具有改变的特征的α‑溶血素变体的制作方法

与相关申请的交叉引用

本申请要求2014年10月31日提交的名称为“α-溶血素变体”的美国临时专利申请序列号62/073,936的优先权。

序列表

在此附上包含seqidnos：1-8的序列表。为了所有目的，序列表中提供的每个序列都通过引用整体并入本文。所述于2015年10月26日创建的ascii副本名称为20-04338.p519wo1_sl.txt，且大小为20,325个字节。

公开了与金黄色葡萄球菌（staphylococcalaureaus）α-溶血素变体相关的组合物和方法。α-溶血素（α-hl）变体可用作例如用于测定聚合物序列信息的设备中的纳米孔（nanopore）。本文所述的纳米孔、方法和系统采用具有改进的特征的基于纳米孔的单分子技术提供单链核酸如dna、rna等的定量检测。

背景

溶血素是由各种生物体生产的蛋白质毒素家族的成员。一些溶血素，例如α溶血素，可以通过在膜中形成孔或通道来破坏细胞膜（例如宿主细胞膜）的完整性。通过成孔蛋白质在膜中形成的孔或通道可用于将某些聚合物（例如，多肽或多核苷酸）从膜的一侧运输到另一侧。

α-溶血素（α-hl、a-hl或alpha-hl）是在宿主细胞膜中形成水通道的自组装毒素。α-hl已成为纳米孔测序界的主要组分。它具有许多有利的性质，包括高稳定性、自组装和孔径足够宽以容纳单链dna而不是双链dna（kasianowicz等人，1996）。

以前关于a-hl孔中dna检测的工作集中在分析dna通过孔转运的离子电流特征（kasianowicz等人，1996，akeson等人，1999，meller等人，2001），已知转运率（100mv时~1nt/µs）和离子电流信号中的固有噪声，这是非常困难的工作。通过并入永久束缚到孔内部的探针分子在基于纳米孔的传感器中已经实现了更高的特异性（howorka等人，2001a和howorka等人，2001b；movileanu等人，2000）。

野生型a-hl导致显著数目的缺失错误，即没有测量碱基。因此，期望具有改进性能的α-hl纳米孔。

发明概述

本发明主要涉及含有氨基酸变异的突变葡萄球菌α溶血素（αhl）多肽，其增强穿过时间（timetothread），例如减少捕获目标分子的时间。

目前公开的变体减少目标分子的穿过时间（timethread），例如各种标记的核苷酸或要测序的核苷酸。

本文公开了α-溶血素（αhl）变体。α-溶血素（αhl）变体衍生自亲本α-hl多肽或与seqidno：8具有至少80％、90％、95％、98％或更高序列同一性的序列，并且包含在对应于seqidno：3（成熟a-hl）的位置12或17的位置的取代。在一些实施方案中，变体还包含h144a。在一些实施方案中，取代包含一个或多个正电荷。在一些实施方案中，变体包含在对应于残基t12和/或n17中的一个或多个的位置处的取代。在一些实施方案中，变体包含选自t12k、t12r、n17k、n17r及其组合的取代。在一些实施方案中，变体相对于亲本α-溶血素具有改变的穿过时间（ttt）。在一些实施方案中，ttt减少。在一些实施方案中，变体包含在与来自金黄色葡萄球菌的α-溶血素（αhl）（seqidno：1）中选自t12r或k，和/或n17r或k的残基相对应的位置处的取代。在一些实施方案中，取代为t12k。在一些实施方案中，取代为t12r。在一些实施方案中，取代是n17k。在一些实施方案中，取代为n17r。在一些实施方案中，与亲本α-溶血素（例如aaa26598）相比具有改变的特征的变体a-hl包含h144a和至少一种另外的突变，其选自

a.t12k/r；

b.n17k/r；

或其组合。

在所有实施方案中，α-溶血素具有与seqidno：8具有至少90％，优选95％、98％或更高序列同一性的序列。

在一些实施方案中，氨基酸取代允许加入异源分子，例如peg。在一些实施方案中，a-hl变体具有翻译后修饰。

在一些实施方案中，取代是在约5至约8.5的ph下为碱性或带正电荷的非天然氨基酸。

在一些情况下，聚合酶与纳米孔结合（例如共价连接到纳米孔），且聚合酶进行核苷酸并入事件。

在一方面，提供了包含如本文所述的至少一种α-溶血素（αhl）变体的七聚体（heptomeric）孔组件。在一个实施方案中，本发明提供了含有突变αhl多肽（m）的异聚体孔组件，例如，含有野生型（wt）葡萄球菌αhl多肽和突变αhl多肽的孔组件，其中突变αhl多肽的氨基酸变体（如本文所提供的）占据孔结构的跨膜通道中的位置。例如，wt和变体αhl多肽的比例由式wt7-nmn表示，其中n为1、2、3、4、5、6或7；优选地，异七聚体中αhl多肽的比例是wt7-nmn；最优选地，比例是wt6m1。本发明也包括其中七聚体的每个亚基都是突变的αhl多肽（即，其中n=7）的同聚体孔。

