半胱氨酸改造抗体和缀合物的制作方法

对相关申请的援引本申请要求2014年9月12日提交的临时美国申请no.62/050,022的优先权，通过援引将其完整收入本文。发明领域本发明一般涉及用反应性半胱氨酸残基改造的抗体，且更具体地说，本发明涉及具有治疗或诊断应用的抗体。可以使半胱氨酸改造抗体与化疗药；毒素；亲和配体，诸如生物素和检测标记，诸如荧光团缀合。本发明还涉及使用抗体和抗体-药物缀合物化合物在体外，原位和体内诊断或治疗哺乳动物细胞或相关病理性情况的方法。发明背景抗体-药物缀合物(adc)是有吸引力的靶向化疗分子，因为它们组合抗体和细胞毒性药物二者的理想特性，即通过将有力的细胞毒性药物靶向表达抗原的肿瘤细胞，由此增强它们的抗肿瘤活性。针对给定靶抗原的成功adc开发取决于抗体选择，接头稳定性，细胞毒性药物效力和接头-药物缀合抗体的方式的优化。常规附着方式，即通过共价键连接，药物模块与抗体一般产生不均一的(heterogeneous)分子混合物，其中药物模块结合在抗体上的许多位点上。例如，细胞毒性药物一般与抗体通过抗体的通常大量的赖氨酸残基缀合，从而产生不均一的抗体-药物缀合物混合物。根据反应条件的不同，所述的不均一混合物一般含有抗体和0-约8或8以上附着的药物模块的分布。此外，在具有特定整数比的药物模块与抗体的缀合物各亚组内可能是不均一的混合物，其中药物模块结合在抗体上的不同位点上。分析和制备方法不足以分离和表征由缀合反应产生的不均一混合物中的抗体-药物缀合物类分子。抗体为较大的复杂的并且结构多样的生物分子，通常带有许多反应性官能基。其与接头试剂和药物-接头中间体的反应性取决于如下因素：诸如ph，浓度，盐浓度和共溶剂。此外，多步骤缀合过程因控制反应条件和表征反应剂和中间体方面的困难而可能不可再现。半胱氨酸硫醇在中性ph具有反应性，这与在接近ph7时质子化和亲核性降低的大部分胺类不同。由于游离硫醇(rsh,硫氢基)基团具有相对的反应性，所以带有半胱氨酸残基的蛋白质通常以其作为二硫化物-连接的寡聚体的氧化形式存在或具有内部桥连的二硫化物基团。抗体半胱氨酸硫醇一般对亲电子缀合反应剂比对抗体胺或羟基更具反应性，即更具亲核性。通过使蛋白质的不同氨基酸残基突变成半胱氨酸氨基酸的在半胱氨酸硫醇上的设计可能存在问题，特别是就未配对的(游离cys)残基或那些相对易于进行反应或氧化的残基而言。在蛋白质的浓溶液中，无论是在大肠杆菌(e.coli)的周质中，还是在培养物上清液或部分或完全纯化的蛋白质中，蛋白质表面上的未配对的cys残基可以配对并且氧化成分子内二硫化物和由此的蛋白质二聚体或多聚体。二硫化物二聚体的形成使得新的cys无法与药物，配体或其它标记发生缀合反应。此外，如果蛋白质以氧化方式在新改造的cys和已存在的cys残基之间形成分子内二硫键，那么两种cys基团对活性位点的参与和相互作用而言均无法利用。此外，可以通过错误折叠或丧失三级结构使蛋白质失活或赋予其非特异性(zhang等(2002)anal.biochem.311:1-9)。在改造的半胱氨酸可供缀合但不扰乱免疫球蛋白折叠和装配或改变抗原结合和效应器功能的位点处具有半胱氨酸替代的抗体(thiomabtm抗体)(junutula,etal.,2008bnaturebiotech.,26(8):925-932；dornanetal(2009)blood114(13):2721-2729；us7521541；us7723485；wo2009/052249)。然后，这些thiomabtm抗体可以经由改造的半胱氨酸硫醇基缀合细胞毒性药物以获得具有统一化学计量(例如在具有一个改造的半胱氨酸位点的抗体中多至2个药物每个抗体)的thiomabtm抗体-药物缀合物(tdc)。针对不同抗原的多种抗体的研究显示了tdc在异种移植物模型中像常规adc一样有效，而且在有关临床前模型中在更高的剂量得到耐受。thiomabtm抗体改造用于在抗体的不同位置(例如轻链-fab，重链-fab和重链-fc内的特定氨基酸位置(即位点))附着药物。由于它们的同质性和位点特异性缀合细胞毒性药物，thiomabtm抗体的体外和体内稳定性，功效和pk特性提供胜过常规adc的独特优势。发明概述本申请包括新颖的，分离的半胱氨酸改造抗体(thiomabtm抗体)的公开，其在重链或轻链中包含游离半胱氨酸氨基酸。本发明的一个方面为一种制备该分离的半胱氨酸改造抗体(thiomabtm抗体)的工艺，即通过将一个或多个氨基酸残基用半胱氨酸替换来诱变亲本抗体的核酸序列以编码该半胱氨酸改造抗体；表达该半胱氨酸改造抗体；并分离该半胱氨酸改造抗体。本发明的另一个方面为分离的半胱氨酸改造抗体(thiomabtm抗体)的缀合物，其中该抗体是共价附着至捕捉标记物，检测标记物，药物模块，或固体支持物的。在某些实施方案中，本发明为一种半胱氨酸改造抗体，其包含选自表1-4任一，优选表1或2任一中鉴定的半胱氨酸突变的半胱氨酸突变。在具体的实施方案中，该半胱氨酸突变为游离半胱氨酸氨基酸。在某些实施方案中，重链中的半胱氨酸突变选自表2或3中鉴定的半胱氨酸突变。在某些实施方案中，轻链中的半胱氨酸突变选自表1或4中鉴定的半胱氨酸突变。在某些实施方案中，该半胱氨酸突变选自由hc-i195c，hc-s420c，hc-y432c，和lc-g64c(依照kabat编号方式)组成的组。在某些实施方案中，该半胱氨酸突变选自由hc-y432c和lc-g64c(依照kabat编号方式)组成的组。在某些实施方案中，该半胱氨酸突变为重链突变且选自由y33c，g162c，v184c，i195c，s420c，y432c，和q434c(依照kabat编号方式)组成的组。在某些实施方案中，该半胱氨酸突变为重链突变且选自由r19c，e46c，t57c，y59c，a60c，m100cc，w103c，g162c，i195c，v258c，s420c，h425c，和n430c(依照kabat编号方式)组成的组。在某些实施方案中，该半胱氨酸突变为重链突变且选自由y33c，g162c，v184c，和i195c(依照kabat编号方式)组成的组。在某些实施方案中，该半胱氨酸突变为重链突变且选自由r19c，e46c，y59c，a60c，m100cc，w103c，v258c，h425c，和n430c(依照kabat编号方式)组成的组。在某些实施方案中，该半胱氨酸突变为轻链突变且选自由y55c，g64c，t85c，和t180c，和n430c(依照kabat编号方式)组成的组。在某些实施方案中，该半胱氨酸突变为轻链突变且选自由t31c，s52c，g64c，r66c，a193c，和n430c(依照kabat编号方式)组成的组。在某些实施方案中，该半胱氨酸突变为轻链突变且选自由g64c，t85c，和t180c，和n430c(依照kabat编号方式)组成的组。在某些实施方案中，该半胱氨酸突变为轻链突变且选自由s52c，g64c，r66c，和a193cn430c(依照kabat编号方式)组成的组。在具体的实施方案中，轻链中的半胱氨酸突变选自包含依照kabat编号方式的lc-i106c，lc-r108c，lc-r142c，和lc-k149c的半胱氨酸突变的组(见图1a；表1)。在一个优选的实施方案中，轻链中的半胱氨酸突变为依照kabat编号方式的lc-k149c(见图1a)。表1：例示性轻链半胱氨酸突变。残基序列(+/-5个残基)seqidno.eu编号方式kabat编号方式igtkveckrtva1106106rkveikctvaap2108108rnnfypceakvq3142142kakvqwcvdnal4149149在优选的实施方案中，重链的半胱氨酸突变选自包含依照eu编号方式的hc-t114c，hc-a140c，hc-l174c，hc-l179c，hc-t187c，hc-t209c，hc-v262c，hc-g371c，hc-y373c，hc-e382c，hc-s424c，hc-n434c，和hc-q438c的半胱氨酸突变的组(见图1b；表2)。在一个优选的实施方案中，重链中的半胱氨酸突变为依照kabat编号方式的hc-a143c(即依照eu编号方式的hc-a140c)(见图1b和21；表2)。在一个优选的实施方案中，重链中的半胱氨酸突变为依照eu编号方式的hc-a174c(见图1b和21；表2)。表2：例示性重链半胱氨酸突变。在某些实施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗体是通过包含下述步骤的工艺制备的：(i)通过将一个或多个氨基酸残基用半胱氨酸替换来诱变亲本抗体的核酸序列以编码该半胱氨酸改造抗体；(ii)表达该半胱氨酸改造抗体；并(iii)分离该半胱氨酸改造抗体。在某些实施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗体为包含清蛋白结合肽(abp)的融合蛋白。在具体的实施方案中，该abp包含选自下述的序列：a)cdkthtgggsqrlmediclprwgclweddf(seqidno:144)，b)qrlmediclprwgclweddf(seqidno:145)，c)qrliediclprwgclweddf(seqidno:146)，d)rliediclprwgclwedd(seqidno:147)，或e)diclprwgclw(seqidno:148)。在某些实施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗体选自单克隆抗体，抗体片段，双特异性抗体，嵌合抗体，人抗体，和人源化抗体。在具体的实施方案中，该抗体片段为fab片段。在某些实施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗体为抗her2抗体。在某些实施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗体为抗muc16抗体。在某些实施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗体为抗steap1抗体.在某些实施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗体为抗cd79b抗体。在某些实施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗体为抗cd22抗体。在某些实施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗体为抗b7h4抗体。在某些实施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗体为抗ly6e抗体。在某些实施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗体为抗napi2b抗体。在某些实施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗体结合受体(1)-(53)中的一项或多项：(1)bmpr1b(骨形态发生蛋白受体-ib型)；(2)e16(lat1,slc7a5)；(3)steap1(前列腺的六次跨膜上皮抗原)；(4)0772p(ca125,muc16)；(5)mpf(mpf,msln,smr,巨核细胞强化因子,间皮素)；(6)napi3b(napi2b,napi-3b,nptiib,slc34a2,溶质载体家族34(磷酸钠),成员2,ii型钠依赖性磷酸转运蛋白3b)；(7)sema5b(flj10372,kiaa1445,mm.42015,sema5b,semag,脑信号蛋白5bhlog,sema结构域,七次血小板反应蛋白重复(1型和类1型),跨膜域(tm)和短胞质域,(脑信号蛋白)5b)；(8)pscahlg(2700050c12rik,c530008o16rik,rikencdna2700050c12,rikencdna2700050c12基因)；(9)etbr(内皮缩血管肽b型受体)；(10)msg783(rnf124,假定蛋白flj20315)；(11)steap2(hgnc_8639,ipca-1,pcanap1,stamp1,steap2,stmp,前列腺癌相关基因1,前列腺癌相关蛋白1,前列腺的六次跨膜上皮抗原2,六次跨膜前列腺蛋白)；(12)trpm4(br22450,flj20041,trpm4,trpm4b,瞬时型受体电位阳离子通道,亚家族m,成员4)；(13)cripto(cr,cr1,crgf,cripto,tdgf1,畸胎瘤衍生的生长因子)；(14)cd21(cr2(补体受体2)或c3dr(c3d/eb病毒受体)或hs.73792)；(15)cd79b(cd79b,cd79β,igb(免疫球蛋白相关β),b29)；(16)fcrh2(ifgp4,irta4,spap1a(含sh2域的磷酸酶锚定蛋白1a),spap1b,spap1c)；(17)her2；(18)nca；(19)mdp；(20)il20rα；(21)brevican；(22)ephb2r；(23)aslg659；(24)psca；(25)geda；(26)baff-r(b细胞活化因子受体,blys受体3,br3)；(27)cd22(b细胞受体cd22-b同种型)；(28)cd79a(cd79a,cd79α,免疫球蛋白相关α,b细胞特异性蛋白)；(29)cxcr5(伯基特氏淋巴瘤受体1,g蛋白偶联受体)；(30)hla-dob(mhcii类分子的β亚基(ia抗原))；(31)p2x5(嘌呤能受体p2x配体门控性离子通道5)；(32)cd72(b细胞分化抗原cd72,lyb-2)；(33)ly64(淋巴细胞抗原64(rp105),富亮氨酸重复(lrr)家族的i型膜蛋白)；(34)fcrh1(fc受体样蛋白1)；(35)irta2(免疫球蛋白超家族受体易位相关2)；(36)tenb2(推定的跨膜蛋白聚糖)；(37)pmel17(银同系物；silv；d12s53e；pmel17；si；sil)；(38)tmeff1(具有egf样和两个卵泡抑素样域的跨膜蛋白1；tomoregulin-1)；(39)gdnf-ra1(gdnf家族受体α1；gfra1；gdnfr；gdnfra；retl1；trnr1；ret1l；gdnfr-α1；gfr-α-1)；(40)ly6e(淋巴细胞抗原6复合物,基因座e；ly67,rig-e,sca-2,tsa-1)；(41)tmem46(shisa同系物2)；(42)ly6g6d(淋巴细胞抗原6复合物,基因座g6d；ly6-d,megt1)；(43)lgr5(含富亮氨酸重复的g蛋白偶联受体5；gpr49,gpr67)；(44)ret(ret原癌基因；men2a；hscr1；men2b；mtc1；ptc；cdhf12；hs.168114；ret51；ret-ele1)；(45)ly6k(淋巴细胞抗原6复合物,基因座k；ly6k；hsj001348；flj35226)；(46)gpr19(g蛋白偶联受体19；mm.4787)；(47)gpr54(kiss1受体；kiss1r；gpr54；hot7t175；axor12)；(48)asphd1(含天冬氨酸β-羟化酶域的1；loc253982)；(49)酪氨酸酶(tyr；ocaia；oca1a；酪氨酸酶；shep3)；(50)tmem118(环指蛋白,跨膜2；rnft2；flj14627)；(51)gpr172a(g蛋白偶联受体172a；gpcr41；flj11856；d15ertd747e)；(52)cd33；和(53)cll-1(clec12a,micl,和dcal2)。在某些实施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗体是共价附着至捕捉标记物，检测标记物，药物模块，或固体支持物的。在具体的实施方案中，该抗体是共价附着至生物素捕捉标记物的。在具体的实施方案中，该抗体是共价附着至荧光染料检测标记物的。在具体的实施方案中，该荧光染料选自荧光素型，若丹明型，丹酰，丽丝胺，花菁，藻红蛋白，德克萨斯红，及其类似物。在具体的实施方案中，该抗体是共价附着至选自3h，11c，14c，18f，32p，35s，64cu，68ga，86y，89zr，99tc，111in，123i，124i，125i，131i，133xe，177lu，211at，和213bi的放射性核素检测标记物的。在具体的实施方案中，该抗体是通过螯合配体共价附着至检测标记物的。在具体的实施方案中，该螯合配体选自dota，dotp，dotma，dtpa和teta。在某些实施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗体共价附着至选自美登木素生物碱，奥瑞司他汀，多拉司他汀，单端孢菌素，cc1065，加利车霉素，烯二炔类抗生素，紫杉烷，和蒽环类抗生素的药物模块以形成具有式i(即ab-(l-d)p)的抗体-药物缀合物，其中ab为该抗体，l为接头，d为该药物模块，且p为1，2，3，或4。在具体的实施方案中，该抗体-药物缀合物具有结构：在具体的实施方案中，缀合至本文所述半胱氨酸改造抗体的式i的药物(d)为美登木素生物碱，其具有结构：其中波状线表示d的硫原子与接头的共价附着；r独立选自h，甲基，乙基，1-丙基，2-丙基，1-丁基，2-甲基-1-丙基，2-丁基，2-甲基-2-丙基，1-戊基，2-戊基，3-戊基，2-甲基-2-丁基，3-甲基-2-丁基，3-甲基-1-丁基，2-甲基-1-丁基，1-己基，2-己基，3-己基，2-甲基-2-戊基，3-甲基-2-戊基，4-甲基-2-戊基，3-甲基-3-戊基，2-甲基-3-戊基，2,3-二甲基-2-丁基，和3,3-二甲基-2-丁基；且m为1，2，或3。在具体的实施方案中，缀合至本文所述半胱氨酸改造抗体的式i的药物(d)选自结构：在具体的实施方案中，缀合至本文所述半胱氨酸改造抗体的式i的药物(d)具有下述结构：其中n为0，1，或2。在具体的实施方案中，缀合至本文所述半胱氨酸改造抗体的式i的药物(d)为单甲基奥瑞司他汀药物模块mmae或mmaf，其具有结构：在本发明的某些实施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗体具有下述结构之一：其中val为缬氨酸；cit为瓜氨酸；且p为1，2，3，或4。在本发明的某些实施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗体具有下述结构：在某些实施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗体缀合至落入本说明书后续部分进一步详细描述的下述类别之一的药物：奥瑞司他汀(auristatin)，多拉司他汀(dolastatin)，单端孢菌素(trichothecene)，cc1065，加利车霉素(calicheamicin)，烯二炔类抗生素，紫杉烷，吡咯并苯并二氮杂卓(pyrrolobenzodiazepine)(pbd)，1-(氯甲基)-2,3-二氢-1h-苯并[e]吲哚(cbi)二聚体，cbi-pbd异二聚体，和蒽环类抗生素(anthracycline)。在某些实施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗体的接头(l)包含硫醇反应性试剂。在具体的实施方案中，该接头(l)选自由马来酰亚胺，碘乙酰胺，和吡啶基二硫化物组成的组。在具体的实施方案中，该接头(l)为吡啶基二硫化物。在具体的实施方案中，该接头(l)为吡啶基二硫化物且该药物(d)为mmae。在某些实施方案中，本发明包含一种制备抗体-药物缀合物的方法，其包含使半胱氨酸改造抗体(ab)的至少一个游离半胱氨酸与接头-药物(l-d)试剂反应以形成具有式(即ab-(l-d)p)的抗体-药物缀合物，其中ab为该半胱氨酸改造抗体，l为接头，d为药物模块，且p为1，2，3，或4；且其中该半胱氨酸改造抗体包含一个或多个游离半胱氨酸氨基酸，其中至少一个游离半胱氨酸氨基酸选自表1或2任一中鉴定的半胱氨酸突变或者选自表3或4中鉴定的备选的稳定的半胱氨酸突变。在某些实施方案中，本发明包含一种制备抗体-药物缀合物的方法，其包含使半胱氨酸改造抗体(ab)的至少一个游离半胱氨酸与接头-药物(l-d)试剂反应以形成具有式(即ab-(l-d)p)的抗体-药物缀合物，其中ab为该半胱氨酸改造抗体，l为接头，d为药物模块，且p为1，2，3，或4；且其中该半胱氨酸改造抗体包含一个或多个游离半胱氨酸氨基酸，其中至少一个游离半胱氨酸氨基酸优选选自表1和2中鉴定的半胱氨酸突变或者选自表3或4中鉴定的备选的稳定的半胱氨酸突变。在具体的实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中该半胱氨酸突变在重链中且选自表2或3中鉴定的半胱氨酸突变。在具体的实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中该半胱氨酸突变在轻链中且选自表1和4中鉴定的半胱氨酸突变。在一个优选的实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中该半胱氨酸突变选自图21中鉴定的半胱氨酸突变。在其它实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中该半胱氨酸突变选自表5中鉴定的半胱氨酸突变。在某些实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中该半胱氨酸突变选自由hc-i195c，hc-s420c，hc-y432c，和lc-g64c(依照kabat编号方式)组成的组。在某些实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中该半胱氨酸突变选自由hc-y432c和lc-g64c(依照kabat编号方式)组成的组。在某些实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中该半胱氨酸突变为重链突变且选自由y33c，g162c，v184c，i195c，s420c，y432c，和q434c(依照kabat编号方式)组成的组。在某些实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中该半胱氨酸突变为重链突变且选自由r19c，e46c，t57c，y59c，a60c，m100cc，w103c，g162c，i195c，v258c，s420c，h425c，和n430c(依照kabat编号方式)组成的组。在某些实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中该半胱氨酸突变为重链突变且选自由y33c，g162c，v184c，和i195c(依照kabat编号方式)组成的组。在某些实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中该半胱氨酸突变为重链突变且选自由r19c，e46c，y59c，a60c，m100cc，w103c，v258c，h425c，和n430c(依照kabat编号方式)组成的组。在某些实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中该半胱氨酸突变在轻链中且选自由y55c，g64c，t85c，和t180c(依照kabat编号方式)组成的组。在某些实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中该半胱氨酸突变在轻链中且选自由t31c，s52c，g64c，r66c，a193c(依照kabat编号方式)组成的组。在某些实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中该半胱氨酸突变在轻链中且选自由g64c，t85c，和t180c(依照kabat编号方式)组成的组。在某些实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中该半胱氨酸突变在轻链中且选自由s52c，g64c，r66c，和a193c(依照kabat编号方式)组成的组。在优选的实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中轻链中的半胱氨酸突变选自包含依照kabat编号方式的lc-i106c，lc-r108c，lc-r142c，和lc-k149c的半胱氨酸突变的组(见图1a和21)。在优选的实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中轻链中的半胱氨酸突变为依照kabat编号方式的lc-k149c(见图1a和21和表1)。在优选的实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中重链中的半胱氨酸突变选自包含依照eu编号方式的hc-t114c，hc-a140c，hc-l174c，hc-l179c，hc-t187c，hc-t209c，hc-v262c，hc-g371c，hc-y373c，hc-e382c，hc-s424c，hc-n434c，和hc-q438c的半胱氨酸突变的组(见图1b和21和表2)。在优选的实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中重链中的半胱氨酸突变为依照eu编号方式的hc-a140c(即依照kabat编号方式的hc-a136c)(见图1b和21和表2)。在优选的实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中重链中的半胱氨酸突变为依照eu编号方式的hc-l174c(见图1b和21和表2)。在某些实施方案中，该方法可用于生成本文所述半胱氨酸改造抗体，其中该半胱氨酸改造抗体是通过包含下述步骤的工艺制备的：(i)通过将一个或多个氨基酸残基用半胱氨酸替换来诱变亲本抗体的核酸序列以编码该半胱氨酸改造抗体；(ii)表达该半胱氨酸改造抗体；并(iii)分离该半胱氨酸改造抗体。在某些实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中该半胱氨酸改造抗体为包含清蛋白结合肽(abp)的融合蛋白。在具体的实施方案中，该abp包含选自下述的序列：a)cdkthtgggsqrlmediclprwgclweddf(seqidno:144)，b)qrlmediclprwgclweddf(seqidno:145)，c)qrliediclprwgclweddf(seqidno:146)，d)rliediclprwgclwedd(seqidno:147)，或e)diclprwgclw(seqidno:148)。在某些实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中该半胱氨酸改造抗体选自单克隆抗体，抗体片段，双特异性抗体，嵌合抗体，人抗体，和人源化抗体。在具体的实施方案中，该抗体片段为fab片段。在某些实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中该半胱氨酸改造抗体为抗her2抗体。在某些实施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗体为抗muc16抗体。在某些实施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗体为抗steap1抗体。在某些实施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗体为抗cd79b抗体。在某些实施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗体为抗cd22抗体。在某些实施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗体为抗b7h4抗体。在某些实施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗体为抗ly6e抗体。在某些实施方案中，本文所述半胱氨酸改造抗体为抗napi2b抗体。在某些实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中该半胱氨酸改造抗体结合受体(1)-(53)中的一项或多项：(1)bmpr1b(骨形态发生蛋白受体-ib型)；(2)e16(lat1,slc7a5)；(3)steap1(前列腺的六次跨膜上皮抗原)；(4)0772p(ca125,muc16)；(5)mpf(mpf,msln,smr,巨核细胞强化因子,间皮素)；(6)napi3b(napi2b,napi-3b,nptiib,slc34a2,溶质载体家族34(磷酸钠),成员2,ii型钠依赖性磷酸转运蛋白3b)；(7)sema5b(flj10372,kiaa1445,mm.42015,sema5b,semag,脑信号蛋白5bhlog,sema结构域,七次血小板反应蛋白重复(1型和类1型),跨膜域(tm)和短胞质域,(脑信号蛋白)5b)；(8)pscahlg(2700050c12rik,c530008o16rik,rikencdna2700050c12,rikencdna2700050c12基因)；(9)etbr(内皮缩血管肽b型受体)；(10)msg783(rnf124,假定蛋白flj20315)；(11)steap2(hgnc_8639,ipca-1,pcanap1,stamp1,steap2,stmp,前列腺癌相关基因1,前列腺癌相关蛋白1,前列腺的六次跨膜上皮抗原2,六次跨膜前列腺蛋白)；(12)trpm4(br22450,flj20041,trpm4,trpm4b,瞬时型受体电位阳离子通道,亚家族m,成员4)；(13)cripto(cr,cr1,crgf,cripto,tdgf1,畸胎瘤衍生的生长因子)；(14)cd21(cr2(补体受体2)或c3dr(c3d/eb病毒受体)或hs.73792)；(15)cd79b(cd79b,cd79β,igb(免疫球蛋白相关β),b29)；(16)fcrh2(ifgp4,irta4,spap1a(含sh2域的磷酸酶锚定蛋白1a),spap1b,spap1c)；(17)her2；(18)nca；(19)mdp；(20)il20rα；(21)brevican；(22)ephb2r；(23)aslg659；(24)psca；(25)geda；(26)baff-r(b细胞活化因子受体,blys受体3,br3)；(27)cd22(b细胞受体cd22-b同种型)；(28)cd79a(cd79a,cd79α,免疫球蛋白相关α,b细胞特异性蛋白)；(29)cxcr5(伯基特氏淋巴瘤受体1,g蛋白偶联受体)；(30)hla-dob(mhcii类分子的β亚基(ia抗原))；(31)p2x5(嘌呤能受体p2x配体门控性离子通道5)；(32)cd72(b细胞分化抗原cd72,lyb-2)；(33)ly64(淋巴细胞抗原64(rp105),富亮氨酸重复(lrr)家族的i型膜蛋白)；(34)fcrh1(fc受体样蛋白1)；(35)irta2(免疫球蛋白超家族受体易位相关2)；(36)tenb2(推定的跨膜蛋白聚糖)；(37)pmel17(银同系物；silv；d12s53e；pmel17；si；sil)；(38)tmeff1(具有egf样和两个卵泡抑素样域的跨膜蛋白1；tomoregulin-1)；(39)gdnf-ra1(gdnf家族受体α1；gfra1；gdnfr；gdnfra；retl1；trnr1；ret1l；gdnfr-α1；gfr-α-1)；(40)ly6e(淋巴细胞抗原6复合物,基因座e；ly67,rig-e,sca-2,tsa-1)；(41)tmem46(shisa同系物2)；(42)ly6g6d(淋巴细胞抗原6复合物,基因座g6d；ly6-d,megt1)；(43)lgr5(含富亮氨酸重复的g蛋白偶联受体5；gpr49,gpr67)；(44)ret(ret原癌基因；men2a；hscr1；men2b；mtc1；ptc；cdhf12；hs.168114；ret51；ret-ele1)；(45)ly6k(淋巴细胞抗原6复合物,基因座k；ly6k；hsj001348；flj35226)；(46)gpr19(g蛋白偶联受体19；mm.4787)；(47)gpr54(kiss1受体；kiss1r；gpr54；hot7t175；axor12)；(48)asphd1(含天冬氨酸β-羟化酶域的1；loc253982)；(49)酪氨酸酶(tyr；ocaia；oca1a；酪氨酸酶；shep3)；(50)tmem118(环指蛋白,跨膜2；rnft2；flj14627)；(51)gpr172a(g蛋白偶联受体172a；gpcr41；flj11856；d15ertd747e)；(52)cd33；和(53)cll-1(clec12a,micl,和dcal2)。在某些实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中该半胱氨酸改造抗体是共价附着至捕捉标记物，检测标记物，药物模块，或固体支持物的。在具体的实施方案中，该抗体是共价附着至生物素捕捉标记物的。在某些实施方案中，该抗体是共价附着至荧光染料检测标记物的。在某些实施方案中，该荧光染料选自荧光素型，若丹明型，丹酰，丽丝胺，花菁，藻红蛋白，德克萨斯红，及其类似物。在某些实施方案中，该抗体是共价附着至选自3h，11c，14c，18f，32p，35s，64cu，68ga，86y，89zr，99tc，111in，123i，124i，125i，131i，133xe，177lu，211at，和213bi的放射性核素检测标记物的。在具体的实施方案中，该抗体是通过螯合配体共价附着至检测标记物的。在具体的实施方案中，该螯合配体选自dota，dotp，dotma，dtpa和teta。在某些实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中该半胱氨酸改造抗体共价附着至选自美登木素生物碱，奥瑞司他汀，多拉司他汀，单端孢菌素，cc1065，加利车霉素，烯二炔类抗生素，紫杉烷，和蒽环类抗生素的药物模块以形成具有式i(即ab-(l-d)p)的抗体-药物缀合物，其中ab为该抗体，l为接头，d为该药物模块，且p为1，2，3，或4。在具体的实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中该半胱氨酸改造抗体具有结构：在具体的实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中该半胱氨酸改造抗体的药物(d)为美登木素生物碱，其具有结构：其中波状线表示d的硫原子与接头的共价附着；r独立选自h，甲基，乙基，1-丙基，2-丙基，1-丁基，2-甲基-1-丙基，2-丁基，2-甲基-2-丙基，1-戊基，2-戊基，3-戊基，2-甲基-2-丁基，3-甲基-2-丁基，3-甲基-1-丁基，2-甲基-1-丁基，1-己基，2-己基，3-己基，2-甲基-2-戊基，3-甲基-2-戊基，4-甲基-2-戊基，3-甲基-3-戊基，2-甲基-3-戊基，2,3-二甲基-2-丁基，和3,3-二甲基-2-丁基；且m为1，2，或3。在具体的实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中该药物(d)选自结构：在具体的实施方案中，该方法可用于生成具有下述结构的半胱氨酸改造抗体：其中n为0，1，或2或在具体的实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中d为单甲基奥瑞司他汀药物模块mmae或mmaf，其具有结构：在具体的实施方案中，该方法可用于生成具有选自下述结构的半胱氨酸改造抗体：其中val为缬氨酸；cit为瓜氨酸；且p为1，2，3，或4。在具体的实施方案中，该方法可用于生成缀合至落入本说明书后续部分进一步详细描述的下述类别之一的药物的半胱氨酸改造抗体：奥瑞司他汀，多拉司他汀，单端孢菌素，cc1065，加利车霉素，烯二炔类抗生素，紫杉烷，吡咯并苯并二氮杂卓(pbd)，1-(氯甲基)-2,3-二氢-1h-苯并[e]吲哚(cbi)二聚体，cbi-pbd异二聚体，和蒽环类抗生素。在具体的实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中该接头(l)包含硫醇反应性试剂。在具体的实施方案中，该接头(l)选自由马来酰亚胺，碘乙酰胺，和吡啶基二硫化物组成的组。在具体的实施方案中，该接头(l)为吡啶基二硫化物。在具体的实施方案中，该接头(l)为吡啶基二硫化物且该药物(d)为mmae。在某些实施方案中，该方法可用于生成半胱氨酸改造抗体，其中该半胱氨酸改造抗体为分离的半胱氨酸改造抗体。在某些实施方案中，该方法可用于生成分离的半胱氨酸改造抗体，其中分离的轻链中的半胱氨酸突变选自包含依照kabat编号方式的lc-i106c，lc-r108c，lc-r142c，和lc-k149c的半胱氨酸突变的组(见图1a和图21)。在某些实施方案中，该方法可用于生成分离半胱氨酸改造抗体，其中分离的轻链中的半胱氨酸突变为依照kabat编号方式的lc-k149c(见图1a和21和表1)。在某些实施方案中，该方法可用于生成分离的半胱氨酸改造抗体，其中分离的重链中的半胱氨酸突变选自包含依照eu编号方式的hc-t114c，hc-a140c，hc-l174c，hc-l179c，hc-t187c，hc-t209c，hc-v262c，hc-g371c，hc-y373c，hc-e382c，hc-s424c，hc-n434c，和hc-q438c的半胱氨酸突变的组(见图1b和21和表2)。在某些实施方案中，该方法可用于生成分离的半胱氨酸改造抗体，其中分离的重链中的半胱氨酸突变为依照eu编号方式的hc-a140c(即依照kabat编号方式的hc-a136c)(见图1b和21和表2)。在一个优选的实施方案中，本文所述任何半胱氨酸改造抗体具有下述半胱氨酸突变之一：依照kabat编号方式的lc-k149c和依照eu编号方式的hc-a140c(见表1和2和图1a和1b)。在本发明的某些实施方案中，本文所述任何半胱氨酸改造抗体具有0.8-1.0的硫醇反应性值。在本发明的某些实施方案中，本文所述任何半胱氨酸改造抗体具有0.9-1.0的硫醇反应性值。在本发明的某些实施方案中，本文所述任何半胱氨酸改造抗体具有0.6-0.9的硫醇反应性值。在本发明的某些实施方案中，本文所述任何半胱氨酸改造抗体具有0.5-0.7的硫醇反应性值。在本发明的某些实施方案中，本文所述任何半胱氨酸改造抗体具有0.4-0.6的硫醇反应性值。在本发明的某些实施方案中，本文所述任何半胱氨酸改造抗体具有0.3-0.5的硫醇反应性值。在本发明的某些实施方案中，本文所述任何半胱氨酸改造抗体具有0.2-0.4的硫醇反应性值。在某些实施方案中，本发明为一种药物组合物，其包含本文所述任何半胱氨酸改造抗体。附图简述图1a显示4d5轻链的kabat编号方案。图1b显示4d5抗体的顺序编号方案(左列)，以n端开始，与kabat编号方案(中列)和eu编号方式(右列)比较。图2显示抗体中用于半胱氨酸诱变和药物缀合的例示性位点。粗体和下划线残基是用于半胱氨酸诱变的例示性位点。下划线残基是用于半胱氨酸诱变的另外的例示性位点。图2a显示重链中用于半胱氨酸诱变的例示性和另外的例示性残基。图2b显示轻链中用于半胱氨酸诱变的例示性和另外的例示性残基。用于半胱氨酸诱变的优选位点以灰色阴影标示且包括依照eu编号方式的hc-t114c，hc-a140c，hc-l174c，hc-l179c，hc-t187c，hc-t209c，hc-v262c，hc-g371c，hc-y373c，hc-e382c，hc-s424c，hc-n434c，和hc-q438c(图2a)和依照kabat编号方式的lc-i106c，lc-r108c，lc-r142c，和lc-k149c(图2b)。优选的依照eu编号方式的hc-a140c(依照kabat编号方式的hc-a136c)和依照kabat编号方式的lc-k149c以框标示且以大号字体突显。图3显示用于聚集分析和计算的聚集体和单体峰的代表性图。8和10分钟之间的大峰为单体峰而8分钟处的小峰为聚集体峰。图4显示thiomabtm抗体的uv280lc/ms层析图。图4a显示通过uv280lc/ms检测的缀合峰。图4b显示dar0(裸抗体)，dar1，和dar2缀合峰。图5显示用于实施全抗体半胱氨酸筛选的方案。对pds-mmae和mc-vc-mmae缀合物实施全抗体筛选。相应地，生成并测试648pds-mmae和648mc-vc-mmae(总共1296)thiomabtm抗体。图6显示mc-vc-mmae和pds-mmae缀合物的代表性稳定性图。图6a显示0小时，48小时，和96小时时使用lc/ms分析获得的pds-mmaelc-r142cthiomabtm抗体的代表性稳定性图。图6b显示0小时，48小时，和96小时时使用lc/ms分析获得的mc-vc-mmaelc-r142cthiomabtm抗体的代表性稳定性图。图7显示通过百分比药物载荷评估的不同pds-mmaethiomabtm抗体的稳定性的图。图8显示通过百分比药物载荷评估的不同mc-vc-mmaethiomabtm抗体的稳定性的图。图9显示lc-k149c，lc-v205c，和hc-a114cthiomabtm抗her2和抗cd33抗体随时间的平均dar的图。图10显示例示性thiomabtm抗体结构。图10a显示thio-her2-hu7c2-hc-a118c-二硫化物-pbd和thio-her2-hu7c2-lc-k149c-二硫化物-pbdthiomabtm抗体的结构。图10b显示thio-her2-hu7c2-lc-k149c-cbi二聚体的结构。图10c显示thio-her2-hu7c2-lc-k149c-二硫化物-cbi-pbd的结构。图10d显示thio-her2-hu7c2-lc-k149c-二硫化物-pnu的结构。图10e显示thio-her2-hu7c2-hc-a118c-马来酰亚胺-pnu和thio-her2-hu7c2-lc-k149c-马来酰亚胺-pnu的结构。图11显示mc-vc-mmaethiomabtm抗体的绘图(不按比例)。图12显示pds-mmaethiomabtm抗体的绘图(不按比例)。图13显示某些药物缀合至lc-k149c半胱氨酸改造抗体的酶促修饰的图解。该修饰如下：cryptophycin发生酰胺切割，tubulysin发生乙酰基损失(即脱乙酰基化)，cbi-pbd异二聚体接头-药物中间体发生氨基甲酸根损失，而类紫杉烷是不稳定的且显示多重酶促切割。图14a显示与lc-k149c相比，hc-a140c对tubulysin的乙酰基基团提供保护。具体而言，使用lcms显示了温育24小时后使用hc-a140c作为附着位点时的药物降解比lc-k149c更少。图14b和14c使用一种新颖的全血测定法显示温育24小时后hc-a140c比lc-k149c更加稳定。图15使用多轮wb测定法显示hc-a140c处的乙酰基损失与lc-k149c相比剧烈降低。确认了hc-a140c挽救乙酰基损失修饰。图16a显示hc-a140c对cbi-pbd异二聚体接头-药物中间体的氨基甲酸酯基团提供保护。具体而言，使用lcms显示了温育24小时后使用hc-a140c作为附着位点时的药物降解比lc-k149c更少(图16a)。图16b和16c使用一种新颖的全血测定法显示温育24小时后hc-a140c比lc-k149c更加稳定。图17使用本文所述新颖的全血测定法显示hc-a140c比lc-k149c更加稳定。图18a显示hc-a140c提供保护免于类紫杉烷的修饰。具体而言，使用lcms显示了温育24小时后使用hc-a140c作为附着位点时的药物降解比lc-k149c更少。图18b和18c使用一种新颖的全血测定法显示温育24小时后hc-a140c比lc-k149c更加稳定。图19使用新颖的全血测定法显示hc-a140c比lc-k149c更加稳定(例如就保护类紫杉烷药物损失而言)。图20显示与lc-k149c相比，hc-a140c保护cryptophycin免于酰胺和酯切割。图21显示对于pds和-vc接头优选的hc和lc半胱氨酸突变，定位于抗体的图解。典型实施方案的详细描述详细内容参照本发明的某些实施方案，其实施例在附带的结构和通式中例示。尽管结合列举的实施方案描述了本发明，但是应理解它们并非指定用于将本发明限定到那些实施方案。相反，本发明覆盖所有的备选，变型和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。本领域技术人员知道可以用于实施本发明的与本文所述的那些相似或等同的许多方法和物质。本发明决不限于所述的方法和物质。除非另做陈述，否则，本文所用的技术和科学术语具有本发明所属
