3中描述了pcr程序。在每种情况下，可以扩增预期大小的pcr片段(pcr1,553bp,(seqidno:26)；pcr2,547bp,seqidno:27)。通过琼脂糖凝胶电泳分离pcr样品，并使用qiaquick凝胶提取试剂盒（qiagen,hilden）分离dna片段。将纯化的pcr片段克隆进载体pko3(seqidno:28)中，并使用geneart®无缝克隆和组装试剂盒（lifetechnologies,carlsbad,ca,usa）用bamhi切割。将组装的产物转化进化学感受态大肠杆菌dh5α细胞（newenglandbiolabs,frankfurt）中。根据生产商的手册进行pcr纯化、体外克隆和转化的操作。通过限制性分析检查靶基因的正确插入，并通过dna测序验证所引入的dna片段的真实性。将得到的敲除的载体命名为pko3δgcvthp(seqidno:29)。在pko3δgcvthp的帮助下，使用link等人,1997所述的方法构建菌株大肠杆菌w3110δfadeδgcvthp。缺失gcvthp之后的dna序列为seqidno:30。借助于电穿孔使用质粒pcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1](seqidno：13，实施例3)转化大肠杆菌菌株w3110δfadeδgcvthp，并铺板在补充了大观霉素(100µg/ml)的lb琼脂平板上。通过质粒制备和分析型限制性分析，针对正确质粒的存在而检查转化体。将得到的菌株命名为大肠杆菌w3110δfadeδδgcvthppcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]。实施例13由具有fade或fade/gcvthp基因缺失的大肠杆菌菌株生产月桂酰基甘氨酸盐，所述菌株过表达hglyat2、fadd和alkl基因使用在实施例1中制备的菌株研究其与没有gcvthp缺失的参照菌株相比生产更多月桂酰基甘氨酸盐的能力。从-80℃甘油培养物开始，首先将待研究的菌株铺板在补充了100µg/ml大观霉素的lb琼脂平板上，并在37℃温育过夜。在每种情况下从单个菌落开始，然后使菌株在补充了100µg/ml大观霉素的lb-液体培养基，miller（merck,darmstadt）中生长为5-ml预培养物。进一步的培养步骤在m9-fit培养基中进行。此培养基由38mm磷酸氢二钠二水合物、22mm磷酸二氢钾、8.6mm氯化钠、37mm氯化铵、2mm硫酸镁七水合物（所有化学品均来自merck,darmstadt）、5%(w/v)麦芽糊精溶液（右旋糖当量13.0-17.0,sigmaaldrich,taufkirchen）、1%(w/v)来自黑曲霉（aspergillusniger）的淀粉糖苷酶（sigma-aldrich,taufkirchen）、1滴delamex180（bussetti&co,wien）和0.1%(v/v)痕量元素溶液组成，用25%浓度的氢氧化铵溶液调节至ph7.4。所加入的痕量元素溶液由9.7mm氯化锰(ii)四水合物、6.5mm硫酸锌七水合物、2.5mm钠-edta(titriplexiii)、4.9mm硼酸、1mm钼酸钠二水合物、32mm氯化钙二水合物、64mm硫酸亚铁(ii)七水合物和0.9mm氯化铜(ii)二水合物组成，溶解在1m盐酸(所有化学品均来自merck,darmstadt)中，在被加入到m9培养基中之前进行过滤除菌。将20ml补充了100µg/ml大观霉素的m9培养基引入带有挡板的100-ml锥形烧瓶中，并用0.5ml预培养物接种。将烧瓶在37℃和200rpm在振荡培养箱中培养。在8小时的培养时间后，将50ml补充了100µg/ml大观霉素的m9培养基引入带有挡板的250-ml锥形烧瓶中，并接种10-ml培养物以达到0.1的光密度(600nm)。将烧瓶在37℃和200rpm在振荡培养箱中培养。当达到0.6-0.8的光密度(600nm)时，通过加入1mmiptg诱导基因表达。将菌株在37℃和200rpm培养另外48小时。在诱导以后1-3h，向培养物中加入6g/l甘氨酸和6g/l月桂酸（溶于月桂酸甲酯中）。培养0h和24h后，取样，并分析存在的月桂酰基甘氨酸盐、月桂酸和甘氨酸。结果显示在图4和5中。