在一方面，提供了编码如本文所述的a-hl变体的核酸。

在一方面，提供了包含编码如本文所述的α-溶血素变体的核酸的载体。

在一方面，提供了用载体转化的宿主细胞，所述载体包含编码如本文所述的α-溶血素变体的核酸。

在一方面，提供了生产α-溶血素变体的方法，包含以下步骤：（a）在合适的培养基中，在合适的条件下培养包含编码本文所述的α-溶血素变体的核酸的宿主细胞，以生产α-溶血素变体；和（b）获得所述生产的α-溶血素变体。

在一方面，提供了一种用于检测靶分子的方法，包含：（a）提供包含处于配置为与传感电极相邻或接近的膜中的如本文所述的纳米孔的芯片；（b）引导核酸分子通过所述纳米孔，其中所述核酸分子与报道分子结合，其中所述核酸分子包含地址区和探针区，其中所述报道分子与所述核酸分子在所述探针区结合，并且其中所述报道分子与靶分子偶联；（c）在所述核酸分子被引导通过所述纳米孔时测序所述地址区，以确定所述地址区的核酸序列；和（d）借助计算机处理器，基于（c）中确定的所述地址区域的核酸序列鉴定所述靶分子。

从下面的详细描述中，本发明的其它目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，尽管详细描述和具体实施例显示了本发明的优选实施方案，但它们仅以示范的方式给出，这是因为在本发明的范围和精神内的各种改变和修改对于本领域技术人员而言根据所述详细描述将变得显而易见。

附图简述

图1-5各自包含两个图，例如图1a和1b。每个图的a图是捕获事件数目的直方图，所述捕获事件具有等于在x-轴上显示的时间箱（timebin）的“穿过时间”。每个图的b图是相应图a的原始数据的一部分。

图1显示野生型α-溶血素纳米孔的结果。图1a（上图）显示了“穿过时间”数据。该数据从捕获标记的核苷酸的许多孔合并得来，表明孔具有聚合酶和模板dna分子两者。野生型ahl的平均值和中位数值以及标准偏差分别为20.7ms、16.1ms和1.5ms，且用于计算的方波总数为41910。

图1b（下图）显示了一些原始数据，显示了五个连续的方波。绿线之间的数据点表示开放通道（其中没有标记的核苷酸在孔中穿过），并且红线之间的数据表示当标记的核苷酸已经穿入孔中并阻止离子通过通道移动时。电极在正和负100mv之间循环，并且在施加负电压时，在我们的系统中不记录数据点。因此，所有的数据点都是从正向施加的电位收集的，且没有数据点的时间（例如1716.9-1717sec之间）是当电极具有对其施加的负电压时。在这个例子中，“穿过时间”测量由具有可观察的穿过的水平的方波计算，并且先前的方波在正电压结束时具有穿过的水平（表示标记穿入孔中，且由聚合酶结合）。

图2显示包含t12k突变的α-溶血素纳米孔的结果。图2a（上图）是从捕获标记的核苷酸的许多孔合并得来的数据，表明孔具有聚合酶和模板dna分子两者。t12kahl的平均值和中位数值以及标准偏差分别为19.7ms、14.5ms和1.5ms，且用于计算的方波总数为4311。

图2b（下图）显示了一些原始数据，显示了五个连续的方波。绿线之间的数据点表示开放通道（其中没有标记的核苷酸在孔中穿过），并且红线之间的数据表示当标记的核苷酸已经穿入孔中并阻止离子通过通道移动时。电极在正和负100mv之间循环，并且在施加负电压时，在我们的系统中不记录数据点。因此，所有的数据点都是从正向施加的电位收集的，且没有数据点的时间（例如1600.4-1601.2sec之间）是当电极具有对其施加的负电压时。在这个例子中，“穿过时间”测量由具有可观察的穿过的水平的方波计算，并且先前的方波在正电压结束时具有穿过的水平（表示标记穿入孔中，且由聚合酶结合）。

图3显示包含t12r突变的α-溶血素纳米孔的结果。图3a是从捕获标记的核苷酸的许多孔合并得来的数据，表明孔具有聚合酶和模板dna分子两者。t12rahl的平均值和中位数值以及标准偏差分别为16.9ms、10.5ms和1.5ms，且用于计算的方波总数为4138。

图3b（下图）显示了一些原始数据，显示了五个连续的方波。绿线之间的数据点表示开放通道（其中没有标记的核苷酸在孔中穿过），并且红线之间的数据表示当标记的核苷酸已经穿入孔中并阻止离子通过通道移动时。电极在正和负100mv之间循环，并且在施加负电压时，在我们的系统中不记录数据点。因此，所有的数据点都是从正向施加的电位收集的，且没有数据点的时间（例如267.2-268.2sec之间）是当电极具有对其施加的负电压时。在这个例子中，“穿过时间”测量由具有可观察的穿过的水平的方波计算，并且先前的方波在正电压结束时具有穿过的水平（表示标记穿入孔中，且由聚合酶结合）。

图4显示包含n17r突变的α-溶血素纳米孔的结果。图4a（上图）是从捕获标记的核苷酸的许多孔合并得来的数据，表明孔具有聚合酶和模板dna分子两者。n17rahl的平均值和中位数值以及标准偏差分别为17.5ms、10.5ms和1.7ms，且用于计算的方波总数为3877。