技术领域：
普通技术人员通常理解的相同的含义并且与如下文献中所述一致：singleton等(1994)dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology,2nded.,j.wiley&sons,newyork,ny；和janeway,c.,travers,p.,walport,m.,shlomchik(2001)immonobiology,5thed.,garlandpublishing,newyork。定义除非另做陈述，否则，本文所用的下列术语和措词具有如下含义：当本文中使用商品名时，申请人意欲独立地包括商品名产品制剂，仿制药和商品名产品的活性药物组分。本文的术语“抗体”以其最广泛的含义使用并且特别覆盖单克隆抗体，多克隆抗体，二聚体，多聚体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性(miller等(2003)jour.ofimmunology170:4854-4861)。抗体可以为鼠，人，人源化，嵌合的抗体或来源于其它物种。抗体为由能够识别和结合特异性抗原的免疫系统产生的蛋白质(janeway,c.,travers,p.,walport,m.,shlomchik(2001)immunobiology,5thed.,garlandpublishing,newyork).靶抗原一般具有由多种抗体的cdrs识别的大量结合位点，也称作表位。特异性结合不同表位的各抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可以具有一种以上相应的抗体。抗体包括全-长免疫球蛋白分子或全-长免疫球蛋白分子的免疫活性模块，即含有免疫特异性结合所关注靶标的抗原或其部分的抗原结合位点的分子，这类靶标包括，但不限于癌细胞或产生与自身免疫性疾病相关的自身免疫抗体的细胞。本文披露的免疫球蛋白可以具有免疫球蛋白分子的任意类型(例如igg，ige，igm，igd和iga)，类别(例如igg1，igg2，igg3，igg4，iga1和iga2)或亚类。免疫球蛋白可以来源于任意的物种。然而，在一个方面中，免疫球蛋白来源于人，鼠或兔。“抗体片段”包含全长抗体的一部分，一般为其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括：fab，fab′，f(ab′)2和fv片段；双抗体；线性抗体；微抗体(minibody)(olafsen等(2004)proteineng.design&sel.17(4):315-323)；fab表达文库制备的片段；抗独特型(抗-id)抗体；cdr(互补决定区)；和以免疫特异性方式结合癌细胞抗原，病毒抗原或微生物抗原的上述任意的表位-结合片段；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。如本文中使用的，术语“多特异性抗体”指包含具有多表位特异性(即能够结合一种分子上的两种或更多种不同表位或能够结合两种或更多种不同分子上的表位)的抗原结合域的抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体是对至少两个不同抗原结合位点具有结合特异性的单克隆抗体(诸如双特异性抗体)。在一些实施方案中，多特异性抗体的第一抗原结合域和第二抗原结合域可结合一种和相同分子内的两种表位(分子内结合)。例如，多特异性抗体的第一抗原结合域和第二抗原结合域可结合相同分子上的两种不同表位。在某些实施方案中，多特异性抗体结合的两种不同表位是正常情况下不受一个单特异性抗体，诸如例如常规抗体或一个免疫球蛋白单一可变域同一时间结合的表位。在一些实施方案中，多特异性抗体的第一抗原结合域和第二抗原结合域可结合位于两种截然不同分子内的表位(分子间结合)。例如，多特异性抗体的第一抗原结合域可结合一种分子上的一种表位，而多特异性抗体的第二抗原结合域可结合一种不同分子上的另一种表位，由此交联该两种分子。在一些实施方案中，多特异性抗体(诸如双特异性抗体)的抗原结合域包含两个vh/vl单元，其中第一vh/vl单元结合第一表位而第二vh/vl单元结合第二表位，其中每个vh/vl单元包含重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)。此类多特异性抗体包括但不限于全长抗体，具有两个或更多个vl和vh域的抗体，和抗体片段(诸如fab，fv，dsfv，scfv，双抗体，双特异性双抗体和三抗体，已经共价或非共价连接的抗体片段)。进一步包含至少部分重链可变区和/或至少部分轻链可变区的vh/vl单元也可称作“臂”或“半体”或“半抗体”。在一些实施方案中，半体包含的部分重链可变区的足以容许与第二半体形成分子内二硫键。在一些实施方案中，半体包含节突变或穴突变，例如为了容许与包含互补穴突变或节突变的第二半体或半抗体异二聚化。下文进一步讨论节突变和穴突变。在某些实施方案中，本文中提供的多特异性抗体可以是双特异性抗体。如本文中使用的，术语“双特异性抗体”指包含能够结合一种分子上的两种不同表位或能够结合两种不同分子上的表位的抗原结合域的多特异性抗体。双特异性抗体在本文中也可称作具有“双重特异性”或是“双重特异性的”。例示性的双特异性抗体可结合该分子和任何其它抗原二者。在某些实施方案中，结合特异性之一针对该分子且另一针对cd3。参见例如美国专利no.5,821,337。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合相同分子的两种不同表位。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合两种不同分子上的两种不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达感兴趣分子的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链的重组共表达(见milstein和cuello，nature305：537(1983)，wo93/08829，和traunecker等，emboj.10：3655(1991))，和“节-入-穴”工程化(见例如美国专利no.5,731,168，wo2009/089004，us2009/0182127，us2011/0287009，marvin和zhu，actapharmacol.sin.(2005)26(6)：649-658，和kontermann(2005)actapharmacol.sin.，26：1-9)。如本文中使用的，术语“节-入-穴”或“knh”技术指通过在两条多肽相互作用的界面处将隆起(节)引入一条多肽并将空腔(穴)引入另一条多肽中，在体外或在体内将两条多肽配对在一起的技术。例如，已经在抗体的fc:fc结合界面，cl:ch1界面或vh/vl界面中引入knh(见例如us2011/0287009，us2007/0178552，wo96/027011，wo98/050431，zhu等(1997)proteinscience6：781-788，和wo2012/106587)。在一些实施方案中，knh在制造多特异性抗体期间驱动两条不同重链配对在一起。例如，在它们的fc区中具有knh的多特异性抗体可进一步包含连接至每个fc区的单一可变域，或进一步包含与相似或不同轻链可变域配对的不同重链可变域。knh技术还可用于将两个不同受体胞外域或包含不同靶物识别序列的任何其它多肽序列(例如包括亲和抗体(affibody)，肽体(peptibody)和其它fc融合物)配对在一起。如本文中使用的，术语“节突变”指在多肽与另一多肽相互作用的界面处向该多肽中引入隆起(节)的突变。在一些实施方案中，另一多肽具有穴突变。如本文中使用的，术语“穴突变”指在多肽与另一多肽相互作用的界面处向该多肽中引入空腔(穴)的突变。在一些实施方案中，另一多肽具有节突变。下文提供简要的非限制性讨论。“隆起”指至少一个氨基酸侧链自第一多肽的界面凸出并因此可放置在邻近界面(即第二多肽的界面)的补偿空腔中，从而稳定异多聚体，并由此例如有利于异多聚体形成，超过同多聚体形成。隆起可存在于初始界面中或可通过合成而引入(例如通过改变编码界面的核酸)。在一些实施方案中，改变编码第一多肽的界面的核酸以编码隆起。为了实现这一点，将编码第一多肽的界面中的至少一个“初始”氨基酸残基的核酸用编码至少一个侧链体积比初始氨基酸残基要大的“输入”氨基酸残基的核酸替换。会领会可以有超过一个初始和对应输入残基。各种氨基酸残基的侧链体积显示于例如us2011/0287009的表1。引入“隆起”的突变可称作“节突变”。在一些实施方案中，用于形成隆起的输入残基是选自精氨酸(r)，苯丙氨酸(f)，酪氨酸(y)和色氨酸(w)的天然发生氨基酸残基。在一些实施方案中，输入残基是色氨酸或酪氨酸。在一些实施方案中，用于形成隆起的初始残基具有较小侧链体积，诸如丙氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸或缬氨酸。“空腔”指至少一个氨基酸侧链自第二多肽的界面凹进并因此容纳第一多肽的邻近界面上的对应隆起。空腔可存在于初始界面中或可通过合成而引入(例如通过改变编码界面的核酸)。在一些实施方案中，改变编码第二多肽的界面的核酸以编码空腔。为了实现这一点，将编码第二多肽的界面中的至少一个“初始”氨基酸残基的核酸用编码至少一个侧链体积比初始氨基酸残基要小的“输入”氨基酸残基的dna替换。会领会可以有超过一个初始和对应输入残基。在一些实施方案中，用于形成空腔的输入残基是选自丙氨酸(a)，丝氨酸(s)，苏氨酸(t)和缬氨酸(v)的天然发生氨基酸残基。在一些实施方案中，输入残基是丝氨酸，丙氨酸或苏氨酸。在一些实施方案中，用于形成空腔的初始残基具有较大的侧链体积，诸如酪氨酸，精氨酸，苯丙氨酸或色氨酸。引入“空腔”的突变可称作“穴突变”。隆起“可放置”在空腔中，这意味着隆起和空腔分别在第一多肽和第二多肽的界面上的空间位置及隆起和空腔的大小使得隆起能定位在空腔中，而对第一和第二多肽在界面处的正常联合没有显著扰乱。因为隆起诸如tyr，phe和trp通常不与界面的轴垂直延伸且具有优选构象，所以隆起与对应空腔的排列在一些情况中可能依赖于隆起/空腔对基于三维结构(诸如通过x射线晶体学或核磁共振(nmr)获得的)的建模。这可以使用本领域广泛接受的技术来实现。在一些实施方案中，igg1恒定区中的节突变为t366w(eu编号方式)。在一些实施方案中，igg1恒定区中的穴突变包含一处或多处选自t366s，l368a和y407v(eu编号方式)的突变。在一些实施方案中，igg1恒定区中的穴突变包含t366s，l368a和y407v(eu编号方式)。在一些实施方案中，igg4恒定区中的节突变为t366w(eu编号方式)。在一些实施方案中，igg4恒定区中的穴突变包含一处或多处选自t366s，l368a，和y407v(eu编号方式)的突变。在一些实施方案中，igg4恒定区中的穴突变包含t366s，l368a，和y407v(eu编号方式)。也可以通过用于生成抗体fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(wo2009/089004a1)；交联两个或更多个抗体或片段(见例如美国专利no.4,676,980，及brennan等，science，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如kostelny等，j.immunol.，148(5):1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如hollinger等，proc.natl.acad.sci.usa，90:6444-6448(1993))；及使用单链fv(sfv)二聚体(见例如gruber等，j.immunol.，152:5368(1994))；及如例如tutt等，j.immunol.147：60(1991)中所描述的，制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”或“双重可变域免疫球蛋白”(dvd)(见例如us2006/0025576a1，和wu等，naturebiotechnology(2007))。本文中的抗体或片段还包括包含结合该分子及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用fab”或“daf”(见例如us2008/0069820)。本文的术语“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群中获得的抗体，即除可能少量存在的天然发生的可能突变之外，包含在该群体中的各抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异的靶向单个抗原位点的抗体。而且，与包括靶向不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，每种单克隆抗体只靶向抗原上的单一决定簇。除其特异性外，单克隆抗体的优点还在于它们可以以不被其它抗体污染的方式合成。修饰语“单克隆”表示获自基本上同质的抗体群的抗体特性，并非解释为需要由任何特定方法生产抗体。例如，可以通过首先由kohler等(1975)nature256:495描述的杂交瘤方法制备用于本发明的单克隆抗体或可以通过重组dna方法制备(例如，参见:us4816567；us5807715)。例如，还可以使用clackson等(1991)nature,352:624-628；marks等(1991)j.mol.biol.,222:581-597所述的技术从噬菌体抗体文库分离单克隆抗体。本文的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类型或亚型的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类型或亚型的抗体中的相应序列相同或同源，本文还包括嵌合抗体的片段，只要它们展示期望的生物学活性(us4816567；和morrison等(1984)proc.natl.acad.sci.usa,81:6851-6855)。本文关注的嵌合抗体包括“灵长化(primatized)”抗体，其包含来源于非人的灵长类(例如旧世界猴，猿等)的可变域抗原结合序列和人恒定区序列。本文的“完整抗体”为包含vl和vh结构域以及轻链恒定域(cl)和重链恒定域ch1，ch2和ch3的抗体。恒定域可以为天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。完整抗体可以具有一种或多种“效应子功能”，意旨归因于抗体的fc恒定区(天然序列fc区或氨基酸序列变体fc区)的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括c1q结合；补体依赖的细胞毒性；fc受体结合；抗体-依赖性细胞介导的细胞毒作用(adcc)；胞吞作用；和细胞表面受体，诸如b细胞受体和bcr的减量调节。在某些实施方案中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的fc区中，由此生成fc区变体。fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人fc区序列(例如，人igg1，igg2，igg3或igg4fc区)。在某些实施方案中，本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体，这使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能(诸如补体和adcc)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认cdc和/或adcc活性的降低/消减。例如，可以进行fc受体(fcr)结合测定法以确保抗体缺乏fcγr结合(因此有可能缺乏adcc活性)，但是保留fcrn结合能力。介导adcc的主要细胞nk细胞仅表达fcγriii，而单核细胞表达fcγri，fcγrii和fcγriii。在ravetch和kinet，annu.rev.immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的fcr表达。评估感兴趣分子的adcc活性的体外测定法的非限制性例子记载于美国专利no.5,500,362(见例如hellstrom，i.等，proc.nat’lacad.sci.usa83:7059-7063(1986))和hellstrom，i等，proc.nat’lacad.sci.usa82:1499-1502(1985)；5,821,337(见bruggemann，m.等，j.exp.med.166:1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(见例如用于流式细胞术的actitm非放射性细胞毒性测定法(celltechnology，inc.mountainview，ca；和cytotox非放射性细胞毒性测定法(promega，madison，wi))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(pbmc)和天然杀伤(nk)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的adcc活性，例如在动物模型中，诸如披露于clynes等，proc.nat’lacad.sci.usa95:652-656(1998)的。也可以实施c1q结合测定法以确认抗体不能结合c1q，并且因此缺乏cdc活性。见例如wo2006/029879和wo2005/100402中的c1q和c3c结合elisa。为了评估补体激活，可以实施cdc测定法(见例如gazzano-santoro等，j.immunol.methods202:163(1996)；cragg，m.s.等，blood101:1045-1052(2003)；及cragg，m.s.和m.j.glennie，blood103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法来实施fcrn结合和体内清除/半衰期测定(见例如petkova，s.b.等，int’l.immunol.18(12):1759-1769(2006))。在一些实施方案中，可以在本文中提供的抗体的fc部分中引入一处或多处氨基酸修饰以提高对新生儿fc受体的igg结合。在某些实施方案中，抗体包含下述三处依照eu编号方式的突变：m252y，s254t，和t256e(“yte突变”)(美国专利no.8,697,650；还见dall’acqua等，journalofbiologicalchemistry281(33):23514-23524(2006)。在某些实施方案中，yte突变不影响抗体结合其关联抗原的能力。在某些实施方案中，yte突变与天然(即非yte突变)抗体相比延长抗体的血清半衰期。在一些实施方案中，yte突变与天然(即非yte突变)抗体相比将抗体的血清半衰期延长3倍。在一些实施方案中，yte突变将抗体的血清半衰期与天然(即非yte突变)抗体相比延长2倍。在一些实施方案中，yte突变将抗体的血清半衰期与天然(即非yte突变)抗体相比延长4倍。在一些实施方案中，yte突变将抗体的血清半衰期与天然(即非yte突变)抗体相比延长至少5倍。在一些实施方案中，yte突变将抗体的血清半衰期与天然(即非yte突变)抗体相比延长至少10倍。见例如美国专利no.8,697,650；还见dall’acqua等，journalofbiologicalchemistry281(33):23514-23524(2006)。在某些实施方案中，yte突变体提供调控抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)活性的一种手段。在某些实施方案中，yteo突变体提供调控针对人抗原的人源化igg抗体的adcc活性的一种手段。见例如美国专利no.8,697,650；还见dall’acqua等，journalofbiologicalchemistry281(33):23514-23524(2006)。在某些实施方案中，yte突变体容许同时调控血清半衰期，组织分布，和抗体活性(例如igg抗体的adcc活性)。见例如美国专利no.8,697,650；还见dall’acqua等，journalofbiologicalchemistry281(33):23514-23524(2006)。具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有依照eu编号方式的fc区残基238，265，269，270，297，327和329中的一个或多个的替代的(美国专利no.6,737,056)。此类fc突变体包括在依照eu编号方式的氨基酸位置265，269，270，297和327中的两处或更多处具有替代的fc突变体，包括依照eu编号方式的残基265和297替代成丙氨酸(即依照eu编号方式的d265a和n297a)的所谓的“dana”fc突变体(美国专利no.7,332,581)。在某些实施方案中，fc突变体包含下述两处氨基酸替代：d265a和n297a。在某些实施方案中，fc突变体由下述两处氨基酸替代组成：d265a和n297a。在某些实施方案中，野生型人fc区的位置329(eu编号方式)处的脯氨酸(p329)是用甘氨酸或精氨酸或大得足以破坏fc/fcγ受体界面内fc的p329和fcgriii的色氨酸残基w87和w110之间形成的脯氨酸三明治的氨基酸残基(sondermann等：nature406，267-273(20july2000))替代的。在又一个实施方案中，fc变体中的至少一处进一步的氨基酸替代为s228p，e233p，l234a，l235a，l235e，n297a，n297d，或p331s，而且在仍有另一个实施方案中，所述至少一处进一步的氨基酸替代为人igg1fc区的l234a和l235a或人igg4fc区的s228p和l235e，均依照eu编号方式(美国专利no.8,969,526，通过援引将其完整收录)。在某些实施方案中，多肽包含野生型人iggfc区的fc变体，其中该多肽所具有的人iggfc区的p329是用甘氨酸替代的，且其中该fc变体包含至少两处进一步的氨基酸替代，人igg1fc区的l234a和l235a或人igg4fc区的s228p和l235e，且其中残基是依照该eu编号方式编号的(美国专利no.8,969,526，通过援引将其完整收录)。在某些实施方案中，包含p329g，l234a和l235a(eu编号方式)替代的多肽展现降低对人fcγriiia和fcγriia的亲和力，用于将adcc下调至由包含野生型人iggfc区的多肽诱导的adcc的至少20％，和/或用于下调adcp(美国专利no.8,969,526，通过援引将其完整收录)。在一个具体的实施方案中，包含野生型人fc多肽的fc变体的多肽包含三重突变：依照eu编号方式的位置pro329处的氨基酸替代，l234a和l235a突变(p329/lala)(美国专利no.8,969,526，通过援引将其完整收录)。在具体的实施方案中，该多肽包含下述氨基酸替代：依照eu编号方式的p329g，l234a，和l235a。描述了具有改善的或降低的对fcr的结合的某些抗体变体(见例如美国专利no.6,737,056；wo2004/056312，及shields等，j.biol.chem.9(2)：6591-6604(2001))。在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善adcc的一处或多处氨基酸替代，例如fc区的位置298，333，和/或334(eu编号方式)的替代的fc区。在一些实施方案中，对fc区做出改变，其导致改变的(即，改善的或降低的)c1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)，例如，如记载于美国专利no.6,194,551，wo99/51642，及idusogie等，j.immunol.164：4178-4184(2000)的。具有延长的半衰期和改善的对新生儿fc受体(fcrn)的结合的抗体记载于us2005/0014934a1(hinton等)，新生儿fc受体(fcrn)负责将母体igg转移至胎儿(guyer等，j.immunol.117:587(1976)及kim等，j.immunol.24:249(1994))。那些抗体包含其中具有改善fc区对fcrn结合的一处或多处替代的fc区。此类fc变体包括那些在依照eu编号方式的fc区残基238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434中的一处或多处具有替代，例如，fc区残基434的替代的(美国专利no.7,371,826)。还可见duncan和winter，nature322:738-40(1988)；美国专利no.5,648,260；美国专利no.5,624,821；及wo94/29351，其关注fc区变体的其它例子。根据其重链恒定域的氨基酸序列的不同，可以将完整抗体指定为不同“类”。存在五大类的完整免疫球蛋白抗体:iga，igd，ige，igg和igm，且可以将其中的几种进一步分成“亚类”(同种型)，例如igg1,igg2,igg3,igg4,iga1,和iga2。对应于不同抗体类别的重链恒定域分别称作α，δ，ε，γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造为众所周知的。ig型包括铰链-修饰型或无铰链型(roux等(1998)j.immunol.161:4083-4090；lund等(2000)eur.j.biochem.267:7246-7256；us2005/0048572；us2004/0229310)。“半胱氨酸改造抗体”或“半胱氨酸改造抗体变体”是如下的抗体，该抗体的一个或多个残基是用半胱氨酸残基替代的。半胱氨酸改造抗体的硫醇基团可以缀合至药物模块(例如经由接头)以形成thiomabtm抗体(即thiomabtm抗体-药物缀合物(tdc))。在特定的实施方案中，替代残基存在于抗体的可及位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此位于抗体的可及位点且可用于将抗体缀合至其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块，以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。例如，thiomabtm抗体可以是具有轻链中(例如依照kabat编号方式的g64c，i106c，r108c，k149c或r142c)或重链中(例如依照kabat编号方式的hc-d101c，hc-v184c，或hc-t205c，或依照eu编号方式的hc-t114c，hc-a140c，hc-l174c，hc-l179c，hc-t187c，hc-t209c，hc-v262c，hc-g371c，hc-y373c，hc-e382c，hc-s424c，hc-n434c，和hc-q438c(即依照kabat编号方式的hc-a136c为依照eu编号方式的hc-a140c)非半胱氨酸天然残基变成半胱氨酸的单一突变的抗体(见图1b))。在具体的例子中，thiomabtm抗体具有重或轻链任一中的单一半胱氨酸突变，使得每个全长抗体(即具有两条重链和两条轻链的抗体)具有两个改造的半胱氨酸残基。“erbb受体”为属于受体erbb受体家族的蛋白酪氨酸激酶，其成员为细胞生长，分化和存活的重要介导物。erbb受体家族包括4种不同的成员，包括表皮生长因子受体(egfr，erbb1，her1)，her2(erbb2或p185neu)，her3(erbb3)和her4(erbb4或tyro2)。已经使用人乳腺肿瘤细胞系skbr3表征了一组抗-erbb2抗体(hudziak等(1989)mol.cell.biol.9(3):1165-1172。使用称作4d5的抑制细胞增殖达56％的抗体获得最大抑制作用。在本试验的一组抗体中的其它抗体降低细胞增殖的程度较弱。进一步发现抗体4d5可以使过表达erbb2的乳腺肿瘤细胞系对tnf-α的细胞毒性效应敏感(us5677171)。hudziak等讨论的抗-erbb2抗体进一步在下列文献中得到表征：fendly等(1990)cancerresearch50:1550-1558；kotts等(1990)invitro26(3):59a；sarup等(1991)growthregulation1:72-82；shepard等(1991)j.clin.immunol.11(3):117-127；kumar等(1991)mol.cell.biol.11(2):979-986；lewis等(1993)cancerimmunol.immunother.37:255-263；pietras等(1994)oncogene9:1829-1838；vitetta等(1994)cancerresearch54:5301-5309；sliwkowski等(1994)j.biol.chem.269(20):14661-14665；scott等(1991)j.biol.chem.266:14300-5；d′souza等，proc.natl.acad.sci.(1994)91:7202-7206；lewis等，(1996)cancerresearch56:1457-1465；和schaefer等(1997)oncogene15:1385-1394。erbb受体通常包含胞外结构域，其可以结合erbb配体；亲脂性跨膜结构域；保守的胞内酪氨酸激酶结构域；和包含几个可以被磷酸化的酪氨酸残基的羧基-末端信号传导结构域。erbb受体可以为“天然序列”erbb受体或其“氨基酸序列变体”。优选erbb受体为天然序列人erbb受体。因此，“erbb受体家族的成员”包括egfr(erbb1)，erbb2，erbb3，erbb4。术语“氨基酸序列变体”意旨在一定程度上具有不同于天然序列多肽的氨基酸序列的多肽。氨基酸序列变体在天然氨基酸序列的氨基酸序列内的某些位置上具有替代，缺失和/或插入。按照常规的名称，即一字母密码和三字母密码命名氨基酸。例如，在某些实施方案中，氨基酸序列变体会与天然erbb配体的至少一种受体结合结构域或与天然erbb受体的至少一种配体结合结构域具有至少约70％的序列同一性，并且优选它的序列会与这类受体或配体结合结构域至少约80％，更优选至少约90％同源。将“序列同一性”定义为对序列进行序列对比排列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后氨基酸序列变体中相同的残基的百分率。用于进行序列对比的方法和计算机程序为本领域众所周知的。一种这类计算机程序为genentech,inc.创建的“align2”，其中归档为1991年12月10日在unitedstatescopyrightoffice,washington,dc20559的用户文件。“天然抗体”通常为由两种相同的轻(l)链和两种相同的重(h)链组成的约150,000道尔顿的异四聚化糖蛋白。每一轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数量在不同免疫球蛋白同种型的重链中可变。每一重链和轻链还具有有规则间隔的链间二硫桥。每一重链在一端上带有可变域(vh)，随后是大量恒定域。每一轻链在一端上带有可变域(vl)，而在另一端上带有恒定域。将轻链的恒定域与重链的第一恒定域进行序列对比并且将轻链的可变域与重链的可变域进行序列对比。认为特定的氨基酸残基在轻链域重链可变域之间形成界面。术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体序列中差异广泛且用于每种特定抗体针对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(fr)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个fr，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过fr非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见kabat等人，1991，《sequencesofproteinsofimmunologicalinterest》，第5版，publichealthservice，nationalinstitutesofhealth，bethesda，md)。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应物功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(adcc)中抗体的参与。术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“cdr”的氨基酸残基(例如轻链可变域中的残基24-34(l1)，50-56(l2)和89-97(l3)及重链可变域中的残基31-35(h1)，50-65(h2)和95-102(h3)；kabat等人，见上文)和/或那些来自“高变环”的残基(例如轻链可变域中的残基26-32(l1)，50-52(l2)和91-96(l3)及重链可变域中的残基26-32(h1)，53-55(h2)和96-101(h3)；chothiaandlesk(1987)j.mol.biol.196:901-917)。“框架区”或“fr”残基指可变域中除了本文中所定义的高变区残基以外的那些残基。用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作“fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，和一个残余“fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个f(ab′)2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。“fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。此区由紧密，非共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变域的二聚体组成。正是在这种构造中，各个可变域的三个高变区相互作用而在vh-vl二聚体表面确定了一个抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或只包含对抗原特异的三个高变区的半个fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整结合位点。fab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(ch1)。fab’片段因在重链ch1结构域的羧基末端增加了少数残基而与fab片段有所不同，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。fab’-sh是本文中对其中恒定区半胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基的fab’的称谓。f(ab′)2抗体片段最初是作为成对fab’片段生成的，在fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。还知道抗体片段的其它化学偶联。根据其恒定域氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体的“轻链”可归入两种截然不同类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。“单链fv”或“scfv”抗体片段包含抗体的vh和vl结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。优选的是，该fv多肽在vh和vl结构域之间还包含多肽接头，使得scfv能够形成抗原结合期望的结构。关于scfv的综述参见plückthun，《thepharmacologyofmonoclonalantibodies》，vol.113，rosenburg和moore编，springer-verlag，newyork，pp.269-315，1994。抗erbb2抗体scfv片段描述于wo93/16185；美国专利5,571,894；和5,587,458。非人(例如啮齿类)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。人源化是将鼠抗原结合信息转移至非免疫原性人抗体受体的方法，并且已经产生了许多治疗上有用的药物。人源化方法一般通过将所有6个鼠互补决定区(cdr)转移至人抗体框架开始(jones等,(1986)nature321:522-525)。这些cdr移植的抗体一般不会保持其对抗原结合的最初亲和力，并且事实上，亲和力通常严重受损。除cdr外，还必须引入选定的非人抗体框架残基以便维持正确的cdr构象(chothia等(1989)nature342:877)。已经证实，将关键的小鼠框架残基转移至人受体以便支持所移植cdr的结构构象恢复抗原结合和亲和力(riechmann等(1992)j.mol.biol.224,487-499；foote和winter,(1992)j.mol.biol.224:487-499；presta等(1993)j.immunol.151,2623-2632；werther等(1996)j.immunol.methods157:4986-4995；和presta等(2001)thromb.haemost.85:379-389)。