已经可能证实，大肠杆菌菌株w3110δfadepcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]和大肠杆菌菌株w3110δfadeδgcvthppcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]都能够形成月桂酰基甘氨酸盐。但是在新菌株背景δfadeδgcvthp中，合成了更高量的月桂酰基甘氨酸盐，并检测到更高量的甘氨酸。似乎更少的甘氨酸在δgcvthp背景中被代谢并可被用于月桂酰基甘氨酸盐合成。实施例14用于在大肠杆菌w3110δfade中缺失glya基因的载体的制备为了制备用于缺失glya基因的载体，所述glya基因编码大肠杆菌w3110的甘氨酸羟甲基转移酶的组分，通过pcr扩增glya基因的上游和下游大约500bp。使用寡核苷酸o-mo-44(seqidno:31)和o-mo-45(seqidno:32)扩增glya的上游区域。使用寡核苷酸o-mo-46(seqidno:33)和o-mo-47(seqidno:34)扩增glya的下游区域。在每种情况下，可以扩增预期大小的pcr片段(pcr1,546bp,(seqidno:35)；pcr2,520bp,seqidno:36)。通过琼脂糖凝胶电泳分离pcr样品，并使用qiaquick凝胶提取试剂盒（qiagen,hilden）分离dna片段。通过交叉pcr组装经纯化的pcr片段。将制备的片段纯化并根据生产商的手册亚克隆进克隆载体pcr®-bluntiitopo（lifetechnologies）中。为了将片段克隆进靶质粒pko3(seqidno:28)中，使用寡核苷酸o-mo-52(seqidno:37)和o-mo-53(seqidno:38)将其与侧接bamhi限制位点一起扩增。将经纯化的、bamhi切割的pcr3片段(seqidno:39)连接进相应地切割的载体pko3(seqidno:28)中。将组装的产物转化进化学感受态的大肠杆菌dh5α细胞（newenglandbiolabs,frankfurt）中。根据生产商的手册进行pcr纯化、体外克隆和转化的操作。通过限制性分析检查靶基因的正确插入，并通过dna测序验证所引入基因的真实性。将所得的敲除的载体命名为pko3δglya(seqidno:40)。在pko3δglya的帮助下，使用link等人,1997所述的方法构建菌株大肠杆菌w3110δfadeδglya。seqidno:41是缺失glya之后的dna序列。使用质粒pcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]（seqidno:13，来自实施例3）借助于电穿孔转化大肠杆菌菌株w3110δfadeδgcvthp，并铺板在补充了大观霉素(100µg/ml)的lb琼脂平板上。通过质粒制备和分析型限制性分析，针对正确质粒的存在而检查转化体。将得到的菌株命名为大肠杆菌w3110δfadeδglyapcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]。实施例15用于在大肠杆菌w3110δfade中缺失ltae基因的载体的制备为了制备用于缺失ltae基因的载体，所述ltae基因编码大肠杆菌w3110的l-别-苏氨酸醛缩酶，如上所述通过pcr扩增ltae的上游和下游大约500bp。使用寡核苷酸ltae-up_fw(seqidno:42)和ltae-up-xhoi_rev(seqidno:43)扩增ltae的上游区域。使用寡核苷酸ltae-down_fw(seqidno:44)和ltae-down_rev(seqidno:45)扩增ltae的下游区域。在每种情况下，可以扩增预期大小的pcr片段(pcr4,550bp,(seqidno:46)；pcr5,536bp,seqidno:47)。通过琼脂糖凝胶电泳分离pcr样品，并使用qiaquick凝胶提取试剂盒（qiagen,hilden）分离dna片段。通过交叉pcr组装经纯化的pcr片段。将制备的片段纯化并根据生产商的手册克隆进克隆载体pcr®-bluntiitopo（lifetechnologies）中。为了将片段克隆进靶质粒pko3(seqidno:28)中，使用寡核苷酸o-mo-54(seqidno:48)和o-mo-55(seqidno:49)将其与侧接bamhi限制位点一起扩增。将经纯化的、bamhi切割的pcr6片段(seqidno:50)连接进相应地切割的载体pko3(seqidno:28)中。