图4b（下图）显示了一些原始数据，显示了五个连续的方波。绿线之间的数据点表示开放通道（其中没有标记的核苷酸在孔中穿过），并且红线之间的数据表示当标记的核苷酸已经穿入孔中并阻止离子通过通道移动时。电极在正和负100mv之间循环，并且在施加负电压时，在我们的系统中不记录数据点。因此，所有的数据点都是从正向施加的电位收集的，且没有数据点的时间（例如344-344.9sec之间）是当电极具有对其施加的负电压时。在这个例子中，“穿过时间”测量由具有可观察的穿过的水平的方波计算，并且先前的方波在正电压结束时具有穿过的水平（表示标记穿入孔中，且由聚合酶结合）。

图5显示包含n17k突变的α-溶血素纳米孔的结果。图5a（上图）显示从捕获标记的核苷酸的许多孔合并得来的数据，表明孔具有聚合酶和模板dna分子两者。n17kahl的平均值和中位数值以及标准偏差分别为5.7ms、2.4ms和0.7ms，且用于计算的方波总数为2424。

图5b（下图）显示了一些原始数据，显示了五个连续的方波。绿线之间的数据点表示开放通道（其中没有标记的核苷酸在孔中穿过），并且红线之间的数据表示当标记的核苷酸已经穿入孔中并阻止离子通过通道移动时。电极在正和负100mv之间循环，并且在施加负电压时，在我们的系统中不记录数据点。因此，所有的数据点都是从正向施加的电位收集的，且没有数据点的时间（例如79.5-80.5sec之间）是当电极具有对其施加的负电压时。在这个例子中，“穿过时间”测量由具有可观察的穿过的水平的方波计算，并且先前的方波在正电压结束时具有穿过的水平（表示标记穿入孔中，且由聚合酶结合）。

详细说明

现在将仅通过参考以下定义和实施例的方式详细描述本发明。在此参考的所有专利和出版物，包括所有在这些专利和出版物中公开的序列都被明确地并入本文作为参考。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。singleton等人，dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology，第2版，johnwileyandsons，newyork（1994）和hale＆marham，theharpercollinsdictionaryofbiology，harperperennial，ny（1991）为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的综合词典。尽管与本文所述类似或等同的任何方法和材料都可用于本发明的实践或测试中，但是描述了优选的方法和材料。关于本领域的定义和术语，请专业人员特别注意sambrook等人，1989和ausubelfm等人，1993。应当理解，本发明不限于所描述的具体方法、规程和试剂，因为它们可能变化。

数值范围包括定义范围的数字。术语约在这里用来表示值的正或负百分之十（10％）。例如，“约100”是指在90和110之间的任何数字。

除非另有说明，核酸以5'至3'取向从左到右书写；氨基酸序列以从氨基到羧基取向从左到右书写。

本文提供的标题不是本发明的各个方面或实施方案的限制，其可以通过参考整个说明书来获得。因此，紧靠在下面定义的术语通过参考整个说明书更完整地定义。

定义

α-溶血素：如本文所用，“alpha-溶血素”、“α-溶血素”、“a-hl”和“α-hl”可互换使用，且是指自组装成七聚体充水跨膜通道（即纳米孔）的单体蛋白质。依赖于上下文，该术语还可以指由七种单体蛋白质形成的跨膜通道。

氨基酸：如本文所用，术语“氨基酸”在其最广泛的含义中是指可并入多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有通用结构h2n-c(h)(r)-cooh。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是d-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是l-氨基酸。“标准氨基酸”是指通常在天然存在的肽中发现的二十种标准l-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除了标准氨基酸以外的任何氨基酸，无论是合成制备的还是从天然来源获得的。如本文所用，“合成氨基酸”或“非天然氨基酸”包括化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物（如酰胺）和/或取代物。氨基酸，包括肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸，可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化和/或用其他化学物质取代进行修饰，而不对其活性产生不利影响。氨基酸可以参与二硫键。术语“氨基酸”可与“氨基酸残基”互换使用，并且可以指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。无论该术语是指游离氨基酸还是肽的残基，从使用该术语的上下文中都将是显而易见的。应当注意，所有氨基酸残基序列在本文中都由左右取向为氨基末端到羧基末端的常规方向的式表示。

碱基对（bp）：如本文所用，碱基对是指在双链dna分子中腺嘌呤（a）与胸腺嘧啶（t）或胞嘧啶（c）与鸟嘌呤（g）的配偶关系。

互补：如本文所用，术语“互补”是指通过碱基配对在两个多核苷酸链的区域之间或两个核苷酸之间的序列互补性的广义概念。已知腺嘌呤核苷酸能够与胸腺嘧啶或尿嘧啶核苷酸形成特异性氢键（“碱基配对”）。类似地，已知胞嘧啶核苷酸能够与鸟嘌呤核苷酸碱基配对。

表达盒：“表达盒”或“表达载体”是重组或合成产生的核酸构建体，其具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列指定的核酸元件。重组表达盒可以并入质粒、染色体、线粒体dna、质体dna、病毒或核酸片段中。通常，表达载体的重组表达盒部分除其他序列外包括要转录的核酸序列和启动子。

异源的：“异源的”核酸构建体或序列具有序列的一部分，其对于其表达于其中的细胞而言不是天然的。关于控制序列异源的是指这样的控制序列（即，启动子或增强子），其在自然界中不起作用以调节其目前调节其表达的相同基因。通常，异源核酸序列对于它们存在于其中的细胞或部分基因组而言不是内源性的，并且已通过感染、转染、转化、显微注射、电穿孔等加入到细胞中。“异源”核酸构建体可以含有与天然细胞中发现的控制序列/dna编码序列组合相同或不同的控制序列/dna编码序列组合。