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性，亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠，大鼠，兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(fr)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常，人源化抗体包含至少一个，通常两个基本上整个如下可变域，其中整个或基本上整个高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且整个或基本上整个fr是人免疫球蛋白序列的fr。人源化抗体任选还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见us6,407,213；jonesetal.(1986)nature321:522-525；riechmannetal.(1988)nature332:323-329；presta(1992)curr.op.struct.biol.2:593-596。“游离半胱氨酸氨基酸”指已经改造到亲本抗体中，带有硫醇官能基(-sh)，并且未作为分子内或分子间二硫键配对的半胱氨酸氨基酸残基。术语“硫醇反应性值”为游离半胱氨酸氨基酸的反应性的定量表征。硫醇反应性值为半胱氨酸改造抗体中与硫醇反应性试剂起反应的游离半胱氨酸氨基酸的百分比，并且换算成最大值1。例如，半胱氨酸改造抗体上以100％产率与硫醇反应性试剂诸如生物素-马来酰亚胺试剂起反应而形成生物素标记的抗体的游离半胱氨酸氨基酸具有1.0的硫醇反应性值。改造到相同或不同亲本抗体中的以90％产率与硫醇反应性试剂起反应的另一个半胱氨酸氨基酸具有约0.9的硫醇反应性值。改造到相同或不同亲本抗体中的以80％产率与硫醇反应性试剂起反应的另一个半胱氨酸氨基酸具有约0.8的硫醇反应性值。改造到相同或不同亲本抗体中的以70％产率与硫醇反应性试剂起反应的另一个半胱氨酸氨基酸具有约0.7的硫醇反应性值。改造到相同或不同亲本抗体中的以60％产率与硫醇反应性试剂起反应的另一个半胱氨酸氨基酸具有约0.6的硫醇反应性值。改造到相同或不同亲本抗体中的以50％产率与硫醇反应性试剂起反应的另一个半胱氨酸氨基酸具有约0.5的硫醇反应性值。改造到相同或不同亲本抗体中的以40％产率与硫醇反应性试剂起反应的另一个半胱氨酸氨基酸具有约0.4的硫醇反应性值。改造到相同或不同亲本抗体中的以30％产率与硫醇反应性试剂起反应的另一个半胱氨酸氨基酸具有约0.3的硫醇反应性值。改造到相同或不同亲本抗体中的以20％产率与硫醇反应性试剂起反应的另一个半胱氨酸氨基酸具有约0.2的硫醇反应性值。改造到相同或不同亲本抗体中的以10％产率与硫醇反应性试剂起反应的另一个半胱氨酸氨基酸具有约0.1的硫醇反应性值。改造到相同或不同亲本抗体中的完全无法与硫醇反应性试剂起反应的另一个半胱氨酸氨基酸具有0的硫醇反应性值。可以通过elisa测定法，质谱法，液相层析法，放射自显影法或其它定量分析试验测定特定半胱氨酸的硫醇反应性值。“亲本抗体”为所含氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基将用一个或多个半胱氨酸残基替代的抗体。亲本抗体可以包含天然或野生型序列。亲本抗体可以具有相对于其它天然，野生型或修饰形式的抗体而言预先存在的氨基酸序列修饰(诸如添加，缺失和/或替代)。亲本抗体可以针对所关注的靶抗原，例如生物学上重要的多肽。还关注针对非多肽抗原(诸如肿瘤相关糖脂抗原；参见us5,091,178)的抗体。例示性亲本抗体包括对细胞表面和跨膜受体和肿瘤相关抗原(taa)具有亲和力和选择性的抗体。“分离的”抗体指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶，激素，和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据lowry方法的测定，抗体重量超过95％，最优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的n-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据使用考马斯蓝或优选银染色的还原性或非还原性条件下的sds-page，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常通过至少一个纯化步骤来制备。“结合”分子靶标或所关注抗原例如erbb2抗原的抗体为能够以足够亲和力结合抗原，使得该抗体可用于靶向表达该抗原的细胞的抗体。如果抗体为结合erbb2的抗体，那么它通常优先结合erbb2胜过其它erbb受体，并且可以为不会与其它蛋白质，诸如egfr，erbb3或erbb4发生显著交叉反应的抗体。在这类实施方案中，抗体与这些非erbb2蛋白质结合(例如对内源受体的细胞表面结合)的程度将低于10％，正如通过荧光激活细胞分选术(facs)分析或放射性免疫沉淀(ria)测定的。有时，抗erbb2抗体不会与大鼠neu蛋白发生显著的交叉反应，例如如schecter等(1984)nature312:513和drebin等(1984)nature312:545-548中所述。本发明所涵盖的抗体的分子靶标包括cd蛋白及其配体，诸如，但不限于：(i)cd3，cd4，cd8，cd19，cd20，cd22，cd34，cd40，cd79α(cd79a)和cd79β(cd79b)；(ii)erbb受体家族的成员，诸如egf受体，her2，her3或her4受体；(iii)细胞粘附分子，诸如lfa-1，mac1，p150,95，vla-4，icam-1，vcam和αv/β3整联蛋白，包括其α或β亚基(例如抗cd11a，抗cd18或抗cd11b抗体)；(iv)生长因子，诸如vegf；ige；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(ob)受体；mpl受体；ctla-4；蛋白c，br3，c-met，组织因子，等；和(v)细胞表面和跨膜肿瘤相关抗原(taa)。术语“抗ly6e抗体”和“结合ly6e的抗体”指能够以足够亲和力结合ly6e，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向ly6e的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(ria)的测量，抗ly6e抗体结合无关的，非ly6e的蛋白质的程度小于该抗体对ly6e的结合的约10％。在某些实施方案中，结合ly6e的抗体具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤5nm，≤4nm，≤3nm，≤2nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm，或≤0.001nm(例如10-8m或更少，例如10-8m到10-13m，例如10-9m到10-13m)的解离常数(kd)。在某些实施方案中，抗ly6e抗体结合在来自不同物种的ly6e中保守的ly6e表位。术语“抗steap1抗体”和“结合steap1的抗体”指能够以足够亲和力结合steap1，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向steap1的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(ria)的测量，抗steap1抗体结合无关的，非steap1的蛋白质的程度小于该抗体对steap1的结合的约10％。在某些实施方案中，结合steap1的抗体具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤5nm，≤4nm，≤3nm，≤2nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm，或≤0.001nm(例如10-8m或更少，例如10-8m到10-13m，例如10-9m到10-13m)的解离常数(kd)。在某些实施方案中，抗steap1抗体结合在来自不同物种的steap1中保守的steap1表位。术语“抗cd79b抗体”和“结合cd79b的抗体”指能够以足够亲和力结合cd79b，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向cd79b的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(ria)的测量，抗cd79b抗体结合无关的，非cd79b的蛋白质的程度小于该抗体对cd79b的结合的约10％。在某些实施方案中，结合cd79b的抗体具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤5nm，≤4nm，≤3nm，≤2nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm，或≤0.001nm(例如10-8m或更少，例如10-8m到10-13m，例如10-9m到10-13m)的解离常数(kd)。在某些实施方案中，抗cd79b抗体结合在来自不同物种的cd79b中保守的cd79b表位。术语“抗muc16抗体”和“结合muc16的抗体”指能够以足够亲和力结合muc16，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向muc16的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(ria)的测量，抗muc16抗体结合无关的，非muc16的蛋白质的程度小于该抗体对muc16的结合的约10％。在某些实施方案中，结合muc16的抗体具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤5nm，≤4nm，≤3nm，≤2nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm，或≤0.001nm(例如10-8m或更少，例如10-8m到10-13m，例如10-9m到10-13m)的解离常数(kd)。在某些实施方案中，抗muc16抗体结合在来自不同物种的muc16中保守的muc16表位。术语“抗her2抗体”和“结合her2的抗体”指能够以足够亲和力结合her2，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向her2的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(ria)的测量，抗her2抗体结合无关的，非her2的蛋白质的程度小于该抗体对her2的结合的约10％。在某些实施方案中，结合her2的抗体具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤5nm，≤4nm，≤3nm，≤2nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm，或≤0.001nm(例如10-8m或更少，例如10-8m到10-13m，例如10-9m到10-13m)的解离常数(kd)。在某些实施方案中，抗her2抗体结合在来自不同物种的her2中保守的her2表位。术语“抗cd22抗体”和“结合cd22的抗体”指能够以足够亲和力结合cd22，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向cd22的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(ria)的测量，抗cd22抗体结合无关的，非cd22的蛋白质的程度小于该抗体对cd22的结合的约10％。在某些实施方案中，结合cd22的抗体具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤5nm，≤4nm，≤3nm，≤2nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm，或≤0.001nm(例如10-8m或更少，例如10-8m到10-13m，例如10-9m到10-13m)的解离常数(kd)。在某些实施方案中，抗cd22抗体结合在来自不同物种的cd22中保守的cd22表位。术语“抗cd79b抗体”和“结合cd79b的抗体”指能够以足够亲和力结合cd79b，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向cd79b的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(ria)的测量，抗cd79b抗体结合无关的，非cd79b的蛋白质的程度小于该抗体对cd79b的结合的约10％。在某些实施方案中，结合cd79b的抗体具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤5nm，≤4nm，≤3nm，≤2nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm，或≤0.001nm(例如10-8m或更少，例如10-8m到10-13m，例如10-9m到10-13m)的解离常数(kd)。在某些实施方案中，抗cd79b抗体结合在来自不同物种的cd79b中保守的cd79b表位。术语“抗napi2b抗体”和“结合napi2b的抗体”指能够以足够亲和力结合napi2b，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向napi2b的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(ria)的测量，抗napi2b抗体结合无关的，非napi2b的蛋白质的程度小于该抗体对napi2b的结合的约10％。在某些实施方案中，结合napi2b的抗体具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤5nm，≤4nm，≤3nm，≤2nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm，或≤0.001nm(例如10-8m或更少，例如10-8m到10-13m，例如10-9m到10-13m)的解离常数(kd)。在某些实施方案中，抗napi2b抗体结合在来自不同物种的napi2b中保守的napi2b表位。除非另做陈述，术语“单克隆抗体4d5”指具有或衍生自鼠4d5抗体(atcccrl10463)的抗原结合残基的抗体。例如，单克隆抗体4d5可以为鼠单克隆抗体4d5或其变体，诸如人源化4d5。例示性人源化4d5抗体包括如美国专利no.5,821,337中所述的humab4d5-1，humab4d5-2，humab4d5-3，humab4d5-4，humab4d5-5，humab4d5-6，humab4d5-7和humab4d5-8(曲妥珠单抗(trastuzumab),)。除非另外指明，术语“单克隆抗体7c2”或“7c2”指具有7c2.v2.2.la抗体的或自其衍生的抗原结合残基的抗体。7c2抗体是抗her2抗体。“hu7c2.v.2.2.la抗体-药物缀合物”(hu7c2adc)指缀合至药物的人源化7c2抗体。在具体的实施方案中，人源化7c2抗体经由改造的半胱氨酸和接头缀合至药物。在具体的实施方案中，人源化7c2adc与一种或多种选自曲妥珠单抗t-dm1和帕妥珠单抗的另外的治疗剂共施用。在一些实施方案中，hu7c2adc与曲妥珠单抗共施用。在一些实施方案中，hu7c2adc与t-dm1共施用。在一些实施方案中，hu7c2adc与帕妥珠单抗共施用。在一些实施方案中，hu7c2adc与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗共施用。在一些实施方案中，hu7c2adc与t-dm1和帕妥珠单抗共施用。术语“治疗”和“处理”指治疗性处理及预防性或防范性措施二者，其中目标是预防或减缓(减轻)不想要的生理学变化或紊乱，诸如癌症的形成或传播。为了本发明，有利或期望的临床结果包括但不限于：缓解症状，削弱疾病的程度，疾病状态稳定(即不恶化)，延迟或减缓疾病进展，改善或减轻疾病状态，及康复(无论是部分的还是完全的)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”或“处理”还可以指与不接受治疗的预期存活相比延长存活。需要治疗的受试者包括早就患有状况或紊乱的受试者以及倾向于患上状况或紊乱的受试者或者要预防状况或紊乱的受试者。术语“治疗有效量”指在哺乳动物中有效治疗疾病或紊乱的药物量。在癌症的情况中，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的尺寸；抑制(即在一定程度上减缓和优选阻止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即在一定程度上减缓和优选阻止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻一种或多种与癌症有关的症状。在药物可阻止生长和/或杀死现有癌细胞的程度上，它可以是抑制细胞的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，可通过例如评估疾病进展时间(ttp)和/或测定响应速率(rr)来测量功效。术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理状况。“肿瘤”包含一个或多个癌性细胞。癌症的例子包括但不限于癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤，及白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)，肺癌包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌(“nsclc”)，肺的腺癌和肺的鳞状癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌包括胃肠癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝瘤(hepatoma)，乳癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，以及头和颈癌。“表达erbb的癌”指包含在其细胞表面上存在erbb蛋白质的细胞的癌。“表达erbb2的癌”指在其细胞表面上生成足够水平的erbb2，使得抗erbb2抗体可与其结合并对癌产生治疗效果的癌。“过表达”抗原性受体的癌指与同一组织类型的非癌性细胞相比，在其细胞表面上具有显著更高水平的受体诸如erbb2的癌。此类过表达可以是由基因扩增或者是由转录或翻译提高引起的。可在诊断或预后测定法中通过评估细胞表面上存在的受体蛋白质水平的升高(例如通过免疫组织化学测定法；ihc)来确定受体过表达。或者/另外，可测量细胞中受体编码核酸的水平，例如通过荧光原位杂交(fish；参见wo98/45479)，southern印迹，或聚合酶链式反应(pcr)技术，诸如实时定量pcr(rt-pcr)。“化学疗法”是可用于治疗癌症的化学治疗剂的使用。“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物，不管作用机制。如本文中使用的，术语“药物”或“药物模块”是化疗剂的例子。因而，在本文所述thiomabtm抗体包含半胱氨酸改造抗体，接头，和药物的情况中，该药物可以是本文所述任何化疗剂。化疗剂的类别包括但不限于：烷化剂类(alkyatingagents)，抗代谢物类(antimetabolites)，纺锤体毒植物生物碱类(spindlepoisonplantalkaloids)，细胞毒性/抗肿瘤抗生素类(cytoxic/antitumorantibiotics)，拓扑异构酶抑制剂类(topoisomeraseinhibitors)，抗体类(antibodies)，光敏剂类(photosensitizers)，和激酶抑制剂类(kinaseinhibitors)。化疗剂的例子包括：erlotinib(genentech/osipharm.)，多西他塞(docetaxel)(sanofi-aventis)，5-fu(氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，casno.51-21-8)，吉西他滨(gemcitabine)(lilly)，pd-0325901(casno.391210-10-9,pfizer)，顺铂(cisplatin)(顺式-二胺,二氯铂(ii)，casno.15663-27-1)，卡铂(carboplatin)(casno.41575-94-4)，帕利他塞(paclitaxel)(bristol-myerssquibboncology,princeton,n.j.)，替莫唑胺(temozolomide)(4-甲基-5-氧-2,3,4,6,8-五氮双环[4.3.0]九-2,7,9-三烯-9-羧酰胺，casno.85622-93-1,scheringplough)，他莫昔芬(tamoxifen)((z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-n,n-二甲基-乙胺，)，和多柔比星(doxorubicin)akti-1/2，hppd，和雷帕霉素(rapamycin)。化疗剂的更多例子包括：奥沙利铂(oxaliplatin)(sanofi)，bortezomib(millenniumpharm.)，sutent(su11248,pfizer)，来曲唑(letrozole)(novartis)，甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate)(novartis)，xl-518(mek抑制剂,exelixis,wo2007/044515)，arry-886(mek抑制剂,azd6244,arraybiopharma,astrazeneca)，sf-1126(pi3k抑制剂,semaforepharmaceuticals)，bez-235(pi3k抑制剂,novartis)，xl-147(pi3k抑制剂,exelixis)，ptk787/zk222584(novartis)，氟维司群(fulvestrant)(astrazeneca)，亚叶酸(leucovorin,folinicacid)，雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫司(sirolimus),wyeth)，lapatinib(gsk572016,glaxosmithkline)，lonafarnib(sarasartm,sch66336,scheringplough)，sorafenib(bay43-9006,bayerlabs)，gefitinib(astrazeneca)，伊立替康(irinotecan)(cpt-11,pfizer)，tipifarnib(zarnestratm,johnson&johnson)，abraxanetm不含克列莫佛(cremophor)，清蛋白改造纳米颗粒剂型帕利他塞(paclitaxel)(americanpharmaceuticalpartners,schaumberg,il)，vandetanib(rinn,zd6474,astrazeneca)，chloranmbucil，ag1478，ag1571(su5271；sugen)，temsirolimus(wyeth)，pazopanib(glaxosmithkline)，canfosfamide(telik)，塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)磺酸烷基酯类(alkylsulfonates)，诸如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)，三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)，三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)，三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；cc-1065(包括其阿多来新(adozelesin)，卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，kw-2189和cb1-tm1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogenmustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)，萘氮芥(chlornaphazine)，胆磷酰胺(chlorophosphamide)，雌莫司汀(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，双氯乙基甲胺(mechlorethamine)，盐酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)，美法仑(melphalan)，新氮芥(novembichin)，苯芥胆甾醇(phenesterine)，泼尼莫司汀(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥(uracilmustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin)，加利车霉素γ1i，加利车霉素ωi1(angewchem.intl.ed.engl.,(1994)33:183-186)；蒽环类抗生素(dynemicin)，dynemicina；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)，阿克拉霉素(aclacinomysin)，放线菌素(actinomycin)，氨茴霉素(authramycin)，偶氮丝氨酸(azaserine)，博来霉素(bleomycin)，放线菌素c(cactinomycin)，carabicin，洋红霉素(carminomycin)，嗜癌霉素(carzinophilin)，色霉素(chromomycinis)，放线菌素d(dactinomycin)，柔红霉素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-二氮-5-氧-l-正亮氨酸，吗啉代多柔比星，氰基吗啉代多柔比星，2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)，表柔比星(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊达比星(idarubicin)，麻西罗霉素(marcellomycin)，丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素c，霉酚酸(mycophenolicacid)，诺拉霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，泊非霉素(porfiromycin)，嘌呤霉素(puromycin)，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素(streptonigrin)，链佐星(streptozocin)，杀结核菌素(tubercidin)，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)，甲氨蝶呤(methotrexate)，蝶罗呤(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)，6-巯基嘌呤(mercaptopurine)，硫咪嘌呤(thiamiprine)，硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷(azauridine)，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷(cytarabine)，双脱氧尿苷(dideoxyuridine)，去氧氟尿苷(doxifluridine)，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)，丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)，表硫雄醇(epitiostanol)，美雄烷(mepitiostane)，睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinicacid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptiniumacetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(jhsnaturalproducts,eugene,or)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2′,2”-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(t-2毒素，疣孢菌素(verrucurin)a，杆孢菌素(roridin)a和蛇行菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(ara-c)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；依托泊苷(etoposide)(vp-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；卡培他滨(capecitabine)(roche)；伊本膦酸盐(ibandronate)；cpt-11；拓扑异构酶抑制剂rfs2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；类视黄酸类(retinoids)，诸如视黄酸(retinoicacid)；及任何上述物质的制药学可接受的盐，酸和衍生物。术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。化疗剂(即“药物”或“药物模块”)可以是细胞毒剂。因而，在本文所述thiomabtm抗体包含半胱氨酸改造抗体，接头，和药物的情况中，该药物可以是本文所述任何细胞毒剂。该术语意图包括：放射性同位素，例如211at，131i，125i，90y，186re，188re，s153m，212bi，32p，60c和lu的放射性同位素；化疗剂；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌，真菌，植物或动物起源的酶活毒素，包括其合成类似物和衍生物。“噬菌体展示”是将变异多肽作为与外壳蛋白的融合蛋白展示在噬菌体例如丝状噬菌体颗粒的表面上的技术。噬菌体展示的一种效用在于可对随机化蛋白质变体的大型文库快速且有效的分选那些以高亲和力结合靶分子的序列的事实。在噬菌体上展示肽和蛋白质文库已经用于对数以百万计的多肽筛选具有特定结合特性的多肽。多价噬菌体展示方法已经用于展示小随机肽和小蛋白质，通常通过与丝状噬菌体的piii或pviii融合(wellsandlowman,(1992)curr.opin.struct.biol.3:355-362及其引用的参考文献)。在单价噬菌体展示中，将蛋白质或肽文库与噬菌体外壳蛋白或其部分融合，且在存在野生型蛋白质时以低水平表达。亲合力效果与多价噬菌体相比降低，使得分选基于内在配体亲和力，并使用简化dna操作的噬菌粒载体。lowmanandwells,(1991)methods:acompaniontomethodsinenzymology3:205-0216。噬菌体展示包括用于生成抗体样分子的技术(janeway,c.,travers,p.,walport,m.,shlomchik,(2001)immunobiology,5thed.,garlandpublishing,newyork,p627-628；leeetal.)。“噬菌粒”是具有细菌复制起点例如co1e1和一个拷贝的噬菌体基因区间的质粒载体。噬菌粒可用于任何已知噬菌体，包括丝状噬菌体和λ形噬菌体。质粒通常还将包含抗生素抗性的选择标志。克隆到这些载体中的dna区段可以像质粒一样增殖。当包含这些载体的细胞中配有生成噬菌体颗粒所必需的所有基因时，质粒的复制方式改变成滚环复制以生成质粒dna的一条链的拷贝并包装噬菌体颗粒。噬菌粒可形成感染性或非感染性噬菌体颗粒。该术语包括包含噬菌体外壳蛋白基因或其片段且其与异源多肽基因连接成基因融合物，使得异源多肽展示在噬菌体颗粒表面上的噬菌粒。“接头”，“接头单元”或“连接物”指包含使抗体与药物模块共价连接的共价键或原子链的化学模块。在各个实施方案中，将接头指定为l。接头包括：二价基，诸如亚烃基(alkyldiyl)，亚芳基，亚杂芳基，诸如-(cr2)no(cr2)n-，烃氧基重复单元(例如聚亚乙基氧基(polyethylenoxy)，peg，聚亚甲基氧基(polymethyleneoxy))和烃氨基(例如聚乙烯氨基，jeffaminetm)等模块；及二酸酯和酰胺类，包括琥珀酸酯，琥珀酰胺，二乙醇酸酯，丙二酸酯和己酰胺。术语“标记”指可以共价附着于抗体并发挥如下功能的任何模块：(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记相互作用以改变由第一或第二标记提供的可检测信号，例如fret(荧光共振能量转移)；(iii)稳定与抗原或配体的相互作用或提高与之结合的亲和力；(iv)通过电荷，疏水性，形状或其它物理参数影响迁移率例如电泳迁移率或细胞通透性；或(v)提供捕捉模块，以调节配体亲和力，抗体/抗原结合，或离子络合。本文中使用的立体化学的定义和规则一般遵循s.p.parker,ed.,mcgraw-hilldictionaryofchemicalterms(1984)mcgraw-hillbookcompany,newyork；eliel,e.andwilen,s.,stereochemistryoforganiccompunds(1994)johnwiley&sons,inc.,newyork。许多有机化合物以旋光形式存在，即它们有能力旋转平面偏振光的平面。在描述旋光化合物时，前缀d和l或r和s用于表示分子关于其手性中心的绝对构型。前缀d和l或(+)和(-)用于表示化合物对平面偏振光的旋转的迹象，其中(-)或1指化合物是左旋的。以(+)或d为前缀的化合物是右旋的。对于指定的化学结构，这些立体异构体是相同的，只是它们互为镜像。特定的立体异构体还可称作对映体，此类异构体的混合物通常称作对映混合物。对映体的50:50混合物称作外消旋混合物或外消旋物，它们可以在没有立体选择性或立体特异性的化学反应或方法中存在。术语“外消旋混合物”和“外消旋物”指两种对映体等摩尔混合从而丧失旋光性的混合物。短语“药学可接受盐”在用于本文时指adc的药学可接受的有机或无机盐。例示性的盐包括但不限于硫酸盐，柠檬酸盐，乙酸盐，草酸盐，氯化物，溴化物，碘化物，硝酸盐，硫酸氢盐，磷酸盐，酸式磷酸盐，异烟酸盐，乳酸盐，水杨酸盐，酸式柠檬酸盐，酒石酸盐，油酸盐，丹宁酸盐，泛酸盐，酒石酸氢盐，抗坏血酸盐，琥珀酸盐，马来酸盐，龙胆酸盐，富马酸盐，葡糖酸盐，葡糖醛酸盐，糖酸盐，甲酸盐，苯甲酸盐，谷氨酸盐，甲磺酸盐，乙磺酸盐，苯磺酸盐，对甲苯磺酸盐和扑酸盐(即1,1’-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。药学可接受盐可能牵涉包含另一种分子，诸如乙酸盐离子，琥珀酸盐离子或其它抗衡离子。抗衡离子可以是稳定母体化合物电荷的任何有机或无机模块。另外，药学可接受盐可以在其结构中具有超过一种带电荷原子。在多种带电荷原子作为药学可接受盐的组成部分的情况中可以具有多种抗衡离子。因此，药学可接受盐可具有一种或多种带电荷原子和/或一种或多种抗衡离子。“药学可接受溶剂化物”指一个或多个溶剂分子和adc的结合。形成药学可接受溶剂化物的溶剂的例子包括但不限于水，异丙醇，乙醇，甲醇，dmso，乙酸乙酯，乙酸和乙醇胺。半胱氨酸改造抗体本发明的化合物包括半胱氨酸改造抗体，其中野生型或亲本抗体中的一个或多个氨基酸被半胱氨酸氨基酸(即“改造的半胱氨酸”)替换(即“替代”或“突变”)。由此可以改造任意形式的抗体，即使其突变。例如，可以改造亲代单克隆抗体以形成“thiomabtm抗体”。“thiomabtm抗体的一个例子是具有改造的半胱氨酸的抗体片段(即fab)。这种fab“thiomabtm抗体可以称作“thiofab”。应注意单一位点突变在thiofab中产生单一改造的半胱氨酸残基(singleengineeredcysteineresidue)，而单一位点突变在thiomabtm抗体中产生两个改造的半胱氨酸残基，这是因igg抗体的二聚化特性所致。对具有改造的半胱氨酸(cys)残基的突变体评价新引入的改造的半胱氨酸硫醇基团的反应性。硫醇反应性值为0至1.0范围中的相对数值范围并且可以测量任意半胱氨酸改造抗体的该值。本发明的半胱氨酸改造抗体的硫醇反应性值在0.0至1.0的范围中。具体而言，本发明的半胱氨酸改造抗体的硫醇反应性值在0.1至1.0的范围中。在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸改造抗体的硫醇反应性值在0.0至0.1，0.1至0.5，0.1至0.6，0.1至0.7，0.1至0.8，0.1至0.9，或0.1至1.0的范围中。在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸改造抗体的硫醇反应性值在0.2至1.0，0.3至1.0，0.4至1.0，0.5至1.0，0.6至1.0，0.7至1.0，或0.8至1.0的范围中。在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸改造抗体的硫醇反应性值在0.6至1.0的范围中。在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸改造抗体的硫醇反应性值在0.7至1.0的范围中。在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸改造抗体的硫醇反应性值在0.8至1.0的范围中。在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸改造抗体的硫醇反应性值在0.5至0.8的范围中。在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸改造抗体的硫醇反应性值在0.5至0.9的范围中。在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸改造抗体的硫醇反应性值在0.5至0.7的范围中。在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸改造抗体的硫醇反应性值在0.5至1.0的范围中。本发明的设计，选择和制备方法能够使半胱氨酸改造抗体能够与亲电子官能基(functionability)反应。这些方法进一步能够形成抗体缀合物化合物，诸如抗体-药物缀合物(adc)化合物，在指定，设计，选择的位点上具有药物分子。抗体表面上的反应性半胱氨酸残基能够通过硫醇反应基，诸如马来酰亚胺或卤代乙酰基特异性地缀合药物模块。cys残基的硫醇官能基与马来酰亚胺基的亲核反应性约高于蛋白质中任意其它氨基酸官能基，诸如赖氨酸残基的氨基或n-末端氨基约1000倍。碘乙酰试剂和马来酰亚胺试剂中的硫醇特异性官能基可以与胺基反应，但需要更高的ph(>9.0)和更长的反应时间(garman,1997,non-radioactivelabelling:apracticalapproach,academicpress,london)。本发明半胱氨酸改造抗体优选保持其野生型亲本抗体对应物的抗原结合能力。因此，半胱氨酸改造抗体能够结合，优选特异性结合抗原。这类抗原包括：例如肿瘤相关抗原(taa)，细胞表面受体蛋白和其它细胞表面分子，跨膜蛋白，信号传导蛋白，细胞存活调节因子，细胞增殖调节因子，与组织发育或分化相关(例如，已知或怀疑在功能上相关)的分子，淋巴因子，细胞因子，涉及细胞周期调节的分子，涉及血管发生的分子和与血管发生相关(例如，已知或怀疑在功能上相关)的分子。肿瘤相关抗原可以为分化簇因子(即cd蛋白)。能够结合半胱氨酸改造抗体的抗原可以为上述类型之一的亚组中的成员，其中所述类型中另一亚组包含具有不同特性的其它分子/抗原(就所关注的抗原而言)。亲本抗体还可以为选自如上所述的us5821337的表3中所述的humab4d5-1，humab4d5-2，humab4d5-3，humab4d5-4，humab4d5-5，humab4d5-6，humab4d5-7和humab4d5-8(曲妥珠单抗,)的人源化抗体，特别将该文献引入本文作为参考；人源化520c9(wo93/21319)和如本文所述的人源化2c4抗体。