将组装的产物转化进化学感受态的大肠杆菌dh5α细胞（newenglandbiolabs,frankfurt）中。根据生产商的手册进行pcr纯化、体外克隆和转化的操作。通过限制性分析检查靶基因的正确插入，并通过dna测序验证所引入基因的真实性。将所得的敲除的载体命名为pko3δltae(seqidno:51)。在pko3δltae的帮助下，使用link等人,1997所述的方法构建菌株大肠杆菌w3110δfadeδltae。在seqidno:52中描述了缺失ltae之后的dna序列)。使用质粒pcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]（seqidno:13，来自实施例3）借助于电穿孔转化大肠杆菌菌株w3110δfadeδltae，并铺板在补充了大观霉素(100µg/ml)的lb琼脂平板上。通过质粒制备和分析型限制性分析，针对正确质粒的存在而检查转化体。将得到的菌株命名为大肠杆菌w3110δfadeδltaepcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]。实施例16基于lc-esi/ms2对月桂酸的定量借助于lc-esi/ms2在外部校准月桂酸(0.1-50mg/l)的基础上并通过使用内部标准品d3-ls进行发酵样品中的月桂酸的定量。使用下述仪器：•具有自动采样器(g1367e)、二元泵(g1312b)和热静态柱(g1316a)的hplc系统1260(agilent;böblingen)；•具有esi源的质谱仪tripelquad6410(agilent;böblingen)；•hplc柱：kinetexc18，100x2.1mm，粒径：2.6µm，孔径100å(phenomenex；aschaffenburg)•前置柱：krudkatcherultrahplc线内过滤器；0.5µm过滤器深度和0.004mm内径(phenomenex;aschaffenburg)。通过将1900µl溶剂(80%(v/v)acn、20%双蒸馏的h2o(v/v)、+0.1%甲酸)和100µl样品移入2ml反应容器中来制备样品。将混合物涡旋大约10秒，并然后在大约13000rpm离心5min。将澄清上清液使用移液器取出，并在用稀释剂(80%(v/v)acn、20%双蒸馏的h2o(v/v)、+0.1%甲酸)适当稀释后进行分析。在每种情况下，将100µlistd加入到900µl样品（10µl，样品体积90µl）中。使用上述柱和前置柱进行hplc分离。注射体积为1.0µl，柱温50℃，流速为0.6ml/min，流动相由洗脱液a（0.1%浓度的(v/v)甲酸水溶液）和洗脱液b（含0.1%(v/v)甲酸的乙腈）组成。使用表4中所示的梯度：表13.在实施例12中所用的洗脱液a和b的浓度。在正模式下采用下述esi源参数进行esi-ms2分析：•气体温度320℃•气体流量11l/min•喷雾器压力50psi•毛细管电压4000v。采用下述mrm参数进行月桂酸的检测和定量。实施例17甘氨酸的检测使用agilent1200hplc系统通过邻-酞二醛（opa）衍生化和紫外/可见光检测进行甘氨酸的检测。将200µl均匀的发酵液样品与1800µl30%(v/v)1-丙醇混合，涡旋10s并随后在13,000xg离心5min。取出上清液并用于使用下述参数的hplc分析：流动相：　　　　洗脱液a　　　　　　　2.5ml乙酸/1l蒸馏水，使用naoh调整ph在6.0　　　　　　　洗脱液b　　　　　　　甲醇柱：　　　　　　luna5µc8100a(100x4.6mm)；phenomenex　　　　　　　柱箱温度：40℃流速：　　　　　1.0ml/min运行时间:　　　22min检测器:　　　　dad　　　　　　　　334nm　　　　　　　　光谱　　　　　　　　存储：全部　　　　　　　　范围：200-400nm　　　　　　　　步长2nm　　　　　　　　fld（在330nm激发；在450nm发射,pmt增益13)衍生化：随注射程序自动地：　　　　　　　　注射程序　　　　　　　　#指令　　　　　　　　1　吸取4.5µl自小瓶1*,def.速率,def.补偿　　　　　　　　2　吸取1.5µl自样品,def.速率,def.补偿　　　　　　　　3　吸取0.5µl自空气,def.速率　　　　　　　　4　在冲洗孔洗涤针.15.0sec　　　　　　　　5　吸取4.5µl自小瓶1,def.