宿主细胞：术语“宿主细胞”是指含有载体并支持表达构建体的复制和/或转录或转录和翻译（表达）的细胞。用于本发明的宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌（e.coli）或枯草芽孢杆菌（bacillussubtilus），或真核细胞如酵母、植物、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞。通常，宿主细胞是原核的，例如大肠杆菌。

分离的：“分离的”分子是与至少一个其它通常与之结合（例如在其天然环境中）的分子分离的核酸分子。分离的核酸分子包括通常表达核酸分子的细胞中包含的核酸分子，但是核酸分子在染色体外存在或位于不同于其天然染色体位置的染色体位置。

修饰的α-溶血素：如本文所用，术语“修饰的α-溶血素”是指起源于另一个（即亲本）α-溶血素的α-溶血素并且与亲本α-溶血素相比含有一个或多个氨基酸改变（例如氨基酸取代、缺失或插入）。在一些实施方案中，本发明的修饰的α-溶血素源自天然存在的或野生型α-溶血素或由其修饰而来。在一些实施方案中，本发明的修饰的α-溶血素源自重组或工程改造的α-溶血素或由其修饰而来，包括但不限于嵌合α-溶血素、融合α-溶血素或其它修饰的α-溶血素。通常，与亲本α-溶血素相比，修饰的α-溶血素具有至少一个改变的表型。

突变：如本文所用，术语“突变”是指引入亲本序列的改变，包括但不限于取代、插入、缺失（包括截短）。突变的后果包括但不限于在由亲本序列编码的蛋白质中未发现的新特征、性质、功能、表型或性状的产生。

纳米孔：本文所用的术语“纳米孔”通常是指在膜中形成或以其他方式提供的孔、通道或通路。膜可以是有机膜，例如脂双层，或合成膜，例如由聚合物材料形成的膜。膜可以是聚合物材料。可以将纳米孔配置为邻近或接近传感电路或耦合到传感电路的电极，例如互补金属氧化物半导体（cmos）或场效应晶体管（fet）电路。在一些实例中，纳米孔具有约0.1纳米（nm）至约1000nm的特征性宽度或直径。一些纳米孔是蛋白质。α-溶血素是蛋白质纳米孔的实例。

核酸分子：术语“核酸分子”包括rna、dna和cdna分子。应当理解，作为遗传密码简并性的结果，可以生产编码给定蛋白质例如α-溶血素和/或其变体的大量核苷酸序列。本发明考虑到所有可能的变体核苷酸序列，其编码变体α-溶血素，所有这些在已知遗传密码的简并性的情况下都是可能的。

启动子：如本文所用，术语“启动子”是指作用为指导下游基因转录的核酸序列。启动子通常将适合于靶基因正在其中表达的宿主细胞。启动子与其他转录和翻译调节核酸序列（也称为“控制序列”）一起是表达给定基因所必需的。通常，转录和翻译调节序列包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活蛋白序列。

纯化的：如本文所用，“纯化的”是指分子以含有其的样品的至少95重量％或至少98重量％的浓度存在于样品中。

纯化：如本文所用，术语“纯化”通常是指对含有转基因核酸或蛋白质的细胞进行生物化学纯化和/或柱层析。

标记：如本文所用，术语“标记”是指可以是原子或分子或原子或分子的集合的可检测部分。标记可以提供光学、电化学、磁性或静电（例如，电感、电容）特征（signature），该特征可以借助纳米孔检测。通常，当核苷酸附着到标记时，称为“标记的核苷酸”。标记可以通过磷酸酯部分附着到核苷酸。

穿过时间：术语“穿过时间”或“ttt”是指聚合酶-标记复合物或核酸链将标记穿入纳米孔的筒体所需的时间。

变体：如本文所用，术语“变体”是指与亲本蛋白质相比显示改变的特征的修饰的蛋白质，例如改变的离子电导。

变体溶血素：术语“变体溶血素基因”或“变体溶血素”分别表示通过去除、添加和/或操作编码序列已经改变了来自金黄色葡萄球菌的α-溶血素基因的核酸序列，或表达的蛋白质的氨基酸序列已经根据本文所述的发明进行了修饰。

载体：如本文所用，术语“载体”是指设计用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”是指能够在外来细胞中并入并表达异源dna片段的载体。许多原核和真核表达载体是可商购的。合适的表达载体的选择在本领域技术人员的知识范围内。

野生型：如本文所用，术语“野生型”是指具有当从天然存在的来源分离时基因或基因产物的特征的基因或基因产物。

百分比同源性：术语“％同源性”在本文中可与术语“％同一性”互换使用，并且是指当使用序列比对程序进行比对时，编码本发明多肽的任何一个的核酸序列或本发明多肽的氨基酸序列之间的核酸或氨基酸序列同一性的水平。

例如，如本文所使用的，80％同源性意指与通过明确的算法确定的80％序列同一性相同的事物，且因此给定序列的同源物在给定序列的长度上具有大于80％的序列同一性。序列同一性的示例性水平包括但不限于与给定序列的80、85、90、95、98％或更高序列同一性，例如本文所述的本发明多肽的任何一种的编码序列。

可以用于确定两个序列之间的同一性的示例性计算机程序包括但不限于在因特网上可公开获得的一组blast程序，例如blastn、blastx和tblastx、blastp和tblastn。另见altschul等人，1990和altschul等人，1997。