本发明的半胱氨酸改造抗体可以位点-特异性和有效地与硫醇-反应试剂偶联。硫醇-反应试剂可以为多官能接头试剂(multifunctionallinkerreagent)；捕捉物，即亲和，标记试剂(例如生物素-接头试剂)；检测标记物(例如荧光团试剂)；固相固定化试剂(例如sepharosetm，聚苯乙烯或玻璃)或药物-接头中间体(drug-linkerintermediate)。硫醇-反应试剂的一个实例为n-乙基马来酰亚胺(nem)。在一个典型的实施方案中，thiomabtm抗体与生物素-接头试剂反应得到生物素化的thiomabtm抗体，通过这种方式可以检测和测定改造的半胱氨酸残基的存在和反应性。thiomabtm抗体与多官能接头试剂反应得到带有可以与药物模块试剂或其它标记进一步反应的官能化接头的thiomabtm抗体。thiomabtm抗体与药物-接头中间体反应得到thiomabtm抗体-药物缀合物。在某些实施方案中，thiomabtm抗体为thiofab。本文所述的典型方法一般可以应用于鉴定和生产抗体，并且更一般地通过使用本文所述的设计和筛选步骤用于其它蛋白质。这类手段可以应用于缀合其它硫醇反应试剂，其中反应基为例如马来酰亚胺，碘乙酰胺，吡啶基二硫化物或其它硫醇反应缀合配偶体(haugland,2003,molecularprobeshandbookoffluorescentprobesandresearchchemicals,molecularprobes,inc.；brinkley,1992,bioconjugatechem.3:2；garman,1997,non-radioactivelabelling:apracticalapproach,academicpress,london；means(1990)bioconjugatechem.1:2；hermanson,g.inbioconjugatetechniques(1996)academicpress,sandiego,pp.40-55,643-671)。所述的配偶体可以为细胞毒性剂(例如毒素，诸如多柔比星(doxorubicin)或百日咳毒素)；荧光团，诸如荧光染料类荧光素或若丹明；用于成像的螯合剂或放射性治疗金属；肽基或非-肽基标记或检测标记；或清除-改进剂(clearance-modifyingagent)，诸如聚乙二醇的不同异构体；结合第三种成分的肽或另一种碳水化合物或亲脂性试剂。在本文典型抗体hu4d5上鉴定的位点主要位于抗体的恒定域中，其在所有抗体种类之间为充分保守的。这些位点可广泛适用于其它抗体，而无需进一步进行结构设计或有关特异性抗体结构的知识，并且不会干扰对抗体可变域而言固有的抗原结合特性。可以用于治疗癌症的半胱氨酸改造抗体包括，但不限于针对细胞表面受体和肿瘤相关抗原(taa)的抗体。这类抗体可以用作裸抗体(未与药物或标记模块缀合)或用作式i抗体-药物缀合物(adc)。肿瘤相关抗原为本领域中公知的并且可以制备它们以便用于使用本领域众所周知的方法和信息生产抗体。在发现用于癌症诊断和疗法的有效细胞靶标的尝试中，研究人员寻求鉴定与一种或多种正常非癌细胞相比在一种或多种特定类型的癌细胞表面上特异性表达的跨膜多肽，或肿瘤相关多肽。与非癌细胞表面上相比，通常这类肿瘤相关多肽更大量地在癌细胞表面上表达。对这类肿瘤相关细胞表面抗原多肽的鉴定已经使人们能够特异性靶向癌细胞，通过基于抗体的疗法对其进行破坏。taa的实例包括，但不限于下述taa(1)-(53)。为方便起见，均为本领域公知的有关这些抗原的信息如下所列，并且按照nationalcenterforbiotechnologyinformation(ncbi)的核酸和蛋白质序列鉴定规定，包括名称，可选择的名称，genbank登记号和主要参考文献。相当于taa(1)-(53)的核酸和蛋白质序列可以在公共数据库，诸如genbank中获得。由抗体靶向的肿瘤相关抗原包括所有氨基酸序列变体和同种型，它们与引述的参考文献中鉴定的序列相比具有至少约70％，80％，85％，90％或95％序列同一性，或表现出基本上与具有引述参考文献中发现的序列的taa相同的生物特性或特征。例如，具有变体序列的taa一般能够特异性结合与文献中所示相应序列taa特异性结合的抗体。特别将本文特别引述的参考文献中的序列和披露内容引入作为参考。肿瘤相关抗原(1)-(53)：(1)bmpr1b(骨形态发生蛋白受体-ib型(bonemorphogeneticreceptor-typeib),genbank登记号nm_001203)tendijke,p.,等science264(5155):101-104(1994),oncogene14(11):1377-1382(1997))；wo2004063362(权利要求2)；wo2003042661(权利要求12)；us2003134790-a1(38-39页)；wo2002102235(权利要求13；页296)；wo2003055443(91-92页)；wo200299122(实施例2；528-530页)；wo2003029421(权利要求6)；wo2003024392(权利要求2；附图112)；wo200298358(权利要求1；183页)；wo200254940(100-101页)；wo200259377(349-350页)；wo200230268(权利要求27；376页)；wo200148204(实施例；附图4)；np_001194骨形态发生蛋白受体,ib型/pid＝np_001194.1.交叉参考:mim:603248；np_001194.1；ay065994(2)e16(lat1,slc7a5,genbank登记号nm_003486)biochem.biophys.res.commun.255(2),283-288(1999),nature395(6699):288-291(1998),gaugitsch,h.w.,等(1992)j.biol.chem.267(16):11267-11273)；wo2004048938(实施例2)；wo2004032842(实施例iv)；wo2003042661(权利要求12)；wo2003016475(权利要求1)；wo200278524(实施例2)；wo200299074(权利要求19；页127-129)；wo200286443(权利要求27；222,393页)；wo2003003906(权利要求10；293页)；wo200264798(权利要求33；页93-95)；wo200014228(权利要求5；133-136页)；us2003224454(附图3)；wo2003025138(权利要求12；150页)；np_003477溶质载体家族7(solutecarrierfamily7)(阳离子氨基酸转运蛋白(cationicaminoacidtransporter),y+系统),成员5/pid＝np_003477.3-人类；交叉参考:mim:600182；np_003477.3；nm_015923；nm_003486_1(3)steap1(前列腺的六次跨膜上皮抗原(sixtransmembraneepithelialantigenofprostate),genbank登记号nm_012449)；cancerres.61(15),5857-5860(2001),hubert,r.s.,等(1999)proc.natl.acad.sci.u.s.a.96(25):14523-14528)；wo2004065577(权利要求6)；wo2004027049(附图1l)；ep1394274(实施例11)；wo2004016225(权利要求2)；wo2003042661(权利要求12)；us2003157089(实施例5)；us2003185830(实施例5)；us2003064397(附图2)；wo200289747(实施例5；页618-619)；wo2003022995(实施例9；附图13a,实施例53；173页,实施例2；附图2a)；np_036581前列腺的六次跨膜上皮抗原；交叉参考:mim:604415；np_036581.1；nm_012449_1(4)0772p(ca125,muc16,genbank登记号af361486)；j.biol.chem.276(29):27371-27375(2001))；wo2004045553(权利要求14)；wo200292836(权利要求6；附图12)；wo200283866(权利要求15；116-121页)；us2003124140(实施例16)；交叉参考：gi:34501467；aak74120.3；af361486_1(5)mpf(mpf,msln,smr,巨核细胞强化因子(megakaryocytepotentiatingfactor),mesothelin,genbank登记号nm_005823)yamaguchi,n.,等biol.chem.269(2),805-808(1994),proc.natl.acad.sci.u.s.a.96(20):11531-11536(1999),proc.natl.acad.sci.u.s.a.93(1):136-140(1996),j.biol.chem.270(37):21984-21990(1995))；wo2003101283(权利要求14)；(wo2002102235(权利要求13；287-288页)；wo2002101075(权利要求4；页308-309)；wo200271928(320-321页)；wo9410312(52-57页)；交叉参考:mim:601051；np_005814.2；nm_005823_1(6)napi3b(也称作napi2b)(napi-3b,nptiib,slc34a2,溶质载体家族(solutecarrierfamily)34(磷酸钠),成员2,ii型钠依赖性磷酸转运蛋白3b,genbank登记号nm_006424)j.biol.chem.277(22):19665-19672(2002),genomics62(2):281-284(1999),feild,j.a.,等(1999)biochem.biophys.res.commun.258(3):578-582)；wo2004022778(权利要求2)；ep1394274(实施例11)；wo2002102235(权利要求13；326页)；ep875569(权利要求1；17-19页)；wo200157188(权利要求20；329页)；wo2004032842(实施例iv)；wo200175177(权利要求24；139-140页)；交叉参考:mim:604217；np_006415.1；nm_006424_1(7)sema5b(flj10372,kiaa1445,mm.42015,sema5b,semag,脑信号蛋白(semaphorin)5bhlog,sema结构域,七次血小板反应蛋白重复(seventhrombospondinrepeats)(1型(type1)和类1型(type1-like)),跨膜域(tm)和短胞质域,(脑信号蛋白)5b,genbank登记号ab040878)；nagaset.,等(2000)dnares.7(2):143-150)；wo2004000997(权利要求1)；wo2003003984(权利要求1)；wo200206339(权利要求1；50页)；wo200188133(权利要求1；页41-43,48-58)；wo2003054152(权利要求20)；wo2003101400(权利要求11)；登记号:q9p283；embl；ab040878；baa95969.1.genew；hgnc:10737(8)pscahlg(2700050c12rik,c530008o16rik,rikencdna2700050c12,rikencdna2700050c12基因,genbank登记号ay358628)；ross等(2002)cancerres.62:2546-2553；us2003129192(权利要求2)；us2004044180(权利要求12)；us2004044179(权利要求11)；us2003096961(权利要求11)；us2003232056(实施例5)；wo2003105758(权利要求12)；us2003206918(实施例5)；ep1347046(权利要求1)；wo2003025148(权利要求20)；交叉参考:gi:37182378；aaq88991.1；ay358628_1(9)etbr(内皮缩血管肽b型受体(endothelintypebreceptor),genbank登记号ay275463)；nakamutam.,等biochem.biophys.res.commun.177,34-39,1991；ogaway.,等biochem.biophys.res.commun.178,248-255,1991；araih.,等jpn.circ.j.56,1303-1307,1992；araih.,等j.biol.chem.268,3463-3470,1993；sakamotoa.,yanagisawam.,等biochem.biophys.res.commun.178,656-663,1991；elshourbagyn.a.,等j.biol.chem.268,3873-3879,1993；haendlerb.,等j.cardiovasc.pharmacol.20,s1-s4,1992；tsutsumim.,等gene228,43-49,1999；strausbergr.l.,等proc.natl.acad.sci.u.s.a.99,16899-16903,2002；bourgeoisc.,等j.clin.endocrinol.metab.82,3116-3123,1997；okamotoy.,等biol.chem.272,21589-21596,1997；verheijj.b.,等am.j.med.genet.108,223-225,2002；hofstrar.m.w.,等eur.j.hum.genet.5,180-185,1997；puffenbergere.g.,等cell79,1257-1266,1994；attiet.,etal,hum.mol.genet.4,2407-2409,1995；auricchioa.,等hum.mol.genet.5:351-354,1996；amielj.,等hum.mol.genet.5,355-357,1996；hofstrar.m.w.,等nat.genet.12,445-447,1996；svenssonp.j.,等hum.genet.103,145-148,1998；fuchss.,等mol.med.7,115-124,2001；pingaultv.,等(2002)hum.genet.111,198-206；wo2004045516(权利要求1)；wo2004048938(实施例2)；wo2004040000(权利要求151)；wo2003087768(权利要求1)；wo2003016475(权利要求1)；wo2003016475(权利要求1)；wo200261087(附图1)；wo2003016494(附图6)；wo2003025138(权利要求12；144页)；wo200198351(权利要求1；页124-125)；ep522868(权利要求8；附图2)；wo200177172(权利要求1；页297-299)；us2003109676；us6518404(附图3)；us5773223(权利要求1a；col31-34)；wo2004001004(10)msg783(rnf124,推定蛋白(hypotheticalprotein)flj20315,genbank登记号nm_017763)；wo2003104275(权利要求1)；wo2004046342(实施例2)；wo2003042661(权利要求12)；wo2003083074(权利要求14；页61)；wo2003018621(权利要求1)；wo2003024392(权利要求2；附图93)；wo200166689(实施例6)；交叉参考:locusid:54894；np_060233.2；nm_017763_1(11)steap2(hgnc_8639,ipca-1,pcanap1,stamp1,steap2,stmp,前列腺癌相关基因1,前列腺癌相关蛋白1,前列腺的六次跨膜上皮抗原2,六次跨膜前列腺蛋白,genbank登记号af455138)；lab.invest.82(11):1573-1582(2002))；wo2003087306；us2003064397(权利要求1；附图1)；wo200272596(权利要求13；页54-55)；wo200172962(权利要求1；附图4b)；wo2003104270(权利要求11)；wo2003104270(权利要求16)；us2004005598(权利要求22)；wo2003042661(权利要求12)；us2003060612(权利要求12；附图10)；wo200226822(权利要求23；附图2)；wo200216429(权利要求12；附图10)；交叉参考:gi:22655488；aan04080.1；af455138_1(12)trpm4(br22450,flj20041,trpm4,trpm4b,瞬时型受体电位阳离子通道(transientreceptorpotentialcationchannel),亚族m,成员4,genbank登记号nm_017636)；xu,x.z.,等proc.natl.acad.sci.u.s.a.98(19):10692-10697(2001),cell109(3):397-407(2002),j.biol.chem.278(33):30813-30820(2003))；us2003143557(权利要求4)；wo200040614(权利要求14；页100-103)；wo200210382(权利要求1；附图9a)；wo2003042661(权利要求12)；wo200230268(权利要求27；391页)；us2003219806(权利要求4)；wo200162794(权利要求14；附图1a-d)；交叉参考:mim:606936；np_060106.2；nm_017636_1(13)cripto(cr,cr1,crgf,cripto,tdgf1,畸胎瘤-衍生的生长因子(teratocarcinoma-derivedgrowthfactor),genbank登记号np_003203或nm_003212)；ciccodicola,a.,等emboj.8(7):1987-1991(1989),am.j.hum.genet.49(3):555-565(1991))；us2003224411(权利要求1)；wo2003083041(实施例1)；wo2003034984(权利要求12)；wo200288170(权利要求2；页52-53)；wo2003024392(权利要求2；附图58)；wo200216413(权利要求1；页94-95,105)；wo200222808(权利要求2；附图1)；us5854399(实施例2；col17-18)；us5792616(附图2)；交叉参考:mim:187395；np_003203.1；nm_003212_1(14)cd21(cr2(补体受体2)或c3dr(c3d/eb病毒受体(epsteinbarrvirusreceptor))或hs.73792genbank登记号m26004)；fujisaku等(1989)j.biol.chem.264(4):2118-2125)；weisj.j.,等j.exp.med.167,1047-1066,1988；moorem.,等proc.natl.acad.sci.u.s.a.84,9194-9198,1987；barelm.,等mol.immunol.35,1025-1031,1998；weisj.j.,等proc.natl.acad.sci.u.s.a.83,5639-5643,1986；sinhas.k.,等(1993)j.immunol.150,5311-5320；wo2004045520(实施例4)；us2004005538(实施例1)；wo2003062401(权利要求9)；wo2004045520(实施例4)；wo9102536(附图9.1-9.9)；wo2004020595(权利要求1)；登记号:p20023；q13866；q14212；embl；m26004；aaa35786.1(15)cd79b(cd79b,cd79β,igb(免疫球蛋白相关β,b29,genbank登记号nm_000626或11038674)；proc.natl.acad.sci.u.s.a.(2003)100(7):4126-4131,blood(2002)100(9):3068-3076,muller等(1992)eur.j.immunol.22(6):1621-1625)；wo2004016225(权利要求2,附图140)；wo2003087768,us2004101874(权利要求1,页102)；wo2003062401(权利要求9)；wo200278524(实施例2)；us2002150573(权利要求5,页15)；us5644033；wo2003048202(权利要求1,306和309页)；wo99/558658,us6534482(权利要求13,附图17a/b)；wo200055351(权利要求11,1145-1146页)；交叉参考:mim:147245；np_000617.1；nm_000626_1(16)fcrh2(ifgp4,irta4,spap1a(含有sh2结构域的磷酸酶锚定蛋白1a(sh2domaincontainingphosphataseanchorprotein1a),spap1b,spap1c,genbank登记号nm_030764,ay358130)；genomeres.13(10):2265-2270(2003),immunogenetics54(2):87-95(2002),blood99(8):2662-2669(2002),proc.natl.acad.sci.u.s.a.98(17):9772-9777(2001),xu,m.j.,等(2001)biochem.biophys.res.commun.280(3):768-775；wo2004016225(权利要求2)；wo2003077836；wo200138490(权利要求5；附图18d-1-18d-2)；wo2003097803(权利要求12)；wo2003089624(权利要求25)；交叉参考:mim:606509；np_110391.2；nm_030764_1(17)her2(erbb2,genbank登记号m11730)；coussensl.,等science(1985)230(4730):1132-1139)；yamamotot.,等nature319,230-234,1986；sembak.,等proc.natl.acad.sci.u.s.a.82,6497-6501,1985；swierczj.m.,等j.cellbiol.165,869-880,2004；kuhnsj.j.,等j.biol.chem.274,36422-36427,1999；choh.-s.,等nature421,756-760,2003；ehsania.,等(1993)genomics15,426-429；wo2004048938(实施例2)；wo2004027049(附图1i)；wo2004009622；wo2003081210；wo2003089904(权利要求9)；wo2003016475(权利要求1)；us2003118592；wo2003008537(权利要求1)；wo2003055439(权利要求29；附图1a-b)；wo2003025228(权利要求37；附图5c)；wo200222636(实施例13；95-107页)；wo200212341(权利要求68；附图7)；wo200213847(71-74页)；wo200214503(页114-117)；wo200153463(权利要求2；41-46页)；wo200141787(15页)；wo200044899(权利要求52；附图7)；wo200020579(权利要求3；附图2)；us5869445(权利要求3；col31-38)；wo9630514(权利要求2；页56-61)；ep1439393(权利要求7)；wo2004043361(权利要求7)；wo2004022709；wo200100244(实施例3；附图4)；登记号:p04626；embl；m11767；aaa35808.1.embl；m11761；aaa35808.1(18)nca(ceacam6,genbank登记号m18728)；barnettt.,等genomics3,59-66,1988；tawaragiy.,等biochem.biophys.res.commun.150,89-96,1988；strausbergr.l.,等proc.natl.acad.sci.u.s.a.99:16899-16903,2002；wo2004063709；ep1439393(权利要求7)；wo2004044178(实施例4)；wo2004031238；wo2003042661(权利要求12)；wo200278524(实施例2)；wo200286443(权利要求27；页427)；wo200260317(权利要求2)；登记号:p40199；q14920；embl；m29541；aaa59915.1.embl；m18728(19)mdp(dpep1,genbank登记号bc017023)；proc.natl.acad.sci.u.s.a.99(26):16899-16903(2002))；wo2003016475(权利要求1)；wo200264798(权利要求33；85-87页)；jp05003790(附图6-8)；wo9946284(附图9)；交叉参考:mim:179780；aah17023.1；bc017023_1(20)il20rα(il20ra,zcytor7,genbank登记号af184971)；clarkh.f.,等genomeres.13,2265-2270,2003；mungalla.j.,等nature425,805-811,2003；blumbergh.,等cell104,9-19,2001；dumoutierl.,等j.immunol.167,3545-3549,2001；parrish-novakj.,等j.biol.chem.277,47517-47523,2002；pletnevs.,等(2003)biochemistry42:12617-12624；sheikhf.,等(2004)j.immunol.172,2006-2010；ep1394274(实施例11)；us2004005320(实施例5)；wo2003029262(74-75页)；wo2003002717(权利要求2；63页)；wo200222153(45-47页)；us2002042366(20-21页)；wo200146261(57-59页)；wo200146232(63-65页)；wo9837193(权利要求1；55-59页)；登记号：q9uhf4；q6uwa9；q96sh8；embl；af184971；aaf01320.1(21)brevican(bcan,behab,genbank登记号af229053)；garys.c.,等gene256,139-147,2000；clarkh.f.,等genomeres.13,2265-2270,2003；strausbergr.l.,等proc.natl.acad.sci.u.s.a.99,16899-16903,2002；us2003186372(权利要求11)；us2003186373(权利要求11)；us2003119131(权利要求1；附图52)；us2003119122(权利要求1；附图52)；us2003119126(权利要求1)；us2003119121(权利要求1；附图52)；us2003119129(权利要求1)；us2003119130(权利要求1)；us2003119128(权利要求1；附图52)；us2003119125(权利要求1)；wo2003016475(权利要求1)；wo200202634(权利要求1)(22)ephb2r(drt,erk,hek5,epht3,tyro5,genbank登记号nm_004442)；chan,j.和watt,v.m.,oncogene6(6),1057-1061(1991)oncogene10(5):897-905(1995),annu.rev.neurosci.21:309-345(1998),int.rev.cytol.196:177-244(2000))；wo2003042661(权利要求12)；wo200053216(权利要求1；页41)；wo2004065576(权利要求1)；wo2004020583(权利要求9)；wo2003004529(128-132页)；wo200053216(权利要求1；42页)；交叉参考:mim:600997；np_004433.2；nm_004442_1(23)aslg659(b7h,genbank登记号ax092328)；us20040101899(权利要求2)；wo2003104399(权利要求11)；wo2004000221(附图3)；us2003165504(权利要求1)；us2003124140(实施例2)；us2003065143(附图60)；wo2002102235(权利要求13；299页)；us2003091580(实施例2)；wo200210187(权利要求6；附图10)；wo200194641(权利要求12；附图7b)；wo200202624(权利要求13；附图1a-1b)；us2002034749(权利要求54；45-46页)；wo200206317(实施例2；320-321页,权利要求34；321-322页)；wo200271928(468-469页)；wo200202587(实施例1；附图1)；wo200140269(实施例3；页190-192)；wo200036107(实施例2；205-207页)；wo2004053079(权利要求12)；wo2003004989(权利要求1)；wo200271928(233-234,452-453页)；wo0116318(24)psca(前列腺干细胞抗原前体(prostatestemcellprecursor),genbank登记号aj297436)；reiterr.e.,等proc.natl.acad.sci.u.s.a.95,1735-1740,1998；guz.,等oncogene19,1288-1296,2000；biochem.biophys.res.commun.(2000)275(3):783-788；wo2004022709；ep1394274(实施例11)；us2004018553(权利要求17)；wo2003008537(权利要求1)；wo200281646(权利要求1；页164)；wo2003003906(权利要求10；页288)；wo200140309(实施例1；附图17)；us2001055751(实施例1；附图1b)；wo200032752(权利要求18；附图1)；wo9851805(权利要求17；页97)；wo9851824(权利要求10；94页)；wo9840403(权利要求2；附图1b)；登记号:o43653；embl；af043498；aac39607.1(25)geda(genbank登记号ay260763)；aap14954脂肪瘤hmgic融合-配偶体-类蛋白(lipomahmgicfusion-partner-likeprotein)/pid＝aap14954.1-人类(人)；wo2003054152(权利要求20)；wo2003000842(权利要求1)；wo2003023013(实施例3,权利要求20)；us2003194704(权利要求45)；交叉参考:gi:30102449；aap14954.1；ay260763_1(26)baff-r(b细胞活化因子受体,blys受体3,br3,genbank登记号af116456)；baff受体/pid＝np_443177.1-人类：thompson,j.s.,等science293(5537),2108-2111(2001)；wo2004058309；wo2004011611；wo2003045422(实施例；32-33页)；wo2003014294(权利要求35；附图6b)；wo2003035846(权利要求70；615-616页)；wo200294852(col136-137)；wo200238766(权利要求3；133页)；wo200224909(实施例3；附图3)；交叉参考:mim:606269；np_443177.1；nm_052945_1；af132600(27)cd22(b细胞受体cd22-b同种型,bl-cam,lyb-8,lyb8,siglec-2,flj22814,genbank登记号ak026467)；wilson等(1991)j.exp.med.173:137-146；wo2003072036(权利要求1；附图1)；交叉参考:mim:107266；np_001762.1；nm_001771_1(28)cd79a(cd79a，cd79α，免疫球蛋白相关α，一种b细胞特异性蛋白，其与igβ(cd79b)共价相互作用并且在表面上与igm分子形成复合物，转导涉及b细胞分化的信号),pi:4.84,mw:25028tm:2[p]genechromosome:19q13.2,genbank登记号np_001774.10)；wo2003088808,us20030228319；wo2003062401(权利要求9)；us2002150573(权利要求4,13-14页)；wo9958658(权利要求13,附图16)；wo9207574(附图1)；us5644033；ha等(1992)j.immunol.148(5):1526-1531；mueller等(1992)eur.j.biochem.22:1621-1625；hashimoto等(1994)immunogenetics40(4):287-295；preud’homme等(1992)clin.exp.immunol.90(1):141-146；yu等(1992)j.immunol.148(2)633-637；sakaguchi等(1988)emboj.7(11):3457-3464(29)cxcr5(伯基特氏淋巴瘤受体1(burkitt’slymphomareceptor1)，一种g蛋白偶联受体，由cxcl13趋化因子活化，在淋巴细胞迁移和体液防御中起作用，在hiv-2感染中起作用和可能在aids，淋巴瘤，黑素瘤和白血病发生中起作用)；372aa,pi:8.54mw:41959tm:7[p]genechromosome:11q23.3,genbank登记号np_001707.1)；wo2004040000；wo2004015426；us2003105292(实施例2)；us6555339(实施例2)；wo200261087(附图1)；wo200157188(权利要求20,页269)；wo200172830(12-13页)；wo200022129(实施例1,152-153页,实施例2,254-256页)；wo9928468(权利要求1,页38)；us5440021(实施例2,col49-52)；wo9428931(56-58页)；wo9217497(权利要求7,附图5)；dobner等(1992)eur.j.immunol.22:2795-2799；barella等(1995)biochem.j.309:773-779(30)hla-dob(mhcii类分子的β亚基(ia抗原)，其与肽结合并且将其呈递给cd4+t淋巴细胞)；273aa,pi:6.56,mw:30820.tm:1[p]genechromosome:6p21.3,genbank登记号np_002111.1)；tonnelle等(1985)emboj.4(11):2839-2847；jonsson等(1989)immunogenetics29(6):411-413；beck等(1992)j.mol.biol.228:433-441；strausberg等(2002)proc.natl.acad.sciusa99:16899-16903；servenius等(1987)j.biol.chem.262:8759-8766；beck等(1996)j.mol.biol.255:1-13；naruse等(2002)tissueantigens59:512-519；wo9958658(权利要求13,附图15)；us6153408(col35-38)；us5976551(col168-170)；us6011146(col145-146)；kasahara等(1989)immunogenetics30(1):66-68；larhammar等(1985)j.biol.chem.260(26):14111-14119(31)p2x5(嘌呤能受体p2x配体门控离子通道5(purinergicreceptorp2xligand-gatedionchannel5)，即由胞外atp门控的离子通道，可能涉及突触传递和神经发生，其缺陷可以促使特发性逼尿肌不稳定病理生理学情况)；422aa),pi:7.63,mw:47206tm:1[p]genechromosome:17p13.3,genbank登记号np_002552.2)；le等(1997)febslett.418(1-2):195-199；wo2004047749；wo2003072035(权利要求10)；touchman等(2000)genomeres.10:165-173；wo200222660(权利要求20)；wo2003093444(权利要求1)；wo2003087768(权利要求1)；wo2003029277(82页)；(32)cd72(b细胞分化抗原cd72,lyb-2)；359aa,pi:8.66,mw:40225tm:1[p]genechromosome:9p13.3,genbank登记号np_001773.1)；wo2004042346(权利要求65)；wo2003026493(51-52,57-58页)；wo200075655(105-106页)；vonhoegen等(1990)j.immunol.144(12):4870-4877；strausberg等(2002)proc.natl.acad.sciusa99:16899-16903(33)ly64(淋巴细胞抗原64(rp105)，即富含亮氨酸重复(lrr)家族i型膜蛋白(typeimemberaneproteinoftheleucinerichrepeatfamily)，调节b细胞细胞活化和程序性细胞死亡，其功能缺失与患有系统性红斑狼疮的患者的疾病活动增加有关)；661aa,pi:6.20,mw:74147tm:1[p]genechromosome:5q12,genbank登记号np_005573.1)；us2002193567；wo9707198(权利要求11,39-42页)；miura等(1996)genomics38(3):299-304；miura等(1998)blood92:2815-2822；wo2003083047；wo9744452(权利要求8,57-61页)；wo200012130(24-26页)(34)fcrh1(fc受体-样蛋白1(fcreceptor-likeprotein1)，即含有c2型ig-样结构域和itam结构域的免疫球蛋白fc结构域的推定受体，可能在b-淋巴细胞分化中起作用)；429aa,pi:5.28,mw:46925tm:1[p]genechromosome:1q21-1q22,genbank登记号np_443170.1)；wo2003077836；wo200138490(权利要求6,附图18e-1-18-e-2)；davis等(2001)proc.natl.acad.sciusa98(17):9772-9777；wo2003089624(权利要求8)；ep1347046(权利要求1)；wo2003089624(权利要求7)(35)irta2(免疫球蛋白超家族受体易位相关2，即在b细胞发育和淋巴瘤的生成中具有可能的作用的推定的免疫受体；由于易位所导致的基因失调在某些b细胞恶性肿瘤中发生)；977aa,pi:6.88,mw:106468,tm:1[p]genechromosome:1q21,genbank登记号人:af343662,af343663,af343664,af343665,af369794,af397453,ak090423,ak090475,al834187,ay358085；小鼠:ak089756,ay158090,ay506558；np_112571.1；wo2003024392(权利要求2,附图97)；nakayama等(2000)biochem.biophys.res.commun.277(1):124-127；wo2003077836；wo200138490(权利要求3,附图18b-1-18b-2)(36)tenb2(tmeff2,tomoregulin,tpef,hpp1,tr,与egf/调蛋白(heregulin)家族生长因子和卵泡抑素(follistatin)有关的推定的跨膜蛋白聚糖)；374aa,ncbi登记号:aad55776,aaf91397,aag49451,ncbirefseq:np_057276；ncbi基因:23671；omim:605734；swissprotq9uik5；genbank登记号af179274；ay358907,caf85723,cq782436；wo2004074320；jp2004113151；wo2003042661；wo2003009814；ep1295944(69-70页)；wo200230268(329页)；wo200190304；us2004249130；us2004022727；wo2004063355；us2004197325；us2003232350；us2004005563；us2003124579；horie等(2000)genomics67:146-152；uchida等(1999)biochem.biophys.res.commun.266:593-602；liang等(2000)cancerres.60:4907-12；glynne-jones等(2001)intjcancer.oct15；94(2):178-84(37)pmel17(银同系物；silv；d12s53e；pmel17；si；sil)；me20；gp100)bc001414；bt007202；m32295；m77348；nm_006928；mcglinchey，r.p.