速率,def.补偿　　　　　　　　6　原地混合11.0µl,def.速率,1次　　　　　　　　7　等待1.00min　　　　　　　　8　注射　　　　　　　　9　等待0.50min　　　　　　　　10旁路阀　　　　　　　　11吸取100.0µl自小瓶2*,def.速率,def.补偿　　　　　　　　12喷射100.0µl自小瓶2,def.速率,def.补偿　　　　　　　　13主路阀*小瓶1含有opa试剂（见下）；小瓶2含有水。opa试剂的制备将100mg邻-酞二醛溶解在1ml甲醇中并随后加入0.4mm硼酸盐缓冲液(ph10.4)以得到10ml。随后，加入50µl巯基乙醇并将试剂在4℃保存。在使用前加入另外10µl巯基乙醇。硼酸盐缓冲液(0.4mmh3bo4)的制备：将38.1gna2b4o7*10h2o(0.1mol)溶解在1l蒸馏水中并用4mnaoh将ph调节至10。随后，加入1ml25%brij35(v/v)。保留时间：甘氨酸：7.153min。实施例18用于表达hglyat2-同系物的载体的制备为了制备用于表达不同生物体的n-酰基转移酶的载体，合成了存在于ncbi数据库中的、与hglyat2具有同源性的变体并针对大肠杆菌进行了密码子优化。这些是：白颊长臂猿的甘氨酸n-酰基转移酶-样蛋白2同种型1(nl,xp_003275392.1,seqidno:53)、亚马逊松鼠猴的甘氨酸n-酰基转移酶-样蛋白2(sb,xp_003920208.1,seqidno:54)、家猫的甘氨酸-n-酰基转移酶-样2(fc,xp_003993512.1,seqidno:55)、欧洲牛的甘氨酸n-酰基转移酶-样蛋白2(bt,np_001178259.1,seqidno:56)和小家鼠的甘氨酸n-酰基转移酶(mm,np_666047.1,seqidno:57)。pcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]的hglyat2基因（实施例3的seqidno:13）如下被该变体替换：将合成的dna片段用限制性内切核酸酶bamhi和asisi消化，并连接进相应地切割的pcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]中。通过限制性分析检查靶基因的正确插入，并通过dna测序验证所引入基因的真实性。将得到的表达载体命名为：。实施例19由具有fade基因缺失的大肠杆菌菌株生产月桂酰基甘氨酸盐，所述菌株过表达hglyat-变体、fadd和alkl基因应用实施例13中所述的方案，将在实施例18中制备的菌株用于研究它们与表达hglyat2的参照菌株相比生产月桂酰基甘氨酸盐的能力，所述参照菌株携带质粒pcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]。在诱导后1-3h，向培养物中加入6g/l甘氨酸和6g/l月桂酸(溶解于月桂酸甲酯中)。在48h的培养时间后，将摇瓶的整个液体培养基用丙酮提取（比率1:2）。在实施例7中描述了进一步的样品处理。取样，并分析存在的月桂酰基甘氨酸盐、月桂酸和甘氨酸。结果显示在表15中。除无质粒对照外的所有菌株均生产月桂酰基甘氨酸盐，其量在0.44至2109.8mg/l之间。实施例20不同甘氨酸代谢途径中的突变体缺陷的构建利用在实施例12、14和15中所述的敲除-质粒，构建不同的突变体。用在link等人,1997中所述的方法，使用菌株大肠杆菌w3110δfade借助于质粒pko3δltae(seqidno:51)、pko3δglya(seqidno:40)和pko3δgcvthp(seqidno:29)构建每个菌株。借助于电穿孔将大肠杆菌菌株w3110δfadeδgcvthpδltae、w3110δfadeδgcvthpδglya、w3110δfadeδglyaδltae和w3110δfadeδgcvthpδltaeδglya各自用质粒pcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1](来自实施例3的seqidno:13)转化，并铺板在补充了大观霉素(100µg/ml)的lb-琼脂平板上。通过质粒制备和分析型限制性分析，针对正确质粒的存在而检查转化体。