在相对于genbankdna序列和其他公共数据库中的核酸序列评价给定的核酸序列时，通常使用blastn程序进行序列检索。blastx程序优选用于对genbank蛋白质序列和其他公共数据库中的氨基酸序列检索已经在所有阅读框中翻译的核酸序列。blastn和blastx两者都使用开放缺口罚分（opengappenalty）为11.0和延伸缺口罚分（extendedgappenalty）为1.0的默认参数运行，并利用blosum-62矩阵。（参见例如altschul，s.f.等人，nucleicacidsres.25：3389-3402，1997）。

使用例如macvector版本13.0.7中的clustal-w程序来执行所选择的序列的优选比对以确定两个或更多个序列之间的“％同一性”，其使用默认参数操作，包括10.0的开放缺口罚分、0.1的延伸缺口罚分和blosum30相似度矩阵。

命名法

在本说明书和权利要求书中，使用了氨基酸残基的常规单字母和三字母代码。

为便于参考，使用以下命名法来描述本申请的变体：

原始氨基酸：位置：取代的氨基酸。根据这个命名法，例如，将在位置17由精氨酸替代苏氨酸显示为：

thr17arg或t17r。

多个突变被加号分开，即：

thr17arg+glu34ser或t17r+e34s

代表位置30和34的突变，分别用丙氨酸和谷氨酸替代天冬酰胺和丝氨酸。

当一个或多个可供选择的氨基酸残基可以插入给定位置时，其表示为：t17r/k或t17r或t17k。

α-溶血素的位点定向诱变

金黄色葡萄球菌α溶血素野生型序列在本文提供（seqidno：1，核酸编码区；seqidno：3，蛋白质编码区），且可在其他地方获得（国家生物信息学中心（nationalcenterforbioinformatics）或genbank登录号m90536和aaa26598）。

使用quikchangelightning2试剂盒（stategene/agilent）遵循制造商的说明可引入点突变。

引物可以从商业公司例如idtdna订购。

纳米孔装配和插入

本文描述的方法可以使用具有与纳米孔附着的聚合酶的纳米孔。在一些情况下，期望每个纳米孔具有一个且仅一个聚合酶（例如，从而使得在每个纳米孔仅仅一个核酸分子被测序）。然而，包括α-溶血素（ahl）在内的许多纳米孔可以是具有多个亚基的多聚体蛋白质（例如，对于ahl而言7个亚基）。亚基可以是相同多肽的相同拷贝。本文提供了具有修饰的亚基（例如a-hl变体）与未修饰的亚基（例如a-hl）的确定比例的多聚体蛋白质（例如纳米孔）。本文还提供了用于生产具有修饰的亚基与未修饰的亚基的确定比例的多聚体蛋白质（例如纳米孔）的方法。

参考wo2014/074727的图27，用于组装具有多个亚基的蛋白质的方法包含提供多个第一亚基2705并提供多个第二亚基2710，其中当与第一亚基比较时第二亚基被修饰。在一些情况下，第一亚基是野生型（例如，从天然来源纯化或重组生产）。可以以任何合适的方式修饰第二亚基。在一些情况下，第二亚基具有附着（例如，作为融合蛋白质）的蛋白质（例如，聚合酶）。

修饰的亚基可以包含化学反应性部分（例如，适于形成键的叠氮化物或炔基）。在一些情况下，该方法还包含进行反应（例如，click化学环加成）以将实体（例如聚合酶）附着到化学反应性部分。

所述方法还可以包含以第一比例使第一亚基与第二亚基接触2715以形成多个具有第一亚基和第二亚基的蛋白质2720。例如，一份修饰的具有适合于附着聚合酶的反应性基团的ahl亚基可与六份野生型ahl亚基混合（即第一比例为1:6）。多个蛋白质可以具有多个第一亚基与第二亚基的比例。例如，混合的亚基可以形成几个具有修饰的与未修饰的亚基的化学计量分布的纳米孔（例如1:6、2:5、3:4）。

在一些情况下，通过简单混合亚基形成蛋白质。例如，在ahl纳米孔的情况下，去污剂（例如脱氧胆酸）可以触发ahl单体采取孔构象。纳米孔也可以使用脂质（例如，1,2-双植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（dphpc）或1,2-二-o-植烷基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（dophpc））和适度的温度（例如，小于约100℃）形成。在一些情况下，将dphpc与缓冲溶液混合产生大的多层脂质体（lmv），并且向该溶液中加入ahl亚基并将混合物在40℃温育30分钟导致孔形成。

如果使用两种不同类型的亚基（例如，天然野生型蛋白质和可以含有单个点突变的第二ahl单体），则所得蛋白质可以具有混合的化学计量（例如，野生型和突变蛋白质的）。这些蛋白质的化学计量可以遵循取决于成孔反应中使用的两种蛋白质的浓度比例的公式。这个公式如下：