等(2009)proc.natl.acad.sci.u.s.a.106(33)，13731-13736；kummer，m.p.等(2009)j.biol.chem.284(4)，2296-2306；(38)tmeff1(具有egf样和两个卵泡抑素样域的跨膜蛋白1；tomoregulin-1)；h7365；c9orf2；c9orf2；u19878；x83961；nm_080655；nm_003692；harms，p.w.(2003)genesdev.17(21)，2624-2629；gery，s.etal(2003)oncogene22(18):2723-2727；(39)gdnf-ra1(gdnf家族受体α1；gfra1；gdnfr；gdnfra；retl1；trnr1；ret1l；gdnfr-α1；gfr-α-1)；u95847；bc014962；nm_145793nm_005264；kim，m.h.等(2009)mol.cell.biol.29(8)，2264-2277；treanor，j.j.等(1996)nature382(6586):80-83；(40)ly6e(淋巴细胞抗原6复合物，基因座e；ly67,rig-e,sca-2,tsa-1)；np_002337.1；nm_002346.2；denooij-vandalen，a.g.等(2003)int.j.cancer103(6)，768-774；zammit，d.j.等(2002)mol.cell.biol.22(3):946-952；(41)tmem46(shisa同系物2(xenopuslaevis)；shisa2)；np_001007539.1；nm_001007538.1；furushima，k.等(2007)dev.biol.306(2)，480-492；clark，h.f.等(2003)genomeres.13(10):2265-2270；(42)ly6g6d(淋巴细胞抗原6复合物，基因座g6d；ly6-d，megt1)；np_067079.2；nm_021246.2；mallya，m.等(2002)genomics80(1):113-123；ribas，g.等(1999)j.immunol.163(1):278-287；(43)lgr5(含富亮氨酸重复的g蛋白偶联受体5；gpr49，gpr67)；np_003658.1；nm_003667.2；salanti，g.等(2009)am.j.epidemiol.170(5):537-545；yamamoto，y.等(2003)hepatology37(3):528-533；(44)ret(ret原癌基因；men2a；hscr1；men2b；mtc1；ptc；cdhf12；hs.168114；ret51；ret-ele1)；np_066124.1；nm_020975.4；tsukamoto，h.等(2009)cancersci.100(10):1895-1901；narita，n.等(2009)oncogene28(34):3058-3068；(45)ly6k(淋巴细胞抗原6复合物，基因座k；ly6k；hsj001348；flj35226)；np_059997.3；nm_017527.3；ishikawa，n.等(2007)cancerres.67(24):11601-11611；denooij-vandalen，a.g.等(2003)int.j.cancer103(6):768-774；(46)gpr19(g蛋白偶联受体受体19；mm.4787)；np_006134.1；nm_006143.2；montpetit，a.和sinnett，d.(1999)hum.genet.105(1-2):162-164；o′dowd，b.f.等(1996)febslett.394(3):325-329；(47)gpr54(kiss1受体；kiss1r；gpr54；hot7t175；axor12)；np_115940.2；nm_032551.4；navenot，j.m.等(2009)mol.pharmacol.75(6):1300-1306；hata，k.等(2009)anticancerres.29(2):617-623；(48)asphd1(含天冬氨酸β-羟化酶域的1；loc253982)；np_859069.2；nm_181718.3；gerhard，d.s.等(2004)genomeres.14(10b):2121-2127；(49)酪氨酸酶(tyr；ocaia；oca1a；酪氨酸酶；shep3)；np_000363.1；nm_000372.4；bishop，d.t.等(2009)nat.genet.41(8):920-925；nan，h.等(2009)int.j.cancer125(4):909-917；(50)tmem118(环指蛋白，跨膜2；rnft2；flj14627)；np_001103373.1；nm_001109903.1；clark，h.f.等(2003)genomeres.13(10):2265-2270；scherer，s.e.等(2006)nature440(7082):346-351(51)gpr172a(g蛋白偶联受体172a；gpcr41；flj11856；d15ertd747e)；np_078807.1；nm_024531.3；ericsson，t.a.等(2003)proc.natl.acad.sci.u.s.a.100(11):6759-6764；takeda，s.等(2002)febslett.520(1-3):97-101。(52)cd33，唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素家族的成员，是一种67-kda糖基化跨膜蛋白。在定型骨髓单核细胞和红细胞祖细胞以外，cd33在大多数髓样和单核细胞白血病细胞上表达。在最早的多能干细胞，成熟粒细胞，淋巴样细胞，或非造血细胞上没有看到它(sabbath等(1985)j.clin.invest.75:756-56；andrews等(1986)blood68:1030-5)。cd33在其胞质尾上含有两个酪氨酸残基，其中每一个跟着是疏水性残基，类似于在许多抑制性受体中看到的免疫受体基于酪氨酸的抑制性基序(itim)。(53)cll-1(clec12a，micl，和dcal2)编码c型凝集素/c型凝集素样域(ctl/ctld)超家族的一个成员。这个家族的成员共享共同的蛋白质折叠且具有各式各样的功能，诸如细胞粘附，细胞-细胞信号传导，糖蛋白周转，和在炎症和免疫应答中的作用。由此基因编码的蛋白质是粒细胞和单核细胞功能的负调节物。已经描述了此基因的数种可变剪接转录物变体，但是还没有测定这些变体中的一些的全长性质。此基因与染色体12p13上的天然杀伤基因复合物区域中的其它ctl/ctld超家族成员紧密连锁(drickamerk(1999)curr.opin.struct.biol.9(5):585-90；vanrhenena等(2007)blood110(7):2659-66；chench等(2006)blood107(4):1459-67；marshallas等(2006)eur.j.immunol.36(8):2159-69；bakkerab等(2005)cancerres.64(22):8443-50；marshallas等(2004)j.biol.chem.279(15):14792-802)。已经显示cll-1是ii型跨膜受体，其包含单个c型凝集素样域(其预测不结合钙或糖)，茎区，跨膜域和短的含有itim基序的胞质尾。亲本抗体还可以为包含清蛋白结合肽(abp)序列的融合蛋白(dennis等(2002)“albuminbindingasageneralstrategyforimprovingthepharmacokineticsofproteins”jbiolchem.277:35035-35043；wo01/45746)。本发明的抗体包括具有下列文献中教导的abp序列的融合蛋白:(i)dennis等(2002)jbiolchem.277:35035-35043，表iii和iv,35038页；(ii)us20040001827，在[0076]；和(iii)wo01/45746，在12-13页，并且将所有这些文献引入本文作为参考。诱变可通过本领域中公知的多种方法制备编码起始多肽的氨基酸序列变体的dna。这些方法包括，但不限于通过定点(或寡核苷酸介导的)诱变，pcr诱变和对编码所述多肽的较早制备的dna的盒式诱变制备。还可以通过限制片段操作或通过使用合成寡核苷酸的重叠延伸pcr构建重组抗体的变体。诱变引物编码半胱氨酸密码子替代物。标准诱变技术可以用于产生编码这类突变的半胱氨酸改造抗体的dna。一般指导原则可以在下列文献中找到：sambrook等molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1989；和ausubel等currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishing和wiley-interscience,newyork,n.y.,1993。定点诱变为一种制备替代变体，即突变蛋白的方法。这项技术为本领域众所周知(例如，参见,carter(1985)等nucleicacidsres.13:4431-4443；ho等(1989)基因(amst.)77:51-59；和kunkel等(1987)proc.natl.acad.sci.usa82:488)。简言之，在进行dna定点诱变过程中，通过首先使编码所需突变的寡核苷酸与这类起始dna的单链杂交来改变起始dna。在杂交后，将dna聚合酶用于使用杂交的寡核苷酸作为引物并且使用起始dna单链作为模板合成完整的第二链。因此，将编码所需突变的寡核苷酸掺入所得双链dna。定点诱变可以在表达质粒中表达预进行诱变的蛋白质的基因中进行，并且可以对所得质粒测序以便证实引入了所需的半胱氨酸替代突变(liu等(1998)j.biol.chem.273:20252-20260)。定点方案和方式，包括那些商购的方案和方式，例如multisite-directedmutagenesiskit(stratagene,lajolla,ca)。pcr诱变还适合于制备起始多肽的氨基酸序列变体。参见higuchi,(1990)：pcrprotocols,pp.177-183,academicpress；ito等(1991)gene102:67-70；bernhard等(1994)bioconjugatechem.5:126-132；和vallette等(1989)nuc.acidsres.17:723-733。简言之，当将少量模板dna用作pcr中的起始物时，在序列方面稍不同于模板dna中相应区的引物可以用于产生相对大量的特异性dna片段，这些片段仅在引物不同于模板的位置上不同于模板序列。用于制备变体的另一种方法，即盒式诱变基于wells等(1985)基因34:315-323所述的技术。起始物为包含要突变的起始多肽dna的质粒(或其它载体)。鉴定要突变的起始dna中的密码子。在鉴定的突变位点的每侧上必须存在独特的限制性内切核酸酶位点。如果不存在这类限制位点，那么可以使用上述寡核苷酸介导的诱变方法产生它们，以便将其引入起始多肽dna的适当位置上。在这些位点上切割质粒dna以使其线性化。使用标准操作步骤合成编码在限制位点之间但含有所需突变的dna序列的双链寡核苷酸。其中分别合成寡核苷酸的两条链然后使用标准技术彼此杂交。通过亚磷酰胺合成法(phosphoramiditesynthesismethod)制备寡核苷酸(us4415732；us4458066；beaucage,s.和iyer,r.(1992)"advancesinthesynthesisofoligonucleotidesbythephosphoramiditeapproach",tetrahedron48:2223-2311).这种双链寡核苷酸称作盒(cassette)。将这种盒设计成具有与线性化质粒末端相容的5′和3′末端，使得它可以直接连接质粒。这种质粒目前含有突变的dna序列。可以通过dna测序证实含有编码的半胱氨酸替代物的突变dna。还通过寡核苷酸定向诱变，使用经pcr的诱变的双链质粒dna作为模板产生单突变(sambrook和russel,(2001)molecularcloning:alaboratorymanual,3rdedition；zoller等(1983)methodsenzymol.100:468-500；zoller,m.j.和smith,m.(1982)nucl.acidsres.10:6487-6500)。在本发明中，在m13噬菌体上展示的hu4d5(gerstner等(2002)“sequenceplasticityintheantigen-bindingsiteofatherapeuticanti-her2antibody”,jmolbiol.321:851-62)作为模型系统用于实验。将半胱氨酸突变引入hu4d5-噬菌体，hu4d5和abp-hu4d5构建体。如上所述使用聚乙二醇(peg)沉淀法进行hu4d5-thiomabtm抗体-噬菌体制备(lowman,henryb.(1998)methodsinmolecularbiology(totowa,newjersey)87(combinatorialpeptidelibraryprotocols)249-264)。pheselector测定pheselector(用于选择反应性硫醇的噬菌体elisa)测定法能够以elisa噬菌体方式检测抗体中反应性半胱氨酸基团。参见美国专利no.7,521,541和美国专利公开文本no.20110301334，通过援引将它们完整收录。具体而言，pheseslector测定包括在孔表面上包被所关注的蛋白质(例如抗体)，随后与噬菌粒一起温育且然后使用吸光度检测hrp标记的二抗的过程。可以以快速，有力和高流通量方式筛选噬菌体上展示的突变蛋白。可以使用从抗体或其它蛋白质的随机蛋白质-噬菌体文库鉴定游离cys掺入的适当反应位点相同的手段生产半胱氨酸改造抗体的文库并且进行结合选择。这项技术包括使噬菌体上展示的半胱氨酸突变体蛋白质与也为硫醇反应性的亲和试剂或报告基团反应。在某些实施方案中，pheselector测定法包括下述步骤：1)在maxisorp96孔板上分开包被牛血清清蛋白(bsa)，部分或整个靶蛋白(例如erbb2胞外域(her2))，和链霉亲合素(100μl，2μg/ml)；2)用0.5％tween-20(在pbs中)封闭后，将生物素化的和非生物素化的thiomabtm抗体-噬菌体(2x1010个噬菌体颗粒)于室温温育1小时(例如如果靶蛋白为erbb2胞外域(her2)，那么是hu4d5-thiomabtm抗体-噬菌体)；3)与噬菌体一起温育后是与辣根过氧化物酶(hrp)标记的二抗(抗m13噬菌体衣壳蛋白，pviii蛋白抗体)一起温育；4)进行标准hrp反应并于450nm测量吸光度；5)通过计算链霉亲合素的od450/靶蛋白(例如her2)的od450之间的比来测量硫醇反应性，使得1的硫醇反应性值指示半胱氨酸硫醇的完全生物素化。蛋白质表达和纯化易于使用常规操作步骤(例如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)分离编码半胱氨酸改造抗体的dna并且对其进行测序。杂交瘤细胞用作这类dna的来源。一旦分离，就可以将dna放入表达载体，然后将其转染入宿主细胞，诸如大肠杆菌细胞，猿猴cos细胞，中国仓鼠卵巢(cho)细胞，hek293t细胞，或其它不额外产生抗体蛋白的哺乳动物宿主细胞，诸如骨髓瘤细胞(us5807715；us2005/0048572；us2004/0229310)，以便获得重组宿主细胞中合成的单克隆抗体。在大多数情况中，半胱氨酸改造抗体的产率与野生型抗体相似。有关细菌中编码抗体的dna的重组表达的综述文章包括skerra等(1993)curr.opinioninimmunol.5:256-262和plückthun(1992)immumol.revs.130:151-188。在设计和选择后，可以通过下列方式生产具有高度反应性的未配对的cys残基的半胱氨酸改造抗体，例如thiomabtm抗体：(i)在细菌，例如大肠杆菌系统或哺乳动物细胞培养系统中表达(wo01/00245)，例如中国仓鼠卵巢细胞(cho)或hek293细胞(例如hek293t细胞)；和(ii)使用常用的蛋白质纯化技术纯化(lowman等(1991)j.biol.chem.266(17):10982-10988)。在本发明的具体实施方案中，在哺乳动物细胞表达系统中表达thiomabtm抗体。在具体的实施方案中，哺乳动物细胞表达系统为hek293t细胞。thiomabtm抗体是全长抗体，其包括天然半胱氨酸残基，在抗体内形成二硫键。因而，这些天然半胱氨酸残基不具有任何与药物-马来酰亚胺缀合的反应性硫醇基团(reactive-thiolgroup)(除非用还原剂处理)。因此，新改造的cys残基可以保持不配对并且能够与亲电子接头试剂或药物-接头中间体(drug-linkerintermediate)，诸如药物-马来酰亚胺反应，即与之缀合。依照顺序编号系统给重链和轻链的改造的cys残基的结构位置编号。这种顺序编号系统(sequentialnumberingsystem)与kabat编号系统相关(kabat等(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md)，而kabat编号系统用于4d5抗体。使用kabat编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有相当于可变域的fr或cdr的缩短或插入的较少或额外的氨基酸。通过图1a和1b中的顺序编号和kabat编号方案鉴定半胱氨酸改造的重链变体位点和轻链变体位点。硫醇反应性可以广泛化至抗体的某些结构域，诸如轻链恒定域(cl)和重链恒定域ch1，ch2和ch3。产生约0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，和0.95和更高硫醇反应性值的半胱氨酸替代可以在如下完整抗体的重链恒定域α，δ，ε，γ和μ中进行：分别为iga，igd，ige，igg和igm，包括igg亚类：igg1，igg2，igg3，igg4，iga1和iga2。标记的半胱氨酸改造抗体本发明的半胱氨酸改造抗体可以与任意标记模块(labelmoiety)缀合，所述的标记模块可以通过反应性半胱氨酸硫醇基团与该抗体共价结合(singh等(2002)anal.biochem.304:147-15；harlowe.和lane,d.(1999)usingantibody:alaboratorymanual,coldspringsharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny；lundbladr.l.(1991)chemicalreagentsforproteinmodification,2nded.crcpress,bocaraton,fl)。结合的标记可以起如下作用：(i)提供可检测信号；(ii)与第二种标记发生相互作用以改变由第一种或第二种标记提供的可检测信号，例如得到fret(荧光共振能量转移)；(iii)使相互作用稳定或增加与抗原或配体的结合亲和力；(iv)通过电荷，亲水性，形状或其它物理参数影响运动性，例如电泳迁移率或细胞渗透性；或(v)提供捕捉模块(capturemoiety)，以调节配体亲和力，抗体/抗原结合或离子络合。标记的半胱氨酸改造抗体可以用于诊断试验，例如用于检测所关注抗原在特异性细胞，组织或血清中的表达。就诊断应用而言，一般用可检测模块标记该抗体。可利用大量标记，一般可以将它们分成如下类：(a)放射性同位素(放射性核素)，诸如3h，11c，14c，18f，32p，35s，64cu，68ga，86y，89zr，99tc，111in，123i，124i，125i，131i，133xe，177lu，211at，或213bi。放射性同位素标记的抗体用于受体靶向的成像实验。可以使用currentprotocolsinimmunology,(1991)volumes1和2,coligen等,ed.wiley-interscience,newyork,ny,pubs.中所述的技术用配体试剂标记抗体，所述配体试剂结合，螯合乃至复合放射性同位素金属，其中所述试剂与改造的抗体的半胱氨酸硫醇反应。可以复合金属离子的螯合配体包括dota，dotp，dotma，dtpa和teta(macrocyclics,dallas,tx)。可以通过与本发明的抗体-药物缀合物复合靶向放射性核素(wu等(2005)naturebiotechnology23(9):1137-1146)。dota-马来酰亚胺试剂与半胱氨酸改造抗体的游离半胱氨酸氨基酸反应并且得到抗体上的金属复合配体(lewis等(1998)bioconj.chem.9:72-86)。螯合接头标记试剂，诸如dota-nhs(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸一(n-羟基琥珀酰亚胺酯)为商购的(macrocyclics,dallas,tx)。使用放射性核素标记的抗体成像的受体靶标可以通过检测和定量肿瘤组织中抗体的进行性蓄积提供活化途径标记(albert等(1998)bioorg.med.chem.lett.8:1207-1210)。用于成像实验的适合于作为抗体标记的金属-螯合物复合物(us2010/0111856；us5342606；us5428155；us5316757；us5480990；us5462725；us5428139；us5385893；us5739294；us5750660；us5834456；hnatowich等(1983)j.immunol.methods65:147-157；meares等(1984)anal.biochem.142:68-78；mirzadeh等(1990)bioconjugatechem.1:59-65；meares等(1990)j.cancer1990,suppl.10:21-26；izard等(1992)bioconjugatechem.3:346-350；nikula等(1995)nucl.med.biol.22:387-90；camera等(1993)nucl.med.biol.20:955-62；kukis等(1998)j.nucl.med.39:2105-2110；verel等(2003)j.nucl.med.44:1663-1670；camera等(1994)j.nucl.med.21:640-646；ruegg等(1990)cancerres.50:4221-4226；verel等(2003)j.nucl.med.44:1663-1670；lee等(2001)cancerres.61:4474-4482；mitchell,等(2003)j.nucl.med.44:1105-1112；kobayashi等(1999)bioconjugatechem.10:103-111；miederer等(2004)j.nucl.med.45:129-137；denardo等(1998)clinicalcancerresearch4:2483-90；blend等(2003)cancerbiotherapy&radiopharmaceuticals18:355-363；nikula等(1999)j.nucl.med.40:166-76；kobayashi等(1998)j.nucl.med.39:829-36；mardirossian等(1993)nucl.med.biol.20:65-74；roselli等(1999)cancerbiotherapy&radiopharmaceuticals,14:209-20)。(b)荧光标记，诸如稀土元素螯合物(铕螯合物)；荧光素类，包括fitc，5-羧基荧光素，6-羧基荧光素；若丹明类，包括tamra；丹酰；丽丝胺(lissamine)；花青(cyanines)；藻红蛋白；德克萨斯红；及其类似物。例如，可以使用同上文的currentprotocolsinimmunology中披露的技术使荧光标记与抗体缀合。荧光染料和荧光标记试剂包括商购自invitrogen/molecularprobes(eugene,or)和piercebiotechnology,inc.(rockford,il)的那些荧光染料和荧光标记试剂。检测标记，诸如荧光染料和化学发光染料(briggs等(1997)"synthesisoffunctionalisedfluorescentdyesandtheircouplingtoaminesandaminoacids,"j.chem.soc.,perkin-trans.1:1051-1058)提供了可检测信号并且一般应用于标记抗体，这些抗体优选具有如下特性：(i)标记的抗体应产生极高的信号与低背景，使得可以在无细胞和基于细胞的试验中灵敏地检测少量抗体；和(ii)标记的抗体应是光稳定的，以便可以观察，监测和记录荧光信号，而无显著的光漂白。就涉及标记抗体与膜或细胞表面，尤其是活细胞的细胞表面结合的应用而言，标记优选(iii)具有良好的水溶性以便获得有效缀合物浓度和检测灵敏度和(iv)对活细胞无毒性，以便不会破坏细胞的正常代谢过程或导致过早细胞死亡。(c)各种酶-底物标记为可得到的或披露的(us4275149)。酶一般催化可以使用各种技术测定的显色底物的化学改变。例如，酶可催化底物中的颜色改变，而这种改变可以通过分光光度法测定。或者，酶可以改变底物的荧光或化学发光。用于定量荧光改变的技术如上所述。化学发光底物通过化学反应变成电激发的且然后可以发射可测定的光(例如使用化学发光计)或给荧光接受器提供能量。酶促标记的实例包括：荧光素酶(例如荧火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利no.4,737,456)；萤光素；2,3-二酞嗪二酮类；苹果酸脱氢酶；尿素酶；过氧化物酶，诸如辣根过氧化物酶(hrp)；碱性磷酸酶(ap)；β-半乳糖苷酶；葡萄糖淀粉酶；溶菌酶；糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)；杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)；乳过氧化物酶；微过氧化物酶等。用于使酶与抗体缀合的技术描述在o′sullivan等(1981)“methodsforthepreparationofenzyme-antibodycojugateforuseinenzymeimmunoassay”：methodsinenzym.(edj.langone&h.vanvunakis),academicpress,newyork,73:147-166中。酶-底物组合的实例(美国专利no.4,275,149和4,318,980)包括，例如：(i)辣根过氧化物酶(hrp)与作为底物的过氧化氢酶，其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如邻苯二胺(opd)或3,3′,5,5′-四甲基联苯胺盐酸盐(tmb))；(ii)碱性磷酸酶(ap)与作为显色底物的磷酸对-硝基苯基酯；和(iii)β-d-半乳糖苷酶(β-d-gal)与显色底物(例如对-硝基苯基-β-d-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形基(umbelliferyl)-β-d-半乳糖苷酶。标记可以与半胱氨酸改造抗体间接缀合。例如，抗体可以与生物素缀合，并且上述三大类标记中的任意类可以与亲合素蛋白或链霉亲合素缀合，或反之亦然。生物素选择性地结合链霉亲合素，且由此标记可以按照这种间接方式与抗体缀合。或者，为了实现标记与多肽变体的间接缀合，使多肽变体与小的半抗原(例如地高辛)缀合并且上述不同类型标记之一与抗-半抗原多肽变体缀合(例如抗地高辛抗体)。因此，可以实现标记与多肽变体的间接缀合(hermanson,g.(1996)inbiocojugatetechniquesacademicpress,sandiego)。本发明的多肽变体可以用于任意已知的测定方法中，诸如elisa，竞争性结合测定法，直接和间接夹心式测定法和免疫沉淀测定法(zola,(1987)monoclonalantibodies:amanualoftechniques,pp.147-158,crcpress,inc.).检测标记可以用于定位，显影和定量结合或识别结果。本发明标记的抗体可以检测细胞-表面受体。另一种用于检测标记的抗体的应用在于基于珠的免疫捕捉，包含使珠与荧光标记的抗体缀合并且检测配体结合时的荧光信号。类似的结合检测方法使用表面等离子共振(spr)效应以测定和检测抗体-抗原相互作用。本发明标记的半胱氨酸改造抗体用作生物医学和分子成像的各种方法和技术的成像生物标记物和探针，所述的方法和技术诸如：(i)mri(磁共振成像)；(ii)microct(电子计算机化断层x线摄影法)；(iii)spect(单光子发射计算机断层术)；(iv)pet(正电子发射断层照相术)tinianow,j.etal(2010)nuclearmedicineandbiology,37(3):289-297；chen等(2004)bioconjugatechem.15:41-49；us2010/0111856；(v)生物发光；(vi)荧光；和(vii)超声。免疫闪烁成像为一种成像方法，其中将放射性物质标记的抗体给予动物或人体患者并且取抗体定位的身体部位的图像(us6528624)。可以客观测定成像生物标记物并且作为正常生物学过程，病理过程或对治疗干预的药理反应的指示评价。生物标记物可以具有几种类型：0型为疾病的天然历史标记物并且与已知的临床指标纵向相关，例如类风湿性关节炎中滑液炎症的mri评价；i型标记捕捉按照作用机制干预的作用，即使该机制与临床结果无关；ii型标记作为替代终点(surrogateendpoint)起作用，其中生物标记的改变或信号预测临床有益性以便“验证”靶向的反应，诸如通过ct在类风湿性关节炎中测定的骨质侵蚀。成像生物标记物由此可以提供有关下列的药效(pd)治疗信息：(i)靶蛋白的表达；(ii)治疗剂与靶蛋白的结合，即选择性；和(iii)清除和半衰期药代动力学数据。与基于实验室的生物标记物有关的体内成像生物标记物的优点包括：非-侵害性治疗；可定量；整体评价；重复给药和评价，即多时间点；和从前期临床(小动物)到临床(人)结果的潜在可转移的作用。就某些应用而言，生物成像替代了前期临床研究中的动物实验或将其次数减少到了最低限度。肽标记方法为众所周知的。参见haugland,2003,molecularprobeshandbookoffluorescentprobesandresearchchemicals,molecularprobes,inc.；brinkley,1992,bioconjugatechem.3:2；garman,(1997)non-radioactivelabelling:apracticalapproach,academicpress,london；means(1990)biogconjugatechem.1:2；glazer等(1975)chemicalmodificationofproteins.laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology(t.s.work和e.work,eds.)americanelsevierpublishingco.,newyork；lundblad,r.l.和noyes,c.m.(1984)chemicalreagentsforproteinmodification,vols.i和ii,crcpress,newyork；pfleiderer,g.(1985)“chemicalmodificationofproteins”,modernmethodsinproteinchemistry,h.tschesche,ed.,walterdegryter,berlin和newyork；和wong(1991)chemistryofproteinconjugationandcross-linking,crcpress,bocaraton,fla.)；deleon-rodriguez等(2004)chem.eur.j.10:1149-1155；lewis等(2001)bioconjugatechem.12:320-324；li等(2002)bioconjugatechem.13:110-115；mier等(2005)bioconjugatechem.16:240-237。使用两模块，即荧光报道基团和猝灭物标记的肽类和蛋白质能够充分近似地进行荧光共振能量转移(fret)。报道基团一般为由一定波长的光激发的荧光染料并且可以将能量转移至接受或猝灭基团，其中对于在最大亮度时发射而言存在适当的stokes偏移。荧光染料包括具有延长的芳香性的分子，诸如荧光素和若丹明及其衍生物。可以通过完整肽的猝灭物模块部分或明显地使荧光报道分子猝灭。在通过肽酶或蛋白酶裂解肽时，可以测定荧光中的可检测到的增加(knight,c.(1995)“fluorimetricassaysofproteolyticenzymes”,methodsinenzymology,academicpress,248:18-34)。还可以将本发明标记的抗体用作亲和纯化试剂。在该方法中，使用本领域众所周知的方法将标记的抗体固定在固相上，诸如sephadex树脂或滤纸上。使固定化抗体与含有要纯化的抗原的样品接触，且此后用可基本上除去样品中除要纯化的抗原外的所有物质的适当溶剂洗涤支持物，所述抗原与固定的多肽变体结合。最终用另一种合适的溶剂，诸如ph5.0的甘氨酸缓冲液洗涤支持物，该溶剂能够使所述抗原从所述多肽变体中释放。标记试剂一般具有反应性官能基，它可以与：(i)半胱氨酸改造抗体的半胱氨酸硫醇直接反应而形成标记的抗体；(ii)与接头试剂反应而形成接头-标记中间体；或(iii)与接头抗体反应而形成标记的抗体。标记试剂的反应性官能基包括：马来酰亚胺，卤代乙酰基，碘乙酰胺琥珀酰亚胺基酯(例如nhs，n-羟基琥珀酰亚胺)，异硫氰酸酯，磺酰氯，2,6-二氯三嗪基，五氟苯基酯和亚磷酰胺，不过，也可以使用其它的官能基。接头药物与thiomabtm抗体的缀合将本文所述thiomabtm抗体缀合至两种不同接头药物以演示重和轻链内每一个位点处的改造的半胱氨酸的缀合效率。在代表性抗体huanti-her24d5(“4d5抗体”)的每一个位置改造半胱氨酸残基以生成thiomabtm抗体。将每一种thiomabtm抗体分开缀合至两种接头药物(mc-vc-pab-mmae和pds-mmae)。在96孔滤板(体积2ml，聚丙烯，0.45um滤器，来自ekscientific)中实施缀合。该板只容许以500xg离心2分钟时水性缓冲液流过。作为20％乙醇中的50％浆，对每个孔添加450μlmabselectsure树脂(gehealthcare)。将树脂在50mmtrisph8.0，150mmnacl，2mmedta(缓冲液a)中清洗3次并平衡。对每个孔添加每种thiomabtm抗体(1.5mg)，并于室温在600rpm的摇板仪上容许结合至树脂达30分钟。30分钟后，将板离心以去除过量的缓冲液。于室温在摇动下在0.9ml含2mm二硫苏糖醇的缓冲液a存在下将thiomabtm抗体还原过夜。通过用缓冲液a清洗2次纯化掉还原剂和任何半胱氨酸或谷胱甘肽嵌段(block)。将板用1ml含1mm脱氢抗坏血酸(dhaa)的缓冲液a清洗3次以用氧化剂充满板。最后一次添加0.9ml含1mmdhaa的缓冲液a后，于室温在摇板仪上容许thiomabtm抗体再氧化3小时。通过离心去除氧化剂。对每个孔添加两倍摩尔过量(相对于可用的硫醇基团)的在含10％dma的缓冲液a中溶解的接头-药物(mc-vc-pab-mmae或pds-mmae任一)，并于室温在摇板仪上与thiomabtm抗体一起温育2小时。通过将板用平衡缓冲液清洗6次来纯化掉过量的接头-药物。于室温在摇板仪上用0.1m甘氨酸缓冲液ph2.7洗脱缀合的thiomabtm抗体30分钟。立即用15％0.5mtris，ph8.0中和thiomabtm抗体。通过lc/ms分析量化每个单抗缀合的药物的数目。通过大小排阻层析评估缀合物的聚集。质谱分析使用液相层析电喷射离子化质谱(lc-esi-ms)分析对缀合的thiomabtm抗体进行精确分子量测定(cole,r.b.electrosprayionizationmassspectrometry:fundamentals,instrumentationandapplications.(1997)wiley,newyork)。在6224质量飞行时间(tof)lc/ms(agilenttechnologies)上实施lc/ms分析。将样品在加热至80℃的prlp-s柱，8μm(50mmx2.1mm，agilenttechnologies)上层析。以0.7ml/min流速在3分钟里使用线性梯度34-42％b(溶剂a，含0.05％tfa的水；溶剂b，含0.04％tfa的乙腈)并使用电喷射源直接将洗提液电离。收集数据并使用agilentmasshunter定性分析软件解卷积。使用lc/ms层析图中存在的解卷积峰的丰度计算药物对抗体比(dar)。thiomabtm抗体的聚集分析在1100系列hplc(agilenttechnologies)上实施大小排阻层析。将样品在shodexkw802.5柱上层析。使用等度方法(其使用流动相0.2m磷酸钾，0.25m氯化钾，ph6.2，0.75ml/min，15分钟)来洗脱缀合物。根据uv280nm层析图的聚集体和单体峰的积分面积计算百分比聚集。曲妥珠单抗的thioigg变体的工程化改造在重和轻链中的每一个残基处将半胱氨酸引入全长单克隆抗体，曲妥珠单抗(genentechinc.)(将seqidno.:1(4d5重链)和seqidno.:2(4d5轻链)的每个天然，非半胱氨酸残基突变成半胱氨酸)。代表性4d5抗体的重链具有450个氨基酸：12个半胱氨酸残基和438个非半胱氨酸残基。代表性4d5抗体的轻链具有214个氨基酸：6个半胱氨酸残基和208个非半胱氨酸残基。具体而言，将单个残基自它的天然氨基酸突变成半胱氨酸，由此产生具有两个改造的半胱氨酸残基的全长抗体。将每种半胱氨酸突变缀合至pds-mmae和mc-vc-mmae。这产生总共648种thiomabtm抗体：648种pds-mmaethiomabtm抗体和648种mc-vc-mmaethiomabtm抗体。在培养基中在hek293t细胞中表达这些半胱氨酸改造抗体(thiomabtm抗体)。evqlvesggglvqpggslrlscaasgfnikdtyihwvrqapgkglewvariyptngytryadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycsrwggdgfyamdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkseqidno:18diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvntavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsrsgtdftltisslqpedfatyycqqhyttpptfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgecseqidno:19在一个优选的实施方案中，thiomabtm抗体包含表2中的依照kabat编号方式的一处或多处重链突变。在一个优选的实施方案中，thiomabtm抗体在与表2中所列依照4d5序列的位置等同的位置处包含改造的半胱氨酸。在一个优选的实施方案中，thiomabtm抗体中的表2中鉴定的改造的半胱氨酸或位置上等同的改造的半胱氨酸是游离半胱氨酸。在一个优选的实施方案中，thiomabtm抗体在依照kabat编号方式的位置hc-a136c(即依照eu编号方式的hc-a140c)处包含改造的半胱氨酸(见实施例11)。在优选的实施方案中，thiomabtm抗体包含图21中的依照eu编号方式的一处或多处重链突变。具体而言，半胱氨酸改造抗体中的重链半胱氨酸突变选自由依照eu编号方式的hc-t110c，hc-a140c，hc-l174c，hc-l179c，hc-t187c，hc-t209c，hc-v262c，hc-g371c，hc-y373c，hc-e382c，hc-s242c，hc-n434c，和q438c组成的位点组。