将得到的菌株命名为大肠杆菌w3110δfadeδgcvthpδltaepcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]、大肠杆菌w3110δfadeδgcvthpδglyapcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]、大肠杆菌w3110δfadeδglyaδltaepcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]和w3110δfadeδgcvthpδltaeδglyapcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]。实施例21用于在过表达hglyat2和fadd的大肠杆菌w3110δfade中表达孔蛋白基因fadl（而不是alkl）的载体的制备为了制备用于表达fadl（而不是alkl）的载体，借助于序列特异性的寡核苷酸fadl_ec-fp和fadl_ec_rp(seqidno.66和67)从大肠杆菌w3110的染色体dna扩增fadl基因。使用寡核苷酸upstream_fp和upstream_rp(seqidno.68和69)从靶载体pcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1](seqidno:13)扩增启动子区域(placuv5)。将片段用pcr融合并使用geneart®seamlesscloningandassemblykit(lifetechnologies,carlsbad,ca,usa)克隆至nsii/bamhi切开的靶载体。将组装的产物转化进化学感受态的大肠杆菌dh5α细胞(newenglandbiolabs,frankfurt)中。通过限制性分析检查靶基因的正确插入，并通过dna测序验证所引入基因的真实性。将得到的表达载体命名为pcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[fadl](seqidno:70)。将在实施例12中制备的大肠杆菌菌株w3110δfadeδgcvthp借助于电穿孔用质粒pcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[fadl]转化并铺板在补充了大观霉素(100µg/ml)的lb琼脂平板上。通过质粒制备和分析型限制性分析，针对正确质粒的存在而检查转化体。将得到的菌株命名为大肠杆菌w3110δfadeδgcvthppcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[fadl]。实施例22用于缺失大肠杆菌w3110δfade中的kbl基因的载体的制备为了制备用于缺失编码大肠杆菌w3110的2-氨基-3-酮丁酸盐辅酶a-连接酶的kbl基因的载体，通过pcr扩增了kbl基因的上游和下游大约500bp。使用寡核苷酸1960_up_fp(seqidno:71)和1960_up_rp(seqidno:72)扩增kbl的上游区域。使用寡核苷酸1960_down_fp(seqidno:73)和1960_down_rp(seqidno:74)扩增kbl的下游区域。在每种情况下，可以扩增预期大小的pcr片段。通过琼脂糖凝胶电泳分离pcr样品，并使用qiaquick凝胶提取试剂盒(qiagen,hilden)分离dna片段。通过交叉pcr组装经纯化的pcr片段。将制备的片段纯化，bsai和sali切割，并连接进相应地切割的载体pko3(seqidno:28)中。将组装的产物转化进化学感受态的大肠杆菌dh5α细胞(newenglandbiolabs,frankfurt)中。根据生产商的手册进行pcr纯化、体外克隆和转化的操作。通过限制性分析检查靶基因的正确插入，并通过dna测序验证所引入基因的真实性。将所得的敲除的载体命名为pko3δkbl(seqidno:75)。使用在link等人,1997中所述的方法，借助于pko3δkbl进行菌株大肠杆菌w3110δfadeδkbl的构建。seqidno:76是缺失kbl以后的dna序列。将大肠杆菌菌株w3110δfadeδgcvthp借助于电穿孔用质粒pcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1](来自实施例3的seqidno:13)转化，并铺板在补充了大观霉素(100µg/ml)的lb-琼脂平板上。通过质粒制备和分析型限制性分析，针对正确质粒的存在而检查转化体。