100pm=100[n!/m!(n-m)!]·fmut^m·fwt^n~m，其中

pm=具有m个突变亚基的孔的概率

n=亚基总数（例如，对于ahl为7）

m=“突变”亚基的数目

fmut=混合在一起的突变亚基的分数或比例

fwt=混合在一起的野生型亚基的分数或比例。

该方法还可以包含分级分离多个蛋白质以富集具有第一亚基与第二亚基的第二比例的蛋白质2725。例如，可以分离具有一个且仅一个修饰的亚基的纳米孔蛋白质（例如，1:6的第二比例）。然而，任何第二比例都是合适的。第二比例的分布也可以被分级分离，例如富集具有一个或两个修饰的亚基的蛋白质。形成蛋白质的亚基的总数不总是7（例如，可以使用不同的纳米孔，或者可以形成具有六个亚基的α-溶血素纳米孔），如wo2014/074727的图27所示。在一些情况下，仅具有一个修饰的亚基的蛋白质被富集。在这种情况下，第二比例是每（n-1）个第一亚基1个第二亚基，其中n是构成蛋白质的亚基数。

第一个比例可以与第二个比例相同，但是这不是必需的。在一些情况下，具有突变的单体的蛋白质可以以比不具有突变的亚基的蛋白质更低的效率形成。如果是这种情况，那么第一比例可以大于第二比例（例如，如果期望在纳米孔中1个突变的与6个未突变的亚基的第二比例，则形成适当数目的1:6蛋白质可能需要以大于1:6的比例混合亚基）。

具有不同第二比例亚基的蛋白质在分离中可以表现不同（例如，具有不同的保留时间）。在一些情况下，使用层析分级分离蛋白质，例如离子交换层析或亲和层析。由于除了修饰之外，第一和第二亚基可以是相同的，所以蛋白质上的修饰数目可以作为分离的依据。在一些情况下，第一或第二亚基具有纯化标记（例如，除了修饰之外）以允许或提高分级分离效率。在一些情况下，使用多组氨酸标记（his-标记）、链霉抗生物素蛋白标记（strep-标记）或其他肽标记。在一些情况下，第一和第二亚基各自包含不同的标记，且分级分离步骤基于每个标记进行分级分离。在his-标记的情况下，在低ph下在标记上产生电荷（组氨酸残基在侧链的pka下带正电荷）。利用与其他ahl分子相比ahl分子之一上电荷中的显著差异，可以使用离子交换层析来分离具有0、1、2、3、4、5、6或7个“电荷-标记的”ahl亚基的寡聚体。原则上，该电荷标记可以是携带均匀电荷的任何氨基酸的串。图28和图29示出了基于his-标记的纳米孔分级分离的实例。图28显示280纳米处的紫外线吸光度、260纳米处的紫外线吸光度和电导率的曲线图。峰对应于具有各种比例的修饰的和未修饰的亚基的纳米孔。wo2014/074727的图29​​显示了使用his-标记和strep-标记的ahl纳米孔和其突变体的分级分离。

在一些情况下，实体（例如，聚合酶）在分级分离后附着于蛋白质。蛋白质可以是纳米孔，且实体可以是聚合酶。在一些情况下，该方法还包含将具有第二比例亚基的蛋白质插入双层。

在一些情况下，纳米孔可以包含多个亚基。聚合酶可以附着到亚基之一，并且至少一个且少于所有亚基包含第一纯化标记。在一些实例中，纳米孔是α-溶血素或其变体。在一些情况下，所有亚基都包含第一纯化标记或第二纯化标记。第一纯化标记可以是多组氨酸标记（例如，在具有附着的聚合酶的亚基上）。

附着到纳米孔的聚合酶

在一些情况下，聚合酶（例如，dna聚合酶）附着于纳米孔和/或位于纳米孔附近。在纳米孔并入膜之前或之后，聚合酶可以附着到纳米孔。在一些情况下，纳米孔和聚合酶是融合蛋白质（即单个多肽链）。

聚合酶可以以任何合适的方式附着到纳米孔。在一些情况下，聚合酶附着到纳米孔（例如，溶血素）蛋白质单体，并然后组装完整的纳米孔七聚体（例如，以1个具有附着的聚合酶的单体与6个没有附着的聚合酶的纳米孔（例如，溶血素）单体的比例）。然后可以将纳米孔七聚体插入膜中。

将聚合酶附着到纳米孔的另一种方法包括将接头分子附着到溶血素单体或使溶血素单体突变以具有附着位点，并然后组装完整的纳米孔七聚体（例如，以1个具有接头和/或附着位点的单体与6个没有接头和/或附着位点的溶血素单体的比例）。然后可以将聚合酶附着到附着位点或附着接头（例如，在插入膜内之前，整批）。在膜中形成（例如，七聚体）纳米孔之后，聚合酶也可以附着到附着位点或附着接头。在一些情况下，将多个纳米孔-聚合酶对插入生物芯片的多个膜（例如，配置在孔和/或电极上）中。在一些情况下，聚合酶与纳米孔复合物的附着发生在生物芯片上的每个电极上。

聚合酶可以用任何合适的化学物质（例如共价键和/或接头）附着到纳米孔。在一些情况下，聚合酶用分子钉（molecularstaple）附着到纳米孔。在一些情况下，分子钉包含三个氨基酸序列（表示为接头a、b和c）。接头a可以从溶血素单体延伸，接头b可以从聚合酶延伸，然后接头c可以结合接头a和b（例如，通过缠绕接头a和b两者），且从而将聚合酶附着到纳米孔。接头c也可被构造为接头a或接头b的一部分，从而减少接头分子的数目。