在优选的实施方案中，thiomabtm抗体包含在选自由依照eu编号方式的hc-a140c，hc-l174c，hc-l179c，hc-g371c，hc-y373c，hc-s424c，和hc-q438c组成的组的改造的半胱氨酸处通过pds接头缀合至药物模块的半胱氨酸改造抗体。在优选的实施方案中，thiomabtm抗体包含在选自由hc-t110c，hc-t187c，hc-t209c，hc-v262c，hc-g371c，hc-e382c，和hc-n434c组成的组的改造的半胱氨酸处通过vc-(即马来酰亚胺)接头缀合至药物模块的半胱氨酸改造抗体。在某些实施方案中，thiomabtm抗体包含表3中的依照kabat编号方式的一处或多处重链突变。在某些实施方案中，thiomabtm抗体在与表3中所列依照4d5序列的位置等同的位置处包含改造的半胱氨酸。例如，如果抗体在它的重链中在依照kabat编号方式的位置5处包含天然丙氨酸(a)(与4d5中的天然缬氨酸(v)相比)，那么可以将该丙氨酸突变成半胱氨酸以产生hc-a5cthiomabtm抗体。在某些实施方案中，thiomabtm抗体中的表3中鉴定的改造的半胱氨酸或位置上等同的改造的半胱氨酸是游离半胱氨酸。表3：依照kabat编号方式的重链半胱氨酸突变。在某些实施方案中，thiomabtm抗体包含表3中所列序列。在某些实施方案中，具有表3中所列突变和/或序列的thiomabtm抗体包含pds接头。在某些实施方案中，具有表3中所列突变和/或序列的thiomabtm抗体包含马来酰亚胺(例如-vc)接头。在具体的实施方案中，将重链位点(依照kabat编号方式)突变成选自下组的半胱氨酸以形成半胱氨酸改造抗体并使用pds接头连接至药物：v2c，t29c，y30c，a37c，e43c，y77c，w96c，g97c，d105c，t139c，n159c，a162c，g166c，g178c，l179c，v188c，i199c，n203c，s207c，e388c，k414c，q418c，s242c，y436c，t437c，q438c，l443c，和m104c。在具体的实施方案中，将重链位点(依照kabat编号方式)突变成选自下组的半胱氨酸以形成半胱氨酸改造抗体并使用-vc(即马来酰亚胺)接头连接至药物：v2c，l1c，v2c，l8c，r16c，f24c，i26c，y30c，q36c，a37c，k40c，l42c，e43c，t51c，g53c，t55c，r56c，y57c，a58c，t66c，n74c，q79c，w107c，t120c，k121c，a140c，g166c，g178c，t187c，i199c，t209c，f243c，m252c，e258c，v262c，n276c，v282c，l309c，t335c，s337c，r344c，q347c，k360c，g371c，e382c，p387c，e388c，s403c，k414c，q418c，g420c，n421c，s424c，n434c，y436c，t437c，q438c，k439c，s442c，l443c，m104c，和n81c。在具体的实施方案中，包含选自表2中所列突变的重链半胱氨酸突变的半胱氨酸改造抗体具有介于1.0和2.0之间的平均dar，是使用本文所述用于稳定性测定测定法的亲和捕捉lc-ms测定法测定的(见实施例12和13)。在具体的实施方案中，包含选自表2中所列突变的重链半胱氨酸突变的半胱氨酸改造抗体具有介于1.1和1.3之间的平均dar。在具体的实施方案中，包含选自表2中所列突变的重链半胱氨酸突变的半胱氨酸改造抗体具有介于1.3和1.5之间的平均dar。在具体的实施方案中，具有选自表1列表的半胱氨酸突变的thiomabtm抗体具有介于1.5和1.8之间的平均dar。在具体的实施方案中，包含选自表2中所列突变的重链半胱氨酸突变的半胱氨酸改造抗体平均具有介于1.8和2.0之间的dar。在一个优选的实施方案中，半胱氨酸改造抗体包含表2中的依照kabat编号方式的一处或多处重链突变。在一个优选的实施方案中，半胱氨酸改造抗体在与表2中所列依照4d5序列的位置等同的位置处包含改造的半胱氨酸。例如，如果抗体在它的重链中在依照kabat编号方式的位置19处包含天然赖氨酸(k)(与4d5中的天然精氨酸(r)相比)，那么可以将该赖氨酸突变成半胱氨酸以产生k19cthiomabtm抗体。在一个优选的实施方案中，thiomabtm抗体中的表2中鉴定的改造的半胱氨酸或位置上等同的改造的半胱氨酸是游离半胱氨酸。表4：依照kabat编号方式的轻链半胱氨酸突变。在一个优选的实施方案中，thiomabtm抗体包含表1中的依照kabat编号方式的一处或多处轻链突变。在一个优选的实施方案中，thiomabtm抗体在与表1中所列依照4d5序列的位置等同的位置处包含改造的半胱氨酸。在一个优选的实施方案中，thiomabtm抗体中的表1中鉴定的改造的半胱氨酸或位置上等同的改造的半胱氨酸是游离半胱氨酸。在一个优选的实施方案中，thiomabtm抗体在依照kabat编号方式的位置lc-k149c处包含改造的半胱氨酸(见实施例2和7)。在优选的实施方案中，将lc-k149c抗体经由pds接头缀合至药物模块。在优选的实施方案中，将lc-k149c抗体经由-vc(即马来酰亚胺)接头缀合至药物模块。在某些实施方案中，thiomabtm抗体包含图21中的依照kabat编号方式的一处或多处轻链突变。具体而言，半胱氨酸改造抗体中的轻链半胱氨酸突变选自由依照kabat编号方式的lc-t22c，lc-k39c，lc-y49c，lc-y55c，lc-t85c，lc-t97c，lc-i106c，lc-r108c，lc-r142c，lc-k149c，和lc-v205c组成的位点组。在优选的实施方案中，thiomabtm抗体包含在选自由依照kabat编号方式的lc-i106c，lc-r108c，和lc-v205c组成的组的改造的半胱氨酸处通过pds接头缀合至药物模块的半胱氨酸改造抗体。在优选的实施方案中，thiomabtm抗体包含在选自由依照kabat编号方式的lc-t22c，lc-k39c，lc-y49c，lc-y55c，lc-t85c，lc-t97c，lc-r142c，和lc-k149c组成的组的改造的半胱氨酸处通过vc-(即马来酰亚胺)接头缀合至药物模块的半胱氨酸改造抗体。在具体的实施方案中，包含选自表1中所列突变的轻链半胱氨酸突变的半胱氨酸改造抗体具有介于1.0和2.0之间的平均dar，是使用本文所述用于稳定性测定测定法的亲和捕捉lc-ms测定法测定的(见实施例12和13)。在具体的实施方案中，包含选自表1中所列突变的轻链半胱氨酸突变的半胱氨酸改造抗体具有介于1.1和1.3之间的平均dar。在具体的实施方案中，包含选自表1中所列突变的轻链半胱氨酸突变的半胱氨酸改造抗体具有介于1.3和1.5之间的平均dar。在具体的实施方案中，具有选自表1列表的半胱氨酸突变的半胱氨酸改造抗体具有介于1.5和1.8之间的平均dar。在具体的实施方案中，包含选自表1中所列突变的重链半胱氨酸突变的半胱氨酸改造抗体具有介于1.8和2.0之间的平均dar。在具体的实施方案中，包含选自表1中所列突变的重链半胱氨酸突变的半胱氨酸改造抗体具有介于0.8和1.4之间的平均dar。在优选的实施方案中，thiomabtm抗体包含表1中所列序列。在优选的实施方案中，具有表1中所列突变和/或序列的thiomabtm抗体包含pds接头。在优选的实施方案中，具有表1中所列突变和/或序列的thiomabtm抗体包含-vc接头。在某些实施方案中，thiomabtm抗体包含表4中所列序列。在某些实施方案中，具有表4中所列突变和/或序列的thiomabtm抗体包含pds接头。在某些实施方案中，具有表4中所列突变和/或序列的thiomabtm抗体包含-vc接头。在某些实施方案中，包含选自表4中所列突变的轻链半胱氨酸突变的半胱氨酸改造抗体具有介于1.0和2.0之间的平均dar，是使用本文所述用于稳定性测定测定法的亲和捕捉lc-ms测定法测定的(见实施例12和13)。在具体的实施方案中，具有选自表4列表的半胱氨酸突变的thiomabtm抗体具有介于1.3和1.9之间的平均dar。在具体的实施方案中，具有选自表4列表的半胱氨酸突变的thiomabtm抗体具有介于1.3和1.8之间的平均dar。在具体的实施方案中，具有选自表4列表的半胱氨酸突变的thiomabtm抗体具有介于1.5和1.9之间的平均dar。在具体的实施方案中，具有选自表4列表的半胱氨酸突变的thiomabtm抗体具有介于0.8和1.0之间的平均dar。在优选的实施方案中，thiomabtm抗体包含图21中的依照eu编号方式的一处或多处轻链突变。具体而言，半胱氨酸改造抗体中的轻链半胱氨酸突变选自由依照eu编号方式的lc-t22c，lc-k39c，lc-y49c，lc-y55c，lc-t85c，lc-t97c，lc-i106c，lc-r108c，lc-r142c，lc-k149c，和lc-v205c组成的位点组。在优选的实施方案中，thiomabtm抗体包含在选自由依照eu编号方式的lc-t22c，lc-k39c，lc-y49c，lc-y55c，lc-t85c，lc-t97c，lc-r142c，和lc-k149c组成的组的改造的半胱氨酸处通过pds接头缀合至药物模块的半胱氨酸改造抗体。在优选的实施方案中，thiomabtm抗体包含在选自由lc-i106c，lc-r108c，和lc-v205c组成的组的改造的半胱氨酸处通过vc-(即马来酰亚胺)接头缀合至药物模块的半胱氨酸改造抗体。在某个实施方案中，thiomabtm抗体包含表5中所列序列。在某个实施方案中，thiomabtm抗体在与表5中所列依照4d5序列的位置等同的位置处包含改造的半胱氨酸。例如，如果抗体在它的重链中在依照kabat编号方式的位置40处包含天然丝氨酸(s)(与4d5中的天然丙氨酸(a)相比)，那么可以将该丝氨酸突变成半胱氨酸以产生s40cthiomabtm抗体。在某个实施方案中，thiomabtm抗体中的表5中鉴定的改造的半胱氨酸或位置上等同的改造的半胱氨酸是游离半胱氨酸。表5：依照kabat编号方式的重链和轻链半胱氨酸突变。突变体序列seqidnohc-i195cgtqtyccnvnhseqidno:150hc-s420cqgnvfccsvmhseqidno:151hc-y432calhnhctqkslseqidno:152lc-g64cpsrfscsrsgtseqidno:153在某些实施方案中，thiomabtm抗体包含表5中所列序列。在某些实施方案中，具有表5中所列突变和/或序列的thiomabtm抗体包含-vc或pds接头。在具体的实施方案中，具有选自表5列表的半胱氨酸突变的thiomabtm抗体具有介于1.0和2.0之间的平均dar。在具体的实施方案中，具有选自表5列表的半胱氨酸突变的thiomabtm抗体具有介于1.3和1.9之间的平均dar。在具体的实施方案中，具有选自表5列表的半胱氨酸突变的thiomabtm抗体具有介于1.3和1.8之间的平均dar。在具体的实施方案中，具有选自表5列表的半胱氨酸突变的thiomabtm抗体具有介于1.5和1.9之间的平均dar。依照另一个实施方案，thiomabtm抗体包含表1-5任一中鉴定的改造的半胱氨酸。在优选的实施方案中，thiomabtm抗体包含表1和2任一中鉴定的改造的半胱氨酸。依照另一个实施方案，可以为任何靶抗原设计thiomabtm抗体。thiomabtm抗体设计和工程化改造将单一半胱氨酸替代引入抗her2hu4d5抗体的重链和轻链的每个位置(即生成了总共648种具有pds接头的抗体和总共648种具有-vc接头的抗体)(实施例1)。还将单一半胱氨酸替代引入抗cd33抗体，抗steap1抗体，抗muc16抗体，抗napi2b抗体，抗ly6e抗体，抗cd22抗体，抗cd79b抗体，抗b7h4抗体，和别的抗her2抗体的选定位置。依照本文所述方法制备所有重链突变体和轻链突变体。重链和轻链序列是依照kabat编号系统编号的。图1a和1b中提供了与每个kabat位置等同的依照顺序编号方式和eu编号方式的位置。在轻链中，kabat，sequential，和eu编号方式表示相同的编号。将4d5thiomabtm抗体的重和轻链经由pds或vc接头缀合至药物(即生成了总共648种具有pds接头的抗体和总共648种具有-vc接头的抗体)。对每种thiomabtm抗体筛选平均药物-抗体比(dar)，浓度(mg/ml)，聚集(％总的)，和稳定性(实施例2)。相应地，对每种thiomabtm抗体测量pds和vc缀合物的dar，浓度，聚集，和稳定性。本文中提供的表中提供了pds缀合物和测量，而且本文中提供的表中提供了vc缀合物和测量。表6：用pds-接头缀合的表3和4的半胱氨酸改造抗体的平均dar，浓度，聚集，和稳定性(elisa大鼠血浆稳定性)。表7：用pds-接头缀合的表3和4的半胱氨酸改造抗体的平均dar，浓度，聚集，和稳定性(质谱大鼠血浆稳定性)。表8：用-vc接头缀合的表3和4的半胱氨酸改造抗体的平均dar，浓度，聚集，和稳定性(elisa大鼠血浆稳定性)。表9：用-vc接头缀合的表3和4的半胱氨酸改造抗体的平均dar/稳定性(质谱大鼠血浆稳定性)。以起始浓度≥1mg/ml的源材料(即pds-mmaethiomabtm抗体)分析表6和7中鉴定的pds-mmaethiomabtm抗体。表6和7中鉴定的pds-mmaethiomabtm抗体的dar计算均≥dar1。表6和7中鉴定的pds-mmaethiomabtm抗体均具有≤50％聚集，再氧化。表6中鉴定的pds-mmaethiomabtm抗体的elisa复制品在大鼠基质中随时间展现至少≥77％稳定性。表6中分析的样品同样用于表7实施的实验。表7显示表6的elisa稳定性结果的lcsm确认。以起始浓度≥1mg/ml的源材料(即mc-vc-mmaethiomabtm抗体)分析表8和9中鉴定的mc-vc-mmaethiomabtm抗体。表8和9中鉴定的mc-vc-mmaethiomabtm抗体的dar计算均≥dar1。表8和9中鉴定的mc-vc-mmaethiomabtm抗体均具有≤50％聚集，再氧化。表8中鉴定的mc-vc-mmaethiomabtm抗体的elisa复制品在大鼠基质中随时间展现至少≥77％稳定性。表9显示表8的elisa稳定性结果的lcsm确认。表10：表1和2的优选半胱氨酸改造抗体的平均dar，浓度，和聚集(与表11和12所示相同的样品)。表11：表1和2的优选半胱氨酸改造抗体的elisa和ms稳定性结果(与表10和12所示相同的样品)。表12：表1和2的优选半胱氨酸改造抗体的半胱氨酸还原测定结果(与表10和11所示样品相同的样品)。表8-10中鉴定的pds-mmae和-vc-mmaethiomabtm抗体的dar计算均>dar0。表8中鉴定的pds-mmaethiomabtm抗体的两份elisa复制品中的至少一份在大鼠基质中随时间展现至少≥80％稳定性。有趣的是，vc-和pds-缀合的半胱氨酸改造抗体(即thiomabtm抗体)的dar，浓度，聚集，和稳定性不相同。例如，表6和7(pds接头)和表8和9(vc接头)的优选半胱氨酸改造抗体不相同。例如，对于pds接头缀合至药物模块优选的头等稳定位点为lc-t22c，lc-k39c，lc-y49c，lc-y55c，lc-t85c，lc-t97c，lc-r142c，lc-k149c，hc-a140c，hc-l174c，hc-l179c，hc-g371c，hc-y373c，和hc-s424c，而对于-vc接头缀合至药物模块优选的头等稳定位点为lc-i106c，lc-r108c，lc-v205c，hc-t110c(kabat编号方式)，hc-t187c，hc-t209c，hc-v262c，hc-g371c，hc-e382c，hc-n434c，依照eu编号方式(见图21)。如此，只有hc-g371c是该筛选中对于pds和-vc而言的头等位点。因而，确定哪些位点在将药物模块用pds或-vc接头任一缀合至半胱氨酸改造抗体时对于稳定性运作最好，是无法预测的且需要大量的实验。thiomabtm抗体的硫醇反应性可以通过美国专利no.7,521,541(通过援引将其完整收录)中记载的生物素化和链霉亲合素结合来测量全长igg半胱氨酸改造抗体(thiomabtm抗体)的硫醇反应性。具体而言，可以建立western印迹测定法以筛选与生物素-马来酰亚胺特异性缀合的thiomabtm抗体。在此测定法中，可以在还原性sds-page上分析抗体并通过与链霉亲合素-hrp一起温育来特异性探查生物素的存在。取决于使用哪种改造的cys变体，能在重链或轻链中观察到链霉亲合素-hrp相互作用，并且可以将结合与没有改造的半胱氨酸的野生型igg的生物素-链霉亲合素相互作用比较，由此指示与野生型抗体的任何背景结合相比哪些thiomabtm抗体特异性缀合生物素。抗体-药物缀合物本发明的半胱氨酸改造抗体可以与任意的治疗剂，即药物模块缀合，所述的治疗剂可以通过反应性半胱氨酸硫醇基团与抗体共价结合。对于例示性目的，将本文中提供的表中公开的半胱氨酸改造抗体缀合至美登木素生物碱药物，具体是mmae。抗体-药物缀合物(adc)化合物的典型实施方案包含半胱氨酸改造抗体(ab)和药物模块(d)，其中抗体具有一个或多个游离半胱氨酸氨基酸，并且抗体通过接头模块(l)经由一个或多个游离半胱氨酸氨基酸附着至d；该组成具有式i：ab-(l-d)pi其中p为1，2，3或4。可以通过硫醇反应接头模块与抗体分子缀合的药物模块的数量受到通过本文所述方法引入的半胱氨酸残基数量的限制。式i的典型adc由此包含具有1，2，3或4个改造的半胱氨酸氨基酸的抗体。抗体-药物缀合物化合物(adc)的另一个典型实施方案包含半胱氨酸改造抗体(ab)，清蛋白-结合肽(abp)和药物模块(d)，其中抗体通过接头模块(l)与药物模块结合并且抗体通过酰胺键或第二种接头模块与清蛋白-结合肽结合；该组成具有式ia:abp-ab-(l-d)pia其中p为1，2，3或4。本发明的adc化合物包括那些用于抗癌活性的化合物。特别地，化合物包括与药物模块，即毒素，通过接头与之缀合，即与之共价结合的半胱氨酸-改造的抗体。当所述药物不与抗体缀合时，药物具有细胞毒性或抑制细胞效应。由此通过与抗体缀合调节药物模块的生物学活性。本发明的抗体-药物缀合物(adc)将有效剂量的细胞毒性剂选择性地递送至肿瘤组织，由此可以实现更大的选择性，即较低的效应剂量(efficaciousdose)。药物模块抗体-药物缀合物(adc)的药物模块(d)包括具有细胞毒性或抑制细胞效应的任意化合物，模块(moiety)或基团。药物模块包括：(i)可以起微管蛋白抑制剂，有丝分裂抑制剂，拓扑异构酶抑制剂或dna嵌入剂作用的化疗剂；(ii)可以通过酶促方式起作用的蛋白毒素；和(iii)放射性同位素。典型的药物模块包括，但不限于美登木素生物碱，奥瑞司他汀，多拉司他汀(dolastatin)，单端孢霉烯(trichothecene)，cc1065，加利车霉素(calicheamicin)和其它烯二炔类(enediyne)抗生素，紫杉烷(taxane)，吡咯并苯并二氮杂卓(pbd)，1-(氯甲基)-2,3-二氢-1h-苯并[e]吲哚(cbi)二聚体，cbi-pbd异二聚体，蒽环类抗生素(anthracycline)及其立体异构体，同电子排列体(isostere)，类似物或衍生物。适合于用作美登木素生物碱药物模块的美登素化合物为本领域众所周知并且可以按照公知方法分离自天然来源，使用遗传工程技术生产(参见yu等(2002)proc.nat.acad.sci.(usa)99:7968-7973)或按照已知方法通过合成制备的美登醇和美登醇类似物。典型的美登木素生物碱药物模块包括那些具有修饰的芳族环的，诸如：c-19-去氯(us4256746)(通过ansamytocinp2的氢化铝锂还原制备)；c-20-羟基(或c-20-去甲基)+/-c-19-去氯(美国专利no.4,361,650和4,307,016)(通过使用链霉菌属(streptomyces)或放线菌属(actinomyces)脱甲基化或使用lah脱氯制备)；和c-20-去甲氧基，c-20-酰氧基(ocor)，+/-去氯(美国专利no.4,294,757)(通过使用酰基氯酰化制备)和那些在其它位置上具有修饰的。典型的美登木素生物碱药物模块还包括那些具有诸如如下修饰的：c-9-sh(us4424219)(通过使美登醇与h2s或p2s5反应制备)；c-14-烷氧基甲基(去甲氧基/ch2or)(us4331598)；c-14-羟甲基或酰氧基甲基(ch2oh或ch2oac)(us4450254)(由nocardia制备)；c-15-羟基/酰氧基(us4364866)(通过由链霉菌属转化美登醇制备)；c-15-甲氧基(us4313946和4315929)(分离自trewianudlflora)；c-18-n-去甲基(us4362663和4322348)(通过用链霉菌属使美登醇脱甲基化制备)；和4,5-脱氧(us4371533)(通过美登醇的三氯化酞/lah还原制备)。已知美登素化合物上的许多位置用作连接位置，这取决于连接的类型。例如，为了形成酯键，具有羟基的c-3位，用羟甲基修饰的c-14位，用羟基修饰的c-15位和具有羟基的c-20位均是合适的。式i的抗体-药物缀合物(adc)的药物模块(d)包括具有如下结构的美登木素生物碱：其中波状线表示d的硫原子与抗体-药物缀合物(adc)的接头(l)共价结合。r可以独立为h或c1-c6烷基，所述的c1-c6烷基选自甲基，乙基，1-丙基，2-丙基，1-丁基，2-甲基-1-丙基，2-丁基，2-甲基-2-丙基，1-戊基，2-戊基，3-戊基，2-甲基-2-丁基，3-甲基-2-丁基，3-甲基-1-丁基，2-甲基-1-丁基，1-己基，2-己基，3-己基，2-甲基-2-戊基，3-甲基-2-戊基，4-甲基-2-戊基，3-甲基-3-戊基，2-甲基-3-戊基，2,3-二甲基-2-丁基和3,3-二甲基-2-丁基。使酰胺基与硫原子结合的亚烷基链可以为甲烷基(methanyl)，乙烷基(ethanyl)或丙基，即m为1，2或3。美登素化合物通过抑制有丝分裂过程中的微管蛋白形成抑制细胞增殖，所述的抑制有丝分裂过程中的微管蛋白形成通过抑制微管蛋白，即微管素的聚合来进行(remillard等(1975)science189:1002-1005)。美登素和美登木素生物碱具有高度毒性，但其在癌症疗法中的临床应用因其主要由于对肿瘤的选择性差导致的严重的全身副作用而非常有限。因对中枢神经系统和胃肠系统的严重不良作用而已中断了使用美登素的临床试验(issel等(1978)can.treatment.rev.5:199-207)。美登木素生物碱药物模块为抗体-药物缀合物中有吸引力的药物模块，因为它们：(i)相对易于接近以便通过发酵或化学修饰，衍生发酵产物来制备；(ii)易于使用适合于通过非二硫化物接头与抗体缀合的官能基衍生；(iii)在血浆中稳定；和(iv)对多种肿瘤细胞系有效(us2005/0169933；wo2005/037992；us5208020)。作为其它药物模块，对本发明的化合物而言，关注美登木素生物碱药物模块的所有立体异构体，即在d的手性碳上的r和s构型的任意组合。在一个实施方案中，美登木素生物碱药物模块(d)具有下列立体化学：美登木素生物碱药物模块的典型实施方案包括:dm1，(cr2)m＝ch2ch2；dm3，(cr2)m＝ch2ch2ch(ch3)；和dm4，(cr2)m＝ch2ch2c(ch3)2，它们具有如下结构：根据连接类型的不同，接头可以在不同位置上与美登木素生物碱分子结合。例如，可以通过使用常规偶联技术与羟基反应形成酯键。该反应可以在具有羟基的c-3位置，使用羟甲基修饰的c-14位置，使用羟基修饰的c-15位置和具有羟基的c-20上进行。在一个优选的实施方案中，所述键在美登醇或美登醇类似物的c-3位置上形成。式i的抗体-药物缀合物(adc)的药物模块(d)还包括多拉司他汀及其肽类似物和衍生物奥瑞司他汀(美国专利us5635483；5780588)。已经证实多拉司他汀和奥瑞司他汀可干扰微管动力学，gtp水解以及核和细胞分裂(woyke等(2001)antimicrob.agentsandchemother.45(12):3580-3584)并且具有抗癌(us5663149)和抗真菌活性(pettit等(1998)antimicrob.agentschemother.42:2961-2965)。多拉司他汀或奥瑞司他汀药物模块的不同形式可以通过肽药物模块的n(氨基)末端或c(羧基)末端与抗体共价结合(wo02/088172；doronina等(2003)naturebiotechnology21(7):778-784；francisco等(2003)blood102(4):1458-1465)。药物模块包括多拉司他汀，奥瑞司他汀(us5635483；us5780588；us5767237；us6124431)及其类似物和衍生物。已经证实多拉司他汀和奥瑞司他汀可干扰微管动力学，gtp水解以及核和细胞分裂(woyke等(2001)antimicrob.agentsandchemother.45(12):3580-3584)并且具有抗癌(us5663149)和抗真菌活性(pettit等(1998)antimicrob.agentschemother.42:2961-2965)。多拉司他汀或奥瑞司他汀药物模块可以通过肽药物模块的n(氨基)末端或c(羧基)末端与抗体结合(wo02/088172)。典型奥瑞司他汀实施方案包括n-末端连接的单甲基奥瑞司他汀药物模块de和df，其披露在下列文献中：us7498298和us7659241，特别将这些文献各自全部披露的内容引入本文作为参考。式i的抗体-药物缀合物(adc)的药物模块(d)包括通过n-末端与抗体连接的单甲基奥瑞司他汀药物模块mmae和mmaf，并且具有如下结构：例示性mmaeadc显示于图11和12。一般而言，可以通过在两种或多种氨基酸和/或肽片段之间形成肽键制备基于肽的药物模块。例如，可以按照肽化学领域众所周知的液相合成法制备这类肽键(参见e.和k.lübke,“thepeptides”,volume1,pp76-136,1965,academicpress)。药物模块包括加利车霉素及其类似物和衍生物。加利车霉素族抗生素能够产生亚-皮摩尔浓度的双链dna断裂。为了制备加利车霉素族抗生素的缀合物，参见us5712374；us5714586；us5739116；us5767285；us5770701,us5770710；us5773001；us5877296。可以使用的加利车霉素的结构类似物包括，但不限于γ1i，α2i，α3i，n-乙酰基-γ1i，psag和θi1(hinman等cancerresearch53:3336-3342(1993),lode等cancerresearch58:2925-2928(1998)。在一些实施方案中，adc包含吡咯并苯并二氮杂卓(pbd)。在一些实施方案中，pdb二聚体识别并结合特定dna序列。天然产物安曲霉素(anthramycin)(一种pbd)首次报告于1965年(leimgruberetal.(1965)j.am.chem.soc.87:5793-5795；leimgruberetal.(1965)j.am.chem.soc.87:5791-5793)。自此以后，报告了一些pbd(天然发生的和类似物二者)(thurstonetal.(1994)chem.rev.1994，433-465)，包括三环pbd支架的二聚体(us6,884,799；us7,049,311；us7,067,511；us7,265,105；us7,511,032；us7,528,126；us7,557,099)。并非意图限于任何特定理论，认为二聚体结构赋予适宜的三维形状以实现与b型dna的小沟的同螺旋度(isohelicity)，导致在结合位点处的紧密贴合(kohn，inantibioticsiii.springer-verlag，newyork，pp.3-11(1975)；hurleyandneedham-vandevanter(1986)acc.chem.res.19:230-237)。携带c2芳基取代基的二聚pbd化合物已经显示出作为细胞毒剂是有用的(hartleyetal.(2010)cancerres.70(17):6849-6858；antonow(2010)j.med.chem.53(7):2927-2941；howardetal.(2009)bioorganicandmed.chem.letters19(22):6463-6466)。在一些实施方案中，可采用pbd化合物作为药物前体，这通过用在体内可移除的氮保护基团在n10位置处保护它们来实现(wo00/12507；wo2005/023814)。在一些实施方案中，免疫缀合物包含缀合至一个或多个加利车霉素分子的抗体。抗生素的加利车霉素家族及其类似物能够以亚皮摩尔浓度生成双链dna断裂(hinmanetal.，(1993)cancerresearch53:3336-3342；lodeetal.，(1998)cancerresearch58:2925-2928)。加利车霉素具有细胞内作用位点，但是在某些情况中，不容易穿过质膜。因此，在一些实施方案中，这些药剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取可能大大增强它们的细胞毒效应。制备具有加利车霉素药物模块的抗体-药物缀合物的非限制性例示性方法记载于例如us5,712,374；us5,714,586；us5,739,116；和us5,767,285。在一些实施方案中，缀合至抗体的加利车霉素药物模块为具有下式的化合物：其中x为br或i；l为接头；r为氢，c1-6烷基，或-c(＝o)c1-6烷基；且ra为氢或c1-6烷基。在一些实施方案中，x为br，ra为氢且r为异丙基。在其它实施方案中，x为br，ra为氢且r为乙基。在其它实施方案中，x为i，ra为氢且r为异丙基。在其它实施方案中，x为i，ra为氢且r为乙基。在一些实施方案中，x为br，ra为氢且r为-c(＝o)ch3。在其它实施方案中，x为i，ra为氢且r为-c(＝o)ch3。在其它实施方案中，x为i，ra为乙基且r为-c(＝o)ch3。在其它实施方案中，x为br，ra为乙基且r为-c(＝o)ch3。已经将pbd二聚体缀合至抗体，而且所得adc显示出具有抗癌特性(us2010/0203007)。pbd二聚体上的非限制性例示性连接位点包括五元吡咯环，pbd单元之间的系链，和n10-c11亚胺基团(wo2009/016516；us2009/304710；us2010/047257；us2009/036431；us2011/0256157；wo2011/130598)。在一些实施方案中，adc包含吡咯并苯并二氮杂卓(pbd)。在一些实施方案中，pdb二聚体识别并结合特定dna序列。天然产物安曲霉素(anthramycin)(一种pbd)首次报告于1965年(leimgruberetal.(1965)j.am.chem.soc.87:5793-5795；leimgruberetal.(1965)j.am.chem.soc.87:5791-5793)。自此以后，报告了一些pbd(天然发生的和类似物二者)(thurstonetal.(1994)chem.rev.1994，433-465)，包括三环pbd支架的二聚体(us6,884,799；us7,049,311；us7,067,511；us7,265,105；us7,511,032；us7,528,126；us7,557,099)。并非意图限于任何特定理论，认为二聚体结构赋予适宜的三维形状以实现与b型dna的小沟的同螺旋度(isohelicity)，导致在结合位点处的紧密贴合(kohn，inantibioticsiii.springer-verlag，newyork，pp.3-11(1975)；hurleyandneedham-vandevanter(1986)acc.chem.res.19:230-237)。携带c2芳基取代基的二聚pbd化合物已经显示出作为细胞毒剂是有用的(hartleyetal.(2010)cancerres.70(17):6849-6858；antonow(2010)j.med.chem.53(7):2927-2941；howardetal.(2009)bioorganicandmed.chem.letters19(22):6463-6466)。在一些实施方案中，可采用pbd化合物作为药物前体，这通过用在体内可移除的氮保护基团在n10位置处保护它们来实现(wo00/12507；wo2005/023814)。adc的非限制性例示性pbd二聚体构件为式a：及其盐和溶剂合物，其中：波形线表示共价附着至接头的位点；虚线表示c1与c2或c2与c3之间任选存在双键；r2独立地选自h，oh，＝o，＝ch2，cn，r，or，＝ch-rd，＝c(rd)2，o-so2-r，co2r和cor，且任选还选自卤素或二卤素，其中rd独立地选自r，co2r，cor，cho，co2h，和卤素；r6和r9独立地选自h，r，oh，or，sh，sr，nh2，nhr，nrr’，no2，me3sn和卤素；r7独立地选自h，r，oh，or，sh，sr，nh2，nhr，nrr’，no2，me3sn和卤素；q独立地选自o，s和nh；r11或为h，或为r，或在q为o的情况下为so3m，其中m为金属阳离子；r和r’各自独立地选自任选取代的c1-8烃基，c1-12烃基，c3-8杂环基，c3-20杂环，和c5-20芳基基团，且任选涉及基团nrr’时，r和r’与它们所附着的氮原子一起形成任选取代的4，5，6或7元杂环环；r12，r16，r19和r17分别如为r2，r6，r9和r7定义的；r”为c3-12亚烃基基团，该链可以由一个或多个杂原子(例如o，s，n(h)，nme)和/或芳香环(例如苯或吡啶)(该环是任选取代的)中断；且x和x’独立地选自o，s和n(h)。在一些实施方案中，r和r’各自独立选自任选取代的c1-12烃基，c3-20杂环，和c5-20芳基，且任选涉及基团nrr’时，r和r’与它们所附着的氮原子一起形成任选取代的4，5，6或7元杂环环。在一些实施方案中，r9和r19为h。在一些实施方案中，r6和r16为h。在一些实施方案中，r7和r17均为or7a，其中r7a为任选取代的c1-4烃基。在一些实施方案中，r7a为me。在一些实施方案中，r7a为ch2ph，其中ph为苯基基团。在一些实施方案中，x为o。在一些实施方案中，r11为h。在一些实施方案中，每一个单体单元中的c2与c3之间存在双键。在一些实施方案中，r2和r12独立选自h和r。在一些实施方案中，r2和r12独立为r。在一些实施方案中，r2和r12独立为任选取代的c5-20芳基或c5-7芳基或c8-10芳基。在一些实施方案中，r2和r12独立为任选取代的苯基，噻吩基，萘基，吡啶基，喹啉基，或异喹啉基。在一些实施方案中，r2和r12独立选自＝o，＝ch2，＝ch-rd，和＝c(rd)2。在一些实施方案中，r2和r12各自为＝ch2。在一些实施方案中，r2和r12各自为h。在一些实施方案中，r2和r12各自为＝o。在一些实施方案中，r2和r12各自为＝cf2。在一些实施方案中，r2和/或r12独立为＝c(rd)2。在一些实施方案中，r2和/或r12独立为＝ch-rd。在一些实施方案中，当r2和/或r12为＝ch-rd时，每一个基团可独立具有下文所示任一构型：在一些实施方案中，一个＝ch-rd处于构型(i)。在一些实施方案中，r”为c3亚烃基基团或c5亚烃基基团。在一些实施方案中，adc的一种例示性pbd二聚体构件具有式a(i)的结构：其中n为0或1。在一些实施方案中，adc的一种例示性pbd二聚体构件具有式a(ii)的结构：其中n为0或1。在一些实施方案中，adc的一种例示性pbd二聚体构件具有式a(iii)的结构：其中re和re”各自独立选自h或rd，其中rd如上文定义的；且其中n为0或1。在一些实施方案中，n为0。在一些实施方案中，n为1。在一些实施方案中，re和/或re”为h。在一些实施方案中，re和re”为h。在一些实施方案中，re和/或re”为rd，其中rd为任选取代的c1-12烃基。在一些实施方案中，re和/或re”为rd，其中rd为甲基。在一些实施方案中，adc的一种例示性pbd二聚体构件具有式a(iv)的结构：其中ar1和ar2各自独立为任选取代的c5-20芳基；其中ar1和ar2可以是相同的或不同的；且其中n为0或1。在一些实施方案中，adc的一种例示性pbd二聚体构件具有式a(v)的结构：其中ar1和ar2各自独立为任选取代的c5-20芳基；其中ar1和ar2可以是相同的或不同的；且其中n为0或1。在一些实施方案中，ar1和ar2各自独立选自任选取代的苯基，呋喃基，硫苯基和吡啶基。在一些实施方案中，ar1和ar2各自独立为任选取代的苯基。在一些实施方案中，ar1和ar2各自独立为任选取代的噻吩-2-基或噻吩-3-基。在一些实施方案中，ar1和ar2各自独立为任选取代的喹啉基或异喹啉基。喹啉基或异喹啉基基团可以经由任何可利用环位置结合至pbd核。例如，喹啉基可以是喹啉-2-基，喹啉-3-基，喹啉-4-基，喹啉-5-基，喹啉-6-基，喹啉-7-基和喹啉-8-基。在一些实施方案中，喹啉基选自喹啉-3-基和喹啉-6-基。异喹啉基可以是异喹啉-1-基，异喹啉-3-基，异喹啉-4-基，异喹啉-5-基，异喹啉-6-基，异喹啉-7-基和异喹啉-8-基。在一些实施方案中，异喹啉基选自异喹啉-3-基和异喹啉-6-基。adc的别的非限制性例示性pbd二聚体构件为式b：及其盐和溶剂合物，其中：波形线表示共价附着至接头的位点；连接至oh的波形线表示s或r构型；rv1和rv2独立选自h，甲基，乙基和苯基(苯基可以是任选用氟取代的，特别是在4位)和c5-6杂环基；其中rv1和rv2可以是相同的或不同的；且n为0或1。在一些实施方案中，rv1和rv2独立选自h，苯基，和4-氟苯基。在一些实施方案中，接头可附着于pbd二聚体药物模块的多个位点之一，包括b环的n10亚胺，c环的c-2内/外位，或连接a环的系链单元(见下文结构c(i)和c(ii))。adc的非限制性例示性pbd二聚体构件包括式c(i)和c(ii)：式c(i)和c(ii)以它们的n10-c11亚胺形式显示。例示性pbd药物模块还包括甲醇胺以及受到保护的甲醇胺形式，如下文表中显示的：其中：x为ch2(n＝1至5)，n，或o；z和z’独立选自or和nr2，其中r为含有1至5个碳原子的伯，仲或叔烃基链；r1，r’1，r2和r’2各自独立选自h，c1-c8烷基，c2-c8烯基，c2-c8炔基，c5-20芳基(包括取代的芳基)，c5-20杂芳基基团，-nh2，-nhme，-oh，和-sh，其中，在一些实施方案中，烷基，烯基和炔基链包含多至5个碳原子；r3和r’3独立选自h，or，nhr，和nr2，其中r为含有1至5个碳原子的伯，仲或叔烃基链；r4和r’4独立选自h，me，和ome；r5选自c1-c8烷基，c2-c8烯基，c2-c8炔基，c5-20芳基(包括用卤素，硝基，氰基，烃氧基，烃基，杂环基取代的芳基)和c5-20杂芳基基团，其中，在一些实施方案中，烷基，烯基和炔基链包含多至5个碳原子；r11为h，c1-c8烃基，或保护基团(诸如乙酰基，三氟乙酰基，叔丁氧羰基(boc)，苄氧羰基(cbz)，9-芴基甲基烯酰基羰基(fmoc)，或包含自我牺牲单元的模块诸如缬氨酸-瓜氨酸-pab)；r12为h，c1-c8烃基，或保护基团；其中r1，r’1，r2，r’2，r5，或r12之一的一个氢或a环之间的-och2ch2(x)nch2ch2o-间隔物的一个氢用连接至adc的接头的键替换。adc的例示性pdb二聚体部分包括但不限于(波形线表示共价附着至接头的位点)：pbd二聚体。包含pbd二聚体的adc的非限制性例示性实施方案具有下示结构：pbd二聚体-val-cit-pab-ab；pbd二聚体-phe-lys-pab-ab，其中：n为0至12。在一些实施方案中，n为2至10。在一些实施方案中，n为4至8。在一些实施方案中，n选自4，5，6，7，和8。在一些实施方案中，本文所述包含pbd二聚体的adc可以通过将包括吡啶离去基团的接头-药物中间体经由硫原子与抗体的半胱氨酸硫醇缀合以形成二硫化物连接来生成。进一步地，在一些实施方案中，本文所述包含pbd二聚体的adc可以通过缀合包括硫代吡啶基离去基团的接头-药物中间体来生成，其中吡啶环是用一个或多个硝基基团取代的。在一些实施方案中，吡啶环是用-no2单取代的。在一些实施方案中，-no2单取代相对于二硫化物是对位的。在一些实施方案中，pbd二聚体是经由n10位置连接的。例如，非限制性的例示性的包含pbd二聚体的adc可以通过将单甲基乙基吡啶基二硫化物，n10连接的pbd接头中间体(下文所示)缀合至抗体来生成：pbd二聚体-val-cit-pab-ab和pbd二聚体-phe-lys-pab-ab的接头是蛋白酶可切割的，而pbd二聚体-马来酰亚胺-乙缩醛的接头是酸不稳定的。pbd二聚体和包含pbd二聚体的adc可依照本领域已知方法来制备。参见例如wo2009/016516；us2009/304710；us2010/047257；us2009/036431；us2011/0256157；wo2011/130598；wo2013/055987。在一些实施方案中，adc包含蒽环类抗生素。蒽环类抗生素是展现细胞毒性活性的抗生化合物。并非意图限于任何特定理论，研究已经指出蒽环类抗生素可通过多种不同机制运作来杀伤细胞，包括：1)将药物分子插入细胞的dna中，由此抑制dna依赖性核酸合成；2)由药物生成自由基，然后自由基与细胞高分子反应以引起对细胞的损害，和/或3)药物分子与细胞膜相互作用(参见例如c.petersonetal.，“transportandstorageofanthracyclineinexperimentalsystemsandhumanleukemia”inanthracyclineantibioticsincancertherapy；n.r.bachur，“freeradicaldamage”id.atpp.97-102)。