将得到的菌株命名为大肠杆菌w3110δfadeδkblpcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]。实施例23在ptrc启动子（而不是ptac）的控制下过表达大肠杆菌fadd和智人hglyat2的菌株的制备为了制备在ptrc启动子的控制下过表达大肠杆菌fadd基因以及智人hglyat2的大肠杆菌菌株(brosius等人.1985)，通过pcr和序列特异性的寡核苷酸的应用将质粒pcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]的启动子区域改变成trc-启动子的序列。将新质粒命名为pcdf{ptrc}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]seqidno:77类似于实施例12和20中的描述，构建下述大肠杆菌w3110菌株：和。实施例24大肠杆菌菌株从水解椰子油和甘氨酸生产酰基甘氨酸盐将如在实施例5中所述制备的大肠杆菌菌株w3110δfadepcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]在补料分批发酵中发酵以研究连接来自水解椰子油的脂肪酸和甘氨酸从而产生酰基氨基酸（例如月桂酰基甘氨酸盐）的能力。在具有8个生物反应器的、来自dasgip的平行发酵系统中进行该发酵。除了以下修改以外，实验设定如在实施例8中所述：来自水解椰子油的脂肪酸在30℃为固体，且不可在微生物发酵过程中用作流体补料。为了克服该问题，省略在异源基因的诱导之前从37℃至30℃的温度转换。整个过程从开始至结束运行在37℃。在补料开始以后2h触发诱导。通过加入10g来自水解椰子油的脂肪酸和100ml的100g/l甘氨酸水溶液进行诱导以后7h，开始生物转化，从而产生24g/l的每种底物（代表整个发酵液）。为了监测转化，在生物转化的47h和65h以后取样并如在实施例7中所述分析。结果显示在表16中。证实了大肠杆菌w3110δfadepcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]不仅能够将月桂酸、而且能够将来自水解椰子油的其它链长度的脂肪酸连接至甘氨酸从而形成酰基甘氨酸盐。实施例25具有甘氨酸代谢途径缺失的大肠杆菌菌株从水解椰子油和甘氨酸生产酰基甘氨酸盐培养如在实施例12和23中制备的大肠杆菌菌株，大肠杆菌w3110并如在实施例24中所述进行生物转化，并与实施例24的结果进行对比。为了监测转化，在生物转化的47h和65h以后取样并如在实施例7中所述分析。结果显示在表17-20中。表17:使用大肠杆菌w3110δfadeδgcvthppcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]作为生物催化剂生物转化的47h和65h以后不同酰基甘氨酸盐、游离脂肪酸和甘氨酸的浓度.表18:使用大肠杆菌w3110δfadeδgcvthppcdf{ptrc}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]作为生物催化剂生物转化的47h和65h以后不同酰基甘氨酸盐、游离脂肪酸和甘氨酸的浓度.表19:使用大肠杆菌w3110δfadeδgcvthpδltaepcdf{ptrc}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1]作为生物催化剂生物转化的47h和65h以后不同酰基甘氨酸盐、游离脂肪酸和甘氨酸的浓度.表20:使用大肠杆菌w3110δfadeδglyapcdf{ptrc}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[alklmod1作为生物催化剂生物转化的47h和65h以后不同酰基甘氨酸盐、游离脂肪酸和甘氨酸的浓度。证实了δgcvthp突变会显著减少由大肠杆菌的天然代谢造成的甘氨酸损失，如已经在实施例13中证实的。对于如在表17中所示的突变体，在生物转化结束时的甘氨酸浓度>7g/l(分别>8g/l)(分别在表18中)。对于缺乏该突变的大肠杆菌，在生物转化结束时的甘氨酸浓度是0g/l，如在表16中所示。阻断第二甘氨酸代谢途径的另一个突变(δltae)不会增强δgcvthp突变的作用。令人惊讶地抑制δgcvthp的δltae期望作用，如在表19中所示。