在一些情况下，使用solulink^tm化学法将聚合酶与纳米孔连接。solulink^tm可以是hynic（6-肼基烟酸，一种芳族肼）和4fb（4-甲酰基苯甲酸酯，一种芳族醛）之间的反应。在一些情况下，使用click化学（例如可从lifetechnologies获得）将聚合酶连接到纳米孔。在一些情况下，将锌指突变引入溶血素分子中，并然后使用分子（例如，dna中间分子）将聚合酶连接到溶血素上的锌指位点。

装置设置

纳米孔可以形成于或以其它方式嵌入配置在与​​传感电路（例如集成电路）的传感电极相邻的膜中。集成电路可以是专用集成电路（asic）。在一些实例中，集成电路是场效应晶体管或互补金属氧化物半导体（cmos）。​​传感电路可以位于具有纳米孔的芯片或其他设备中，或者位于芯片或设备外，例如处于芯片外（off-chip）构型。半导体可以是任何半导体，包括但不限于iv族（例如硅）和iii-v族半导体（例如砷化镓）。参见例如wo2013/123450，用于传感核苷酸或标记的装置和设备设置。

基于孔的传感器（例如，生物芯片）可以用于单分子的电询问（electro-interrogation）。基于孔的传感器可以包括形成于膜中的本公开内容的纳米孔，所述膜被配置为邻近或接近传感电极。传感器可以包括对电极。膜包括反侧（即，面向传感电极的一侧）和顺侧（即，面向对电极的一侧）。

在下面的实验公开内容中，应用以下缩写：eq（当量）；m（摩尔）；μμ（微摩尔）；n（正常）；mole（摩尔）；mmol（毫摩尔）；μmol（微摩尔）；nmol（纳摩尔）；g（克）；mg（毫克）；kg（千克）；μg（微克）；l（升）；ml（毫升）；μl（微升）；cm（厘米）；mm（毫米）；μm（微米）；nm（纳米）；℃（摄氏度）；h（小时）；min（分钟）；sec（秒）；msec（毫秒）。

实施例

在以下实施例中进一步详细描述本发明，这些实施例不以任何方式意图限制所要求保护的本发明的范围。附图应被认为是本发明的说明书和描述的组成部分。所引用的所有参考文献对于其中描述的所有内容都通过引用特别并入本文。提供以下实施例来说明但不限制要求保护的发明。

实施例1

表达和回收

该实施例说明了来自细菌宿主细胞例如大肠杆菌的蛋白质的表达和回收。

编码野生型a-hl的dna购自商业来源。通过测序验证序列。

质粒构建。将编码野生型或变体α-溶血素的基因在t7启动子的控制下插入到ppr-iba2质粒（ibalifesciences，德国）。

转化。使用本领域熟知的技术，将大肠杆菌bl21de3（来自lifetechnologies）细胞用包含编码野生型或变体α-溶血素的dna的表达载体转化。简言之，细胞在冰上解冻（如果冷冻的话）。接下来，将所期望的dna（在合适的载体/质粒中）直接加入到感受态细胞中（不应超过感受态细胞的5％），并通过轻弹管来混合。将管置于冰上20分钟。接下来，将细胞置于42℃水浴中45秒而不混合，然后将管置于冰上2分钟。然后将细胞转移到含有0.9mlsoc培养基的15ml灭菌的培养管中（在室温预热），并在摇床中于37℃培养1小时。最后，将等分试样的细胞涂布在含有适当抗生素的lb琼脂平板上，并将平板在37℃温育过夜。

蛋白质表达。转化后，挑取菌落，并在37℃振荡的情况下接种到含有合适抗生素的小体积（例如3ml）生长培养基（例如lb液体培养基）中过夜。

第二天早晨，将1ml过夜培养物转移到含有适当抗生素的新的100ml自体诱导培养基，例如magicmedia（lifetechnologies），以选择表达质粒。在25℃振荡使培养物生长大约16小时，但这取决于表达质粒。通过在4℃以3,000g离心20分钟收获细胞，并储存在-80℃直到使用。

纯化。细胞通过超声处理裂解。通过亲和柱层析将α-溶血素纯化至均匀。

实施例2

t12和/或n17变体

以下实施例详述了在所期望的残基引入突变。

突变。使用quikchangemultisite-directedmutagenesis试剂盒（stratagene，lajolla，ca）进行位点定向诱变以制备t12和/或n17变体。

变体如实施例1所述进行表达和纯化。

实施例3

纳米孔的组装

该实施例描述了包含六个a-hl变体亚基和一个野生型亚基的纳米孔的组装。

野生型a-hl如实施例1所述用spytag和histag表达，并使用钴洗脱缓冲液（200mmnacl，300mm咪唑，50mmtris，ph8）在钴亲和柱上纯化。所期望的a-hl变体如实施例1所述用streptag表达，并使用洗脱缓冲液（50mmtris，5mm脱硫生物素，200mmnacl，ph8）在快速蛋白质液相层析（fplc）上使用streptactin亲和柱进行纯化。如果在5天内使用，则蛋白质在4℃储存，否则加入8％海藻糖并储存在-80℃。

使用约20mg的总蛋白质，将野生型a-hl与所期望的a-hl变体溶液以1:6的比例混合在一起。将双植烷酰基磷脂酰胆碱（dphpc）脂质溶解于50mmtris，200mmnacl，ph8或150mmkcl，30mmhepes，ph7.5中至终浓度为50mg/ml，并加入到a-hl单体的混合物中至终浓度为5mg/ml。将a-hl单体的混合物在40℃温育至少10min。将脂质溶血素混合物应用于尺寸排阻层析柱以从寡聚的蛋白质分离脂质。