由于它们的细胞毒性潜力，蒽环类抗生素已经用于治疗众多癌症，诸如白血病，乳腺癌，肺癌，卵巢腺癌和肉瘤(参见例如p.h-wiernik，inanthracycline：currentstatusandnewdevelopmentsp11)。非限制性例示性蒽环类抗生素包括多柔比星，表柔比星，伊达比星，道诺霉素，奈莫柔比星，及其衍生物。已经制备并研究柔红霉素和多柔比星的免疫缀合物和药物前体(kratzetal.(2006)currentmed.chem.13:477-523；jeffreyetal.(2006)bioorganic&med.chem.letters16:358-362；torgovetal.(2005)bioconj.chem.16:717-721；nagyetal.(2000)proc.natl.acad.sci.usa97:829-834；dubowchiketal.(2002)bioorg.&med.chem.letters12:1529-1532；kingetal.(2002)j.med.chem.45:4336-4343；ep0328147；us6,630,579)。抗体-药物缀合物br96-多柔比星与肿瘤相关抗原lewis-y特异性反应，而且已经在i和ii期研究中进行评估(salehetal.(2000)j.clin.oncology18:2282-2292；ajanietal.(2000)cancerjour.6:78-81；tolcheretal.(1999)j.clin.oncology17:478-484)。pnu-159682是一种有力的奈莫柔比星代谢物(或衍生物)(quintierietal.(2005)clinicalcancerresearch11(4):1608-1617)。奈莫柔比星是多柔比星的一种半合成类似物，在多柔比星的糖苷氨基上具有2-甲氧基吗啉基团，而且已经处于临床评估(grandietal.(1990)cancertreat.rev.17:133；ripamontietal.(1992)brit.j.cancer65:703)，包括针对肝细胞癌瘤的ii/iii期试验(sunetal.(2003)proceedingsoftheamericansocietyforclinicaloncology22，abs1448；quintieri(2003)proceedingsoftheamericanassociationofcancerresearch44:1sted，abs4649；pacciarinietal.(2006)jour.clin.oncology24:14116)。包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物的一种非限制性例示性adc如式ia所示：其中r1为氢原子，羟基或甲氧基基团且r2为c1-c5烃氧基基团，或其药学可接受盐；l1和z一起为本文所述接头(l)；t为本文所述抗体(ab)；且m为1至约20。在一些实施方案中，m为1至10，1至7，1至5，或1至4。在一些实施方案中，r1和r2二者为甲氧基(-ome)。包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物的又一种非限制性例示性adc如式ib所示：其中r1为氢原子，羟基或甲氧基基团且r2为c1-c5烃氧基基团，或其药学可接受盐；l2和z一起为本文所述接头(l)；t为本文所述抗体(ab)；且m为1至约20。在一些实施方案中，m为1至10，1至7，1至5，或1至4。在一些实施方案中，r1和r2二者为甲氧基(-ome)。在一些实施方案中，含奈莫柔比星的adc的奈莫柔比星构件为pnu-159682。在一些此类实施方案中，adc的药物部分可具有下示结构之一：其中波形线表示附着至接头(l)。可以经由数个连接位点和多种接头(us2011/0076287；wo2009/099741；us2010/0034837；wo2010/009124)(包括本文所述接头)将蒽环类抗生素(包括pnu-159682)缀合至抗体。包含奈莫柔比星和接头的例示性adc包括但不限于：pnu-159682马来酰亚胺乙缩醛-ab；pnu-159682-val-cit-pab-ab；pnu-159682-val-cit-pab-间隔物-ab；pnu-159682-val-cit-pab-间隔物(r1r2)-ab，其中：r1和r2独立选自h和c1-c6烃基；和pnu-159682-马来酰亚胺-ab。pnu-159682马来酰亚胺乙缩醛-ab的接头是酸不稳定的，而pnu-159682-val-cit-pab-ab，pnu-159682-val-cit-pab-间隔物-ab，和pnu-159682-val-cit-pab-间隔物(r1r2)-ab的接头是蛋白酶可切割的。例示性pnuadc显示于图10d和10e。在一些实施方案中，adc包含1-(氯甲基)-2,3-二氢-1h-苯并[e]吲哚(cbi)。5-氨基-1-(氯甲基)-1,2-二氢-3h-苯并[e]吲哚(氨基cbi)类的dna小沟烷化剂是有力的细胞毒素(atwelletal.(1999)j.med.chem.,42:3400)，而且已经作为效应器单元用于为癌症疗法设计的多类前体药物。这些包括抗体缀合物(jeffreyetal.(2005)j.med.chem.,48:1344)，基于氨基甲酸硝基苄酯的用于基因疗法的前体药物(hayetal.(2003)j.med.chem.46:2456)和作为缺氧活化的前体药物的相应硝基cbi衍生物(terceletal.(2011)angew.chem.,int.ed.,50:2606-2609)。已经通过烷基链将cbi和吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂卓(pbd)药效团连接到一起(terceletal.(2003)j.med.chem46:2132-2151)。在一些实施方案中，adc包含1-(氯甲基)-2,3-二氢-1h-苯并[e]吲哚(cbi)二聚体(wo2015/023355)。一种例示性cbi二聚体adc显示于图10b。在一些此类实施方案中，该二聚体为异二聚体，其中该二聚体的一半为cbi模块且该二聚体的另一半为pbd模块。一种例示性cbi-pbd异二聚体adc显示于图10c。在一些实施方案中，cbi二聚体包含式：其中r1选自h，p(o)3h2，c(o)nrarb，或与接头(l)的键；r2选自h，p(o)3h2，c(o)nrarb，或与接头(l)的键；ra和rb独立选自h和任选用一个或多个f取代的c1-c6烷基，或者ra和rb形成五或六元杂环基基团；t为选自c3-c12亚烷基，y，(c1-c6亚烷基)-y-(c1-c6亚烷基)，(c1-c6亚烷基)-y-(c1-c6亚烷基)-y-(c1-c6亚烷基)，(c2-c6亚烯基)-y-(c2-c6亚烯基)，和(c2-c6亚炔基)-y-(c2-c6亚炔基)的拴系基团；其中y独立选自o，s，nr1，芳基，和杂芳基；其中亚烷基，亚烯基，芳基，和杂芳基是独立且任选用f，oh，o(c1-c6烷基)，nh2，nhch3，n(ch3)2，op(o)3h2，和c1-c6烷基取代的，其中烷基是任选用一个或多个f取代的；或者亚烷基，亚烯基，芳基，和杂芳基是独立且任选用与l的键取代的；d′为药物模块，其选自：其中波状线表示附着至t的位点；x1和x2独立选自o和nr3，其中r3选自h和任选用一个或多个f取代的c1-c6烷基；r4为h，co2r，或与接头(l)的键，其中r为c1-c6烷基或苄基；且r5为h或c1-c6烷基。在一些实施方案中，免疫缀合物包含缀合一个或多个鹅膏蕈毒素分子的抗体。鹅膏蕈毒素是由8个氨基酸构成的环肽。它们可以自蘑菇鬼笔鹅膏(amanitaphalloides)分离或合成制备。鹅膏蕈毒素特异性抑制哺乳动物细胞的dna依赖性rna聚合酶ii，并由此还抑制受影响细胞的转录和蛋白质合成。细胞中对转录的抑制引起生长和增殖停止。见例如moldenhaueretal.jnci104:1-13(2012)，wo2010115629，wo2012041504，wo2012119787，wo2014043403，wo2014135282，和wo2012119787，在此通过援引将它们完整收录。在一些实施方案中，一个或多个鹅膏蕈毒素分子是一个或多个α-鹅膏蕈毒素分子。其它药物模块包括蛋白毒素，诸如：白喉毒素a链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素a链(来自铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa))，蓖麻毒蛋白a链(ricinachain)(vitetta等(1987)science,238:1098)，相思豆毒蛋白a链(abrinachain)，蒴莲根毒蛋白a链(modeccinachain)，α-帚曲霉素(alpha-sarcin)，油桐(aleuritesfordii)毒蛋白，香石竹毒蛋白(dianthinproteins)，美洲商陆(phytolacaamericana)毒蛋白(papi，papii和pap-s)，苦瓜(momordicacharantia)抑制物，麻疯树毒蛋白(curcin)，巴豆毒蛋白(crotin)，肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制物，白树毒蛋白(gelonin)，丝林霉素(mitogellin)，局限曲菌素(restrictocin)，酚霉素(phenomycin)，依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(tricothecenes)(wo93/21232)。应当理解，在多于一个亲核基团与药物-接头中间体或与接头试剂反应的情况中，所得产物是具有一个或多个药物模块附着于抗体之分布的adc化合物混合物。可通过对抗体特异性的和对药物特异性的双重elisa抗体测定法自混合物计算每个抗体的平均药物数(dar)。混合物中的各种adc分子可通过质谱术来鉴定，并通过hplc来分离，例如疏水相互作用层析(参见例如mcdonaghetal.(2006)prot.engr.design&selection19(7):299-307；hamblettetal.(2004)clin.cancerres.10:7063-7070；hamblett，k.j.etal.，“effectofdrugloadingonthepharmacology，pharmacokinetics，andtoxicityofananti-cd30antibody-drugconjugate,”abstractno.624，americanassociationforcancerresearch，2004annualmeeting，march27-31，2004，proceedingsoftheaacr，volume45，march2004；alley，s.c.etal.，“controllingthelocationofdrugattachmentinantibody-drugconjugates,”abstractno.627，americanassociationforcancerresearch，2004annualmeeting，march27-31，2004，proceedingsoftheaacr，volume45，march2004)。在某些实施方案中，可通过电泳或层析自缀合混合物分离具有单一载荷值的同质adc。表18的抗体-药物缀合物51-58(见实施例16)可以通过依照wo2013/055987；wo2015/023355；wo2010/009124；wo2015/095227的规程偶联药物模块与接头试剂，并与本文所述任何抗体，包括半胱氨酸改造抗体缀合来制备。具体的抗体-药物缀合物记载于表19(见实施例16)。药物模块还包括具有核酸降解活性的化合物(例如核糖核酸酶或dna内切核酸酶)。治疗放射性同位素包括：32p，33p，90y，125i，131i，131in，153sm，186re，188re，211at，212bi，212pb和lu的放射性同位素。可以按照公知方式将放射性同位素或其它标记掺入缀合物(fraker等(1978)biochem.biophys.res.commun.80:49-57；"monoclonalantibodyinimmunoscintigraphy"chatal,crcpress1989)。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲二乙烯三胺五乙酸(mx-dtpa)为用于放射性核素与抗体缀合的典型螯合剂(wo94/11026)。别的adc的具体例子呈现于实施例16。接头“接头”(l)为可用于连接一个或多个药物模块(d)与抗体(ab)以形成式i的抗体-药物缀合物(adc)的双官能或多官能模块。在一些实施方案中，可以使用具有用于共价附着至药物和抗体的反应性官能基的接头制备抗体-药物缀合物(adc)。例如，在一些实施方案中，抗体(ab)的半胱氨酸硫醇可以与接头或药物-接头中间体的反应性官能基形成键以生成adc。一方面，接头具有能够与抗体上存在的游离半胱氨酸反应以形成共价键的官能度。非限制性例示性此类反应性官能度包括马来酰亚胺，卤代乙酰胺，α-卤代乙酰基，活化的酯诸如琥珀酰亚胺酯，4-硝基苯基酯，五氟苯基酯，四氟苯基酯，酸酐，氯化酸，磺酰氯，异氰酸酯，和异硫氰酸酯。参见例如klussmanetal.(2004)bioconjugatechemistry15(4):765-773第766页上的缀合方法及本文中的实施例。在一些实施方案中，接头具有能够与抗体上存在的亲电子基团反应的官能度。例示性此类亲电子基团包括但不限于醛和酮羰基。在一些实施方案中，接头的反应性官能度的杂原子能与抗体上的亲电子基团反应并与抗体单元形成共价键。非限制性例示性此类反应性官能度包括但不限于酰肼(hydrazide)，肟(oxime)，氨基(amino)，肼(hydrazine)，硫代半卡巴腙(thiosemicarbazone)，肼羧酸酯(hydrazinecarboxylate)，和芳酰肼(arylhydrazide)。接头可包含一种或多种接头构件。例示性接头构件包括6-马来酰亚胺基己酰基(“mc”)，马来酰亚胺基丙酰基(“mp”)，缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)，丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)，对氨基苄氧羰基(“pab”)，n-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(“spp”)，和4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1羧酸酯(“mcc”)。本领域已知多种接头构件，下文描述了其中一些。接头可以是便于释放药物的“可切割接头”。非限制性例示性可切割接头包括酸不稳定接头(例如包含腙)，蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接头，光不稳定接头，或含二硫化物接头(charietal.(1992)cancerresearch52:127-131；us5,208,020)。在某些实施方案中，接头具有下示式ii：-aa-ww-yy-ii，其中a为“延伸物单元”(stretcherunit)，而a为0至1的整数；w为“氨基酸单元”，而w为0至12的整数；y为“间隔物单元”(spacerunit)，而y是0，1，或2；且ab，d，和p如上文关于式i定义的。此类接头的例示性实施方案记载于美国专利no.7,498,298，通过述及明确将其收入本文。在一些实施方案中，接头构件包含将抗体连接至另一接头构件或药物模块的“延伸物单元”。非限制性例示性延伸物单元显示于下文(其中波形线指示共价附着至抗体，药物，或别的接头构件的位点)：在一些实施方案中，接头可以是肽模拟物接头，诸如wo2015/095227，wo2015/095124或wo2015/095223中记载的那些，在此通过援引完整收录这些文件。一方面，接头具有反应位置，该位置上带有与存在于抗体上的亲核半胱氨酸反应的亲电子基团。抗体的半胱氨酸硫醇与接头上的亲电子基团反应并且与接头形成共价键。有用的亲电子基团包括，但不限于马来酰亚胺和卤代乙酰胺基团。半胱氨酸改造抗体与接头试剂或药物-接头中间体，与亲电子官能基，诸如马来酰亚胺或α-卤代羰基按照klussman等(2004)在bioconjugatechemistry15(4):765-773,766页上的缀合方法和实施例4的方案反应。在又一个实施方案中，接头试剂或药物-接头中间体的反应基含有可以与抗体的游离半胱氨酸硫醇形成键的硫醇-反应性官能基。硫醇-反应官能基的实例包括，但不限于：马来酰亚胺；α-卤代乙酰基；活化的酯类，诸如琥珀酰亚胺酯类，4-硝基苯基酯类，五氟苯基酯类，四氟苯基酯类；酸酐类；酰基氯类；磺酰氯类；异氰酸酯类和异硫氰酸酯类。在另一个实施方案中，接头可以为树枝状类型接头，其用于通过支化多官能接头模块与抗体共价结合一个以上药物模块(sun等(2002)bioorganic&medicinalchemistryletters12:2213-2215；sun等(2003)bioorganic&medicinalchemistry11:1761-1768；king(2002)tetrahedronletters43:1987-1990)。树枝状接头可以增加药物与抗体的摩尔比，即负荷，它与adc的效能相关。因此，如果半胱氨酸改造抗体仅带有一个反应性半胱氨酸硫醇基团，那么可以通过树枝状接头结合众多药物模块。接头可以包含氨基酸残基，其使抗体(ab)与本发明的半胱氨酸改造抗体-药物缀合物(adc)的药物模块(d)连接。氨基酸残基可以形成二肽，三肽，四肽，五肽，六肽，七肽，八肽，九肽，十肽，十一肽或十二肽单元。氨基酸残基包括那些天然存在的以及最小的氨基酸和非-天然存在的氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。可以设计和优化有用的氨基酸残基单元在通过特定的酶，例如肿瘤相关蛋白酶进行酶促裂解中的选择性，以便释放活性药物模块。在一个实施方案中，氨基酸残基单元诸如缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)是其裂解由组织蛋白酶b，c和d或纤维蛋白溶酶蛋白酶催化的单元。接头单元可以是自我牺牲(self-immolative)类型的，诸如对-氨基苄基氨基甲酰基(pab)单元，其中adc具有如下典型结构：其中q为-c1-c8烷基，-o-(c1-c8烷基)，-卤素，-硝基或-氰基；m为0-4的整数；并且p为1-4。自我牺牲的间隔物的其它实例包括，但不限于在带电方式上与pab基团类似的芳族化合物，诸如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(us7375078；hay等(1999)bioorg.med.chem.lett.9:2237)和邻位或对位-氨基苄基乙缩醛类。可以使用在酰胺键水解时进行环化的间隔物，诸如取代和未被取代的4-氨基丁酸酰胺类(rodrigues等(1995)chemistrybiology2:223)，适当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环系(storm等(1972)j.amer.chem.soc.94:5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺类(amsberry,等(1990)j.org.chem.55:5867)。消去在甘氨酸上被取代的含胺的药物(kingsbury等(1984)j.med.chem.27:1447)也是用于adcs的自我牺牲的(self-immolative)间隔物的实例。在另一个实施方案中，接头l可以为用于通过支化多官能接头模块使一种以上药物模块共价结合抗体的树枝状类型的接头(dendritictypelinker)(sun等(2002)bioorganic&medicinalchemistryletters12:2213-2215；sun等(2003)bioorganic&medicinalchemistry11:1761-1768)。树枝状接头可以增加药物与抗体的摩尔比，即负荷，它与adc的效能相关。因此，如果半胱氨酸改造抗体仅带有一个反应性半胱氨酸硫醇基，那么可以通过树枝状接头结合众多药物模块(wo2004/01993；szalai等(2003)j.amer.chem.soc.125:15688-15689；shamis等(2004)j.amer.chem.soc.126:1726-1731；amir等(2003)angew.chem.int.ed.42:4494-4499)。式ia抗体-药物缀合物化合物的实施方案包括(val-cit)，(mc-val-cit)，和(mc-val-cit-pab):式ia抗体-药物缀合物化合物的其它典型实施方案包括以下结构:其中x为：-(ch2)n-，-(ch2ch2o)n-，y为：且r独立为h或c1-c6烷基；并且n为1-12。在另一个实施方案中，接头带有反应性官能基，该反应性官能基具有与存在于抗体上的亲电子基团反应的亲核基团。抗体上有用的亲电子基团包括，但不限于醛和酮羰基。接头的亲核基团的杂原子可以与抗体上的亲电子基团反应并且与抗体单元形成共价键。接头上有用的亲核基团包括，但不限于酰肼，肟，氨基，肼，缩氨基硫脲(thiosemicarbazone)，肼羧酸酯和芳基酰肼。抗体上的亲电子基团提供了用于结合(附着)接头的便利位置。一般而言，可以通过在两种或多种氨基酸和/或肽片段之间形成肽键制备肽-类接头。例如，可以按照肽化学领域众所周知的液相合成法(e.和k.lübke(1965)“thepeptides”,volume1,pp76-136,academicpress)制备这类肽键。在另一个实施方案中，接头可以被调节溶解性或反应性的基团取代。例如，带电荷的取代基，诸如磺酸基(-so3-)或铵可以增加试剂的水溶性并且有利于接头试剂与抗体或药物模块的偶联反应，或有利于ab-l(抗体-接头中间体)与d或d-l(药物-接头中间体)与ab的偶联反应，这取决于用于制备adc的合成途径。特别关注本发明的化合物，但不限于：用如下接头试剂制备的adc：bmpeo，bmps，emcs，gmbs，hbvs，lc-smcc，mbs，mpbh，sbap，sia，siab，smcc，smpb，smph，磺基-emcs，磺基-gmbs，磺基-kmus，磺基-mbs，磺基-siab，磺基-smcc和磺基-smpb以及svsb(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)；并且包括双-马来酰亚胺试剂:dtme，bmb，bmdb，bmh，bmoe，bm(peo)3和bm(peo)4，它们商购自piercebiotechnology,inc.,customerservicedepartment,p.o.box117,rockford,il.61105u.s.a,1-800-874-3723,international+815-968-0747。参见467-498页,2003-2004applicationshandbookandcatalog，双-马来酰亚胺试剂能够使半胱氨酸改造抗体的硫醇基与含硫醇的药物模块，标记或接头中间体按照依次或同时的方式结合。除马来酰亚胺外的其它与半胱氨酸改造抗体，药物模块，标记或接头中间体的硫醇基反应的官能基包括碘乙酰胺，溴乙酰胺，乙烯基吡啶，二硫化物，吡啶基二硫化物，异氰酸酯(盐)和异硫氰酸酯(盐)。还可以通过其它商业渠道，诸如molecularbiosciencesinc.(boulder,co)获得或按照下列文献中所述的操作步骤合成有用的接头试剂：toki等(2002)j.org.chem.67:1866-1872；walker,m.a.(1995)j.org.chem.60:5352-5355；frisch等(1996)bioconjugatechem.7:180-186；us6214345；wo02/088172；us2003130189；us2003096743；wo03/026577；wo03/043583；和wo04/032828。具有马来酰亚胺延伸物和对-氨基苄基氨基甲酰基(pab)自我牺牲的间隔物的典型缬氨酸-瓜氨酸(val-cit或vc)二肽接头试剂具有如下结构：其中q为-c1-c8烷基，-o-(c1-c8烷基)，-卤素，-硝基或-氰基；且m为0-4的整数。可以按照dubowchik等(1997)tetrahedronletters,38:5257-60所述制备具有马来酰亚胺延伸物单元和对-氨基苄基自我牺牲的间隔物的典型phe-lys(mtr)二肽接头试剂并且其具有如下结构：其中mtr为一-4-甲氧基三苯甲基，q为-c1-c8烷基，-o-(c1-c8烷基)，-卤素，-硝基或-氰基；且m为0-4的整数。本发明典型的抗体-药物缀合物化合物包括：其中val为缬氨酸；cit为瓜氨酸；p为1，2，3或4；且ab为半胱氨酸改造抗体。其它典型的抗体-药物缀合物具有如下结构，其中美登木素生物碱药物模块dm1通过bmpeo接头与曲妥珠单抗的硫醇基连接：其中ab为半胱氨酸改造抗体；n为0，1或2；和p为1，2，3或4。抗体-药物缀合物的制备可以通过几种途径，使用本领域技术人员公知的有机化学反应，条件和试剂制备式i的adc，包括：(1)半胱氨酸改造抗体的半胱氨酸基团与接头试剂反应，从而通过共价键形成抗体-接头中间体ab-l，随后与活化的药物模块d反应；和(2)使药物模块的亲核基团与接头试剂反应，从而通过共价键形成药物-接头中间体d-l，随后与半胱氨酸改造抗体的半胱氨酸基团反应。缀合方法(1)和(2)可以用于各种半胱氨酸改造抗体，药物模块和接头以便制备式i的抗体-药物缀合物。抗体半胱氨酸硫醇基为亲核性的并且能够与接头试剂和药物-接头中间体上的亲电子基团反应而形成共价键，所述的药物-接头中间体包括：(i)活性酯类，诸如nhs酯类，hobt酯类，卤代甲酸酯类和酰基卤类；(ii)烷基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺类；(iii)醛类，酮类，羧基和马来酰亚胺基；和(iv)通过硫化物交换的二硫化物，包括吡啶基二硫化物。药物模块上的亲核基团包括，但不限于：胺，硫醇，羟基，酰肼，肟，肼，缩氨基硫脲，肼羧酸酯和芳基酰肼基团，它们能够与接头模块和接头试剂上的亲电子基团反应而形成共价键。例如，可以将美登素转化成may-ssch3，可以将其还原成游离硫醇may-sh并且使之与修饰的抗体反应(chari等(1992)cancerresearch52:127-131)而生成带有二硫化物接头的美登木素生物碱-抗体免疫缀合物。已经报导了带有二硫化物接头的抗体-美登木素生物碱缀合物(wo04/016801；us6884874；us2004/039176a1；wo03/068144；us2004/001838a1；美国专利us6441163,5208020,5416064；wo01/024763)。使用接头试剂n-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶硫基)戊酸酯构建二硫化物接头spp。在某些条件下，可以通过用还原剂，诸如dtt(cleland试剂,二硫苏糖醇)或tcep(三(2-羧乙基)膦盐酸盐处理使半胱氨酸改造抗体反应以便缀合接头试剂；getz等(1999)anal.biochem.vol273:73-80；soltecventures,beverly,ma)。在37℃用约50倍过量的tcep将在cho细胞中表达的全长半胱氨酸改造的单克隆抗体(thiomabtm抗体)还原3小时以便还原可以在新引入的半胱氨酸残基与存在于培养基中的半胱氨酸之间形成的二硫键。用10mm乙酸钠,ph5稀释还原的thiomabtm抗体并且上样至10mm乙酸钠,ph5中的hitraps柱上并且用含有0.3m氯化钠的pbs洗脱。在室温在存在稀(200nm)硫酸铜水溶液(cuso4)的条件下过夜，使亲代mab中的半胱氨酸残基之间重新建二硫键。可以使用本领域公知的其它氧化剂，即氧化剂和氧化条件。环境空气氧化也是有效的。这种适度的部分再氧化步骤有效地形成具有高保真度的链间二硫键。加入约10倍过量的药物-接头中间体，例如bm(peo)4-dm1，混合并且在室温下保持约1小时，以便进行缀合并且形成抗体-药物缀合物(即缀合的thiomabtm抗体)。将缀合混合物进行凝胶过滤并且上hitraps柱且洗脱该柱以便除去过量的药物-接头中间体和其它杂质。例如，通过援引完整收录的美国专利公开文本no.20110301334显示制备由细胞培养物表达的用于缀合的半胱氨酸改造抗体的一般方法。推定带有各种链间二硫键的半胱氨酸加合物被还原裂解成抗体的还原形式。在部分氧化条件下，诸如接触环境氧重新形成配对半胱氨酸残基之间的链间二硫键。新引入的，改造的和未配对的半胱氨酸残基仍然可以用于与接头试剂或药物-接头中间体反应而形成本发明的抗体缀合物。哺乳动物细胞系中表达的thiomabtm抗体通过-s-s-键形成产生与改造的cys产生外部缀合的cys加合物，因此，纯化的thiomabtm抗体必须通过还原和氧化操作步骤处理以便产生反应性thiomabtm抗体。这些thiomabtm抗体用于缀合含有马来酰亚胺的细胞毒性药物，荧光团和其它标记。制备例示性thiomabtm抗体缀合物，而且可以在本文中提供的表格中找到。体外细胞增殖试验一般而言，通过下列步骤测定抗体-药物缀合物(adc)的细胞毒性或细胞生长抑制活性：使具有受体蛋白，例如her2的哺乳动物细胞在细胞培养基中接触adc的抗体；将细胞培养约6小时－约5天的时间；和测定细胞存活率。基于细胞的体外试验用于测定存活率(增殖)，细胞毒性和本发明adc的程序性细胞死亡诱导(胱天蛋白酶活化)。可以通过细胞增殖试验测定抗体-药物缀合物的体外功效。例如，luminescentcellviabilityassay为商购的(promegacorp.,madison,wi)基于鞘翅目(coleoptera)荧光素酶的重组表达的同质性试验方法(homogeneousassaymethod)(美国专利us5583024；5674713和5700670)。该细胞增殖试验基于对存在的atp进行定量测定了培养物中存活细胞的数量，其中存在的atp为代谢活性细胞的指示剂(crouch等(1993)j.immunol.meth.160:81-88；us6602677)。在96孔板中进行assay，使得它易于进行自动化高流通量筛选(hts)(cree等(1995)anticancerdrugs6:398-404)。同质性试验操作步骤包括将单一试剂(reagent)直接加入到在血清补充的培养基中培养的细胞中。无需进行细胞洗涤，除去培养基和多次吸移的步骤。该系统可以在添加试剂并且混合后10分钟内检测384-孔格中低至15个细胞/孔。可以用adc连续处理细胞，或可以处理它们并且从adc中分离。一般而言，暂短，即3小时处理的细胞表现出与连续处理的细胞相同的功效作用。同质性“添加-混合-测定”方式导致细胞裂解并且产生与存在的atp量成比例的发光信号。atp的量与培养物中存在的细胞数量成正比。assay产生由荧光素酶反应产生的“辉光-型(glow-type)”发光信号，它具有一般大于5小时的半衰期，这取决于所用的细胞类型和培养基。以相对发光单位(rlu)反映出存活细胞。底物甲虫荧光素被重组荧火虫荧光素酶氧化脱羧化，而同时atp转化成amp并且产生光子。体内功效可以通过高度表达的转基因外植体小鼠模型测定本文所述thiomabtm抗体的体内功效(例如，可以通过高度表达her2的转基因外植体小鼠模型测定自抗her24d5抗体生成的本文中提供的表格的thiomabtm抗体的体内功效)。例如，可以使同种异体移植物从不对疗法起反应或对它的反应差的fo5mmtv转基因小鼠增殖。可以用抗her24d5thiomabtm抗体和安慰剂pbs缓冲液对照品(媒介物)治疗受试者一次并且可以在3周内监测以便测定肿瘤体积倍增的时间，log细胞杀伤和肿瘤缩小。抗体-药物缀合物的给药可以通过适合于所治疗疾病的任意途径给予本发明的抗体-药物缀合物(adc)。一般通过肠胃外途径给予adc，即输注，皮下，肌肉内，静脉内，真皮内，鞘内和硬膜外。药用配制剂本发明的治疗性抗体-药物缀合物(adc)通常与药学上可接受的肠胃外媒介物一起配制成单位剂量可注射形式的药用配制剂供肠胃外施用，即快速灌注(bolus)，静脉内注射，肿瘤内注射。任选将具有所需纯度的抗体-药物缀合物(adc)与药学上可接受的稀释剂，载体，赋形剂或稳定剂混合(remington′spharmaceuticalsciences(1980)16thedition,osol,a.ed.)成冻干剂型或水溶液形式。可以通过混合具有期望纯度的此类抗体(即thiomabtm抗体)与一种或多种任选的药学可接受载体(remington’spharmaceuticalsciences，第16版，osol，a.编(1980))以冻干配制剂或水性溶液形式制备如本文中所描述的半胱氨酸改造抗体的药物配制剂。一般地，药学可接受载体在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于缓冲剂，诸如磷酸盐，柠檬酸盐，和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵，苯索氯铵；酚，丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂，诸如edta；糖类，诸如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(peg)。本文中的例示性的药学可接受载体进一步包含间质药物分散剂诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(shasegp)，例如人可溶性ph-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rhuph20(baxterinternational，inc.)。某些例示性的shasegp和使用方法，包括rhuph20记载于美国专利公开文本no.2005/0260186和2006/0104968。在一方面，将shasegp与一种或多种别的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。例示性的冻干抗体和免疫缀合物配制剂记载于美国专利no.6,267,958，将其完整收入本文。水性抗体或免疫缀合物配制剂包括那些记载于美国专利no.6,171,586和wo2006/044908(将二者完整收入本文)的，后一种配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性组分，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。活性成分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体，清蛋白微球体，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)，或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如remington′spharmaceuticalsciences，第16版，osol,a.编(1980)。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有抗体或免疫缀合物的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形商品形式，例如膜，或微胶囊。用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。抗体-药物缀合物治疗方法和组合关注本发明的抗体-药物缀合物(adc)可以用于治疗各种疾病或病症，例如其特征在于肿瘤抗原的过表达的疾病或病症。例示性的疾病是过度增殖性病症，包括良性或恶性肿瘤和白血病和淋巴样恶性肿瘤。其它疾病包括神经元，神经胶质，星形胶质细胞，下丘脑，腺体，巨噬细胞，上皮细胞，间质，囊胚腔，炎性，血管发生和免疫性疾病，包括自身免疫性疾病。一般而言，所治疗的疾病或病症为过度增殖性疾病，诸如癌症。本文中要治疗的癌症的实例包括，但不局限于癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。更具体地说，这类癌症包括：鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)；肺癌，包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌和肺鳞癌；腹膜癌；肝细胞癌；胃癌，包括胃肠癌；胰腺癌，成胶质细胞瘤；宫颈癌；卵巢癌；肝癌(livercancer)；膀胱癌；肝细胞癌(hepatoma)；乳腺癌；结肠癌；直肠癌；结直肠癌；子宫内膜癌或子宫癌；唾液腺癌；肾癌；前列腺癌，外阴癌；甲状腺癌；肝癌(hepaticcarcinoma)；肛门癌；阴茎癌和头颈部癌。adc化合物可以用于治疗的自身免疫性疾病包括风湿病(诸如，例如类风湿性关节炎；斯耶格仑氏综合征；硬皮病；狼疮，诸如sle和狼疮性肾炎；多肌炎/皮肌炎；冷球蛋白血症；抗-磷脂抗体综合征；和牛皮癣性关节炎)，骨关节炎，自身免疫性胃肠和肝病(诸如，例如炎症性肠病(例如溃疡性结肠炎和克罗恩(crohn′s)病)，自身免疫性胃炎和恶性贫血，自身免疫性肝炎，原发性胆汁性肝硬变，原发性硬化性胆管炎和乳糜泻(celiacdisease))，血管炎(诸如，例如anca相关血管炎，包括丘-施(churg-strauss)血管炎，韦格纳(wegener′s)肉芽肿和多动脉炎)，自身免疫性神经疾病(诸如，例如多发性硬化，斜视眼肌阵挛综合征(opsoclonusmyoclonussyndrome)，重症肌无力，眼脑脊髓病，帕金森(parkinson’s)病，阿尔茨海默(alzheimer’s)病和自身免疫性多神经病)，肾脏疾病(诸如，例如肾小球肾炎，古德帕斯彻(goodpasture’s)综合征和贝格尔(berger’s)病)，自身免疫性皮肤病(诸如，例如银屑病，荨麻疹(urticaria)，荨麻疹(hives)，寻常天疱疮，大疱性类天疱疮和皮肤红斑狼疮)，血液病(诸如，例如血小板减少性紫癜，血栓性血小板减少性紫癜，输血后紫癜和自身免疫性溶血性贫血)，动脉粥样硬化，眼色素层炎，自身免疫性听觉疾病(诸如，例如内耳疾病和,听力丧失)，贝切特(behcet′s)病，雷诺(raynaud′s)综合征，器官移植和自身免疫性内分泌病症(诸如，例如糖尿病相关性自身免疫性疾病，诸如胰岛素依赖性糖尿病(iddm)，阿狄森(addison’s)病和自身免疫性甲状腺病(例如格雷夫斯(graves’)病和甲状腺炎))。更优选的这类疾病包括：例如类风湿性关节炎，溃疡性结肠炎，anca相关血管炎，狼疮，多发性硬化，斯耶格仑综合征，格雷夫斯病，iddm，恶性贫血，甲状腺炎和肾小球肾炎。为了预防或治疗疾病，adc的适当剂量取决于如上述定义的所治疗的疾病类型，疾病的严重程度和时程，给予所述分子是为了预防还是为了治疗目的，先前的治疗，患者的临床病史和对抗体的反应以及主治医师的判定。将所述的分子适当对患者给予一次或在一系列治疗过程中给予。根据疾病类型和严重程度的不同，对患者给药的分子的初始候选剂量约为1μg/kg-15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)，例如，无论是通过一次或多次分开的给药，还是通过连续输注。典型的每日剂量可以在约1μg/kg-100mg/kg或更大的范围，这取决于上述因素。对患者给予的典型的adc的剂量在约0.1-约10mg/kg患者体重的范围。为了在几天或几天以上时程中反复给药，根据病情的不同，将治疗持续至对所需疾病症状的抑制发生为止。典型的给药方案包含给予约4mg/kg的起始负荷剂量，随后给予约2mg/kg抗-erbb2抗体的每周维持剂量。其它剂量方案也是有用的。该疗法的进展易于通过常规技术和试验监测。在一方面，本文中提供的thiomabtm抗体可用于抑制细胞增殖的方法。例如，抗her2thiomabtm抗体可用于抑制her2阳性细胞的细胞增殖。又例如，抗cd33thiomabtm抗体可用于抑制cd33阳性细胞的细胞增殖。因而，可以生成针对肿瘤细胞上表达的任何多肽的抗体，而且可以改造该抗体以包括非天然半胱氨酸用于药物缀合(即可以将该抗体改造成thiomabtm抗体)。一旦生成thiomabtm抗体，抑制细胞增殖的方法包括在允许thiomabtm抗体结合细胞表面上的靶物(例如her2)的条件下将细胞暴露于thiomabtm抗体(例如抗her2thiomabtm抗体)，由此抑制细胞增殖。在某些实施方案中，所述方法是体外或体内方法。体外细胞增殖抑制可使用可购自promega(madison，wi)的celltiter-glotm发光细胞存活力测定法来测定。该测定法基于存在的atp(它是代谢活跃细胞的指标)的量化来测定培养物中的可存活细胞数目。参见crouchetal.(1993)j.immunol.meth.160:81-88；美国专利no.6602677。该测定法可以以96孔或384孔形式进行，使之适应自动化高通量筛选(hts)。