证实了δglya突变也会显著减少由大肠杆菌的天然代谢造成的甘氨酸损失。对于如在表20中所示的突变体，在生物转化结束时的甘氨酸浓度>8g/l。实施例26大肠杆菌菌株使用替代性的porinefadl从水解椰子油和甘氨酸生产酰基甘氨酸盐培养如在实施例12和23中制备的大肠杆菌w3110菌株，并如在实施例24中所述进行生物转化。在生物转化的47h和65h以后取转化样品，并如在实施例7中所述进行分析。然后将结果显示在表21和22中。表21:使用大肠杆菌w3110δfadeδgcvthppcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]作为生物催化剂生物转化的47h和65h以后不同酰基甘氨酸盐、游离脂肪酸和甘氨酸的浓度.表22:使用大肠杆菌w3110δfadeδgcvthppcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]{placuv5}[fadl]作为生物催化剂生物转化的47h和65h以后不同酰基甘氨酸盐、游离脂肪酸和甘氨酸的浓度。证实了porine对于良好生物催化剂性能而言是重要的。在菌株大肠杆菌w3110δfadeδgcvthppcdf{ptac}[hglyat2(co_ec)-fadd_ec]中的porine类没有导致在选择的条件下进行的生物转化结束时发酵液中显著量的残余脂肪酸(表21)。用作porine的alkl导致来自水解椰子油的所有脂肪酸的几乎完全转化(表17)。还证实了fadl可以用作porine类alkl，从而导致进行生物转化的脂肪酸的几乎完全转化。参考文献allgemeinemikrobiologie,2008,georgthiemeverlag.f.m.ausubel(1995),currentprotocolsinmolecularbiology.johnwiley&sons,inc.antonenkov,v.,d..vanveldhoven,p.,p.,waelkens,e.,和mannaerts,g.p.(1997)arthurlesk(2008),introductiontobioinformatics,第3版.beguin,pandaubert,j-p(1994)femsmicrobial.rev.13:25-58.brosiusj,erflemandjstorella(1985).jbiolchem.mar25;260(6):3539-41cornish-bowden(1995),fundamentalsofenzymekinetics,portlandpresslimited,1995.fujita,y.,matsuoka,h.,和hirooka,k.(2007)mol.microbiology66(4),829-839.jeremymberg,johnltymoczko,andlubertstryer,biochemistry,第5版,w.h.freeman,2002.kang,y(2010),plosone5(10),e13557.katoh等人,genomeinformation,16(1),22-33,2005.liebl等人(1991)internationaljournalofsystematicbacteriology41:255-260.linkaj,phillipsd,churchgm.j.bacteriol.1997.179(20)ohima,k.等人(1997)biotechnol.genet.eng.rev.14:365414.sambrook/fritsch/maniatis(1989):molecularcloning-alaboratorymanual,coldspringharbourpress,第2版,“thedigsystemusersguideforfilterhybridization”,boehringermannheimgmbh,mannheim,germany,1993thompson等人,(1994)nucleicacidsresearch22,4637-4680.waluk,d.p.,schultz,n.,和hunt,m.c.(2010),fasebj.24,2795-2803.ep11191520.3,us5734070,us20140051136,gb1483500.美国专利号6,960,455。当前第1页12