实施例4

聚合酶的附着

该实施例提供聚合酶与纳米孔的附着。

聚合酶可以通过任何合适的方式与纳米孔偶联。参见，例如pct/us2013/068967（公开为wo2014/074727；geniatechnologies），pct/us2005/009702（公开为wo2006/028508）和pct/us2011/065640（公开为wo2012/083249；columbiauniv）。

聚合酶例如phi29dna聚合酶通过接头分子与蛋白质纳米孔（例如α-溶血素）偶联。具体来说，使用spytag和spycatcher系统，其在生理条件下自发形成共价的异肽键。参见，例如，li等人，jmolbiol.2014年1月23日，426(2):309-17。

粘性phi29spycatcherhistag根据实施例1表达，并使用钴亲和柱进行纯化。将spycatcher聚合酶和spytag寡聚的蛋白质在4℃在3mmsrcl2中温育过夜。然后使用尺寸排阻层析纯化1:6-聚合酶-模板复合物。

实施例5

变体的活性

该实施例显示了由实施例3提供的纳米孔（具有附着的聚合酶的纳米孔）的活性。

测定野生型和变体纳米孔（nonpore）以确定在一个或多个位置的突变的作用。该测定被设计为使用交变电压（即，方波）测量通过附着到纳米孔的dna聚合酶捕获标记的分子所花费的时间。

如于2014年10月23日提交的pct/us14/61853中所述的，形成双层并插入孔。用于检测分子（和/或测序核酸）的纳米孔设备（或传感器）如wo2013123450中所述设置。

为了测量在我们的测序复合物中通过dna聚合酶捕获标记的核苷酸所花费的时间，我们已经设计了一种使用交变的正电压和负电压（方波）来确定所花费的时间量的测定。我们的测序复合物包含附着到单个dna聚合酶的蛋白质纳米孔（αhl）（参见实施例4）。标记的核苷酸是带负电荷的，且因此当施加的电压实际上是正的时被吸引到纳米孔，并且当施加到纳米孔测序复合物的电压为负时被排斥。因此，我们可以通过循环正电位和负电位之间的电压来测量标记穿入孔所花费的时间，并确定纳米孔的电流有多少时间是与当标记穿过时（减小的电流通量）相比较无阻塞的（开放通道）。

为了进行这种“穿过时间”测定，genia测序设备与genia测序芯片（geniasequencingchip）一起使用。如pct/us2013/026514中所解释的，电极被调节并且在芯片上建立磷脂双层。将genia的测序复合物按照pct/us2013/026514（公开为wo2013/123450）中描述的规程插入双层。使用包含20mmhepesph7.5，300mmkcl，3um标记的核苷酸，3mmca²⁺的缓冲系统收集本专利中显示的穿过时间数据，其中施加+/-100mv的电压，工作循环为5hz。在收集数据之后，分析其显示持续到方波的正部分结束且随后为在随后的方波上进行的另一个标记捕获的标记的核苷酸的捕获（穿过的水平）的方波。通过确定第二个方波报告多长时间的无阻塞的开放通道电流来测量穿过时间。例如，如果10个连续的方波显示持续到方波的正部分结束的标记的核苷酸捕获，则穿过时间参数将从方波2-10计算（因为在先前的方波中聚合酶不具有与其结合的标记，所以第一个方波不计入计算）。然后收集实验中所有孔的这些穿过时间数值，并从中提取统计学参数（如平均值、中位数、标准偏差等）。

结果如图1-5所示。

应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且将对本领域技术人员提出根据其的各种修改或改变，且所述各种修改或改变将被包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请的全部内容都为了所有目标通过引用并入本文。

序列表自由文字

seqidno：2（wtahl氨基酸）[如在大肠杆菌中表达的]

seqidno：3（用于编号的成熟wtahl序列）

seqidno：4（n17kahl氨基酸）

seqidno：5（n17rahl氨基酸）

seqidno：6（t12kahl氨基酸）

seqidno：7（t12rahl氨基酸）

seqidno：8（成熟wtahl；aaa26598）

引用列表

专利文献

[1]pct/us2013/026514（公开为wo2013/123450），名称为“methodsforcreatingbilayersforusewithnanoporesensors”

[2]pct/us2013/068967（公开为wo2014/074727），名称为“nucleicacidsequencingusingtags”

[3]2014年10月23日提交的名称为“methodsforforminglipidbilayersonbiochips”的pct/us14/61853

非专利文献

本文引用的每个专利、专利申请、出版物、文件、genbank序列、网站和其他出版的材料的全部内容都通过引用并入，包括所有表、图和数字。所有专利和出版物都通过引用并入本文，其程度如同每一个被具体地和单独地指出通过引用并入一样。上述专利、专利申请、出版物和文件的引用不是承认上述的任一项是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。本文提及的所有专利和出版物都表示本发明所属领域的普通技术人员的技能水平。

序列表

<110>geniatechnologies,inc.

<120>具有改变的特征的α-溶血素变体

<130>20-04338.p519wo1

<140>

<141>

<150>62/073,936

<151>2014-10-31

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<212>dna

<213>金黄色葡萄球菌（staphylococcalaureaus）

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290