参见creeetal.(1995)anticancerdrugs6:398-404。该测定法规程牵涉直接向培养细胞添加单一试剂(试剂)。这导致细胞溶解和通过萤光素酶反应产生的发光信号的生成。发光信号与存在的atp的量成正比，后者直接与培养物中存在的可存活细胞数成正比。可以通过光度计或ccd照相机成像装置来记录数据。发光输出表述成相对光单位(rlu)。在另一方面，提供了作为药物使用的thiomabtm抗体(例如抗her2thiomabtm抗体)。在其它的方面，提供了在治疗方法中使用的thiomabtm抗体。在一个非限制性实施方案中，提供了用于治疗her2阳性癌症的抗her2thiomabtm抗体。在某些实施方案中，本发明提供了在治疗具有her2阳性癌症的个体的方法中使用的抗her2thiomabtm抗体，所述方法包括对个体施用有效量的抗her2thiomabtm抗体。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种其它的治疗剂，例如下文描述的。在一个非限制性实施方案中，提供了用于治疗cd33阳性癌症的抗cd33thiomabtm抗体。在某些实施方案中，本发明提供了在治疗具有cd33阳性癌症的个体的方法中使用的抗cd33thiomabtm抗体，所述方法包括对个体施用有效量的抗cd33thiomabtm抗体。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种其它的治疗剂，例如下文描述的。在又一方面，本发明提供了thiomabtm抗体(例如抗her2thiomabtm抗体)在制造或制备药物中的用途。例如，抗her2thiomabtm抗体药物用于治疗her2阳性癌症的方法，所述方法包括对具有her2阳性癌症的个体施用有效量的所述药物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种其它的治疗剂，例如如下文所描述的。在又一方面，本发明提供了thiomabtm抗体(例如抗muc16thiomabtm抗体)在制造或制备药物中的用途。例如，抗muc16thiomabtm抗体药物用于治疗muc16阳性癌症的方法，所述方法包括对具有muc16阳性癌症的个体施用有效量的所述药物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种其它的治疗剂，例如如下文所描述的。在又一方面，本发明提供了thiomabtm抗体(例如抗steap1thiomabtm抗体)在制造或制备药物中的用途。例如，抗steap1thiomabtm抗体药物用于治疗steap1阳性癌症的方法，所述方法包括对具有steap1阳性癌症的个体施用有效量的所述药物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种其它的治疗剂，例如如下文所描述的。在又一方面，本发明提供了thiomabtm抗体(例如抗napi2bthiomabtm抗体)在制造或制备药物中的用途。例如，抗napi2bthiomabtm抗体药物用于治疗napi2b阳性癌症的方法，所述方法包括对具有napi2b阳性癌症的个体施用有效量的所述药物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种其它的治疗剂，例如如下文所描述的。在又一方面，本发明提供了thiomabtm抗体(例如抗ly6ethiomabtm抗体)在制造或制备药物中的用途。例如，抗ly6ethiomabtm抗体药物用于治疗ly6e阳性癌症的方法，所述方法包括对具有ly6e阳性癌症的个体施用有效量的所述药物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种其它的治疗剂，例如如下文所描述的。在又一方面，本发明提供了thiomabtm抗体(例如抗b7h4thiomabtm抗体)在制造或制备药物中的用途。例如，抗b7h4thiomabtm抗体药物用于治疗b7h4阳性癌症的方法，所述方法包括对具有b7h4阳性癌症的个体施用有效量的所述药物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种其它的治疗剂，例如如下文所描述的。在又一方面，本发明提供了thiomabtm抗体(例如抗cd79bthiomabtm抗体)在制造或制备药物中的用途。例如，抗cd79bthiomabtm抗体药物用于治疗cd79b阳性癌症的方法，所述方法包括对具有cd79b阳性癌症的个体施用有效量的所述药物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种其它的治疗剂，例如如下文所描述的。在又一方面，本发明提供了thiomabtm抗体(例如抗cd22thiomabtm抗体)在制造或制备药物中的用途。例如，抗cd22thiomabtm抗体药物用于治疗cd22阳性癌症的方法，所述方法包括对具有cd22阳性癌症的个体施用有效量的所述药物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种其它的治疗剂，例如如下文所描述的。在又一方面，本发明提供了通过施用thiomabtm抗体或其药物来治疗癌症的方法。在具体的实施方案中，thiomabtm抗体或其药物预防癌细胞增殖。在具体的实施方案中，thiomabtm抗体或其药物促进癌细胞凋亡。在具体的实施方案中，thiomabtm抗体或其药物缩小癌细胞的肿瘤体积。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种其它的治疗剂，如下文所描述的。可以单独或与疗法中的其它药剂组合使用本发明的thiomabtm抗体。例如，可以与至少一种其它的治疗剂共施用本发明的抗体或免疫缀合物。例如，其它的治疗剂可以是第二thiomabtm抗体或本文中定义的化疗剂。上文记录的此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在同一配制剂或分开的配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用其它的治疗剂和/或佐剂之前，同时，和/或之后发生本发明的抗体或免疫缀合物的施用。也可以与放射疗法组合使用本发明的抗体或免疫缀合物。可以通过任何合适的手段，包括胃肠外，肺内，和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用来施用本发明的thiomabtm抗体(和任何其它的治疗剂)。胃肠外输注包括肌肉内，静脉内，动脉内，腹膜内，或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适的路径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点里的多次施用，推注施用，和脉冲输注。本发明的thiomabtm抗体应当以一种符合良好的医学实践的方式配制，确定剂量及给药。关于这一点考虑的因素包括在治疗的特定病症，在治疗的特定哺乳动物，患者个体的临床状态，病因，药物递送部位，给药方法，服药日程以及其它为开业医生所知的因素。thiomabtm抗体无需但任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所述病症的药物一起配制。上述其它药物的有效量取决于配方中所存在的抗体或免疫缀合物的量，疗法和病症的类型，以及其它上述讨论的因素。这些药物通常以相同的剂量使用并具有本文中所描述的给药途径，或以约1-99％的本文所描述的剂量使用，或以任何剂量并通过任何途径使用，所述剂量和途径是凭经验确定的/经临床测定合适的。为了预防或治疗疾病，本发明的thiomabtm抗体(当单独或与一种或多种其它另外的治疗剂联合使用时)的合适剂量应取决于所要治疗的疾病的类型，抗体或免疫缀合物的种类，疾病的严重性和病程，给予thiomabtm抗体是出于预防还是治疗目的，之前的治疗，患者的临床史和对thiomabtm抗体的应答，以及主治医师的斟酌决定。thiomabtm抗体适合于在一次或一系列的治疗中给予患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg-15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的thiomabtm抗体可作为首次候选用量给予患者，无论是例如通过一次或多次单独的给药或通过连续输注。取决予上述提及的因素，一个典型的日剂量可在约1μg/kg-100mg/kg或更多的范围内。对于几天或更长时间的重复给药，取决于病情，治疗应通常持续直至出现病症得到期望的抑制为止。thiomabtm抗体的一种例示性剂量会在约0.05mg/kg到约10mg/kg的范围中。如此，可以对患者施用一剂或多剂约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)。上述剂量可间歇给予，如每周或每三周给予一次(如使得患者得到约2-约20个，或例如约6个剂量的抗体)。可给予初始较高的负荷剂量，接着给予一个或多个较低的剂量。然而，可使用其它给药方案。通过常规技术和测定方法易于监测该治疗的进展。应当理解，可以使用本发明的thiomabtm抗体和第二化疗剂(如本文中定义的)二者实施任何上述配制剂或治疗性方法。标记的抗体成像方法在本发明的另一个实施方案中，可以用放射性核素，荧光染料，激发生物发光的底物模块，激发化学发光的底物模块，酶和其它检测标记通过半胱氨酸硫醇来标记半胱氨酸改造抗体以便用于具有诊断，药效学和治疗应用的成像实验。一般而言，通过注射，灌注或口服摄入对活生物体，例如人，啮齿动物或其它小动物，灌注器官或组织样品给予标记的半胱氨酸改造抗体，即“生物标记物”或“探针”。在一定时间过程中检测探针的分布并且由影像显示。制品在本发明的另一个实施方案中，提供了含有用于治疗上述病症的物质的制品或“试剂盒”。所述的制品包含容器和在容器上或与其相连的标签或包装说明书。合适的容器包括：例如瓶，小瓶，注射器，泡罩包等，容器可以由各种材料，诸如玻璃或塑料形成。容器可以容纳有效治疗疾病的本发明thiomabtm抗体并且可以具有无菌存取口(例如容器可以为静脉用溶液袋或具有可刺入皮下注射针头的塞的小瓶)。组合物中至少一种活性剂为thiomabtm抗体。标签或包装说明书表示组合物用于治疗选择的疾病，诸如癌症。或者或另外，所述制品可以进一步含有第二种(或第三种)容器，该容器包含药学上可接受的缓冲剂，诸如抑菌性注射用水(bwfi)，磷酸缓冲盐水，林格液和葡萄糖溶液。它可以进一步包括从商业和使用者角度而言需要的其它物质，包括其它缓冲液，稀释剂，过滤器，针头和注射器。实施例实施例1-thiomabtm抗体的制备使用hu4d5质粒作为双链dna模板，生成thiomabtm抗体。使用来自agilenttechnologies的quickchangeiixl试剂盒实施基于pcr的定点诱变。使用该方法进行定点诱变以生成thiomabtm抗体：1)使用hu4d5质粒dna(50-100ng)，2)使用含有期望突变的正向和反向引物(各1μm)，3)将dntp(0.4mm)和pfuultrahfdna聚合酶(2.5个单位)添加至25μl反应混合物，4)将样品在热循环仪(appliedbiosystems，fostercity，ca)中温育，初始变性(4min，94℃)，接着是20个循环的0.5min变性(94℃)，0.5min退火(52℃)和10min链延伸(68℃)，5)将pcr扩增dna样品与dpni限制酶一起于37℃温育4小时，6)用经dpni处理的pcr样品(2μl)转化感受态细胞(novabluesingles，50μl)，7)自转化板挑取单菌落并在5ml含有羧苄青霉素(50ug/ml)的2yt培养基中培养，并8)纯化质粒dna并通过dna测序筛选所获得的克隆以鉴定抗体序列的轻和重链区中的半胱氨酸替代和非特异性突变缺失。将半胱氨酸改造的hu4d5质粒稳定转染入哺乳动物细胞系进行蛋白质生成。用于这项研究的293t细胞系是经过sv40大t抗原稳定转染的悬浮适应性hek293细胞系。在瞬时转染之前，在80％增湿温箱中在37℃，5％co2，和150rpm摇速，25mm摆动直径的条件下在摇瓶中作为种子培养物培养细胞。使用补充有1％超低igg血清(sigma，st.louis，mo)的gibcofreestyle293表达培养基(lifesciences，carlsbadca)作为种子培养和生产培养基。除非另有规定，所有瞬时转染均是在50ml离心管中进行的(stettleretal.，2007)，最终工作体积30ml，而且以96分批处理。为效率起见，使用biomekfxp液体操作机器人来将细胞大量分配入96个离心管中。转染后，将细胞在80％增湿kuhnerisf1-x温箱中于37℃，5％co2和225rpm摇速，50mm摆动直径培养7天。对于转染，以1.0e6个细胞/ml接种细胞，并在转染之前于37℃，5％co2温育2小时。在接种时以75mm的浓度对生产培养物添加丙戊酸。以大量制备规模(sigma，st.louis，mo)纯化编码选定thiomabtmhuigg1抗体的质粒dna。利用标准瞬时转染工艺，在基于dmem的培养基中将30ugdna稀释至3ml的终体积。然后将60ul7.5mm25kda线性pei添加至dna溶液，混合，并于室温温育10分钟，之后添加至细胞。实施例2-thiomabtm抗体的缀合将依照实施例1生成的每种半胱氨酸改造抗体(thiomabtm抗体)分开缀合至两种接头药物：mc-vc-pab-mmae和pds-mmae。例如，4d5lc-k149c半胱氨酸改造抗体生成两种不同thiomabtm抗体：1)4d5lc-k149c-mc-vc-pab-mmae和2)4d5lc-k149c-pds-mmae。优选缀合的另外的例子可以在表1和2中找到且在本文中有描述，而且包括但不限于依照eu编号方式的4d5hc-a140c-mc-vc-pab-mmae和4d5hc-a140c-pds-mmae和依照eu编号方式的4d5hc-l174c-mc-vc-pab-mmae和4d5hc-l174c-pds-mmae。全抗体筛选中鉴定的头等稳定缀合物的其它例子可以在表3和4中找到。-vc和pds缀合的优选位点见图21。在96孔滤板(体积2ml，聚丙烯，0.45um滤器，来自ekscientific)中实施thiomabtm抗体的缀合。该板只容许以500xg离心2分钟时水性缓冲液流过。作为20％乙醇中的50％浆，对每个孔添加450μlmabselectsure树脂(gehealthcare)。将树脂在50mmtrisph8.0，150mmnacl，2mmedta(缓冲液a)中清洗3次并平衡。对每个孔添加1.5mg每种thiomabtm抗体，并于室温在600rpm的摇板仪上容许结合至树脂达30分钟。30分钟后，将板离心以去除过量的缓冲液。然后于室温在摇动下在0.9ml含2mm二硫苏糖醇(dtt)的缓冲液a存在下将thiomabtm抗体还原过夜。通过用缓冲液a清洗2次去除还原剂(即dtt)和任何半胱氨酸或谷胱甘肽嵌段(block)。然后将板用1ml含1mm脱氢抗坏血酸(dhaa)的缓冲液a清洗3次以用氧化剂充满板。最后一次添加0.9ml含1mmdhaa的缓冲液a后，于室温在摇板仪上容许thiomabtm抗体再氧化3小时。通过离心去除氧化剂。添加两倍摩尔过量(相对于可用的硫醇基团)的在含10％dma的缓冲液a中溶解的接头-药物(mc-vc-pab-mmae或pds-mmae)，并于室温在摇板仪上与thiomabtm抗体一起温育2小时。通过将板用平衡缓冲液(缓冲液a)清洗6次来去除过量的接头-药物。于室温在摇板仪上用0.1m甘氨酸缓冲液ph2.7洗脱thiomabtm抗体30分钟。然后立即用15％0.5mtris，ph8.0中和thiomabtm抗体。通过lc/ms分析量化每个thiomabtm抗体缀合的药物的数目。通过大小排阻层析评估缀合物的聚集。实施例3-thiomabtm抗体的质谱分析使用质谱分析(即lc/ms分析)测定每种thiomabtm抗体的药物-抗体比(dar)。在6224质量飞行时间(tof)lc/ms仪器(agilenttechnologies)上实施lc/ms分析。将样品在加热至80℃的prlp-s柱，8μm(50mmx2.1mm，agilenttechnologies)上层析。以0.7ml/min流速在3分钟里使用线性梯度34-42％b(溶剂a，含0.05％tfa的水；溶剂b，含0.04％tfa的乙腈)并使用电喷射源直接将洗提液电离。收集数据并使用agilentmasshunter定性分析软件解卷积。使用lc/ms层析图中存在的解卷积峰的丰度计算药物dar。dar计算可见例如上文表6-12。而且，对在抗体中的每一个位置处含有单一改造的半胱氨酸突变的4d5半胱氨酸改造抗体实施lc/ms分析。表13-16中的空白单元格代表非决定性的实验，不是0dar。表13：pds连接的具有重链半胱氨酸替代的thiomabtm抗体的dar。表14：pds连接的具有轻链半胱氨酸替代的thiomabtm抗体的dar。表15：vc连接的具有重链半胱氨酸替代的thiomabtm抗体的dar。表16：vc连接的具有轻链半胱氨酸替代的thiomabtm抗体的dar。实施例4-mc-vc-mmae和pds-mmaethiomabtm抗体的聚集分析经由大小排阻测定法对表6-10中呈现的每种thiomabtm抗体实施聚集分析。在1100系列hplc(agilenttechnologies)上实施大小排阻层析。将样品在shodexkw802.5柱上层析。使用等度方法(其使用流动相0.2m磷酸钾，0.25m氯化钾，ph6.2，0.75ml/min，15分钟)来洗脱缀合物。根据uv280nm层析图的聚集体和单体峰的积分面积计算百分比聚集。图3显示用于聚集分析和计算的聚集体和单体峰的代表性图。实施例5-thiomabtm抗体的缀合分析使用液体层析-质谱(lc/ms或lcms)实施thiomabtm抗体的缀合分析。如图4a和图4b中所示，thiomabtm抗体的uv280lc/ms层析显示dar0(裸抗体)，dar1，和dar2缀合。完整抗体半胱氨酸(其中生成在抗体内的每一个位置处具有单一半胱氨酸突变的4d5抗体以测定抗体内对于附着接头-药物以生成adc的目的不可预测的最稳定位点)筛选的最稳定位点的lcms结果显示于表7和9。实施例6-mc-vc-mmae和pds-mmaethiomabtm抗体的稳定性分析。对于3个时间点(0小时，48小时和96小时)的大鼠血浆和缓冲液(0小时)二者一式两份生成pds-mmae和mc-vc-mmaethiomabtm抗体的稳定性样品。稳定性筛选的实验规程的流程图提供于图5。为了创建稳定性样品，将9μl每种thiomabtm抗体(即源材料)添加至351μl大鼠血浆或缓冲液(1xpbs，0.5％bsa，15ppmproclin)任一，然后彻底混合。源材料的浓度提供于例如表6，8，和10。一旦混合，将120μl大鼠血浆稳定性样品等分入分开的三套试管，用于三个不同时间点。然后将0小时时间点的大鼠血浆和缓冲液置于-80℃冰箱中，而将48小时和96小时时间点的大鼠血浆置于37℃温箱中的摇床上。当48小时和96小时样品到达给定时间点时，也将它们置于-80℃冰箱中。使用质谱分析显示mc-vc-mmae和pds-mmaelc-r142cthiomabtm抗体在0小时，48小时，和96小时时的稳定性的代表性图提供于图6a和6b。使用elisa测定法测定pds-mmae和mc-vc-mmaethiomabtm抗体的稳定性。通过elisa测定大鼠血浆中总的抗体(缀合的和未缀合的thiomabtm抗体)的浓度，使用人erb2的胞外域(ecd)作为捕捉剂，使用山羊抗人igg-辣根过氧化物酶(hrp)作为检测抗体。该测定法具有0.5mg/ml的检测限度(lod)及800倍的最小稀释度。通过elisa测定大鼠血浆中缀合的pds-mmae和mc-vc-mmaethiomabtm抗体的浓度，使用抗药物单克隆抗体进行捕捉，使用山羊抗人igg-hrp进行检测。该测定法具有0.5mg/ml的检测限度(lod)及800倍的最小稀释度。计算基于特定半胱氨酸改造位点处的缀合的药物载荷稳定性。使用时间0小时时的缀合抗体浓度对0小时时的总抗体浓度(通过elisa测定)之比来计算0小时时针对总抗体标准化的缀合抗体浓度，使得[c0]/[t0]＝nc0。使用时间48小时时的缀合抗体浓度对48小时时的总抗体浓度(通过elisa测定)之比来计算48小时时针对总抗体标准化的缀合抗体浓度，使得[c48]/[t48]＝nc48。通过计算48小时时的缀合抗体对0小时时的缀合抗体(通过elisa测定)之比来确定百分比稳定性，由此计算百分比药物载荷稳定性，使得nc48/nc0＝百分比药物载荷稳定性。图7显示48小时时间点时测量的优选pds-mmaethiomabtm抗体的稳定性的图。图8显示48小时时间点时测量的优选mc-vc-mmaethiomabtm抗体的稳定性的图。所有筛选的pds-mmae和mc-vc-mmaethiomabtm抗体的稳定性可以在本文中提供的表中找到。实施例7-lc-k149c，lc-v205c，和hc-a114cthiomabtm抗体的制备使用抗cd33和抗her2抗体生成lc-k149c，lc-v205c，和hc-a114cthiomabtm抗体，并基于平均dar评估那些thiomabtm抗体的稳定性(图9)。与hc-a114c和lc-v205c相比，抗her2lc-k149cthiomabtm抗体在抗her2抗体中显示令人惊讶的稳定性。具体而言，抗her2lc-k149cthiomabtm抗体的药物缀合是稳定的，而且thiomabtm抗体在缀合后六天保持dar为2。类似地，抗cd33lc-k149cthiomabtm抗体也保留dar为2达6天。与之对比，抗her2lc-v205c和hc-a114cthiomabtm抗体。实施例8-pds-mmaethiomabtm抗体在缀合后48小时和96小时时的稳定性对抗体实施半胱氨酸筛选以确定哪些所得pds-thiomabtm抗体具有≥1的dar，≥1mg/ml的源储液浓度，≤50％的聚集，再氧化，vc变体药物载荷在大鼠血浆中在48小时上基于elisa(两份复制品)≥80％的稳定性，pds变体药物载荷在大鼠血浆中在48小时上基于elisa(两份复制品)≥70％的稳定性，和直至96小时通过可靠ms谱确认的稳定性。具体而言，将4d5抗体用于例示目的，使得本领域技术人员会了解任何抗体可替代4d5抗体。筛选鉴定出轻链和重链内对于半胱氨酸工程化改造和接头-药物附着以生成稳定adc而言优选的候选位点(见表1和2)和另外的稳定位点(见表3和4)。该实验的结果提供于表6-12。实施例9-mc-vc-mmaethiomabtm抗体在缀合后48小时和96小时时的稳定性对抗体实施半胱氨酸筛选以确定哪些所得mc-vc-thiomabtm抗体具有≥1的dar，≥1mg/ml的源储液浓度，≤50％的聚集，再氧化，vc变体药物载荷在大鼠血浆中在48小时上基于elisa(两份复制品)≥80％的稳定性，pds变体药物载荷在大鼠血浆中在48小时上基于elisa(两份复制品)≥70％的稳定性，和直至96小时通过可靠ms谱确认的稳定性。具体而言，将4d5抗体用于例示目的，使得本领域技术人员会了解任何抗体可替代4d5抗体。该筛选鉴定出轻链和重链内对于半胱氨酸工程化改造和接头-药物附着以生成稳定adc而言优选的候选位点(见表1和2)和另外的稳定位点(见表3和4)。该实验的结果提供于表6-12。实施例10-体外细胞增殖试验可以通过使用下列方案的细胞增殖试验测定thiomabtm抗体的功效(celltitergloluminiscentcellviabilityassay,promegacorp.technicalbulletintb288；mendoza等(2002)cancerres.62:5485-5488)：1.可以使在培养基中含有约104个细胞(skbr-3，bt474，mcf7或mda-mb-468)的100μl细胞培养物等份沉积在96-孔不透明壁的平板的各孔中。2.可以制备含有培养基，但不含细胞的对照孔。3.可以将thiomabtm抗体加入到实验孔中并且温育3-5天。4.可以使平板平衡至室温约30分钟。5.可以加入等于存在于各孔中的细胞培养基的体积的celltiter-gloreagent。6.可以将内含物在定轨振荡器上混合2分钟以便诱导细胞裂解。7.可以将平板在室温温育10分钟以便稳定发光信号。8.可以记录发光并且作为rlu＝相对发光单位在图中报导。可以将某些细胞以1000-2000个/孔(pc3系)或2000-3000个/孔(ovcar-3)接种在96孔平板上，50μl/孔。在1(pc3)或2(ovcar-3)天后，可以加入在50μl体积中的thiomabtm抗体至终浓度为9000，3000，1000，333，111，37，12.4，4.1或1.4ng/ml，其中"无adc"对照孔仅接受培养基。条件为一式两份或一式三份。3(pc3)或4-5(ovcar-3)天后，加入100μl/孔celltitergloii(基于荧光素酶的试验；根据atp水平测定的增殖)并且可以使用发光计测定细胞计数。例如，可以以各组重复测定的发光平均值将数据绘图，其中使用标准偏差条柱形图。或者，可以依照promega的方法实施celltitergloluminiscentcellviabilityassay(promega)：1.用1000个细胞/孔的pc3/muc16，pc3/neo(在50μl/孔中)的培养基铺板。应将ovcar3细胞以2000个细胞/孔(在50μl中)的其培养基铺板(pc3/neo和pc3/muc16生长在50/50/10％fbs/谷氨酰胺/250μg/mlg-418中ovcar-3生长在rpmi/20％fbs/谷氨酰胺中)。允许细胞附着过夜。2.以18μg/ml的工作浓度开始在培养基中以1:3连续稀释thiomabtm抗体(这导致终浓度为9μg/ml)。将50μl稀释的adc加入到已经在孔中的50μl细胞和培养基中。3.孵育72-96小时(标准品为72小时，但在细胞达到85-95％融合率时，观察到0ug/ml浓度，终止试验)。4.加入100μl/孔的promegacelltiterglo试剂，振摇3分钟并且在发光计上读数。实施例11-高度表达her2的转基因外植体小鼠的肿瘤生长抑制体内功效适合于转基因实验的动物可以获自标准商业来源，诸如taconic(germantown,n.y.)。许多品系都是合适的，但优选fvb雌性小鼠，因为它们对肿瘤形成高度易感。将fvb雄小鼠用于交配并且将切除输精管的cd.1种畜用于刺激假性妊娠。切除输精管的小鼠可以获自任何商品供应商。使用fvb小鼠或129/bl6xfvbp53杂合型小鼠繁殖建立者(founder)。将在p53等位基因上具有杂合性的小鼠用于潜在地增加肿瘤形成。然而，已经证实这是不必要的。因此，某些f1肿瘤具有混合的品系。建立者的肿瘤仅为fvb。获得了有某种程度的肿瘤发生但未产仔的6个建立者。通过iv注射adc用单剂量或多剂治疗具有肿瘤(由fo5mmtv转基因小鼠繁殖的同种异体移植物)的动物。在注射后的不同时间点评价肿瘤体积。肿瘤易于在转基因小鼠中产生，这些小鼠表达neu的突变活化形式，即大鼠her2的同源物，而在人乳腺癌中过表达的her2未突变并且肿瘤形成远低于过表达未突变her2的转基因小鼠(webster等(1994)semin.cancerbiol.5:69-76)。为了改善具有未突变的her2的肿瘤形成，使用her2cdna质粒生成转基因小鼠，其中atg的上游缺失，以便防止在这类上游atg密码子上起始翻译，否则就可能减少从her2的下游真正起始密码子起始翻译的频率(例如，参见child等(1999)j.biol.chem.274:24335-24341)。另外，将嵌合内含子添加到5’末端上，这也应如以前报导的提高表达水平(neuberger和williams(1988)nucleicacidsres.16:6713；buchman和berg(1988)mol.cell.biol.8:4395；brinster等(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:836)。嵌合内含子来源于promega载体，即pci-neo哺乳动物表达载体(bp890-1022)。cdna3’-末端位于人生长激素外显子4和5和聚腺苷酸化序列的侧翼。此外，使用fvb小鼠，因为该品系更易感肿瘤发生。来自mmtv-ltr的启动子用于确保在乳腺中的组织特异性her2表达。给动物饲喂ain76a膳食以便增加对肿瘤形成的易感性(rao等(1997)breastcancerres.andtreatment45:149-158)。可以为另外的肿瘤类型生成和研究类似的体内模型。例如，可以生成体内模型来使用cd33表达性模型研究抗cd33thiomabtm抗体的功效。实施例12-hc-a140c在稳定性方面挽救接头-药物的用途如本文中讨论的，由于它在保持接头-药物方面的稳定性(即接头-药物保持在改造的lc-k149c位置处结合至抗体)，发现lc-k149c(依照kabat编号方式)是对于半胱氨酸替代优选的位点。然而，出乎意料地发现即使接头保持在lc-k149c处结合至半胱氨酸改造抗体，某些药物当在位置lc-k149c处连接至半胱氨酸改造抗体时进行酶促修饰。具体而言，令人惊讶地发现经由接头附着至lc-k149c的某些药物进行酶促修饰诸如氨基甲酸根基团损失，乙酰基损失(即脱乙酰基化)，磷酸根损失，糖损失，和其它切割。在观察到某些药物(包括但不限于cryptophycin，tubulysinm，类紫杉烷药物，和cbi-pbd异二聚体接头-药物中间体)当在lc-k149c处附着至半胱氨酸改造抗体时的修饰之后，检查来自表1-4的另外的位点(包括hc-a118c，lc-v205c，hc-s121c，和hc-a140c)以查看它们的使用是否能降低和/或消除药物修饰。具体而言，观察到当经由接头缀合至半胱氨酸改造抗体上的lc-k149c时，cryptophycin发生酰胺切割，tubulysin发生乙酰基损失(即脱乙酰基化)，cbi-pbd异二聚体接头-药物中间体发生氨基甲酸根损失，而类紫杉烷是不稳定的且显示切割(见图13)。出乎意料地发现hc-a140c对tubulysin的乙酰基基团提供保护(见图14a-14c)。具体而言，使用lcms显示了温育24小时后使用hc-a140c作为附着位点时的药物降解比lc-k149c更少(图14a)。使用一种新颖的全血测定法类似地显示了hc-a140c更加稳定。对于该新颖的全血(wb)测定法(本文中首次描述)，在小鼠(cb17scid)，大鼠(sprague-dawley)，食蟹猴和/或人全血血浆以及缓冲液中生成样品(0和24小时)。通过bioreclamation收集血液，然后冷链运输过夜并在全血达到后立即创建样品。为了创建稳定性样品，在缓冲液(1xpbs，0.5％bsa，15ppmproclin)中生成源材料的初始稀释液，使得所有分子的浓度为1mg/ml。然后实施1:10x稀释(36ul1mg/ml初始稀释液+324ul血液或缓冲液)以生成终浓度100ug/ml的稳定性样品。一旦混合，将150μl全血/缓冲液稳定性样品等分入分开的两套试管，用于两个不同时间点。然后将0小时时间点置于-80℃在三轮wb测定法中确认hc-a140c和lc-k149c处的乙酰基损失。确认了hc-a140c挽救乙酰基损失修饰(图15)。出乎意料地发现hc-a140c对cbi-pbd异二聚体接头-药物中间体的氨基甲酸根基团提供保护(见图16a-16c)。具体而言，使用lcms显示了温育24小时后使用hc-a140c作为附着位点时的药物降解比lc-k149c更少(图16a)。类似地使用新颖的全血测定法显示了hc-a140c更加稳定(图17)。还出乎意料地发现hc-a140c提供保护免于类紫杉烷的修饰(见图18a-18c)。具体而言，使用lcms显示了温育24小时后使用hc-a140c作为附着位点时的药物降解比lc-k149c更少(图18a)。类似地使用新颖的全血测定法显示hc-a140c更加稳定(例如就保护类紫杉烷药物损失而言)(图19)。正如通过将药物连接至hc-a140c代替lc-k149c而对tubulysin，cbi-pbd异二聚体接头-药物中间体，和类紫杉烷药物出乎意料地观察到保护，还发现到hc-a140c保护cryptophycin免于酰胺和酯切割(见图20)。对具有pds和/或马来酰亚胺(即vc-)接头的抗her2抗体(具体是4d5)和/或抗cd22抗体实施实验。实施例13-对pds连接而言的最稳定位点的鉴定通过使用亲和捕捉lc-ms测定法分析0，48和96小时血浆稳定性样品进一步评估来自elisa筛选的头等稳定变体。首先将链霉亲合素包被的磁珠(lifetechnologiescorporation，grandisland，ny)用hbs-ep缓冲液(gehealthcare，sunnyvale，ca)清洗2次，然后与使用kingfisherflex(thermofisherscientific，waltham，ma)生物素化的人erb2胞外域(ecd)混合，并于室温在温和摇动下温育2小时。2小时后，将sa-珠/生物素-ecd复合物用hbs-ep缓冲液清洗2次，与稀释的血浆稳定性样品混合，然后于室温在温和摇动下温育2小时。2小时后，将sa-珠/生物素-ecd/样品复合物用hbs-ep缓冲液清洗2次，接着用水(optimah2o，fisherscientific，pittsburgh，pa)清洗2次，最后用10％乙腈清洗1次。然后，为了洗脱，将珠置于30％乙腈/0.1％甲酸中，在其中于室温在温和摇动下温育30分钟，之后收集珠。然后将洗脱的样品加载到lc-ms(synapt-g2s，waters，milford，ma)上进行分析。还使用半胱氨酸还原测定法评估头等稳定pds-mmae变体，其中将样品用水稀释至100ug/ml并与100um半胱氨酸和100mm碳酸氢铵缓冲液1:1混合得到终浓度50um半胱氨酸和50mm碳酸氢铵。然后将样品于室温在黑暗中温育过夜18小时，然后添加等体积的60％乙腈/0.2％甲酸以淬灭反应。然后将样品加载到lc-ms(synapt-g2s，waters，milford，ma)上进行分析。表1和2中鉴定了优选的稳定pds-mmae变体，而表3和4中鉴定了另外的稳定变体。具体而言，图21和实施例2中清楚地鉴定了头等pds-mmae变体。实施例14-对-vc(即马来酰亚胺)连接而言的最稳定位点的鉴定通过使用亲和捕捉lc-ms测定法分析0，48和96小时血浆稳定性样品进一步评估来自elisa筛选的头等稳定变体。首先将链霉亲合素包被的磁珠(lifetechnologiescorporation，grandisland，ny)用hbs-ep缓冲液(gehealthcare，sunnyvale，ca)清洗2次，然后与使用kingfisherflex(thermofisherscientific，waltham，ma)生物素化的人erb2胞外域(ecd)混合，并于室温在温和摇动下温育2小时。2小时后，将sa-珠/生物素-ecd复合物用hbs-ep缓冲液清洗2次，与稀释的血浆稳定性样品混合，然后于室温在温和摇动下温育2小时。2小时后，将sa-珠/生物素-ecd/样品复合物用hbs-ep缓冲液清洗2次，接着用水(optimah2o，fisherscientific，pittsburgh，pa)清洗2次，最后用10％乙腈清洗1次。然后，为了洗脱，将珠置于30％乙腈/0.1％甲酸中，在其中于室温在温和摇动下温育30分钟，之后收集珠。然后将洗脱的样品加载到lc-ms(synapt-g2s，waters，milford，ma)上进行分析。表1和2中鉴定了优选的稳定vc-mmae变体，而表3和4中鉴定了另外的稳定变体。具体而言，图21和实施例2中清楚地鉴定了头等vc-mmae变体。实施例15-能改造成具有单一半胱氨酸突变(即两个半胱氨酸每个抗体)的例示性抗体任何抗体能改造成具有单一半胱氨酸突变(即两个半胱氨酸每个抗体)。已经使用本文所述方法改造成具有单一半胱氨酸突变(即两个半胱氨酸每个抗体)的例示性抗体包括但不限于针对下述抗原的抗体：her2，muc16，steap1，napi2b，cd22，ly6e，cll-1，b7h4，和cd79。已经进行半胱氨酸改造的某些抗her2抗体包括4d5和7c2(见本文中的实施例和图)。类似地，已经在抗cd33，抗muc16，抗steap1，抗ly6e，抗b7h4，抗cd22，和抗cd79b抗体中进行了单一半胱氨酸突变。已经改造成具有单一半胱氨酸突变(即两个半胱氨酸每个抗体)的抗muc16抗体的例子包括具有下述序列的抗体：已经改造成具有单一半胱氨酸突变(即两个半胱氨酸每个抗体)的抗steap1抗体的例子包括具有下述序列的抗体：已经改造成具有单一半胱氨酸突变(即两个半胱氨酸每个抗体)的抗napi2b抗体的例子包括具有下述序列的抗体：已经改造成具有单一半胱氨酸突变(即两个半胱氨酸每个抗体)的抗ly6e抗体的例子包括具有下述序列的抗体：已经改造成具有单一半胱氨酸突变(即两个半胱氨酸每个抗体)的抗cd79b抗体的例子包括具有下述序列的抗体：已经改造成具有单一半胱氨酸突变(即两个半胱氨酸每个抗体)的抗cd22抗体的例子包括具有下述序列的抗体：seqidno:描述序列192抗cd22hvr-h1gyefsrswmn193抗cd22hvr-h2griypgdgdtnysgkfkg194抗cd22hvr-h3dgsswdwyfdv195抗cd22hvr-l1rssqsivhsvgntfle196抗cd22hvr-l2kvsnrfs197抗cd22hvr-l3gyefsrswmn对上文所述改造成具有lc-k149c突变的抗ly6e抗体实施了实验。对上文所述改造成具有lc-k149c突变的抗napi2b抗体实施了实验。类似地，对上文所述改造成具有lc-k149c突变的抗cd22抗体实施了实验。而且，还将本文所述抗cd22抗体改造成具有依照eu编号方式的hc-l174c突变。对上文所述改造成具有hc-a140c突变(依照eu编号方式)的抗cd22抗体实施了实验。对上文所述改造成具有hc-l174c突变(依照eu编号方式)的抗cd22抗体实施了实验。某些抗cll1抗体已经进行半胱氨酸改造以包括表1或2中的优选位点之一且能改造成具有表3和4中公开的稳定位点之一。具体而言，将抗cll1抗体进行半胱氨酸改造以包括lc-k149c半胱氨酸突变。某些抗b7h4抗体能进行半胱氨酸改造以包括表1或2中的优选位点之一且能改造成具有表3和4中公开的稳定位点之一。在本文所述实验以外，本文所述任何抗体能改造成具有表1或2中描述的任何优选的改造的半胱氨酸位点以生成半胱氨酸改造抗体(即thiomabtm抗体)。而且，本文所述任何抗体能改造成具有表3或4中描述的任何稳定的改造的半胱氨酸位点以生成半胱氨酸改造抗体(即thiomabtm抗体)。具体而言，本文所述任何抗体能改造成具有lc-k149c，hc-a140c(依照eu编号方式)，或hc-l174c(依照eu编号方式)且能用pds或-vc接头缀合至本文所述药物之一。实施例16-例示性adc本文所述任何抗体能使用接头缀合至本文所述任何类别的药物，该接头将药物附着至改造的半胱氨酸残基。此类adc的例子可以通过依照wo2013/055987；wo2015/023355；wo2010/009124；wo2015/095227的规程偶联药物模块与接头试剂，并与本文所述任何半胱氨酸改造抗体缀合来制备。下表中使用了下述术语和缩写：dar＝平均药物/抗体比，a118c(重链，eu编号方式)(或者依照gne的顺序编号方式称作a121c(见图1b)，或者依照kabat编号方式称作a114c)，k149c(轻链，kabat编号方式)，a140c(eu编号方式)重链野生型("wt")，半胱氨酸改造的突变体抗体("thio")，轻链("lc")，重链("hc")，6-马来酰亚胺基己酰基(“mc”)，马来酰亚胺基丙酰基(“mp”)，缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)，丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)，对氨基苄基(“pab”)，对氨基苄氧羰基(“pabc”)，1-(氯甲基)-2,3-二氢-1h-苯并[e]吲哚(“cbi”)，吡咯并苯并二氮杂卓(“pbd”)，和单甲基奥瑞司他汀(“mmae”)。此类另外的adc的例子包括但不限于下文表17中提供的那些。表17：例示性抗体-药物缀合物#51-69的结构。注意，为简便起见，所述结构和adc51至63的结构只显示一个接头-药物基团附着至一个抗体。如上文提到的，多于一个接头-药物基团能附着至一个抗体。表18和19中提供了已经生成的adc的具体例子。表18提供已经生成的其中l-d在半胱氨酸改造位点lc-k149c处附着至抗体的adc的例子。表19提供已经生成的其中l-d在半胱氨酸改造位点hc-a140c处附着至抗体的adc的例子。表18：已经生成的其中l-d在半胱氨酸改造位点lc-k149c处附着至抗体的adc的例子。表19：已经生成的其中l-d在半胱氨酸改造位点hc-a140c处附着至抗体的adc的例子。在表18和19二者中，dar是在缓冲盐水中计算的。本发明并不限于由实施例中披露的具体实施方案的范围，这些实施例用来例示本发明的几个方面并且在功能上等效的任意实施方案均属于本发明的范围。实际上，除本文所示和所述的外，本发明的各种变型也对本领域技术人员而言也是显而易见的并且属于本文所附权利要求的范围。通过述及明确收录贯穿本说明书引用的所有专利，专利申请，和参考文献全文用于所有目的。当前第1页12